Resumen El proyecto de investigación: Producción de metabolitos secundarios de interés farmacológico (antialacránico) en plántulas in vitro de Aristolochia elegans , tiene como objetivo genreral estudiar los factores fisicoquímicos en el cultivo in vitro de A. elegans, que intervienen en la biosíntesis de metabolitos de interés farmacológico, particularmente contra el efecto del veneno de alacrán. Los resultados de períodos anteriores permiten suponer que los cultivos celulares producen metabolitos con actividad farmacológica contra los efectos del veneno de alacrán, ya que se ha comprobado la actividad farmacológica de extractos hexánicos y metabólicos de plantas propagadas in vitro y crecidas en invernadero. Con base en lo anterior, los objetivos particulares planteados para el período: Enero-Diciembre de 2006 fueron los siguientes: 1. Desarrollar una línea celular de A. elegans 2. Conocer el efecto relajante de extractos de los cultivos celulares obtenidos 3. Difundir el conocimiento generado. Se consideró como producto final: el establecimiento de una línea celular de A. elegans productora de metabolitos de interés farmacológico (antialacránico)

Se lograron los siguientes avances: 1. Establecimiento de la metodología para el desarrollo de callo 2. Protocolo para controlar la oxidación tanto en explantes como en callos 3. Cultivo celulares, de los cuales se obtendrán los extractos Los cultivos celulares tienen las siguientes ventajas: 1. Producción continua de los metabolitos de interés 2. Selección de líneas de alto rendimiento 3. Reducción de espacio 4. Máximo control de calidad del metabolito

Subproductos obtenidos: 1. Servicio social del alumno Jorge Alberto Sánchez Velázquez 2. Estancia Profesional de la alumna Diana Yeimy Navarrete Godínez 3. Tesis Nivel: licenciatura: Efecto Antioxidante de la Poivinilpirrolidona y L-Cisteína en Cultivos de A. elgans. Diana Yeimy Navarrete. Fecha de examen: 9 de Junio 2006 4. Estancia de investigación de la alumna Yadid Chávez Morales Para fines del presente informe, es importante considerar lo siguiente: Este proyecto tiene dos líneas, una es el estudio farmacológico de los metabolitos secundarios obtenidos tanto de plantas silvestres como micropropagadas y crecidas en invernadero. La otra es el estudio farmacológico de los metabolitos secundarios obtenidos de cultivos celulares. En el primer caso se ha avanzado de manera importante, pues se han alcanzado las siguientes metas:

1. Estudio farmacológico en íleo de cobayo y en ratones, de los extractos íntegros hexánicos y metanólicos de plantas silvestres de Aristolochia elegans Mast.

2. Establecimiento del sistema de micropropagación de la especie antes referida 3. Estudio farmacológico en íleo de cobayo, de los extractos íntegros hexánicos y metanólicos de

plantas micropropagadas de Aristolochia elegans Mast. Los subproductos obtenidos de esta parte del proyecto en el período: Enero-Diciembre de 2006, fueron los siguientes: 1. Dos alumnos PIFI 2. Una tesis de maestría en proceso 3. Una conferencia 4. Un programa de Televisión 5. Una colección científica de germoplasma 6. Una presentación en congreso internacional

Introducción “Anteriormente la sobreexplotación de las plantas medicinales no se tomaba en cuenta porque había abundancia de recursos” (Luzuriaga, 1998). Actualmente hay una mayor preocupación de la sociedad por la conservación de la biodiversidad en todos sus aspectos, pero especialmente por los recursos vegetales. Del total de las especies de plantas del mundo, más de las dos terceras partes (poco menos de 35,000) tienen valor medicinal y se originan en los países en desarrollo. Miles de productos elaborados de plantas sirven como analgésicos, antibióticos, hormonas y diuréticos, entre muchos otros usos (Dürbeck, 1996). En la década de los años ochenta, más de 10,000 compuestos químicos se aislaron de diferentes tejidos vegetales, así como muchos antibióticos (FAO, 1989). Esta preocupación por la conservación de los recursos naturales ha sido motivo de búsqueda de soluciones, lo cual no es sencillo, pues se requiere del conocimiento de diversos campos que involucra la interrelación del hombre con su medio. En este sentido, desde hace treinta años se hace investigación integral en las áreas de la biología, de la conservación, la lingüística y la antropología de las culturas contemporáneas, así como de la etnobiología y la etnoecología, de la cual se ha formulado el postulado bio-cultural, que pregona “la imposibilidad de preservar la biodiversidad sin proteger la diversidad cultural y viceversa” (Maffi, 2001; Toledo, 2001a), cuya esencia es el conservacionismo tomando en cuenta el complejo de creencias-conocimiento-prácticas de los pueblos indígenas. Lo anterior significa que se debemos conservar y aprovechar la riqueza etnobotánica y biológica de México. En este sentido, la conservación de la diversidad biológica es indispensable para la supervivencia de los pueblos. Uno de los postulados que apoya el aprovechamiento sostenible de la biodiversidad es el de “producir conservando y conservar produciendo”. Dentro de la biotecnología vegetal, particularmente la técnica de cultivo de células, tejidos y órganos vegetales, incluye diversas metodologías con las que es posible desarrollar sistemas In Vitro de propagación masiva de plantas con diversas finalidades, desde comercializar especies ornamentales, o medicinales, hasta rescatar a otras del peligro de extinción. Proyectos más ambiciosos incluyen el desarrollo de sistemas In Vitro para producir metabolitos secundarios con actividad contrarrestante a diversos padecimientos del ser humano, mediante el cultivo de células vegetales. Esta alternativa al igual que la de propagación In Vitro ofrece la posibilidad de obtener y aprovechar dichas sustancias sin afectar al recurso natural.

Bajo este esquema, se pretende contribuir a evitar la sobreexplotación de Aristolochia elegans Mast., a través de la obtención de una línea celular de esta especie, con capacidad de producir metabolitos secundarios que contrarresten los efectos del veneno de alacrán Centruroides limpidus limpidus Karsch.

Durante la formación de callos in vitro, se hace necesario su sub-cultivo a medio de cultivo recién preparado, ya que la falta de transferencia de nutrimentos lleva irremediablemente al debilitamiento, intoxicación y muerte de los tejidos cultivados. Esto se debe a que en esta etapa el crecimiento y la multiplicación celular son tan intensas que provocan no sólo el gasto de los nutrientes del medio, sino que también liberan sustancias que pueden acumularse dentro de los cultivos, dichas sustancias son conocidas como metabolitos secundarios, encontrándose como ejemplos de éstas a los compuestos fenólicos, antocianos, cumarinas entre otros.

Estas sustancias son lábiles y fáciles de oxidar, por lo que una acumulación de éstas puede ser tan alta que se vuelven fitotóxicas para el tejido y aún más, son capaces de alterar procesos morfogénicos y/o de crecimiento y desarrollo (Hurtado y Merino, 1987; Zaid, 1987).

Así mismo numerosos estudios han demostrado que la producción de éstos metabolitos secundarios por parte de las células vegetales cultivadas, se incrementa en gran medida cuando el crecimiento se restringe o se detiene (Phillips y Henshaw, 1977) y, generalmente, la máxima producción ocurre durante la fase de crecimiento estacionaria (Constabel y Vasil, 1987).

Es importante señalar sin embargo, que si bien la síntesis fenólica puede estar regulada a nivel enzimático (Constabel y Vasil, 1987), existen también otros factores que agregados al medio de cultivo (líquido o

sólido), pueden influir en la formación de compuestos fenólicos, entre algunos de esos factores podemos destacar a la sacarosa, reguladores del crecimiento vegetal y condiciones de luz.

Mecanismos de control de la oxidación

En el cultivo de tejidos se hace necesario controlar por una parte, los compuestos fenólicos protectores de auxinas, con objeto de estimular el crecimiento tisular y, por otro lado, limitar la biosíntesis de fenoles y/o retardar o impedir su oxidación cuando llegan al medio de cultivo. Esta oxidación de fenoles provoca en los cultivos el "browning" o "blackening" es decir un ennegrecimiento tanto del medio de cultivo como de los explantes, que suele concluir con la muerte o necrosis generalizada de los propágulos (George y Sherrigton, 1984).

Se han propuesto diversos métodos para eliminar o paliar los efectos negativos de estos compuestos fenólicos:

Para empezar es lógico suponer que evitar o suavizar el estrés que provocan o estimulan su biosíntesis, será el mejor método para impedir que estas sustancias aparezcan en los cultivos y produzcan efectos tóxicos e inhibición del crecimiento. Una práctica adecuada sería cuidar que las condiciones fitosanitarias y fisiológicas de las plantas madres origen de los explantes fueran idóneos en la Fase 0, o de siembra y que los métodos de desinfección y aislamiento fueran lo menos agresivos posibles en la Fase 1, o de establecimento de los cultivos.

Otros métodos que dan buen resultado si la síntesis de fenoles no puede evitarse son, la dispersión, adsorción o lavado, con sustancias como el carbón activado (CA) o la polivinilpirrolidona (PVP); la modificación del potencial redox (disminuyendo los agentes redox, o la disponibilidad de oxigeno; la inactivación de enzimas de tipo fenolasa (quelantes), y otros sistemas como la incubación en condiciones de oscuridad, bajo pH, incubación a temperaturas más bajas, que persiguen reducir la actividad fenolasa y la disponibilidad de sustratos.

La adición de sustancias antioxidantes, es otro de los métodos que suelen aplicarse, aunque es necesario tener mucho cuidado, ya que tras su oxidación pasan a ser oxidantes muy potentes, invirtiéndose su efecto positivo en el control de los fenoles (Cleland, 1964).

MÉTODOS Y MATERIALES

Material biológico

Se utilizaron semillas de A. elegans obtenidas de la parcela experimental del Centro de Investigación Biomédica del Sur(CIBIS) - IMSS, ubicado en el municipio de Xochitepec, Morelos.

Metodología experimental

En la siguiente figura se muestra el diagrama de flujo general para el establecimiento de la línea celular de A. elegans: La metodología experimental desarrollada para tal fin incluyó las siguientes etapas: a) Colecta y selección de las semillas, b) Desinfección, c) Siembra e incubación, d) Multiplicación por cultivo de yemas axilares, e) Obtención de callo y f) Control de oxidación.

Micropropagación

DDeessiinnffeecccciióónn

SSiieemmbbrraa eenn MMeeddiioo MMSS aall 5500 %%

IInnccuubbaacciióónn

PPlláánnttuullaa ddeessaarrrroollllaaddaa

Obtención de Callo

SSeelleecccciióónn ddee eexxppllaannttee yy CCoommbbiinnaacciióónn ddee rreegguullaaddoorreess ddeell ccrreecciimmiieennttoo

T = 25 ± 2 °C, de 3 a 4 semanas en oscuridad Después de emerger las radículas, se pasan a condiciones de luz con Fotoperiodo = 16 hrs., con una Intensidad luminosa = 2 000 luxes.

CCoolleeccttaa ddee sseemmiillllaass ddee AA.. eelleeggaannss

LLíínneeaa cceelluullaarr

CCoonnttrrooll ddee ooxxiiddaacciióónn

Germinación in vitro de las semillas La siembra se realizó en condiciones asépticas, para ello se colocó cada una de las semillas en tubos de vidrio de fondo plano de 1.4 cm de diámetro x 8 cm de largo, que contenían 4 ml de medio MS al 50 %. Los tubos se colocaron en caja magenta, previamente cubiertos con tapones de algodón. El periodo de incubación requirió de 3 a 4 semanas en oscuridad, a una temperatura de 25 ± 2 °C. Una vez que emergieron las radículas, se transfirieron a condiciones de luz, con fotoperiodo de 16 hrs con una irradiancia de 310 µmol m-2 s-1, esto, con el fin de inducir el desarrollo de las plántulas. Propagación in vitro por cultivo de yemas axilares A partir de las plántulas asépticas de 10 semanas de edad (8-10 cm de altura), se obtuvieron los nodos (región del tallo donde se localizan las yemas axilares), estos se colocaron en cajas Magenta con medio de cultivo MS 100 %, adicionado con 10 µM del regulador de crecimiento Benzilaminopurina (BAP), 30 g / L de sacarosa y agar 8 g / L (Mora, 2005). Las condiciones de cultivo fueron iguales a las utilizadas para el desarrollo de plántulas asépticas. Obtención de callo Efecto de la combinación de reguladores del crecimiento en el desarrollo de callo Se tomó como referencia el estudio previo realizado por Mora en el 2005, en el cual se observó que el mejor desarrollo de callo se obtuvo de explantes de hoja. Se probó la combinación de las auxinas ANA, 2,4-D y AIA a una concentración constante de 10 µM para cada una de ellas, con una citocinina (KIN) a diferentes concentraciones, de acuerdo a la tabla 2. Como testigo se usó medio MS sin reguladores del crecimiento.

Efecto de la combinación de tres auxinas con una citocinina en la formación de callo

Concentración constante (10 µM)

Concentración de KIN (µM) ANA 2,4-D AIA 0.0 0.5 1.0 2.0 5.0

10.0 Efecto de la concentración de ácido naftalenacético en la calidad de callo Con la finalidad de obtener un callo de mejor calidad, refiriéndose esta, a un buen desarrollo y aspecto sano, y con base en los resultados obtenidos en el experimento anterior, se evaluó el efecto de la combinación de diferentes concentraciones de ácido naftalenacético con dos concentraciones de kinetina tabla 3.

Efecto de la concentración de ANA en la calidad de callo .

ANA (µМ) KIN(µМ) 0.0 0.5 1.0 2.0 3.0 5.0 7.0 10 15 20

0.0 2.0 5.0

En todos los experimentos anteriores se consideró como unidad experimental una caja desechable de Petri de 60 mm de diámetro x 15 mm de altura, que contenía 10 mL de medio, con cuatro explantes, el número de réplicas fue de cinco. En todos los experimentos, el medio de cultivo contenía ácido cítrico y carbón activado ambos en concentraciones de 150 mg / L. Las condiciones de cultivo para el desarrollo de callo fueron: oscuridad y temperatura de 25 ± 2 °C. Se evaluó el porcentaje de respuesta para lo cual se contabilizó el número de explantes que formaron callo y se dividió entre el número total de explantes sembrados, este resultado se multiplicó por 100.

Control de oxidación

Efecto antioxidante de tratamientos aplicados al explante en forma de baño antes de la siembra In Vitro

Con base en lo reportado por la literatura y en trabajos preliminares con A. elegans, se desarrolló un experimento bifactorial mediante el cual se evaluó por un lado el efecto de tres sustancias antioxidantes: ácido cítrico, ácido ascórbico y L-cisteína, aplicados a los explantes en forma de baño antes de colocarlos en el medio de cultivo y por otro, el efecto e interacción del pH del medio de cultivo (tabla No. 4).

Efecto de la combinación de baños antioxidantes con dos valores de pH en el medio de cultivo en el control de la oxidación.

pH del medio

de cultivo Sin baño

Ác. Ascórbico (0.1 % p/v)

Ác. Cítrico (150 mg/L)

L - Cist. (100 mM)

pH 5.8 pH 5.0

Las soluciones antioxidantes se prepararon en las siguientes concentraciones: ácido ascórbico 0.1 % p/v, ác. cítrico 150 mg / L y L-cisteína 100 mM. Previo a su utilización, se esterilizaron mediante filtro milipore estéril. Antes de colocar los explantes en el medio de cultivo, se sumergieron en la solución correspondiente por un tiempo de 10 – 15 minutos. Efecto antioxidante de la combinación de baños con diferentes concentraciones de fluoroglucinol adicionadas al medio de cultivo.

Se adicionó al medio de cultivo fluoroglucinol en concentraciones de 1.0, 1.5 y 20 mg/ L. Los explantes se sometieron a los tratamientos antioxidantes de la misma forma en que se describió para el experimento anterior Tabla No. 5.

Tratamientos antioxidantes mediante la combinación de baños y concentraciones de fluoroglucinol

Baños Antioxidantes MS + PG (mg/L) Sin baño

Ác. Ascórbico (0.1 % p/v)

Ác. Cítrico (150 mg/L)

L-Cist. (100 mM)

0.0

1.0 1.5 2.0

En todos los experimentos de control de oxidación la unidad experimental fue de una caja petri chica con cuatro explantes por caja (figura 5), con 5 repeticiones por experimento.

Fotografía de la Unidad experimental usada para todos los tratamientos.

Las variables de respuesta evaluadas fueron el porcentaje de formación de callo, porcentaje de callos oxidados y el grado de oxidación. Las dos primeras se determinaron dividiendo el número total de callos formados u oxidados sobre el número total de explantes sembrados, el resultado se multiplicó por 100. Para el grado de oxidación se usó la tabla de color 2.5 Y de Munsell©. La evaluación se realizó a las cuatro semanas después de iniciarse el experimento. Resultados Efecto de la concentración de ácido naftalenacético en la calidad de callo Los resultados mostrados en la figura 7 indican que la presencia única de ANA induce la formación de callo. No se observó una relación directa entre la respuesta y la concentración de la auxina y tampoco la hubo con las diferentes conmbinaciones auxina-citocinina. El mayor % de formación de callo lo presentó el tratamiento ANA – KIN (1 – 0 µМ), sin embargo el mejor aspecto de callo (con menor grado de oxidación) lo mostró el tratamiento ANA – KIN = 5 – 5 µМ (figura 8), por lo que se eligió éste último como mejor tratamiento para el subcultivo.

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% fo

rmac

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de c

allo

[ANA](µМ)

Concentracion de ANA, (µM)

Porcentaje de formación de callo con diferentes tratamientos de ANA-KIN

[KIN] = 0 µM

[KIN] = 2 µM

[KIN] = 5 µM

Aspectos evaluados en los tratamientos para la formación de callo

Tratamiento Aspectos evaluados ANA KIN Color Friabilidad Textura Grado de Oxidación

0 0 S / formación de callo -- -- -- 0 2 S / formación de callo -- -- -- 0 5 S / formación de callo -- -- -- 0.5 0 Amarillo Friable Rugoso Poco oxidado 0.5 2 Amarillo Friable Rugoso Poco oxidado 0.5 5 Amarillo Friable Rugoso+Granuloso Poco oxidado 1 0 Café olivo claro Friable Rugoso+Granuloso Medio oxidado 1 2 Amarillo olivo Friable Rugoso+Granuloso Poco oxidado 1 5 Café olivo claro Friable Rugoso+Granuloso Medio oxidado 2 0 Amarillo Friable Rugoso+Granuloso Poco oxidado 2 2 Café olivo claro Friable Rugoso+Granuloso Medio oxidado 2 5 Café olivo Friable Rugoso+Granuloso Medio oxidado 3 0 Café olivo Friable Rugoso+Granuloso Medio oxidado 3 2 Café olivo claro Friable Rugoso+Granuloso Medio oxidado 3 5 Café olivo claro Friable Rugoso+Granuloso Medio oxidado 5 0 Café olivo claro Friable Rugoso Medio oxidado 5 2 Café olivo claro Friable Rugoso Medio oxidado 5 5 Amarillo claro Friable Rugoso * Poco oxidado 7 0 Café olivo, amarillo claro Friable Rugoso Medio oxidado 7 2 Café olivo, amarillo claro Friable Rugoso Medio oxidado 7 5 Amarillo olivo Friable Rugoso Poco oxidado 10 0 Amarillo olivo Friable Rugoso Poco oxidado 10 2 Café olivo Friable Rugoso Medio oxidado 10 5 Café olivo oscuro Friable Rugoso Medio oxidado 15 0 Café olivo Friable Rugoso Medio oxidado 15 2 Amarillo olivo Friable Rugoso Poco oxidado 15 5 Amarillo claro Friable Rugoso Poco oxidado 20 0 Café olivo Friable Rugoso Medio oxidado 20 2 Café olivo oscuro Friable Rugoso Muy oxidado 20 5 Amarillo olivo Friable Rugoso Poco oxidado

Los valores del grado de oxidación fueron dados de acuerdo a las coloraciones de la tabla de Munsell© de color 2.5 Y (Munsell© Soil Color Charts 1992).

. Efecto de la combinación ANA – KIN = 5 – 5 µМ en la formación de callo.

Control de oxidación

Efecto antioxidante de tratamientos aplicados al explante en forma de baño antes de la siembra in

Vitro.

La figura 9a muestra los porcentajes de oxidación obtenidos con la aplicación de diferentes baños antioxidantes a los explantes colocados en medio de cultivo con pH de 5.8. Los explantes del control (sin baño), presentaron el 45 % de oxidación, superior a los observados con los tratamientos de ácido ascórbico y L-cisteína. El baño con ácido cítrico, lejos de disminuir la oxidación, la produjo en mayor proporción. Es probable que a este pH se haya convertido en una sustancia fuertemente oxidante. De acuerdo a estos resultados, el ácido ascórbico y la L-cisteína disminuyeron el oscurecimiento de los callos.

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CA-AC, pH 5.8Medio

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Sin baño Ác. ascórbico Ácido cítrico L-cisteína Figura 9a: Efecto de diferentes sustancias en el control de la oxidación

Los resultados obtenidos con los mismos tratamientos pero en un medio de cultivo con pH de 5 difieren de los anteriores (figura 9b). En el control, el porcentaje de oxidación fue de sólo 5 %. Es probable que este pH afecte negativamente la actividad enzimática de las polifenolasas disminuyendo la oxidación de las sustancias fenólicas. El baño con ácido cítrico disminuyó el problema hasta el 9%. El efecto de la L-cisteína no cambió con respecto al observado bajo un pH de 5.8. Lo que llamó la atención fue el incremento del porcentaje de oxidación en el tratamiento con ácido ascórbico, al parecer la disminución

del pH convierte al ácido ascórbico en una sustancia oxidante. Cabe mencionar que el medio a este pH, no solidificó totalmente.

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CA-AC, pH 5Medio

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Sin baño Ác. ascórbico Ácido cítrico L-cisteína Figura 9b: Efecto de diferentes sustancias en el control de la oxidación

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PG, 1.0 mg / L Medio

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Sin baño Ác. ascórbico Ácido cítrico L-cisteína Figura 9c: Efecto de diferentes sustancias en el control de la oxidación

La adición de 1.0 mg / L de fluoroglucinol (figura 9c) disminuyó el grado de oxidación por sí solo, esto se puede observar al comparar las barras de color blanco de las figura 9a (primer exp.) y (1.0 mg / L de PG): 45 y 25 % respectivamente, donde la disminución de la oxidación tal vez se debió a que el PG pudo ser más fácilmente oxidado por los agentes oxidantes que los compuestos fenólicos, por lo cual se puede suponer que con el PG agregado al medio de cultivo, es posible controlar la oxidación de los callos. En los explantes tratados con el baño de ácido ascórbico también disminuyó en un 10 % el problema. El baño con ácido cítrico a los explantes en combinación con el tratamiento con PG a esta concentración (1 mg / L) redujo la oxidación alrededor del 1 % siendo el mejor. Por otro lado, el grado de oxidación en explantes tratados con L-cisteína no cambió al adicionar 1.0 mg / L PG. De acuerdo con estos resultados, puede decirse que el mejor tratamiento para controlar la oxidación es la combinación del baño antioxidante de ácido cítrico con 1.0 mg / L de fluoroglucinol.

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PG, 1.5 mg / L Medio

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Sin baño Ác. ascórbico Ácido cítrico L-cisteína

Figura 9d: Efecto de diferentes sustancias en el control de la oxidación

Comparando los resultados con la figura anterior, la adición de 1.5 mg / L de PG (figura 9d) se redujo todavía más el % de oxidación en los explantes sin tratamiento y tratados con baños antioxidantes de ácido ascórbico y L-cisteína. El ácido cítrico, alcanzó valores superiores de oxidación.

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PG, 2.0 mg / L Medio

Porc

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je d

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Sin baño Ác. ascórbico Ácido cítrico L-cisteína

Figura 9e: Efecto de diferentes sustancias en el control de la oxidación

Con 2.0 mg / L de PG (figura 9e), el porcentaje de oxidación se mantuvo constante en los explantes que no tuvieron baño. Mientras que los tratados con ácido ascórbico y ácido cítrico presentaron de 5 % por arriba y por abajo respectivamente al compararse con el efecto de 1.5 mg / L de PG.

De manera general la adición de PG en diferentes concentraciones tuvo un efecto positivo en el control de la oxidación.

Conclusiones

La inducción de los callos se da por acción de la auxina más que por la de la citocinina. De acuerdo con los porcentajes de formación de callo, el mejor tratamiento para la formación de callo se obtuvo con la combinación ANA – KIN (1 – 0 µМ) pero se eligió el tratamiento ANA – KIN = 5 – 5 µМ por tener mejor aspecto físico, como el tratamiento más adecuado para el subcultivo.

Un valor de pH de 5 permite el control de oxidación, al disminuir el porcentaje de callos oxidados hasta un 5 %, sin embargo no es el adecuado para la solidificación del medio de cultivo.

En general, la adición del fluoroglucinol al medio de cultivo MS en diferentes concentraciones, disminuye la oxidación de los callos, siendo el tratamiento antioxidante de 1 mg / L de PG con baño en solución de 150 mg / L de ácido cítrico el más adecuado para el control de oxidación.

Impacto

En este período de trabajo (Enero-Diciembre de 2006), además de establecer las condiciones del cultivo celular y control de oxidación, se realizó el fraccionamiento por cromatografía en columna y caracterización por cromatografía en capa fina de los extractos hexánicos de raíces de plantas silvestres y el estudio farmacológico de las fracciones que presentaron actividad antiveneno de alacrán. Se iniciará el mismo proceso con los extractos metanólicos y con acetato de etilo. Por otro lado, ya se cuenta con planta micropropagada y crecida en invernadero para que se realicen los mismos estudios. Estas metas están consideradas dentro de la tesis del alumno de maestría Assael Y. Luna Guerrero, quien las realizará durante el semestre Febrero-Junio de 2007. Esta etapa de la investigación es una de las más interesantes, ya que se están identificando los principales metabolitos que tienen actividad antiveneno así como evaluando farmacológicamente. Por otro lado, se tiene el antecedente de que los extractos de las plantas micropropagadas y crecidas en invernadero, también presentan actividad antiveneno, por lo cual se espera que también se identifiquen los mismos metabolitos y con la misma actividad farmacológica que en la planta silvestre. El sistema de micropropagación de la especie permitirá el establecimiento de plantaciones en invernadero y en campo como fuentes de materia prima para la obtención de los metabolitos de interés, en cantidad suficiente, con la finalidad de realizar estudios conducentes a la elaboración de un fitomedicamento, que sería la etapa final de esta investigación. Posteriormente se transferirá la tecnología a Emprendedores Mexicanos para que produzcan y coloquen éste fitomedicamento en el mercado nacional e internacional. Todo este proceso permitirá un Desarrollo Tecnológico Sustentable.

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