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INDICE

INDICE………………..…………………………………………………………04

RESUMEN……………………………...………………………………………08

ABSTRACT…………………………….……………………………………….09

INTRODUCCION………………………………………………………………10

ANTECEDENTES……………………………………………………………...13

MATERIALES Y METODOS………………………………………………….22

I. Obtención de la Muestra Microalgal y su

Aislamiento…..………………………………………………....22

1. Origen de la cepa…………………..………………………22

2. Clasificación taxonómica………………………………….22

3. Técnicas de colección algal……………….………………22

4. Manipulación de la muestra en laboratorio………..…….23

4.1 Tratamiento del agua de mar…………………………23

4.2 Limpieza y esterilización de material…..……………24

4.3 Medio de cultivo……………………….……………….25

4.4 Adaptación de la especie……………………..………25

5. Aislamiento…………………………………………………..26

2

5.1 Conteo………………………………………...………..26

5.2 Técnica de dilución ……………………………..…….26

5.3 Técnica de lavado de células…………….………….27

II. Flujo de Cultivo……………………………..…..………………28

1. Cultivo inicial……………………………….……………….29

2. Cultivo intermedio………………………………………..29

3. Cultivo masivo…………………………………………….30

III. Instalación de Acuarios....………………….…..……………..30

1. Lugar de ejecución……………………..………………….31

2. Limpieza…………………………………………………….31

3. Especie elegida Cheiodactylus variegatus…………….. 31

4. Instalación…………………………………………………..31

5. Acondicionamiento y adaptación de Cheiodactylus

variegatus…………………………...………………………32

5.1 Acondicionamiento…………………………………….32

5.2 Adaptación………………………………..…………….33

IV. Realización de las Pruebas Mediante la Técnica de Agua

Verde………………………………………..……………..……34

1. Acuarios de tratamiento………………….………………..34

2. Acuario control…………………..………………………….35

3. Parámetros físico-químicos……………………………….35

3.1 Oxígeno………………….……………………………..35

3.2 pH………………………………………………………..35

3.3 Amonio y nitritos………………...……………………..36

3.4 Temperatura……………………………………………36

4. Procedimiento/Registros por día………………………….36

3

4.1 Día 1……………………………….……………………36

4.2 Del día 2 al día 4……………………..………………..37

4.3 Día 5……………………………….……………………37

V. Análisis Microbiológicos………...…………………….……….38

1. Colimetría………………………..………………………….38

1.1 Preparación del Medio de cultivo y batería de

tubos…………………………………………………...….38

1.2 Dilución de las muestras………..…………………….39

1.3 Siembra…………………………...…………………….39

2. Conteo de colonias………………….……………………..40

2.1 Incubación 37ºC………………....…………………….40

2.2 Incubación 20ºC………………….……………………40

3. Aislamiento de Vibrio……………………………………..41

3.1 Primera siembra. Caldo APA…………..……………..41

3.2 Segunda siembra. Agar TCBS………………………..42

3.3 Citocromo oxidasa……………………..………………42

3.4 Aislamiento. Agar TSA…………………………..…….43

4. Pruebas bioquímicas………………………………………43

VI. Mediciones Morfométricas…………………………………….44

VII. Estadística…………………………...…………………..……..44

RESULTADOS………………………………………………..………………..46

1. Adaptación y aislamiento………………………………….46

2. Flujo de cultivo……………………………………….……..47

2.1 Cultivo inicial……………………………………………47

2.2 Cultivo intermedio………………………………….…..47

4

2.3 Cultivo masivo………………………………………….47

3. Factores físico-químicos…………………………………..47

3.1 Oxígeno………………………….……………………..47

3.2 pH…………………………………………….………….48

3.3 Amonio……………………………………………….....48

3.4 Nitrito………………………………………………..…..49

3.5 Temperatura………………………………………..…..49

4. Análisis microbiológicos………………………...…………49

4.1 Colimetría ………………………………………………49

4.2 Conteo de colonias……………………………..……..50

4.3 Identificación de Vibrio………………………………..50

4.4 Crecimiento y sobrevivencia………………………....51

DISCUSION…………………………………………………………………….53 CONCLUSIONES……………………………………………...………………60 REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA…..…………………………………………61 ANEXOS………………………………………………………………………..67

5

RESUMEN

Las microalgas han sido descritas como microorganismos con

capacidad purificadora y en algunos casos actividad antimicrobiana. El

género Tetraselmis es conocido por poseer dicha actividad, la cual se

puso a prueba en este trabajo mediante la técnica de agua verde, que

consiste en agregar cultivos microalgales a elevadas densidades

celulares en cultivos de diferentes organismos acuáticos, en este caso

fueron juveniles de Cheilodactylus variegatus “pintadilla”, y la especie

microalgal fue Tetraselmis contracta. El experimento contó con cuatro

acuarios de diez individuos cada uno, donde tres acuarios fueron réplicas

del tratamiento con microalgas y uno sirvió de control sin microalgas. Se

realizaron siete pruebas consecutivas en las cuales se midieron los

parámetros físico-químicos (oxígeno, pH, amonio, nitritos, temperatura) en

todas de ellas, y análisis microbiológicos en las últimas cuatro. Los

resultados mostraron poco aumento de los niveles de amonio de los

tratamientos con diferencia significativa (p<0.001) en relación al control, y

la carga bacteriana se vio reducida en mas del 50% para los valores del

tratamiento, lo cual demuestra la capacidad de esta especie microalgal de

actuar como biocontrolador de la calidad de agua en acuicultura.

6

ABSTRACT

Microalgae have been described as microorganism with purifying

and sometimes antimicrobial activity. Genus Tetraselmis is well known for

possessing such activity against bacteria, which was proved in this work

using the green water technique, this consists in adding microalgae

cultures at high cell densities on other culturing aquatic organisms, that in

this case were Cheilodactylus variegatus juveniles “pintadilla”, and the

microalgae specie was Tetraselmis contracta. The experiment had four

tanks containing ten fishes each; three of these tanks were repeated

treatments using microalgae and one were used as control without

microalgae. Seven continuous assays were made measuring physical

chemical factors (oxygen, pH, ammonium, nitrite, temperature), and

microbiological analysis were made in the last four. Results showed a

slight increase in the treatment ammonium levels with a significant

difference (p<0.001) in comparison to control, and bacteria load was

reduced in more than 50% for the treatment; this proves that this

microalgae Tetraselmis contracta is able to act as a biocontroller in water

quality.

7

INTRODUCCIÓN

Las microalgas, constituyen un grupo fotosintético heterogéneo de

distribución cosmopolita, caracterizados por habitar ambientes tanto

acuáticos como terrestres, incluyen ambientes de condiciones extremas, y

de naturaleza salobre, marina o dulceacuícola. Pueden ser procariotas

como las cianobacterias (algas verdes azules) o eucariotas (como la gran

mayoría), y su morfología varía desde organismos unicelulares con o sin

flagelo hasta las formas coloniales o filamentosas, capaces de formar a

partir de elementos simples, sustancias orgánicas complejas.

El género Tetraselmis contiene aproximadamente más de 50

especies, y sus características pueden variar según su hábitat. En su

ambiente natural pueden encontrárseles en forma solitaria de nado libre,

coloniales, aflageladas y sésiles. También pueden presentarse es estadío

de quiste, según sean las condiciones medioambientales, éstos son

esféricos y presentan una pared celular bastante gruesa de naturaleza

orgánica, que en algunos casos puede presentar ornamentaciones.

El cultivo de microalgas tuvo gran importancia para acuicultores,

biotecnólogos, ecólogos, etc. por años y durante la década de los

noventa, produciéndose cultivos en forma masiva con la finalidad de

utilizar el producto como suplemento en la dieta alimenticia para animales

(larvas de crustáceos, moluscos, peces), como fertilizantes de tierras de

cultivo o materia prima en la obtención de productos químicos (pigmentos,

lípidos, glicerol). Actualmente, la aplicabilidad de las microalgas y sus

productos ha ido en aumento, dados los avances generados por estudios

8

bioquímicos y el desarrollo de nuevos sistemas de cultivo tendientes a la

obtención de mayor producción y aprovechamiento de su biomasa, la cual

ha sido utilizada en muchos aspectos para beneficio del ser humano,

dada su riqueza en cuanto a sus constituyentes, entre los que destacan

los proteínicos y lipídicos.

El despliegue actual de la biotecnología y el desarrollo de nuevas

técnicas, se encuentra constantemente tras la búsqueda y mejoramiento

de organismos capaces de reemplazar procesos industriales sin generar

contaminación alguna. Dentro de este contexto, las microalgas, se

presentan como un grupo de organismos que, mediante un proceso

biológico, son capaces de transformar una sustancia en otra, propiedad

más conocida como biotransformación y cuyo fundamento es

precisamente la producción de ciertos compuestos mediante el empleo de

un organismo o procesos derivados a partir de éste y cuya ventaja es la

de ser menos contaminantes que los procesos químicos.

Una de las tecnologías más recientes, aplicable al cultivo de

microalgas, es la técnica del “agua verde”, empleada en cultivo de

diferentes organismos acuáticos, sobretodo en cultivos larvales, por

considerárseles la época más crítica en los cultivos acuícolas, y consiste

en la adición de cultivos microalgales de alta densidad celular a los

tanques de cultivo. Los efectos de estos microorganismos fitoplanctónicos

varían desde la estabilización de la calidad del agua en sistemas

estáticos, remoción de compuestos metabólicos, producción de oxígeno, y

control de carga bacteriana patógena. Asimismo, también se les reconoce

el efecto de estimular de manera directa el sistema inmune no específico

de la larva, debido a la presencia de polisacáridos en su pared celular;

mientras que, de manera indirecta, sirve como fuente de nutrientes a

través de las presas vivas, cuyo valor nutricional se mantiene gracias a

las microalgas, ya que por su tamaño reducido son fácilmente capturables

y digeridas por multitud de larvas y estadíos juveniles de moluscos,

crustáceos y peces.

9

El presente trabajo se basa en las propiedades anteriormente

explicadas sobre la importancia del aislamiento y cultivo microalgal,

demostrando de esta manera la capacidad de la microalga Tetraselmis

contracta como agente biocontrolador microbiano de la calidad de agua

mediante la técnica de agua verde y su rol en el campo de la acuicultura,

lo que permitiría valorar la naturaleza de esta especie nativa.

10

ANTECEDENTES

La industria acuícola viene creciendo enormemente a escala

comercial durante las dos últimas décadas y sufriendo varios cambios,

sobretodo la acuicultura de sistemas intensivos debido a su gran

relevancia. Sin embargo, los factores limitantes son principalmente la

calidad de agua, la parte económica y la disponibilidad de terreno en el

caso de sistemas extensivos. En la actualidad, adicionalmente, los

productores se ven obligados a adoptar tecnologías ambientalmente cada

vez más adecuadas, reduciendo el impacto ambiental, la descarga de

aguas y enfermedades; de esta forma, esta industria ha desarrollado

prácticas cada vez más intensivas, dentro de las cuales predominan los

sistemas de recirculación y el empleo de biofiltros que tratan de manera

interna el agua contaminada reduciendo de esta forma el recambio de

agua y la descarga (Avnimelech, 2006; Gutierrez-Wing y Malone, 2006).

Neori et al. (2007) describieron un sistema de biofiltro donde

emplean las aguas de desecho orgánico de peces como fuente de

carbono y energía para la reducción de nitratos (por procesos

microbianos), lo que resulta en una descarga casi nula y una

contaminación mínima y es capaz de ser operada por largos periodos de

tiempo manteniendo los valores dentro del rango aceptable para cultivo

intensivo. Otra alternativa es la liberación del agua con nutrientes a otro

compartimento conteniendo algas que van a asimilarlos y a su vez

suministrar materia orgánica a los peces (tilapias) que se encuentran en

ese mismo compartimento (Avnimelech, 2006). En camaroneras, se utiliza

otro método mediante el uso de un batch reactor de secuencia para tratar

las aguas de desecho, cuyo modo de operación es

aeróbico/anóxico/aeróbico logrando la nitrificación y denitrificación

11

(microorganismos Nitrosomonas, Nitrobacter, Pseudomonas) y la

remoción de carbono (Boopathy et.al., 2007).

La remoción de nutrientes, nitrógeno y fósforo, que se encuentran

en elevadas concentraciones en aguas residuales, consiste en emplear

tratamientos capaces de disminuir, a su mínima expresión, estas

concentraciones tóxicas, de modo tal, que los efluentes sean

ambientalmente inofensivos y no se alteren los ciclos bioquímicos. En

relación a ello, el uso de microalgas en tratamientos de biorremediación

de aguas residuales (de cualquier actividad humana) ha sido investigado

por décadas, quedando demostrado, por numerosos estudios, su alto

potencial y efectividad en la remoción de éstos compuestos, guardando

armonía dentro del ecosistema al no tratarse de ningún proceso químico

(Jiménez-Pérez et al. 2004; Aslan y Kapdan, 2006; Fierro et al. 2007).

Las ventajas del empleo de algas para tal propósito son; el bajo

costo operacional, la posibilidad de reciclar el nitrógeno y fósforo

asimilados en la biomasa algal como fertilizante evitando el problema de

la producción de lodo, y la descarga de efluentes oxigenados dentro de

los cuerpos de agua (Voltolina et al. 2005; Aslan y Kapdan, 2006); sin

embargo, existen también quienes opinan que la principal desventaja o

dificultad de este sistema es el elevado costo que tomaría la cosecha de

los cultivos así como la disponibilidad de un área adecuada para llevarlos

a cabo (Jiménez-Pérez et al. 2004; Fierro et al. 2007). Ante tal disyuntiva

surge el empleo de técnicas de inmovilización de microalgas en matrices

de naturaleza polimérica, que facilita la recuperación de la biomasa y

provee una mayor flexibilidad operacional (Mallick y Rai, 1993 en Fierro et

al. 2007). En tal sentido, el empleo de cuentas de alginato obtenidas de

Macrocystis pyrifera con Scenedesmus intermedius y Nannochloris sp,,

fueron mas efectivas que el empleo de cultivos de células libres

suspendidas (Jiménez-Pérez et al. 2004). Fierro et al. (2007) pusieron a

prueba la inmovilización de la microalga Scenedesmus sp con el derivado

de un biopolímero de quitina denominado quitosan, obtenido del

12

exoesqueleto de crustáceos, obteniendo resultados positivos tanto para la

inmovilización como para la remoción de nutrientes.

Estudios con ciertas macroalgas de la India han reportado gran

capacidad de remoción de amonio, como: Ulva lactuca (Chlorophyta),

Soliera robusta (Rodophyta) y Dyctiota dichotoma (Phaeophyta) (Raikar y

Wafar, 2006).

Por otro lado, las aguas residuales de origen industrial o doméstico

se ven también contaminadas por metales pesados que alteran los

ecosistemas acuáticos, constituyendo una problemática mundial por

desencadenar pérdidas en la diversidad biológica y un incremento de

compuestos tóxicos dentro de la cadena alimenticia. Diferentes técnicas

se han desarrollado para remover éstos metales tóxicos del ambiente

acuático como filtración, ósmosis inversa, precipitación química,

intercambio iónico, remoción electroquímica, entre otras. Sin embargo,

existen ciertas limitaciones al momento de ponerlas en práctica, por

ejemplo, una pobre selectividad, producción de sólidos residuales (10

veces más pesados que el propio metal), desagüe de metales iónicos

peligrosos, compuestos orgánicos que inhiban el proceso, y una baja

eficiencia para remover los metales. La biotecnología, basada en la

acción de crecimiento activo de células algales puede resolver algunas de

estas dificultades mediante la adsorción y la absorción. La biosorción de

metales pesados es una técnica relativamente nueva y es una propiedad

de cierto tipo de biomasas para enlazar y concentrar metales inclusive

estando en soluciones bastante diluídas. Este fenómeno es provocado

por la estructura de la pared celular de ciertas bacterias, hongos, y algas,

siendo estas últimas las que poseen una mayor capacidad de enlace.

Otra de las principales ventajas de la biosorción es su fácil aplicabilidad y

bajo costo (Kalyani et al. 2004; Peña-Castro et al. 2004; Alpat et al. 2007).

Kalyani et al. (2004) investigaron la adsorción de Ni (II) en el alga

parda Sargassum sp (Phaeophyta) bajo forma natural y en tratamiento

13

ácido. Los resultados mostraron una remoción del 95% para el

tratamiento natural y del 99% para el tratamiento ácido. Mientras que,

Peña-Castro et al. (2004) trabajaron con cultivos de Scenedesmus

incrassatulus sometidos a diferentes concentraciones de Cr (VI), Cd (II) y

Cu (II), individuales y en mezclas de dos o tres metales. La interacción de

Cr (VI) y Cd (II) fue positiva incrementando la remoción de ambos

metales, mas no sucedió lo mismo con el Cu (II), este metal no tuvo

ningún tipo de interacción que promueva su remoción.

Basado en las propiedades de la biosorción, Alpat et al. (2007)

desarrollaron un biosensor para mediciones voltamétricas de Cu (II)

empleando como materia prima la microalga Tetraselmis chuii. Su

excelente rendimiento representa una buena alternativa para el desarrollo

de otros biosensores.

Los pesticidas son otras sustancias tóxicas que se encuentran

también en los canales naturales de agua, como la triazina. Dentro de

este herbicida está la atrazina y la terbutrina (herbicida acuático) que

fueron sometidos a pruebas con dos microalgas de agua dulce, la

cianobacteria Synechococcus elongatus y la clorofita Chlorella vulgaris

(Gonzáles-Barreiro et al. 2006). El estudio comprobó que C. vulgaris tuvo

una capacidad de bioconcentración más alta para los dos herbicidas de

triazina que S. elongatus, especialmente con respecto a la terbutrina.

Las propiedades de las algas van mas allá de controlar índices

abióticos, como los factores físico-químicos del agua, compuestos

contaminantes de naturaleza biogeoquímica, o metales pesados; también

actúan sobre el factor biótico, debido a que presentan actividad

antimicrobiana.

La actividad antibacteriana en un organismo algal se ha reportado

desde la década del sesenta, a partir de entonces se han ailsado

14

sustancias bioactivas y farmacologicamente activas. En las microalgas,

dicha actividad se manifiesta debido a la presencia de ácidos grasos, la

producción de metabolitos intra y extracelulares y otros compuestos

bioactivos de potencial medicinal (Kellam y Walter, 1989). En las

macroalgas, esta actividad se manifiesta al someter los extractos crudos a

tratamientos con solventes. En el año 2005, trabajos realizados con

extractos de algas africanas determinó una mayor eficacia en las especies

de la división Phaeophyta (algas pardas), (Choudhury et al. 2005),

mientras que, en muestras colectadas de la costa atlántica europea, se

reportó mayor actividad antibacteriana en las algas pertenecientes a la

división Rodophyta (algas rojas) (Bansemir et al. 2005). Esta variación

puede deberse a diferentes factores, como el método de extracción, el

solvente empleado en la extracción y la temporada en la cual se

colectaron las muestras (Hornsey y Hide, 1974 en Kandhasamy, 2008)

Das et al. (2005) examinaron la producción de compuestos

bioactivos/antimicrobianos a partir de Euglenoides de agua dulce

empleando ensayos microbiológicos, y se investigaron los efectos de los

extractos orgánicos de Euglena viridis contra cepas de diferentes

patógenos de peces y bivalvos, como por ejemplo, Aeromonas hydrophila,

Pseudomonas putida, P. aeruginosa, P. fluorescens, Edwardsiella tarda,

Vibrio alginolyticus, V. anguillarum, V. harveyi, V. fluvialis, and V.

parahaemolyticus y Escherichia coli.

Kellam y Walter (1989) sometieron 132 especies de microalgas a

ensayos microbiológicos para demostrar su actividad antibacteriana,

incluyeron 9 cepas del género Tetraselmis abarcando 8 especies: T. chui,

T. marina, T. striata, T. suecica, T. impelagicus, T. hazeni, T. tetrathele y

Tetraselmis sp., quedando demostrado de esta manera la importancia de

la clase Prasinophyceae en este tipo de estudios, ya que fueron las mas

predominantes, junto a las Bacillarophyceae, en contrarrestar el

15

crecimiento bacteriano, especialmente de Staphylococcus aureus y

Bacillus subtilis.

Dicha actividad antibiótica ha sido reportada, asimismo, en

Chlorella vulgaris y diatomeas, debido a derivados metabólicos bioactivos.

En cultivos de C. vulgaris la producción de metabolitos secundarios tiene

un gran efecto sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. En las

diatomeas dicha actividad se manifiesta a partir de derivados de los

ácidos grasos. Diferentes especies de diatomeas de naturaleza

limnológca y marina han sido investigadas y reportadas como fuentes de

sustancias lipofílicas portadoras de la actividad antimicrobiana (Skulberg,

2004).

En acuicultura, gran parte de las enfermedades que afectan a

peces, bivalvos, crustáceos, y demás organismos marinos cultivables son

provocadas por bacterias patógenas, y dentro de ellas, las mas peligrosas

y dañinas son del género Vibrio, causantes de graves infecciones y

elevadas mortalidades (Pang, 2008), cuyo principal reservorio es el medio

acuático natural (Kahla-Nakbi, 2007). De este modo, bacterias como

Vibrio alginolitycus, desarrollaron estrategias de superviviencia. En el mar

bajo condiciones de estrés, principalmente en ausencia de nutrientes y

baja temperatura, la bacteria entra en un estado conocido como Viable

pero No Cultivable, lo cual significa que puede recuperarse una vez que

las condiciones óptimas se restauren, pero incluso en aquel estado

mantiene su potencial patogénico pudiendo causar infecciones en el

organismo donde se aloje (Kahla-Nakbi, 2007).

En el 2005, una mortalidad masiva atacó varios criaderos de peces

planos en Korea. Para el descubrimiento de la causa se analizaron los

individuos muertos. Todos presentaron daño en la cavidad peritoneal a

partir de los cuales se aislaron Vibrio harveyi, Edwardsiella tarda y

birnavirus marino. Posteriormente se comprobó que la mortandad se

debió a una co-infección del virus con V. harveyi o E. tarda, ya que los

16

individuos sometidos a prueba únicamente con el birnavirus marino no

presentaron mortalidad alguna (Oh, 2006). Ante la peligrosa

patogenicidad de la bacteria Vibrio harveyi y la resistencia que ha

adquirido a los antibióticos comerciales, se propone como terapia

alternativa el uso de bacteriófagos, aislados de las mismas aguas de los

cultivos larvales en cuestión, tras comprobar su efectividad en la tasa de

sobrevivencia, los cuales servirían como biocontroladores. (Vinod et al.

2006; Karunasagar et al. 2007)

Bacillus sp. fue empleado exitosamente como un probiótico en

pruebas de laboratorio logrando una sobrevivencia del 74% después de

haber enfrentado a V. harvey. Por su parte Lactobacillus casei y L.

acidophilus también han demostrado tener un comportamiento similar al

Bacillus sp. ante el mismo patógeno. (Ruangpan, 1998)

Las enfermedades bacterianas causadas por el género Vibrio en la

crianza de camarones son el principal factor limitante a nivel mundial,

principalmente los brotes de Vibrio harveyi causante de la vibriosis

luminiscente, que ha traído pérdidas catastróficas de grandes

producciones en Asia según se ha reportado. Ante esta problemática

surge una técnica relativamente nueva e innovadora, la técnica de agua

verde. Ella consiste en cultivar los individuos en aguas donde microalgas,

por ejemplo Chlorella, crecen de manera abundante y de esta manera

aprovechar su capacidad de contrarrestar el efecto de bacterias

patógenas. Algunas de las especies de microalgas que han reportado

buen rendimiento están: Tetraselmis suecica, Tetraselmis chuii, Chlorella

minutissima, Chlorella sp, Chaetoceros calcitrans, Nitzchia sp,

Leptolyngbia sp y Skeletonema costatum. (Regunathan y Wesley, 2004;

Huervana et al. 2006; Lio-Po et al. 2005; Tendencia y de la Peña, 2003;

Makridis et al. 2006).

17

Un mejor aprovechamiento del empleo de las microalgas en el

cultivo de larvas de peces marinos, se evidencia al agregarlas de manera

directa a los tanques aplicando la técnica de agua verde, o usándolas

como alimento de rotíferos. En ambos casos va a ser beneficioso debido

a la disminución del número de bacterias oportunistas y gracias a esto un

aumento en la sobrevivencia de las larvas; de forma similar actúa en el

caso de los rotíferos ya que éstos a su vez también sirven de alimento a

las larvas, por tanto una contaminación en ellos puede desencadenar

alguna enfermedad o muerte masiva de los individuos cultivados (Makridis

et al. 2006).

La técnica de agua verde es, quizás, una de las biotécnicas mas

empleadas en el control de enfermedades, demostrando resultados

promisorios, como el caso de Isochrysis galbana y su mejoramiento en la

sobreviviencia de lubina, y la incubación de la carpa con Spirulina

platensis para mejorar su sistema inmune. También están las

cianobacterias que atenúan las enfermedades bacterianas y virales al

estimular la secreción de sustancias antioxidantes, moléculas

inmunológicamente activas, y compuestos virostáticos; mientras que

Tetraselmis sp produce sustancias antibacterianas que van a proteger a

peces y camarones de los efectos perjudiciales de bacterias patógenas.

(Yeong, 2008).

El hábitat que asocia al fitoplancton con las bacterias se ha

denominado ficósfera, el cual define el área alrededor de las células

algales en donde las bacterias se ubican para alimentarse de los

productos extracelulares que éstas excretan, los cuales son en su

mayoría compuestos orgánicos con grandes proporciones de

carbohidratos y contribuyen con la cadena alimenticia microbiana. Es

importante conocer esta interacción y las relaciones interespecificas que

entre ellas pueden surgir, así como las investigaciones que demuestran

18

los fenómenos de inhibición y crecimiento en microalgas y/o bacterias.

(Riquelme et al., 2003; Sapp, 2006 )

Finalmente, la bioseguridad es y seguirá siendo parte esencial de

la producción intensiva de animales, y en este aspecto la acuicultura está

bien ubicada al mantenerse al tanto de las amezanas de enfermedades y

patógenos, así como de las metodologías de bioseguridad más eficientes

para combatir cualquier amenaza (Pruder, 2004).

19

MATERIALES Y MÉTODOS

I. Obtención de la Muestra Microalgal y su Aislamiento

1. Origen de la cepa

La muestra fue obtenida de los humedales de Puerto Viejo,

ambiente rodeado de lomas arenosas, localizado en la provincia de

Cañete, con los distritos de San Antonio y Chilca. Se encuentra entre

los 12º 33’ 14,96” - 12º 34’ 48,05”S y 76º 42’ 50,49” - 76º 41’ 53,37”O.

Dentro de las condiciones naturales en las que se encontró se

consideraron los siguientes factores: Temperatura entre 17 y 39º C, pH

de 6,5 a 10,5 y una salinidad entre 5 y 90ppm.

2. Clasificación Taxonómica

División Chlorophyta (A. Pascher, 1914)

Clase Prasinophyceae (T. Christiensen, 1962)

Orden Prasinocladales (Fritsch, 1917)

Familia Tetraselmiaceae (Stein, 1878)

Género Tetraselmis (Stein, 1878)

Especie Tetraselmis contracta (N. Carter) Butcher 1959

3. Técnicas de colección algal

20

Se emplearon las técnicas de colecta directa, tomando la muestra

con ayuda de un cucharón del mismo espejo de agua y la colecta con

red fitoplanctónica de 15µ filtrando el agua.

4. Manipulación de la muestra en laboratorio

Una vez trasladada la muestra al laboratorio se procedió a aislar

mediante diferentes técnicas para su posterior cultivo.

Cada paso que requiera llevarse a cabo se hará dentro de

condiciones estériles, tanto el material utilizado como el espacio de

trabajo.

4.1 Tratamiento del agua de mar

El agua de mar fue tratada luego de haber sido extraída de la

bahía del Callao por el sistema de bombeo y pasada por diferentes

filtros de hasta 1µ. El agua se almacenó en tanques

(envejecimiento).

Filtración al vacío:

Una vez envejecida y decantada el agua de mar tratada, se

filtra al vacío con ayuda de una bomba de vacío de 0,5 HP y un

equipo Kitasato. Los filtros utilizados son de nitrocelulosa de

0,45 y 0,22µ, pasando primero por el filtro cuyo poro es de

mayor diámetro y luego por el menor. El agua filtrada a 0,22µ

fue guardada en botellas autoclavables de borosilicato con

capacidad para 2L.

Autoclavado:

21

Para autoclavar se empleó una autoclave digital Yamato SM510

con una capacidad de 40L. Se programó el equipo para una

esterilización a 115º C por 15 minutos, evitando de esta manera

la cristalización de las sales del agua. Al finalizar (indicado por

el equipo a los 90ºC), se procedió a retirar el agua dejando

reposar al ambiente hasta que enfríe para poder utilizarla, en

caso contrario era guardada bajo refrigeración.

4.2 Limpieza y esterilización del material

El lavado del material de vidrio, sobretodo los de cultivo inicial e

intermedio como erlenmeyers de 100, 250, 500 y 1000mL, tubos de

ensayo, así como probetas, pipetas, varillas aireadoras, botellas,

beakers, etc., se realizó con Extran neutro al 5% (detergente

biodegradable de laboratorio). En casos necesarios (material muy

contaminado) se dejaba reposar por un periodo máximo de 24

horas, luego se enjuagaba con abundante agua potable para retirar

cualquier resto de detergente o residuo y finalmente con agua

destilada.

La esterilización del material se realizó en la estufa por un periodo

de 90 minutos a 130º C, después se retiraba con ayuda de guantes

protectores y una vez tibios la parte superior de los erlenmeyers,

probetas y beakers fueron cubiertos con papel aluminio y papel

kraft ; las pipetas y varillas fueron envueltas en su totalidad con

papel kraft y guardados en tubos de aluminio y los tubos de ensayo

con tapa rosca envueltos en papel krakt en paquetes de 10

unidades. Todo el material envuelto fue introducido una vez más en

la estufa por un periodo de 15 minutos para una esterilización

completa, y luego almacenados.

22

El material de plástico, como las mangueras conectoras siguió el

mismo protocolo de esterilización pero con una permanencia menor

en la estufa (sólo 30 minutos) debido a la naturaleza del material.

Al momento de su uso se limpió cada una de ellas con alcohol para

contrarrestar el punto crítico, de igual forma se procedió con las

llaves aireadoras.

4.3 Medio de cultivo

El medio de cultivo empleado fue F/2 modificado (Guillard, 1973).

(ver composición en ANEXOS)

La preparación del medio se hizo directamente en la botella de

borosilicato que contenía los 2L de agua autoclavada, a la cual se

le adicionaron tres soluciones: nitratos y fosfatos, metales traza y

vitaminas, a razón de 1mL de cada una de ellas por cada litro de

agua de mar estéril. La salinidad del medio no se modificó,

manteniéndose a 35ppm.

4.4 Adaptación de la especie

Una vez trasladadas al laboratorio las tres muestras recolectadas

se mantuvieron en una cámara de cultivo, a una temperatura que

oscilaba entre 24 y 26º C y la fuente lumínica era sólo artificial

suministrada por tubos fuorescentes de 20 Watts. Esta cámara se

encontraba dentro del Laboratorio de Microalgas, cuya temperatura

es de 18º C controlada por un sistema de aire acondicionado y la

fuente lumínica también es artificial suministrada por tubos

fluorescentes de 40 Watts.

La observación al microscopio (Leica de contraste de fases),

demostró que sólo una de las muestras contenía exclusivamente la

23

especie de interés, mientras que en las otras se encontraba junto

con Arthrospira. A pesar de eso, se procedió a sembrar una

microplaca de 6 pocillos por cada muestra madre, en la cual se

inoculó 1mL de muestra por cada pocillo conteniendo 5mL de

medio. Se trató en lo posible de retirar las células que estaban

formando columna en las muestras mediante una pipeta pasteur.

Las microplacas se mantuvieron en la cámara de cultivo designada

para este trabajo.

5. Aislamiento de la microalga

El aislamiento se realizó mediante las técnicas de dilución y lavado

celular, utilizando para ambas el mismo medio antes descrito. Este

proceso tiene como finalidad purificar la muestra obteniéndose cultivos

clonales. (Guillard, 1973; Aguilar, 1995). El trabajo de aislamiento fue

realizado bajo estrictas medidas requeridas para un ambiente estéril

bajo campana de extracción dentro de la cámara de siembra y con el

uso de guantes quirúrgicos.

5.1 Conteo

El conteo de células para conocer la densidad celular o capacidad

de carga en esta técnica y en cualquier momento que se requiera,

se realizó con una cámara de Neubauer por triplicado para obtener

un valor promedio más real. La muestra se diluyó en caso que lo

amerite para facilitar el conteo.

5.2 Técnica de dilución

24

Mediante esta técnica, la toma de inóculos cada vez más diluídos

en número de células algales va a permitir una purificación a través

de su crecimiento.

Para ello se emplearon 10 microplacas de 6 pocillos cada una

dentro de los cuales se vertieron 6mL de medio. El inóculo inicial

fue de 0,25mL del cultivo madre, tomado con ayuda de una pipeta

volumétrica de 1mL y vertido para los 10 casos en el pocillo

numero uno; es a partir de éste que se diluirá 5 veces más dentro

de los pocillos restantes, tomando la misma cantidad (0,25mL) para

ir inoculando consecutivamente. Al llegar al sexto pocillo se toma

0,25mL de la muestra inoculada y se desecha para obtener

volúmenes uniformes.

Las microplacas son rotuladas y selladas con parafilm para evitar

cualquier agente contaminante, para luego ser incubadas en la

cámara de cultivo.

5.3 Técnica de lavado de células

Mediante esta técnica la utilización de micropipetas y su acción de

capilarización permite capturar células algales individuales. A

diferencia de la técnica anterior, ésta se trabaja bajo observación

microscópica. Se coloca una gota de la muestra elegida en el

primer pocillo de una lámina excavada y tras su observación al

microscopio se trata de capturar el menor número de células en la

micropipeta para vertirlas en otras gotas de medio colocadas en los

pocillos contiguos. El continuo traslado de las células de gota en

gota a través de la micropipeta es lo que va a permitir su lavado.

Este proceso se repite indefinidas veces hasta obtener una sola

célula por gota de medio, la cual será vertida a manera de inóculo

en un tubo de ensayo de tapa rosca conteniendo 10mL de medio f2

25

fresco y estéril. Los tubos se flamearon al mechero antes de

taparlos para disminuir el riesgo de contaminación (Guillard, 1973;

Aguilar, 1995; Lee et al. 2004).

Para este caso, la técnica se repitió muchas veces hasta obtener

10 tubos inoculados con una sola célula, los cuales posteriormente,

se llevaron a incubar a la cámara de cultivo a una temperatura de

23±1°C y un fotoperiodo de 14:10 L:O, con una iluminación de

3500 Lux, siendo observados diariamente.

II. Flujo de Cultivo

Una vez obtenida la cepa se procedió a levantar el cultivo microalgal

según el flujo programado, que en este caso empezó con un cultivo inicial

de 250 y 500mL, seguido de un cultivo intermedio de 1000mL, hasta

finalizar en cultivo masivo de 10L.

Para los cultivos inicial e intermedio, el medio de cultivo empleado fue

el F2 Guillard modificado y el sembrado se realizó en la cámara de

siembra bajo campana extractora, tomando las medidas necesarias de

bioseguridad; asimismo, se mantuvo en ambos el mismo protocolo de

esterilización de agua de mar y del material de vidrio, para asegurar de

esta manera un crecimiento exitoso, optimizando el tiempo y la calidad del

cultivo.

En el caso del cultivo masivo, debido a que se trata de volúmenes

mayores, no es del todo necesario que se mantenga el mismo cuidado

que se mantuvo anteriormente; sobretodo con respecto al tratamiento del

agua de mar, la cual no fue filtrada hasta las 0,22µ ni autoclavada, sólo

fue necesario hacerla envejecer un par de semanas mas de lo establecido

26

para obtener una buena base al momento de su transformación en medio

de cultivo, que para este nivel se vio enriquecido por el fertilizante

industrial orgánico Bayfolan ®. Si bien a mayores volúmenes el grado de

esterilidad no es tan extremo, se guardó el mayor grado de limpieza e

higiene posible.

1. Cultivo Inicial

El cultivo inicial partió de cepa con un volumen de 250mL, cuyo

inóculo fueron los 10mL contenidos en el tubo de ensayo y llegó a una

concentración máxima de 104 cel.mL-1 al séptimo día. Para ello se

prepararon 2 erlenmeyers de 250mL como cultivo inicial.

A este nivel no hizo falta aireación porque todavía no se busca

alcanzar una densidad celular muy alta, basta con moverlo

periódicamente para homogenizar el cultivo. Su incubación aún se

mantuvo dentro de la cámara de cultivo. Los 250mL sirvieron de

inóculo para dos nuevos cultivos de 500mL respectivamente.

En este nuevo nivel se contaron con 2 erlenmeyers de 500mL de

cultivo, los cuales si tuvieron aireación, obteniendo su mayor

concentración en el menor tiempo posible para el inóculo de

numerosos cultivos con volúmenes cada vez mayores.

Una vez alcanzados los 500mL no se incubaron dentro de la

cámara, sino que pasaron a la sala de microalgas donde la

temperatura es de 23º C ±1 controlada por un sistema de aire

acondicionado y tiene una intensidad lumínica de 2000 Lux.

2. Cultivo Intermedio

27

El cultivo intermedio constó de una batería de 10 cultivos de

1000mL cada uno, cuyos inóculos fueron distribuidos de igual manera

y proporcionados sólo por 2 cultivos de 500mL, por ello la necesidad

de sincronizar el tiempo de crecimiento con la capacidad de carga y

calidad del cultivo.

Este nivel se mantuvo con aireación continua dentro de la sala de

microalgas bajo las mismas condiciones antes mencionadas;

esperándose lograr una densidad celular mínima de 107 cel.mL-1 en 4

días ya que constituiría la base del cultivo masivo, que es el objeto de

estudio. (Fig. 1)

3. Cultivo Masivo

El cultivo masivo constó de una batería de 4 balones de 10L y 2

erlenmeyers de 5L, donde los inóculos fueron de 2 y 1L de cultivo

intermedio respectivamente. Como se dijo anteriormente, el agua de

mar no es filtrada al vacío ni autoclavada, pero para disminuir

cualquier riesgo se vierte pasando por una malla nytal de 20µ, y

posteriormente se fertiliza con Bayfolan ® a razón de 1mL por cada 5L

de agua de mar. (Fig. 2)

Los cultivos permanecieron dentro de la sala de microalgas con

abundante aireación bajo las mismas condiciones que estuvieron

desde los 1000mL.

III. Instalación de Acuarios de Pruebas

28

Para la realización de las pruebas correspondientes, se prepararon

4 acuarios rectangulares, de los cuales 3 serían las pruebas de los

tratamientos y 1 el control; estaban hechos de acrílico de

policarbonato de ¼” de espesor y una capacidad de 120L.

1. Lugar de ejecución

Se colocaron en las instalaciones del Laboratorio de Peces Planos,

correspondiente al Laboratorio de Cultivos Marinos de la Unidad de

Acuicultura, Dirección de Investigaciones en Acuicultura, Gestión

Costera y Calidad Ambiental del Instituto del Mar del Perú.

2. Limpieza

El lavado de los acuarios se realizó con ayuda de accesorios de

limpieza (esponja verde, escobillas, etc), detergente industrial y una

manguera de agua potable con fuerte presión. También se realizó el

lavado de las mangueras conectoras, las llaves de aireación y las

piedras aireadoras

3. Especie elegida para el experimento

La especie elegida fue Cheilodactylus variegatus “pintadilla”, las

cuales fueron extraídas de su ambiente natural en la bahía del Callao

encontrándose en estado juvenil. Antes de distribuirlas se procedió a

tomar sus mediciones morfométricas para comparar al término de la

experiencia.

29

4. Instalación

Se instalaron los cuatro acuarios de manera contigua sobre una

base de PVC, luego se llenaron con agua de mar pasada por el

sistema de bombeo y los filtros de 1µ. El volumen de agua de mar

vertida fue de 100L, inmediatamente después se aireó por 2 horas

para luego colocar los individuos de Cheilodactylus variegatus,

distribuyéndolos a razón de 10 individuos por cada acuario para su

acondicionamiento y adaptación.

5. Acondicionamiento y Adaptación de Cheilodactylus variegatus

En esta etapa la especie debió aprender a reconocer su estado de

cautiverio como nuevo hábitat; lo cual tomaría 8 semanas, de las

cuales 5 fueron de acondicionamiento, es decir, se les dio el mismo

trato a los cuatro acuarios; mientras que las otras 3 semanas restantes

fueron de adaptación, simulando las pruebas que se realizarían

posteriormente e involucrarían un cambio en su medio.

5.1 Acondicionamiento

El acondicionamiento se realizó por un periodo de 5 semanas.

Durante este tiempo se les suministró 10g diarios de alimento

peletizado en dos tandas, 5g a las 11am y los otros 5g a las 4pm.

Se realizaron cambios parciales de agua durante siete días (50%)

mediante succión según la poca o abundante presencia de

desechos fecales como de alimento no digerido o en

descomposición; transcurridos los siete días se limpiaban los

acuarios, mangueras y piedras aireadoras para nuevamente

30

llenarlos con 100L de agua de mar y repetir la operación 4 veces

más. La aireación se mantuvo constante durante todo el periodo.

5.2 Adaptación

Durante este periodo de 3 semanas, el medio en que se

encontraban los peces sufrió un cambio, producido por la adición

de un 20% de cultivo microalgal con una concentración de 107

cel.mL-1 de la totalidad del volumen de agua que solía verterse

(100L).

Esta fase es similar a la de acondicionamiento en modo de

operación, en la cual se simularon las pruebas que debían

realizarse como parte de esta investigación, y se empezaron a

tomar datos sobre los factores físico-químicos. En la adaptación se

pretendió lograr individuos en buen estado que soporten

condiciones de estrés.

Los acuarios se distribuyeron de igual forma eligiendo tres de ellos

para las pruebas (tratamientos) y uno como control, el cual no

contó con la presencia de microalgas y su trato se mantuvo tal cual

había sido durante el acondicionamiento para evitar el desgaste en

vano de sus individuos. El volumen de cambio de agua diario en

este caso fue máximo de 10L, tratando de esta manera de retirar

todo resto orgánico depositado en el fondo mediante la misma

técnica de succión. Para una succión más eficaz se retiró la

aireación por tiempo máximo de una hora para permitir la caída

total de los restos suspendidos y retirar una mayor cantidad de

ellos en un mínimo volumen de agua. Otro punto variable es el

tiempo de permanencia de los peces en estas condiciones, porque

debido a los diversos factores fisicoquímicos que se tomaron en

cuenta, sólo se permitió una permanencia de 5 días.

31

IV. Realización de las Pruebas Mediante la Técnica de Agua Verde

La técnica que se empleó como base para esta investigación fue la

Técnica del Agua Verde, la cual es actualmente usada en cierto sector de

la industria acuícola y cuyo principio es el aprovechamiento de la biomasa

microalgal en el mantenimiento de diferentes cultivos. Para tal fin fue

necesario contar con cultivos microalgales de calidad y con elevadas

densidades celulares que hagan significativa su presencia en cada

tratamiento puesto a prueba ya que se vertieron en una proporción de 5:1

(agua de mar : cultivo microalgal), lo suficiente para que cumpla el rol

indicado. (Fig. 3 y 4)

Esta etapa de realización, las pruebas duraron 4 semanas continuas,

realizándose una prueba por semana, y cada prueba con una duración de

5 días, al cabo de los cuales se procedió a realizar el análisis

microbiológico de la misma y preparar nuevamente todo para la prueba

siguiente. El procedimiento fue el mismo realizado durante la época de

adaptación. No sólo se tomó en cuenta el cambio de los factores

fisicoquímicos según el transcurrir de los días, sino también los análisis

microbiológicos recogidos al final de cada prueba, ambos en combinación

y/o individualmente, permitieron evaluar el objetivo de la investigación.

1. Acuarios de Tratamiento

Los tratamientos puestos a prueba fueron hechos en repeticiones

de tres, distribuidos cada uno de ellos de la siguiente forma: 80 litros

de agua de mar más 20 litros de cultivo microalgal de Tetraselmis

32

contracta, 10 individuos de Cheilodactylus variegatus, aireación

constante, 10g de alimento peletizado diario en 2 tandas de 5g a las

11am y 5g a las 4pm, iluminación natural con aproximadamente 12

horas de luz y 12 horas de oscuridad.

2. Acuario Control

El cuarto acuario o acuario control se llenó de la misma forma que

se había venido haciendo, con 100 litros de agua de mar, aireación y

alimentación diaria. Para las 4 semanas de pruebas, el trato será el

mismo para los cuatro acuarios, esto quiere decir que, la succión diaria

de agua será máximo de 10L también para este caso, de tal manera

que se encuentren uniformemente sometidos a las mismas

condiciones para analizar y comparar posteriormente sus reacciones.

3. Parámetros fisicoquímicos

Todos los parámetros fisicoquímicos se midieron diariamente antes

de succionar el fondo por el número de días que duró cada tratamiento

con ayuda de equipos y kits.

3.1 Oxígeno

El oxígeno se midió empleando un Oxímetro SCHOTT®. Una vez

calibrado, se introdujo en cada uno de los acuarios. Para esto fue

preferible cortar la aireación para obtener valores más cercanos a

la realidad y mantener el bulbo lejos de la piedra aireadora.

3.2 pH

33

El pH fue medido con ayuda de un Potenciómetro Mettler Toledo®.

Una vez calibrado con una solución neutra de pH 7 se tomaron los

datos evitando que el bulbo choque con el fondo donde se

encontraban todos los restos orgánicos. Se midió de igual forma

que el oxígeno, con la diferencia de que después de cada medición

se limpiaba el bulbo para calibrar nuevamente antes de pasar al

siguiente tratamiento, asegurando valores más confiables.

3.3 Amonio y Nitratos

Ambos fueron medidos empleando 1 kit Sera® para cada fin, en el

cual se tomaban 5mL de la muestra de agua para añadirle 3

diferentes reactivos indicadores, luego de 5 minutos se dió lectura

del resultado en la tabla de valores.

3.4 Temperatura

La temperatura se midió usando un termómetro de campo, cuyo

rango iba de -10 a 120º C. Esta temperatura era generalmente

confrontada con la temperatura indicada en el potenciómetro y el

oxímetro para tener mayor exactitud.

4. Procedimiento/ Registros por día

4.1Día 1

Se lavó los acuarios, mangueras y piedras aireadoras antes de

instalar el sistema de tratamiento. Una vez limpio se instalaron

como se explicó anteriormente, 3 acuarios del mismo tratamiento

con cultivo microalgal y un acuario control sin tratamiento

microalgal. Inmediatamente después se midieron los parámetros

34

fisicoquímicos y se sacó una muestra del agua de mar para su

análisis microbiológico, para saber en que condiciones ingresó.

Estas actividades se realizaron en el transcurso de la mañana, así,

una vez listos, se dejaron reposar una hora a los peces antes de

alimentarlos para que se relajen, ya que la manipulación de

haberlos retirado y vuelto a colocar en su lugar les causa cierto

nivel de estrés.

4.2 Del día 2 al día 4

Durante los 3 días siguientes la rutina fue la misma. Lo primero que

se hizo fue cortar la aireación para tomar los parámetros

fisicoquímicos de los 4 acuarios, mientras que, también se

aprovechó para que decanten los restos orgánicos que se

encontraban suspendidos en la columna de agua. Al transcurrir

aproximadamente una hora se realizaba la limpieza de los

acuarios; primero se succionaban para remover la mayor parte de

desechos procurando no sobrepasar los 10L y luego con ayuda de

una malla pequeña se retiraban manualmente algunos restos que

hubieran quedado flotando, o natas de grasa producidas por el

alimento. Una vez retirada la mayoría de desechos se reponía el

volumen de agua de mar extraído y la aireación.

Luego de aproximadamente una hora se alimentaban con la

primera ración del día (5g) y 5 horas después con la segunda

ración (5g).

4.3 Día 5

Durante el último día el procedimiento fue el mismo para tomar los

parámetros fisicoquímicos, e inmediatamente después se tomó una

35

muestra de agua de cada uno de los acuarios para su análisis

microbiológico.

La limpieza del quinto día fue completa, se vació todo el contenido

de los acuarios y se llenaron con agua de mar. Permanecieron así

por 2 días mientras se procesaban las muestras obtenidas, luego

se volvía a preparar todo para la prueba siguiente.

V. Análisis Microbiológicos

1. Colimetría

Este análisis permite determinar la contaminación fecal de las

muestras por parte de enterobacterias, coliformes y coliformes fecales,

bacterias entero patógenas termotolerantes como la E. coli

principalmente, y determinar el grado de contaminación según la

presencia de gas en el cultivo.

El análisis de colimetría se hizo siguiendo la metodología del

Número Más Probable, NMP APHA, 1992. El NMP es una estrategia

eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente

cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es

factible. La técnica se basa en la determinación de presencia o

ausencia (positiva o negativa) en réplicas de diluciones consecutivas

de atributos particulares de microorganismos presentes en la muestra.

Cada paso del procedimiento descrito a continuación se realizó en

ambientes estériles.

1.1 Preparación del Medio de Cultivo y batería de tubos

36

El medio empleado fue el Caldo Lauryl Sulfato (ver composición en

ANEXOS). En un erlenmeyer de 1000mL se preparó 35.6 g del

medio y se enrasó hasta 1000mL con agua destilada. Agitando

constantemente y con ayuda de una bagueta se trata de disolver el

medio lo mayor posible hasta lograr un aspecto claro sin grumos.

Luego se sirvieron 10mL de medio en 36 tubos de ensayo sin tapa,

cada tubo contenía una campana de Durham como parte de la

metodología, donde se observaría la presencia de gas en el caso

que hubiera. Con el fin de evitar falsos resultados se debió

asegurar que ningún tubo contenga burbuja alguna dentro de la

campana, ya que al momento de le lectura podría prestarse a una

mala interpretación del resultado. Finalmente los tubos se taparon

con algodón (lo cual permite el intercambio gaseoso) y se

autoclavan a 121º C durante 15 minutos.

1.2 Dilución de las muestras

Cada una de las muestras (M1, M2, M3, M4control) de agua fue

sometida a 3 diluciones como parte de la metodología empleada,

de esa forma obtuvimos las muestras por triplicado: M1-1, M1-2, M1-

3; M2-1, M2-2, M2-3; M3-1, M3-2, M3-3; M4c-1, M4c-2, M4c-3.

La dilución fue hecha en agua de mar estéril para no alterar la

naturaleza de la muestra.

1.3 Siembra

La siembra se realizó en réplica de tres para cada dilución.

Cada una de estas diluciones tuvo una réplica de tres:

Muestra 1: 3 tubos con 3 diluciones. Inóculo 1mL

Muestra 2: 3 tubos con 3 diluciones. Inóculo 1mL

37

Muestra 3: 3 tubos con 3 diluciones. Inóculo 1mL

Muestra 4 (control) : 3 tubos con 3 diluciones. Inóculo 1mL.

Una vez finalizada la siembra se agitaron suavemente los tubos

para homogenizar el inóculo en el medio y se incubaron a 37º C por

24 horas.

2. Conteo de colonias

Para el conteo de colonias se preparó una batería de 20 placas de

Agar Play Count y 20 placas de Agar Marino (ver composición en

ANEXOS)

La siembra se hizo por difusión con el asa Dragasky. Las muestras

de diluyeron 2 veces (M-2) para realizar la siembra de la siguiente

manera:

2.1Incubación a 37º C

Agar Play Count:

Se sembaron 2 placas de Agar Play Count para cada dilución

de la muestra.

Agar Marino:

Se sembraron 2 placas de Agar Marino para cada dilución de la

muestra.

2.2 Incubación a 20º C

Agar Play Count:

Se sembaron 2 placas de Agar Play Count para cada dilución

de la muestra.

38

Agar Marino:

Se sembraron 2 placas de Agar Marino para cada dilución de la

muestra.

De esta forma obtuvimos 2 réplicas de placas para observar el

comportamiento a diferentes grados de incubación ya que se trató de

bacterias marinas. El recuento de colonias de cada una de las

diluciones, y se hizo mediante observación directa de la placa

aplicando la siguiente fórmula:

UFC = #colonias x FD-1 x 1/Vol total

Donde: # colonias, es la cantidad de colonias presentes en la placa

FD, es el factor de dilución de la muestra

Volumen total, es el volumen del inóculo

3. Aislamiento de Vibrio a partir de las muestras

Vibrio es el género bacteriano blanco en esta etapa de la investigación

debido a sus efectos patológicos que son actualmente bastante conocidos

en el ambiente acuícola.

3.1 Primera siembra. Caldo APA

La siembra en caldo APA (ver composición en ANEXOS) fue el

primer paso a seguir en el aislamiento de Vibrio. La preparación

del medio se hizo con un día de anticipación, con agua destilada y

se separó en 4 erlenmeyers de 200mL, conteniendo cada uno

45mL de caldo, luego se autoclavó a 121º C por 15 minutos.

39

La siembra se realizó directamente de la muestra obtenida el quinto

día de prueba, en una proporción de 1:1, es decir, se agregaron

45mL de cada muestra pura en los 45mL de caldo.

Este cultivo de dejó incubar a temperatura ambiente de 22º por 24

horas, tiempo suficiente para observar la aparición de una nata

superficial, la cual debería contener dicha bacteria.

3.2 Segunda siembra. Agar TCBS

El agar TCBS (ver composición en ANEXOS) es específico para el

crecimiento de Vibrio. Se prepararon 10 placas un día antes y se

mantuvieron en refrigeración hasta el día de su uso.

La siembra se realizó bajo campana de extracción y con mechero

prendido para reducir cualquier riesgo de contaminación. Se tomó

una asada de la nata superficial contenida en el caldo APA y se

sembró mediante estrías. Se sembraron 2 placas por muestra,

obteniendo finalmente 8 placas las cuales se incubaron a 37º C por

24 horas.

3.3 Citocromo Oxidasa

Una vez transcurrido el tiempo de incubación se leyeron las placas

de TCBS para identificar las colonias amarillas o verdes solitarias y

realizar la prueba de citocromo Oxidasa.

Esta prueba consistió en tomar 1 banda indicadora Bactident ®

Oxidase (ver composición en ANEXOS), en la cual se colocó una

mínima porción de la colonia elegida con ayuda del asa de siembra,

evitando el contacto del asa con la banda. La reacción positiva

40

significó la aparición de una mancha violeta azulada al contacto con

la colonia.

3.4 Aislamiento en Agar TSA

El agar TSA permite mantener la cepa obtenida por periodos de

tiempo prolongados (ver composición en ANEXOS)

El medio se preparó un día antes con una concentración de NaCl al

3%, separándolo en viales con 8mL de medio cada uno, luego se

autoclavaron a 121º C por 15 minutos. Al finalizar el esterilizado se

dejaron a temperatura ambiente dentro de la cámara de siembra en

plano inclinado para que solidifique.

La siembra se realizó directamente de la colonia elegida tan pronto

como se supo el resultado positivo de la prueba de citocromo

oxidasa. La técnica de sembrado fue mediante estrías. Finalmente

se rotuló la cepa y se sella con parafina para evitar cualquier

intercambio de gases.

4. Pruebas Bioquímicas

Las pruebas bioquímicas realizadas para la identificación de la

especie fueron las siguientes: Simmons Citrate Agar, Lysine Iron Agar,

SIM Médium (Sulfuro, Indol y Motilidad), Triple Sugar Iron (Lactosa,

sacarosa, glucosa), Hugh y Leifson (Oxidación/Fermentación), y

crecimiento en diferentes concentraciones de NaCl, TSB 3%, TSB 6%

y TSB 10%. (ver composición de los medios en ANEXOS)

La batería de pruebas se prepararon con un par de días de

anticipación. Un día antes de la siembra la cepa debió ser activada en

medio TSB al 3% de NaCl. Una vez activada la cepa después de 24

41

horas de incubación al 37º C se procedió a realizar las pruebas,

mediante siembra en estría o hincando el medio según corresponda.

VI. Mediciones Morfométricas

Los 40 individuos de Cheilodactylus variegatus que se instalaron a

razón de 10 por cada acuario se pesaron en una balanza digital y se

midieron con un ictiómetro para obtener su peso y talla antes de ser

sometidos al experimento y al final de este y poder comparar el

crecimiento y sobrevivencia que presentaron a lo largo de este tiempo

entre los que se encontraban bajo efectos del tratamiento y los de control.

VII. Estadística

El procesamiento de los datos obtenidos se realizó mediante el

programa estadístico SYSTAT ®. La diferencias significativas de los

parámetros del agua entre tratamiento y control fueron determinadas

mediante la prueba t-studen con corrección de Bonferroni. Previamente se

evaluó la normalidad de los datos con el test de Lilliefors y se realizó la

transformación de datos en caso que fuera necesario.

La metodología se encuentra a continuación representada

gráficamente en un flujograma, donde se muestra la secuencia de

actividades detallando brevemente lo que se realiza en cada etapa.

42

Obtención de muestra

Origen: Puerto Viejo Método: Colecta Directa Especie: Tetraselmis contracta

Adaptación: A condiciones de laboratorio Al medio de cultivo

Aislamiento Dilución

Lavado celular

Cepa

Flujo de cultivo:

Inicial

Intermedio

Masivo

Instalación de acuarios:

Acondicionamiento

Adaptación de individuos

(parámetros fisicoquímicos)

Pruebas: Técnica de agua verde

Toma de datos:

Fisicoquímicos diarios

Microbiológicos al final de la prueba

Análisis microbiológicos:

Colimetría

Recuento de colonias

Determinación de Vibrio

Obtención de resultados

43

RESULTADOS

1. Adaptación y aislamiento

Las microplacas sembradas con inóculo directo de la muestra madre

se mantuvieron en incubación hasta observar cambios que indiquen su

crecimiento. Transcurridos 30 días se hizo la observación microscópica, y,

efectivamente, el mejor crecimiento se observó en la microplaca

proveniente de la muestra madre casi pura del género Tetraselmis, la cual

sirvió para realizar el aislamiento algal, así como para mantener un cultivo

unialgal de 250mL mientras no se obtenían resultados.

Morfológicamente se observaron que células elipsoidales y/o

cilíndricas y algo aplanadas con una longitud de 7µ ±1, presentan 4

flagelos los cuales emergen a través de un poro ubicado en el extremo

apical de la célula, formando una depresión en la pared celular, y su

longitud es ligeramente mas pequeña que la longitud de la célula. (Fig. 5)

De las dos técnicas de aislamiento, ambas dieron resultados en

tiempos diferentes. De los 10 tubos inoculados con 1 célula cada uno, 6

dieron positivos (60%), es decir, al cabo de 45 días de incubación se

evidenció el crecimiento de la nueva cepa, a partir de la cual se

desarrollará el flujo de cultivo y se mantendrá la cepa como parte del

Banco de Germoplasma Algal del Laboratorio de Biotecnología Acuática.

La técnica de dilución también dio resultados positivos en las 10 placas

multipocillos (100%) en menor tiempo, en sólo 15 días ya se observó un

ligero crecimiento; pero se prefirió trabajar con la obtención de cepa

mediante lavado celular. La cepa obtenida fue codificada como IMP-LBA-

001.

44

2. Flujo de cultivo

2.1 Cultivo inicial

Los cultivos de 250mL alcanzan una concentración promedio de

104 cel.mL-1 después de 7 días de incubación. A partir de éstos se

siembran 2 cultivos de 500mL que alcanzan en 5 días una

concentración promedio de 106 cel.mL-1 .

2.2 Cultivo intermedio

Los 10 cultivos alcanzan una concentración promedio de 107

cel.mL-1 transcurridos 3 días desde su siembra.

2.3 Cultivo masivo

Los balones alcanzan una concentración promedio de 107 cel.mL-1

transcurridos 3 días desde su siembra.

3. Factores Físico-químicos

Los resultados de la variación de los factores físico-químicos durante

las siete pruebas realizadas en que se tomaron los datos se detallan a

continuación y se represen en curvas, donde los valores simbolizan la

media y las barras el error estándar. La curva de tratamientos representa

el promedio de datos de las tres réplicas.

3.1 Oxígeno

La Figura 6 representa la curva de variación de los valores de

oxígeno tanto para los tratamientos como para el control. En ella se

indica las concentraciones de oxígeno disuelto en mg/L por cada

día mientras duró la prueba. La curva que indica la variación de los

tratamientos contiene los siguientes valores en orden cronológico:

45

5.65; 6.02; 5.78; 5.79; 5.48; mientras que para el control fueron:

5.5; 5.56; 5.57; 4.81; 4.77; datos expresados en mg/L. El último día

existe una diferencia de 0.71 entre ambas curvas que favorece a

los tratamientos. Los datos recopilados durante el experimento que

originan los valores de cada uno de los puntos se detallan en la

Tabla 1.

3.2 pH

La curva de variación para los valores de pH del tratamiento y el

control se ilustran en la Figura 7, donde el tratamiento obtuvo los

siguientes valores en orden cronológico: 7.71; 7.77; 7.87; 7.86;

7.85; mientras que para el control fueron: 7.70; 7.66; 7.79; 7.71;

7.82. Ambas curvas tuvieron un desarrollo paralelo, con una

diferencia final de 0.033 entre ellas. Los datos recopilados durante

el experimento que originan los valores de cada uno de los puntos

se detallan en la Tabla 2.

3.3 Amonio

El aumento del amonio para ambos casos esta representado por la

Figura 8. Para este caso, el resultado mostró una diferencia

significativa (p<0.001) al quinto día del tratamiento donde la

concentración de amonio en el agua para el control fue mas del

doble de la concentración de los tratamientos. Los valores para la

curva de tratamiento fueron cronológicamente: 0.003; 0.022; 0.027;

0.028; 0.032; y para el control: 0.003; 0.016; 0.027; 0.028; 0.0328;

datos expresados en mg/L. El comportamiento de la curva control

evidencia claramente el despliegue en sus concentraciones de

amonio a partir del tercer día de prueba. Los datos recopilados

durante el experimento que originan los valores de cada uno de los

puntos se detallan en la Tabla 3.

46

3.4 Nitrito

Los valores de nitrito para ambas curvas, tratamiento y control, se

ilustran en la Figura 9. En ella se aprecia un aumento moderado y

casi paralelo en los dos casos hasta el cuarto día, a partir del cual

se dispara la curva control notablemente alcanzando valores

mayores en un 44.4% al de los tratamientos. Los valores de la

curva de tratamiento cronológicamente fueron: 0.10; 0.25; 0.50;

0.69; 0.76; y para el control: 0.10; 0.15; 0.31; 0.44; 1.71; datos

expresados en mg/L. Los datos recopilados durante el experimento

que originan los valores de cada uno de los puntos se detallan en

la Tabla 4.

3.5 Temperatura

La temperatura fue el factor mas constante, la variación entre

tratamientos y control no mostró mayor diferencia, lo que se puede

observar en la Figura 10, donde los valores para la curva de

tratamientos fueron cronológicamente: 18.65; 19.82; 20.33; 20.28;

20.29; y para el control: 18.75; 19.90; 20.37; 20.38; 20.40; datos

expresados en grados centígrados (ºC). Los datos recopilados

durante el experimento que originan los valores de cada uno de los

puntos se detallan en la Tabla 5.

4. Análisis Microbiológicos

4.1 Colimetría

El análisis de colimetría tuvo resultados negativos para todas las

pruebas. La formación de gas en la campana de Durham,

acompañada de turbidez, indica la presencia de coliformes,

47

característica que no se encontró en ninguno de los tubos a través

de todo el experimento, por lo cual se presume que el agua estuvo

libre de concentraciones significativas de coliformes totales, valor

que se expresa como <30UFC para todos los casos.

4.2 Conteo de colonias

La Figura 11 muestra el crecimiento bacteriano en dos diferentes

agares (Plate Count y Agar Marino) a una temperatura de

incubación de 37º C para los tratamientos y para el control. La

máxima carga bacteriana alcanzada por los tratamientos fue de

13.2 x 104 UFC.mL-1 y 12.4 x 104 UFC.mL-1; mientras que para el

control fue de 29.3 x 104 UFC.mL-1 y 27.3 x 104 UFC.mL-1 para el

Agar Marino y Plate Count respectivamente.

La Figura 12 muestra el crecimiento bacteriano en dos diferentes

agares (Plate Count y Agar Marino) a una temperatura de

incubación de 20º C para los tratamientos y para el control. La

máxima carga bacteriana alcanzada por los tratamientos fue de

13.4 x 104 UFC.mL-1 y 11.2 x 104 UFC.mL-1; mientras que para el

control fue de 29.8 x 104 UFC.mL-1 y 28.4 x 104 UFC.mL-1 para el

Agar Marino y Plate Count respectivamente.

Los valores se presentan en promedios, tanto para los tratamientos

(1,2,3) como para el control para una mejor observación.

4.3 Identificación de Vibrio

Transcurrido el tiempo de incubación se dio lectura a las placas de

TCBS, que fueron sembradas a partir del caldo APA, mediante

observación directa de la placa. Se identificaron de 3 a 4 colonias

color amarillo y en algunos casos verdes, circulares con un

48

diámetro aproximado de 2mm y que se encuentren solitarias para

cada muestra. (Fig. 13)

La prueba de citocromo oxidasa se llevó a cabo con las colonias

elegidas de cada placa. Todas las colonias elegidas dieron como

resultado citocromo-oxidasa positivos.

Las pruebas bioquímicas realizadas para corroborar la presencia

de esta bacteria tuvieron los siguientes resultados para todas las

cepas aisladas:

Simmons Citrate Agar: Positivo K/K (alcalinidad)

Lysine Iron Agar: Positivo

SIM: Positivo para Motilidad e Indol, negativo para H2S.

Triple Sugar Iron: negativo K/A (alcalinidad/acidez)

Oxidación/Fermentación: Ambas pruebas reaccionaron, tanto

en presencia como en ausencia de oxígeno.

Concentración de sales al 0%: No hubo crecimiento

Concentración de sales al 3%: Hubo crecimiento

Concentración de sales al 6%: Hubo crecimiento

Concentración de sales al 10%: No hubo crecimiento

La coloración Gram mostró que se tratan de bacterias Gram

negativas.

5. Crecimiento y sobrevivencia

La Figura 14 indica el crecimiento en talla (cm) de los individuos de los

cuatro acuarios durante las siete semanas de pruebas, donde los tres

primeros corresponden a los tratamientos y el cuarto al control. Al inicio

del trabajo los individuos presentaron tallas promedios de 12.84, 13.21,

49

13.29, 13.33 cm respectivamente para cada acuario. La talla promedio

alcanzada para los tratamientos fue de 15.81, 15.90, 16 cm para cada

acuario respectivamente, mientras que el cuarto acuario control alcanzó

una talla promedio de 13.79.

La Figura 15 indica el crecimiento en peso (g) de los individuos de los

cuatro acuarios durante las siete semanas de pruebas, donde los tres

primeros corresponden a los tratamientos y el cuarto al control. Al inicio

del trabajo los individuos presentaron tallas promedios de 31.12, 32.29,

33.30, 33.13g respectivamente para cada acuario. La talla promedio

alcanzada para los tratamientos fue de 49.85, 49.59, 50.32g para cada

acuario respectivamente, mientras que el cuarto acuario control alcanzó

una talla promedio de 33.39.

Los resultados se muestran en valores promedios. Para mayor detalle

de los datos individuales ver Tablas 6 y 7.

Al final del experimento se determinó una taza de supervivencia del

70% para el control y de 100% para los tratamientos, ya que durante las

pruebas murieron 3 individuos del cuarto acuario.

50

DISCUSION

La microalga Tetraselmis contracta demostró una buena

adaptación a las condiciones de laboratorio, sobretodo en un inicio y en

cultivos de menor volúmen, lo que resultó muy útil para poder realizar el

aislamiento.

Si bien los resultados de ambas técnicas de aislamiento se dieron

en tiempo diferentes, se prefirió esperar a obtener los resultados de la

técnica de lavado de células debido a la calidad de cepa que se obtiene,

garantizando un buen desarrollo y aprovechamiento de su biomasa.

Como es sabido, cualquier variación en la actividad biosintética de las

células está influenciada por el origen y tipo de clones a partir de los

cuales si inició el cultivo, así como de las condiciones en que se

mantengan (Skulberg, 2004).

Los cultivos de mayor escala se adaptaron lentamente a las

condiciones de laboratorio; tras un buen manejo dela cepa, se logró un

comportamiento ideal, óptimo para la realización del flujo de cultivo tal

cual se había planificado. Esta característica es un factor importante y

requisito crítico para cultivar de manera comercial, las microalgas deben

ser una conexión entre estabilidad y productividad alta (Skulberg, 2004).

Para aplicar la técnica de agua verde fue necesario contar con

densidades celulares elevadas como mínimo de 107 cel.mL-1 para que se

logre evidenciar la propiedad antibacteriana principalmente por medio de

la producción de substancias que mitiguen estos microorganismos, dentro

de las cuales el género Tetraselmis ha sido extensamente descrita como

una microalga con capacidad inhibitoria de bacterias, fenómeno

considerado como natural.

51

Los productos extracelulares de las microalgas han sido, desde

tiempo atrás, un objetivo importante en la investigación ficológica. Ciertos

metabolitos son generalmente producidos durante la fase estacionaria de

crecimiento de un cultivo de microorganismos cualquiera, y son más

conocidos como metabolitos secundarios, constituyendo algunos de los

productos biotecnológicos más importantes de la humanidad (Skulberg,

2004). Sin embargo, el efecto antibacteriano de la microalga Tetraselmis

contracta, y de otras especies, no está del todo esclarecido, si bien es

cierto que se debe a la secreción de sustancias extracelulares, quepa

también la posibilidad de que se trate de otros mecanismos de interacción

bacteriana. Situándonos en el hecho de que, para el presente caso, el

efecto antibacteriano se deba a la producción de metabolitos, los cultivos

se cosecharon al día siguiente del término de fase Log, es decir, con 24

horas de permanencia en la fase estacionaria, tiempo suficiente para

obtener el producto deseado, y, a su vez, gozar de un cultivo joven, factor

importante considerando que luego pasarían a estar estancadas y

sometidas a condiciones totalmente diferentes como parte del

experimento.

Las algas por su naturaleza autótrofa son empleadas en

biorremediación de aguas residuales y como filtros biológicos en diversos

cultivos acuícolas, debido a que van a consumir los productos de la

actividad metabólica como fuente de nutrientes, entre ellos los

compuestos derivados del nitrógeno que son los que mayor problema

representan en la industria.

De todos los factores físico-químicos considerados, los niveles de

amonio presentaron una diferencia significativa entre los tratamientos y el

control (p<0.001). Una elevada concentración de amonio indica grado de

contaminación del agua causando intoxicación y muerte de los

organismos cultivados. Como se mencionó anteriormente, las microalgas

tienen la propiedad de remover este compuesto tóxico del medio debido a

52

que lo absorve de manera natural como nutriente para realizar su propia

actividad metabólica. Su desempeño en este experimento fue positivo,

pero según Voltolina et al. (2005) analizaron su rol en biorremediación

como purificadora de aguas, afirmando que aunque se les considera

como eficientes removedores, esta actividad es causada sólo en parte por

la toma natural de nutrientes y su empleo en la síntesis de nueva

biomasa; mientras que, su actividad fotosintética es la que juega un rol

mucho más importante en los cambios químicos en el agua. Para la

remoción de compuestos nitrogenados mediante microalgas deben

tenerse en cuenta factores ambientales como luz, pH y disponibilidad de

fuentes de carbono (Fierro et al., 2007), que en este caso estuvo limitado

con respecto a la iluminación, ya que por motivos logísticos, el

experimento contó sólo con la luz natural del día que a su vez fue limitada

al encontrarse bajo techo; la luz artificial no fue utilizada en ningún

momento del día, por tanto es probable que la actividad fotosintética se

haya visto limitada, lo que se refleja en los valores reportados.

Dentro de los demás parámetros tomados en cuenta, también se

encontraron diferencias entre la presencia de agua verde y el control con

una tendencia favorable hacia los tratamientos, aunque no hayan sido

estadísticamente significativas. Los niveles de oxígeno, aunque

diferentes, se mantuvieron dentro de los márgenes aceptables (sobre los

4mg/L) y no variaron mucho en relación a la concentración con la cual

ingresó de forma directa del mar. Si bien otra de las cualidades atribuidas

a las microalgas es la producción de oxígeno tomando como fuente el

CO2, cabe resaltar que los valores que mostraron fueron superiores al

control, y, aunque no fueron significativos, es necesario tener en cuenta la

presencia de bacterias que también van a consumir el oxígeno presente,

así como el hecho de que no había una iluminación buena ni constante

que permita la misma actividad fotosintética que tuvo al ser cultivada

como se mencionó anteriormente.

53

Con respecto al nitrito, es otro factor cuyos valores fueron

favorables para los tratamientos. Este compuesto se forma como producto

intermedio en el proceso de descomposición de las heces. Es importante

mencionar que dentro de las bondades de la técnica de agua verde, está

el hecho de que proporciona un ambiente amigable para el pez, larvas o

cualquiera que sea el organismo que se cultive, dando cierto grado de

turbidez que les permite, paradójicamente, ver mejor y orientarse dentro

del medio, reduciendo el nivel de estrés. Esta característica relaciona de

manera directa el nivel de contaminación con la presencia de heces, dado

que la ingesta de alimento fue mucho mayor en los tratamientos que en el

control, aumentando de esta manera la concentración de nitrito en el

medio; esto debió elevar los niveles de amonio en el medio, sin embargo

no fue así gracias a la presencia de microalgas y su efecto purificador.

La reducción de carga bacteriana fue el principal blanco de esta

investigación, conociendo la naturaleza de la especie microalgal. Dentro

del amplio espectro de diversidad bacteriana se optó por un mayor

enfoque a contrarrestar la presencia de Vibrio por varios motivos, dentro

de ellos está la literatura que afirma y confirma mediante diversos

estudios citados anteriormente que el género Tetraselmis posee actividad

antibacteriana específica contra este grupo de bacterias, y por otro lado

está el hecho de que se trata de una bacteria patógena responsable de

grandes pérdidas económicas en la industria acuícola al ser causante de

graves enfermedades. (Vinod et al. 2006; Karunasagar et al. 2007)

Si bien los resultados cualitativos demuestran la presencia de

Vibrio tanto en los tratamientos como en el control, no es tan simple como

parece. Es necesario analizar la bibliografía para interpretar los resultados

de recuento de colonias y la taza de mortandad, y así, dar cuenta de la

importancia de la presencia de Tetraselmis en la calidad micribiológica del

agua.

54

Las placas de conteo de colonias de los tratamientos en relación al

control revelaron una disminución considerable en la carga bacteriana en

general de los tratamientos en relación al control. Aunque no podemos

afirmar que esa reducción sea exclusivamente de Vibrio, ya que el conteo

de colonias se hizo en Agar Plate Count y Agar Marino que permiten el

crecimiento de cualquier microorganismo, se puede deducir que

efectivamente hubo una disminución de este grupo de bacterias.

No existe un protocolo para la determinación y cuantificación de

Vibrio en estos casos. Regunathan et al. (2004) emplearon una técnica

similar a la empleada en este trabajo, sembrando directamente la muestra

en agar TCBS específico para Vibrio, y asumiendo de esta forma su

presencia en la formación de cualquier colonia amarilla o verde. Como se

sabe, los agares específicos favorecen el crecimiento de ciertas bacterias

e inhiben el crecimiento de otras, mas no es 100% confiable ya que el

comportamiento de estos microorganismos es variable y pueden ser

capaces de desarrollar inclusive en medios no esperados. La técnica

empleada para la determinación de Vibrio en esta investigación, necesitó

un enriquecimiento previo de dicha bacteria, que garantice su presencia al

momento de pasar al agar, de lo contrario, el cambio brusco de su medio

natural al medio de cultivo puede provocar que no se manifieste,

originando falsos resultados. Es debido a esto que no se puede cuantificar

su presencia, ya que el caldo de enriquecimiento promueve no sólo su

vitalidad, sino también su proliferación.

Investigaciones in Vitro sí pueden obtener resultados cuantitativos

mas reales. Es por ello que la mayoría de pruebas sobre este tema se

realizan en laboratorio, con ensayos microbiológicas y muestras traídas

de campo en el mejor de los casos, o si no, se simulan preparando agua

contaminada con bacterias ya codificadas (Lio-Po et al. 2005). Estos

resultados son válidos aunque muchas veces en la realidad no se

obtienen los mismos resultados que en laboratorio por diferentes factores.

55

Lio-Po et al. (2005) aisló diferentes bacterias de tanques de camarones y

tilapias, y obtuvo una cepa de V. harveyi de manera comercial para probar

su inhibición por parte de microalgas (obtenidas de una colección

ficológica de laboratorio) y de las mismas bacterias que actuarían como

probióticos. Empleó el método de co-cultivo inoculando V. harveyi a un

caldo bacteriano de cada una de las bacterias aisladas, y luego del tiempo

de incubación lo llevó a placa para el recuento de colonias, el medio

empleado fue agar nutritivo con 1.5% de NaCl, asumiendo el crecimiento

de cualquier colonia como Vibrio. Este método le permitió cuantificar,

aunque no se puede descartar la presencia de otras bacterias al momento

del recuento por la naturaleza misma del agar.

Para obtener resultados más certeros sobre la autenticidad de

Vibrio se realizaron pruebas bioquímicas, que nos aseguraron que se

trata de dicho género, y aunque no se puede afirmar con exactitud la

especie, los resultados obtenidos indican que podría tratarse de Vibrio

alginolyticus por haber sido reportado anteriormente en la zona del Callao

de donde se obtuvo el agua de mar.

Para comprender mejor el fundamento de la técnica de agua verde

y la actividad antibacteriana de las microalgas, es necesario conocer la

relación que existe entre ellas y las bacterias, la cual no es precisamente

antagónica en todos los casos. La actividad antibacteriana es la que se

refleja al momento de realizar los ensayos, pero no es exclusivamente por

la producción de compuestos extracelulares; puede deberse también a la

composición bioquímica de los ácidos grasos presentes en cada célula,

donde aquellos que contengan mas de 10 átomos de carbono en su

estructura van a producir la lisis del protoplasto bacteriano. En este caso,

es bastante conocida la naturaleza del género Tetraselmis, ya que es

empleada como alimento vivo por su alto valor nutricional y su riqueza

lipídica. Otra teoría es que dicha capacidad inhibitoria es provocada por

bacterias asociadas a ellas mismas, y esto se apoya en que la mayoría de

56

estudios se han hecho con cultivos no axénicos, en donde existiría una

interrelación entre microalgas y bacterias (Riquelme et al. 2003)

De esta forma, los microorganismos evolucionan desarrollando

mecanismos de producción de sustancias con actividad antibiótica,

manteniendo así la dinámica y estructura de las poblaciones bacterianas

en los microambientes algales (Riquelme et al., 2003).

57

CONCLUSIONES

El aislamiento y cultivo de la microalga Tetraselmis contracta, se

realizó satisfactoriamente, sin presentar problemas adaptativos, logrando

un desarrollo exitoso al momento de cultivar a mayor escala.

La densidad del cultivo de Tetraselmis contracta alcanzó

concentraciones de 107 cel.mL-1, lo que sirvió de base para evaluar su

eficiencia como biocontrolador en los cultivos de “pintadilla”

Cheilodactylus variegatus durante 7 semanas de pruebas continuas.

La evaluación de los parámetros físico-químicos demostró la acción

de la microalga como agente purificador.

Los análisis microbiológicos han demostrado que efectivamente

existe una reducción en la carga bacteriana de más del 50% y una taza

de sobrevivencia del 100% de los individuos de Cheilodactylus variegatus,

lo que confirma la actividad de Tetraselmis contracta como biocontrolador

microbiano de la calidad de agua para uso acuícola.

58

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Bioresource Technology 96 (2005) 359–362.

Yeong, Y. S., 2008. Protection of Artemia from vibriosis by heat shock

and heat shock proteins. Tesis para obtener el grado de PhD.

Universidad de Ghent, Bélgica.

64

ANEXOS

Fig. 1: Cultivo intermedio (1000 mL) de Tetraselmis contracta

65

Fig. 2: Cultivo masivo (10L) de Tetraselmis contracta

66

Fig. 3: Preparación de los tres acuarios tratamiento empleando la técnica de

agua verde y un control.

67

Fig. 4: Acuarios tratamiento (3) y control (1) instalados y listos para empezar la

prueba.

68

Fig. 5: Tetraselmis contracta. Observación a 400X, microscopio Leica de

contraste de fases.

69

3

4

5

6

7

1 2 3 4 5

Tiempo (días)

Oxíg

eno (

mg/L

)

Tratamiento

Control

Fig. 6: Curva de Oxígeno. Curva de variación de los valores promedio de oxígeno entre

tratamiento y control, por un período de 5 días de duración de cada prueba.

6

6.5

7

7.5

8

8.5

1 2 3 4 5

Tiempo (días)

pH

Tratamientos

Control

Fig. 7: Curva de pH. Curva de variación de los valores promedio de pH entre

tratamiento y control, por un período de 5 días de duración de cada prueba.

70

*

0

2

4

6

1 2 3 4 5

Tiempo (días)

Am

onio

(m

g/L

)

Tratamientos

Control

Fig. 8: Curva de Amonio. Curva de variación de los valores promedio de amonio entre

tratamiento y control, por un período de 5 días de duración de cada prueba. El asterisco

indica diferencia significativa.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

1 2 3 4 5

Tiempo (días)

Nitr

ito (

mg/L

)

Tratamientos

Control

Fig. 9: Curva de nitrito. Curva de variación de los valores promedio de nitrito entre

tratamiento y control, por un período de 5 días de duración de cada prueba.

71

14

16

18

20

22

1 2 3 4 5

Tiempo (días)

Tem

pera

tura

(ºC

)

Tratamiento

Control

Fig. 10: Curva de temperatura. Curva de variación de los valores promedio de

temperatura entre tratamiento y control, por un período de 5 días de duración de cada

prueba

72

Recuento de colonias (37º)

13.2E+4 12.4E+4

29.3E+427.3E+4

00.0E+0

5.0E+4

10.0E+4

15.0E+4

20.0E+4

25.0E+4

30.0E+4

35.0E+4

medios de cultivo

UF

C

tratamientos

control

Agar marino Plate Count

Fig. 11: Crecimiento bacteriano. Promedio del recuento de colonias incubadas a 37º analizados

durante cuatro semanas de pruebas microbiológicas continuas.

Recuento de colonias (20º)

13.4E+411.2E+4

28.4E+429.8E+4

00.0E+0

5.0E+4

10.0E+4

15.0E+4

20.0E+4

25.0E+4

30.0E+4

35.0E+4

medios de cultivo

UF

C

tratamientos

control

Agar marino Plate Count

Fig. 12: Crecimiento bacteriano. Promedio del recuento de colonias incubadas a 20º analizados

durante cuatro semanas de pruebas microbiológicas continuas.

73

Fig. 13: Crecimiento de colonias de Vibrio en placa de TCBS

74

Crecimiento

12.8413.21 13.29 13.22

15.81 15.9 16

13.79

10

12

14

16

18

1 2 3 4

acuarios

Ta

lla

(c

m)

Tallas iniciales

Tallas f inales

Fig. 14: Tallas al inicio y término de las pruebas. Crecimiento en talla (cm) de los individuos

durante siete semanas que se les sometió a la prueba de agua verde.

Crecimiento

31.1232.29 33.3 33.13

49.85 49.59 50.32

33.39

20

30

40

50

60

1 2 3 4acuarios

Pe

so

(g

)

Peso inicial

Peso final

Fig. 15: Pesos al inicio y término de las pruebas. Crecimiento en peso (g) de los individuos durante

siete semanas que se les sometió a la prueba de agua verde.

75

Tabla 1: Valores de oxígeno (mg/L). La tabla muestra los promedios de los valores de oxígeno obtenidos para los tratamientos (acuario 1, 2, 3) y para

el control (acuario 4) durante las siete pruebas consecutivas de cinco días de duración cada una.

Pruebas Promedio Tratamientos (acuarios 1,2,3) Control (acuario4)

Oxígeno dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5

prueba1 6.43 7.08 6.1 5.78 5.75 6.35 5.92 4.8 4.56 5 prueba2 6.08 6.17 6.03 5.66 5.66 6.14 8.38 6.81 5.25 prueba3 5.13 5.66 5.56 6.33 6.03 5.19 5.31 5.19 6.03 6.17 prueba 4 4.99 5.14 5.28 5.32 4.02 4.96 5.21 4.42 3.51 2.51 prueba 5 6.17 6.5 6.2 4.76 5.52 5.18 5.9 3.2 4.05 prueba6 5.6 5.36 5.12 5.22 5.32 5.09 3.68 4.1 4.52 prueba7 5.18 6.26 6.46 6.11 6.82 5.73 5.64 6.64 5.5 5.89

PROM 5.65428571 6.02428571 5.78666667 5.79833333 5.48 5.5 5.56666667 5.57285714 4.81571429 4.77 ES 0.21783411 0.25697746 0.22173057 0.18230774 0.34083231 0.179761747 0.16345574 0.59325059 0.50739699 0.467674

76

Pruebas Promedio Tratamientos (1,2,3) Control

pH dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5

prueba1 7.78 7.84 7.51 7.68 7.51 7.45 prueba2 7.65 7.75 7.8 7.86 7.63 7.48 7.72 7.54 7.72 prueba3 7.74 7.78 8 7.81 7.81 7.76 7.53 8 7.6 7.59 prueba 4 7.7 7.79 7.86 7.9 7.88 7.61 7.58 7.57 7.7 7.87 prueba 5 7.73 7.72 7.9 7.88 7.81 7.78 7.65 7.84 7.83 7.84 prueba6 7.74 7.81 7.89 7.91 7.9 7.81 7.83 7.91 7.94 7.98 prueba7 7.74 7.82 7.91 7.84 7.89 7.85 7.9 8 7.92 7.95

PROM 7.71666667 7.77833333 7.87714286 7.86333333 7.85833333 7.707142857 7.66428571 7.79285714 7.71142857 7.825 ES 0.0147573 0.01536591 0.02783577 0.01605546 0.01621042 0.047142857 0.05826283 0.07507819 0.07238878 0.0600416

Tabla 2: Valores de pH. La tabla muestra los promedios de los valores de pH obtenidos para los tratamientos (acuario 1, 2, 3) y para el control (acuario

4) durante las siete pruebas consecutivas de cinco días de duración cada una.

77

Pruebas Promedio Tratamientos (1,2,3) Control

Amonio dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5

prueba1 0.009 0.03 0.03 0.03 0.03 0.009 0.009 0.025 0.03 prueba2 0 0.02 0.05 0 0.02 0.03 0.09 0.09 prueba3 0 0.025 0.03 0.03 0.03 0 0.02 0.03 0.07 0.09 prueba 4 0.0045 0.02 0.025 0.03 0.03 0.0045 0.02 0.03 0.09 0.09 prueba 5 0.009 0.009 0.02 0.02 0.03 0.009 0.009 0.02 0.03 0.09 prueba6 0 0.02 0.03 0.03 0.03 0 0.02 0.03 0.03 0.09 prueba7 0 0.03 0.03 0.03 0.03 0 0.02 0.03 0.03 0.09

PROM 0.00321429 0.022 0.0275 0.0283333 0.03285714 0.003214286 0.0168571 0.02785714 0.05285714 0.09 ES 0.00161782 0.00275162 0.00170783 0.0016666 0.00285714 0.001617822 0.0020287 0.0014869 0.01106567 6.20634E-18

Tabla 3: Valores de amonio (mg/L). La tabla muestra los promedios de los valores de amonio obtenidos para los tratamientos (acuario 1, 2, 3) y para el

control (acuario 4) durante las siete pruebas consecutivas de cinco días de duración cada una.

78

Pruebas Promedio Tratamientos (1,2,3) Control

Nitrito dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5

Prueba1 0.1 0.1 0.3 0.3 0.3 0.1 0.1 0.3 0.3 0.3 Prueba2 0.1 0.3 0.3 0.53 0.6 0.1 0.1 0.3 0.1 0.3 Prueba3 0.1 0.17 0.53 0.5 0.67 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 Prueba 4 0.1 0.3 0.37 1 1 0.1 0.1 0.1 0.3 0.3 Prueba 5 0.1 0.3 0.5 1 0.1 0.1 0.1 0.3 1 Prueba6 0.1 0.3 0.5 0.5 1 0.1 0.3 1 5 Prueba7 0.1 0.3 1 1 1 0.1 0.3 1 1 5

PROM 0.1 0.25285714 0.5 0.69 0.76166667 0.1 0.15714286 0.31666667 0.44285714 1.714285714

ES 5.6656E-

18 0.03137441 0.09099974 0.1132002 0.11805131 5.66558E-

18 0.03688556 0.14240006 0.14777258 0.855076875

Tabla 4: Valores de nitrito (mg/L). La tabla muestra los promedios de los valores de nitrito obtenidos para los tratamientos (acuario 1, 2, 3) y para el

control (acuario 4) durante las siete pruebas consecutivas de cinco días de duración cada una.

79

Tabla 5: Valores de temperatura. La tabla muestra los promedios de los valores de temperatura obtenidos para los tratamientos (acuario 1, 2, 3) y para

el control (acuario 4) durante las siete pruebas consecutivas de cinco días de duración cada una.

Pruebas Promedio Tratamientos (1,2,3) Control

Temperatura dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5

prueba1 19.33 19.23 18.9 18.97 19.1 20 19.5 19 19.1 19.3 prueba2 18.27 19 20.97 20.5 19.97 18.5 19.1 20.9 20.5 20.1 prueba3 18.73 19.4 21 20.03 20.03 18.6 19.4 21 20.2 20.2 prueba 4 17.87 19.63 19.8 19.4 19.9 18.2 19.7 19.8 19.5 19.9 prueba 5 17.73 19.77 19.23 20.73 21.03 17.5 19.8 19.3 20.9 21.2 prueba6 17.67 20.97 21.53 20.77 21.03 17.5 21 21.6 20.8 21.1 prueba7 21 20.8 20.9 21.57 21 21 20.8 21 21.7 21.1

PROM 18.6571429 19.8285714 20.3328571 20.2814286 20.2942857 18.75714286 19.9 20.3714286 20.385714 20.414285 ES 0.45120323 0.28941179 0.3829442 0.33480932 0.28188867 0.491284586 0.27255406 0.37588897 0.3326864 0.2763956

80

Mediciones Iniciales

Acuario 1 Acuario 2 Acuario 3 Control

Talla (cm) 12.3 13.5 12.9 12.8 Talla (cm) 12.5 13.2 13.3 13.6 Talla (cm) 12.7 13.4 13.4 13.5 Talla (cm) 12.6 13.5 12.8 13 Talla (cm) 13.2 13.4 13.5 12.9 Talla (cm) 13 13.1 13.3 13.6 Talla (cm) 12.7 12.9 13.7 12.8 Talla (cm) 13.2 12.8 13.6 12.9 Talla (cm) 12.9 13.1 12.9 13.5 Talla (cm) 13.3 13.2 13.5 13.6

Promedio (T) 12.84 13.21 13.29 13.22

DE 0.33 0.24 0.32 0.36

Peso (g) 29.3 34.3 30.1 31.4 Peso (g) 29.9 33.5 33.5 36.4 Peso (g) 31.5 31.6 33.8 35.1 Peso (g) 29.9 32.8 32.2 33.2 Peso (g) 32 31.4 35.6 32.6 Peso (g) 33.4 32.6 34.6 34.6 Peso (g) 33.2 31.4 33.9 31.4 Peso (g) 32 30.2 34.2 32.2 Peso (g) 31.4 30.5 35.4 31.8 Peso (g) 29.8 32.3 30.4 32.6 Peso (g) 29.9 34.6 32.6 33.1

Promedio (P) 31.12 32.29 33.30 33.13

DE 1.44278771 1.4432287 1.82208672 1.610025409

Tabla 6: Mediciones al inicio del las pruebas. Pesos y tallas de los individuos

de Cheilodactylus variegatus al inicio de las pruebas, dispuestos en un número de

diez para cada acuario (tres réplicas de tratamientos y un control)

81

Mediciones Finales

Acuario 1 Acuario 2 Acuario 3 Control

Talla (cm) 15 16.3 15.9 13 Talla (cm) 15.5 15.6 16.4 14.5 Talla (cm) 15.8 15.8 16.1 14.5 Talla (cm) 15.5 16 15.6 14 Talla (cm) 16 16.3 15.8 13.5 Talla (cm) 16.1 15.5 16.4 13.5 Talla (cm) 15.9 15.7 16.1 13.5 Talla (cm) 16.2 16.2 15.9 Talla (cm) 15.9 15.9 15.8 Talla (cm) 16.2 15.7 16

Promedio (T) 15.81 15.9 16 13.79

DE 0.38 0.29 0.26 0.57

Peso (g) 43.4 50.9 48.5 26.9 Peso (g) 48.2 48.9 52.5 40.6 Peso (g) 50.3 49.1 52.1 38.2 Peso (g) 46.7 49.5 48.5 32.2 Peso (g) 51.2 51.6 48.5 33.4 Peso (g) 52 48.4 52.8 30.6 Peso (g) 50.9 48.8 52 31.8 Peso (g) 51 50.9 49.5 33.4 Peso (g) 52.5 49.7 49.4 Peso (g) 50.5 48.9 49.5 Peso (g) 51.6 48.8 50.2

Promedio (P) 49.85 49.59 50.32 33.39

DE 2.71711746 1.06532112 1.70400598 4.2923312

Tabla 7: Mediciones al término de las pruebas. Pesos y tallas de los individuos

de Cheilodactylus variegatus al término de las pruebas, dispuestos en un número

de diez para cada acuario (tres réplicas de tratamientos y un control). Los espacios

vacíos representan la muerte del individuo.

82

Medios de cultivo empleados

Medio f/2 Guillard modificado para microalgas marinas

Nitratos y fosfatos g/L

KNO3 75

NaH2PO4.2H2O 5.65

Traza de metales (quelantes) g/L

EDTANa2 4.360

FeCl3.6H2O 3.150

CuSO4.5H2O 0.010

ZnSO4.7H2O 0.022

CoCl2.6H2O 0.010

MnCl2.4H2O 0.180

NaMoO4.2H2O 0.006

Mezcla de vitaminas g/L

Cyanocobalamina 0.002 Tiamina HCl 0.100 Biotina 0.001

Solución de metasilicato de sodio mL/L

Na2SiO3.5H2O 10

H3ClO4 5

Caldo Lauryl Sulfato (Lauryl Sulfate Broth)

Componentes g/L

Triptosa 20 Lactosa 5 Cloruro de Sodio 5 Sulfato Lauryl de Sodio 0.1 Fosfato hidrógeno di-potasio 2.75 Fosfato di-hidrógeno de potasio 2.75

83

Agar Plate Count

Componentes g/L

Peptona de caseína 5 Extracto de levadura 2.5 D(+) glucosa 1 Agar-agar 14

Agar Marino

Componentes g/L

Bacto peptona 5 Extracto de levadura 2 Bacto Agar 15 Agar-agar 14

Agua de mar envejecida 750mL

Caldo de enriquecimiento APA

Componentes g/L

Cloruro de Sodio 100 Peptona 20

Agar TCBS ( Thiosulfate Citrate Bile Sucrose)

Componentes g/L

Peptona de caseína 5 Peptona de carne 5 Extracto de levadura 5 Citrato de sodio 10 Tiosulfato de sodio 10 Bilis ox 5 Colato de sodio 3 Sacarosa 20 Cloruro de Sodio 10 Citrato de Fe (III) 1 Azul de timol 0.04 Azul de bromotimol 0.04 Agar-agar 14

84

Agar LIA (Lysine Iron Agar)

Componentes g/L

Peptona de carne 5 Extracto de levadura 3 D(+) glucosa 1 Monohidrocloruro de L-lisina 10 Tiosulfato de sodio 0.04 Citrato Fe(III) de amonio 0.5 Morado de bromocresol 0.02 Agar-agar 12.5

Bactident Oxidasa (cintas)

Componentes Concentración

Cloruro diamonio de N,N-dimetil- 1,4 fenileno………………………. 0.1µmol 1-naftol…………………………… 1µmol

Agar TSA (Tryptic Soy Agar)

Componentes g/L

Peptona de caseína 15 Peptona de soya 5 Cloruro de Sodio 5 Agar-agar 15

Citrato (SIMMONS Citrate)

Componentes g/L

Fosfato dihidrógeno de amonio 1 Fosfato hidrógeno di-potasio 1 Cloruro de sodio 5 Citrato de sodio 2 Sulfato de magnesio 0.2 Azul de bromotimol 0.08 Agar-agar 13

85

Oxidación Fermentación (O/F Basal medium acc. TO Hugh & Leifson)

Componentes g/L

Peptona de caseína 2 Extracto de levadura 1 Cloruro de sodio 5 Fosfato hidrógeno di-potasio 0.2 Azul de Bromotimol 0.08 Agar-agar 2.5

Medio SIM (SIM Medium)

Componentes g/L

Peptona de caseína 20 Peptona de carne 6.6 Citrato Fe(II) de amonio 0.2 Tiosulfato de sodio 0.2 Agar-agar 3

Agar TSI (Triple Sugar Iron Agar)

Componentes g/L

Peptona de caseina 15 Peptona de carne 5 Extracto de carne 3 Extracto de levadura 3 Cloruro de sodio 5 Lactosa 10 Sacarosa 10 D(+) glucosa 1 Citrato Fe(III) de amonio 0.5 Tiosulfato de sodio 0.5 Rojo de fenol 0.024 Agar-agar 12

Caldo TSB (Tryptic Soy Broth)

Componentes g/L

Peptona de caseína 17 Peptona de soya 3 D(+) glucosa 2.5 Cloruro de Sodio 5

86

Fosfato hidrógeno di-potasio 2.5