Inclusion procesado embebido_corte_en Inmunohistoquimica
36
Click here to load reader
-
Upload
rebeca-arrue -
Category
Education
-
view
407 -
download
12
Transcript of Inclusion procesado embebido_corte_en Inmunohistoquimica
INCLUSION, PROCESADO,
INCLUSION EN PARAFINA Y
CORTE ENFOCADO A LA
INMUNOHISTOQUIMICA.LCDA REBECA ARRUE,
TECNOLOGA MEDICA
HISTOTECNOLOGA
SERVICIO DE PATOLOGIA
VENCE EL MAL
HACIENDO EL BIEN,
NO TE CANSES DE
HACER EL BIEN A TU
PRÓJIMO.
INCLUSION DE LA MUESTRA
LA MUESTRA SE RECIBE EN EL LABORATORIO
DE PATOLOGIA UNA VEZ QUE ES EXTRAIDA.
SE CUENTA CON UN CUARTO DE CORTE QUE
ES EL AREA DESIGNADA PARA RECIBIR,
REGISTRAR, FOTOGRAFIAR, DISECAR Y
TALLAR LA MUESTRA.
EN EL LABORATORIO DE PATOLOGIA SE
COLOCA LA MUESTRA EN LA FORMALINA
BUFFERIZADA 10% PARA SU FIJACION.
LA FIJACION DEBE INICIAR ANTES DE LOS 30
MINUTOS.
INCLUSION DE LA MUESTRA
YA QUE SI EL TEJIDO PERMANECE MUCHO
TIEMPO SIN FORMALINA EMPIEZA LOS
PROCESOS DE AUTOLISIS (por acción de las
enzimas intracelulares), PUTREFACCION (por
acción bacteriana).
ES IMPORTANTE UNA VEZ QUE SE RECIBE LA
MUESTRA (PIEZA QUIRURGICA), EL PATOLOGO
DEBE SECCIONAR LA PIEZA PARA QUE HAYA
UNA MEJOR PENETRACION DEL FIJADOR AL
TEJIDO.
SELECCION DEL FIJADOR
TIPO DE FORMALINA INFLUYE EN LOS
ESTUDIOS DE H&E, INMUNOHISTOQUIMICA Y
TECNICAS MOLECULARES.
SI ES UNA FORMALINA QUE SE PREPARA EN
EL LABORATORIO Y NO SE LE AGREGAN LOS
FOSFATOS VAMOS A TENER UNA FORMALINA
ACIDA.
LA FORMALINA ACIDA PRODUCE UN
PRECIPITADO COLOR NEGRO/MARRON EN LA
TINCION DE H&E.
SU EFECTO MAYOR ES SOBRE LAS
PROTEINAS, ACIDOS NUCLEICOS(ADN Y RNA),
LIPIDOS Y CARBOHIDRATOS.
FIJACION
SI LA FORMALINA ESTA MUY CONCENTRADA
ESTA VA A DAÑAR EL TEJIDO.
EL TEJIDO SE VA A ENDURECER Y SE VA A
ENCOGER.
SI EL TEJIDO NO TIENE EL VOLUMEN
ADECUADO DE FORMALINA ESTE NO SE VA
FIJAR. (MAL FIJADO).
LA TEMPERATURA OPTIMA DE FIJACION ES A
TEMPERATURA AMBIENTE.
FIJACION
EL AUMENTO DE LA TEMPERATURA
INCREMENTA LA VELOCIDAD DE FIJACION Y
EL TEJIDO SE QUEMA.
SI EL TEJIDO VIENE CON LA FORMALINA
BUFFERIZADA AL 10% Y ES UN TEJIDO
RICO EN SANGRE
Y SI NO SE TIENE EL CUIDADO DE
CAMBIAR LA FORMALINA, ESTA SE OXIDA
Y SE PRODUCE ACIDO FORMICO.
Y VA A PRODUCIR UN PRECIPITADO QUE
ES DERIVADO DE LA HEMATINA
Y EL PH DISMINUYE A 6
INCLUSION DE LA MUESTRA
(FIJACION)
LA MUESTRA SE
COLOCA EN UN
VOLUMEN DE 10
VECES SU TAMAÑO.
FIJACIÓN DEBE
ESTAR EN UN RANGO
DE 6-24HORAS/24-48
HORAS
DEPENDE DEL
TAMAÑO DE LA
MUESTRA.
INCLUSION DE LA MUESTRA
SOBREFIJACION DE LA MUESTRA
LA SOBREFIJACION ENMASCARA EL
EPITOPE PORQUE SE VAN A FORMAR MAS
PUENTES DE METILENO.
DEBIDO A QUE EL FORMALDEHIDO
PERTENECE AL GRUPO DE LOS ALDEHIDOS
Y ESTE GRUPO SE HIDRATA Y SE FORMAN
LOS PUENTES DE METILENO CON LOS
AMINOACIDOS DEL TEJIDO.
A LA HORA DE LA RECUPERACION
ANTIGENICA NO SE LOGRA
DESENMASCARAR EL EPITOPE POR LA GRAN
CANTIDAD DE PUENTES DE METILENO.
LA SOBREFIJACION PRODUCE UNA TINCION
DEBIL (SEÑAL) O NADA DE SEÑAL.
ARTEFACTOS LOS PROCESOS DE FIJACIÓN
PUEDEN ACARREAR ALTERACIONES
TISULARES COMO VARIACIONES
MORFOLÓGICAS, CRISTALIZACIÓN DE
COMPUESTOS, DESPLAZAMIENTO DE
SUSTANCIAS, ETCÉTERA.
ESTOS CAMBIOS PUEDEN PRODUCIRSE
POR LAS CARACTERÍSTICAS DEL FIJADOR
O POR UN MAL USO DE ÉSTE.
SI EL TEJIDO ESTA SOBREFIJADO O POCO
FIJADO A LA HORA DE LA INTERPRETACION
DEL CASO TE VAS A ENCONTRAR CON
BACKGROUND.
TIPO DE FIJADOR VA A PRODUCIR UNA
REACCION CRUZADA NO PROTEINICA
(AMINOACIDOS).
VOLUMEN Y CONCENTRACION
INADECUADOS DEL FIJADOR PRODUCE UNA
TINCION HETEROGENEA.
TIEMPO EN EL FIJADOR PRODUCE
BACKGROUND, TINCION NO ESPECIFICA,
BACKGROUND CON TINCION NO ESPECIFICA.
SI EL FORMALDEHIDO REACCIONA CON LOS
AMINOACIDOS DENTRO DEL EPITOPE, EL
ANTICUERPO SERA INCAPAZ DE UNIRSE.
SI HAY CAMBIOS CONFORMACIONALES QUE
RESULTEN DE LA REACCION DEL
FORMALDEHIDO CON LOS AMINOACIDOS
ADYACENTES AL EPITOPE ESTOS PUEDEN
REVERTIRSE A MENUDO CON LA DIGESTION
ENZIMATICA O LA RECUPERACION
ANTIGENICA POR CALOR.
ANTES DE COLOCAR UN TEJIDO
EN DECAL ESTE DEBE ESTAR
FIJADO 24 HORAS.
LUEGO SE COLOCA EN LA
SOLUCION DECALCIFICANTE.
ESTA SOLUCION PRODUCE
DEGRADACION DEL EPITOPE.
CUARTO DE CORTE
DESCRIPCION MACROSCOPICA DE LA
BIOPSIA O PIEZA QUIRURGICA.
MUESTREO TISULAR SI EL PATOLOGO
SELECCIONA EL AREA INCORRECTA
OBVIAMENTE A LA HORA DE LA LECTURA NO
VA ENCONTRAR NADA.
MANEJO ADECUADO DE LAS MUESTRAS.
SI LAS MUESTRAS NO SE FIJAN ANTES DE
ENTRAR AL PROCESADOR SE CORRE EL
RIESGO DE QUE QUEDEN MAL FIJADAS.
INCLUSION DE LA MUESTRA
(FIJACION)
LAS SECCIONES DE TEJIDO SELECCIONADAS NO
DEBEN SUPERAR LOS 3MM DE ESPESOR DEBIDO
A QUE SE NECESITA QUE ESA SECCION SE FIJE.
GROSOR DEL TEJIDO A INCLUIR: 2-3MM
SABEMOS QUE LA FIJACION SE HACE A
TEMPERATURA AMBIENTE Y QUE LA VELOCIDAD
DE PENETRACION ES DE 1MM/HORA.
INCLUSION DE LA MUESTRA
(FIJACION)
SI EL ESPESOR O GROSOR DEL TEJIDO ES
MAYOR DE 3MM
ESTO AFECTA LA FIJACION DEL TEJIDO
PORQUE LA VELOCIDAD DE PENETRACION
DEL TEJIDO ES DE 1MM/HORA
SI EL TEJIDO NO SE FIJA EN EL CENTRO A LA
HORA DE HACER EL CORTE NO VA HABER
TEJIDO EN ESA AREA.
EL LARGO DEL TEJIDO NO DEBE
SOBREPASAR LOS MARGENES DE
INCLUSION.
INCLUSION DE LA MUESTRA
(FIJACION)
LAS SECCIONES DE MUESTRASSELECCIONADAS SE COLOCAN EN SUSRESPECTIVOS CASSETTES DE INCLUSION.
SE CUENTA CON BAÑOS DE FORMALINABUFFERIZADA 10 % Y UN BAÑO DE FORMALINAALCOHOLICA.
LA FORMALINA ALCOHOLICA(FORMALINA+ETANOL) ES PARA PRESERVARMEJOR LOS CARBOHIDRATOS, CAUSA MENOSACHICAMIENTO CELULAR Y MENOSENDURECIMIENTO.
SI EL TEJIDO ESTA MAL FIJADO NO VA HABERUNA BUENA RECUPERACIÓN ANTIGENICA.
PROCESADO DEL TEJIDO
ES IMPORTANTE EL PROCESAMIENTO DEL
TEJIDO.
PASO 1. FIJACIÓN
PASO 2. DEHIDRATACIÓN
DEPENDE DE LA CALIDAD DEL ETANOL.
LA CONCENTRACION DEL ETANOL.
PASO 3. ACLARAMIENTO
DEPENDE DE LA CALIDAD DEL SOLVENTE.
PASO 4. INFILTRACION
DEPENDE DE LA CALIDAD DE LA PARAFINA.
PROCESADO DEL TEJIDO
PASO 2.
DESHIDRATACION
YA SEA QUE LAS CONCENTRACIONES DE
ALCOHOL ESTEN MUY CONCENTRADAS O
CON UNA CONCENTRACION MENOR, NO SE VA
A REMOVER TODA EL AGUA QUE SE
ENCUENTRA EN LOS ESPACIOS
INTRACELULARES Y EXTRACELULARES DEL
TEJIDO.
PROCESADO DEL TEJIDO
AL NO REMOVER TODA EL AGUA DEL
TEJIDO, POSTERIORMENTE LA
INFILTRACION POR PARAFINA NO SE VA
HACER ADECUADAMENTE YA QUE EL AGUA
NO ES MISCIBLE CON LA PARAFINA.
ES IMPORTANTE MENCIO-
NAR QUE EL TEJIDO SE
TERMINA DE FIJARSE EN
LOS ALCOHOLES.
PROCESADO DEL TEJIDO
LA DESHIDRATACION PROLONGADA CAUSA:
RESEQUEDAD
ENDURECIMIENTO DEL TEJIDO
CAMBIA LA CONFIGURACION DE LAS
PROTEINAS EN EL TEJIDO.
PROCESADO DEL TEJIDO
PASO 3. ACLARAMIENTO
SE USA XILOL EL CUAL ES UN SOLVENTE.
HIDROCARBURO.
ANILLO BENCENICO
COMPUESTO POR UNA MEZCLA DE ISOMEROS
META, PARA Y ORTO.
EN ESTE PASO EL AGENTE ACLARANTE
ELIMINA EL ALCOHOL DEL TEJIDO.
PROCESADO DEL TEJIDO
SI EL TEJIDO SE DEJA MUCHO TIEMPO
EN EL XILOL ESTE SOLVENTE HACE
QUE EL TEJIDO SE VUELVA
QUEBRADIZO
AL ENDURECERSE ESTE SE VUELVE
QUEBRADIZO.
EL TEJIDO SE RESECA.
DEGENERA LAS MOLECULAS DEL
TEJIDO.
PROCESADO DEL TEJIDO
PASO 4. INFITRACION POR PARAFINA
LA PARAFINA ES UNA SUSTANCIA
CONFORMADA POR HIDROCARBUROS
SATURADOS DE CADENAS LARGAS.
EL PUNTO DE FUSIÓN PERMITE LA
CATEGORIZACIÓN DE LAS MISMA.
TIPOS DE PARAFINA:
BLANDAS
DURAS
PROCESADO DE TEJIDO
LA INFILTRACION DEPENDE DE LA CALIDAD DE
LA PARAFINA Y SU PUNTO DE FUSION.
YA QUE SI UTILIZAMOS UNA PARAFINA CON UN
PUNTO DE FUSION MAYOR DE 60°C ESTO VA A
PRODUCIR QUE LOS EPITOPES SE PIERDAN
EN LOS BAÑOS DE PARAFINA.
YA QUE SE VA A REQUERIR DE UNA
TEMPERATURA ALTA PARA QUE ESTA SE
DERRITA.
LAS TEMPERATURAS ALTAS DEGENERAN LA
PUREZA DE LAS MOLECULAS DE PARAFINA
POR MUY BUENA QUE SEA LA PARAFINA.(58-
60°C)
PROCESADO DEL TEJIDO
LA TEMPERATURA ALTA EN LOS BAÑOS DE
PARAFINA DEL PROCESADOR DE TEJIDOS
DESTRUYE EL EPITOPE DEL TEJIDO.
AL HABER UN MAL
PROCESAMIENTO EL EPITOPE O
LOS EPITOPES SE DEGRADAN
POR CONSIGUIENTE VA A HABER
UNA MALA RECUPERACION
ANTIGENICA.
EMBEBIDO EN PARAFINA (BLOQUEO)
TIPO DE PARAFINA
PUNTO DE FUSION
CORTE
BLANDA 50-52°C GRUESO
BLANDA 53-55°C GRUESO
DURA* 56-58°C FINO
DURA 60-68°C FINO
EMBEBIDO EN PARAFINA (BLOQUEO)
CENTRO DE
BLOQUEO
SI LA PLANCHA
CALIENTE DEL
CENTRO DE
BLOQUEO TIENE
UNA TEMPERATURA
MAYOR DE 60°C.
EL CALOR DESTRUYE
EL EPITOPE.
AL QUEMAR LOS
TEJIDOS CAMBIA LA
CONFIGURACION DE
LAS PROTEINAS.
CORTE HISTOLOGICO
PARA
INMUNOHISTOQUIMI
CA SE REQUIERE
QUE SE HAGAN
CORTES DE 4
MICRAS.
PARA TECNICAS
MOLECULARES
(FISH, CISH) CORTES
DE 4 MICRAS.
LA PARAFINA QUE
SE USE EN LA
CONFECCION DEL
BLOQUE DEBE SER
IDEAL PARA QUE A LA
HORA DE HACER EL
CORTE ESTA SE
EXPANDA BIEN EN EL
BAÑO FLOTADOR.
CORTE HISTOLOGICO
LA TEMPERATURA
DEL BAÑO DEBE
OSCILAR ENTRE 42-
44°C PARA QUE EL
TEJIDO SE EXPANDA
BIEN.
PARA QUE NO HAYA
ARRUGAS SOBRE EL
TEJIDO.
LAS ARRUGAS EN EL
TEJIDO ENMASCARA
EL EPITOPE.
SI EL TEJIDO DE
ESTUDIO SE COLOCA
ENCIMA DE LA
PARAFINA DEL
CONTROL ESA PARTE
SE VA A CAER EN EL
PASO DE
DESPARAFINAR.
CORTE HISTOLOGICO
AL AGUA DEL BAÑO
NO SE LE DEBE
COLOCAR NINGUN
ADITIVO.
YA QUE ESTO PUEDE
PRODUCIR UNA
REACCION
INESPECIFICA.
• BURBUJAS EN EL
BAÑO.
A LA HORA DE PESCAR
EL TEJIDO EN EL
BAÑO NO DEBE
HABER BURBUJAS
LAS BURBUJAS
SOBRE EL TEJIDO
ENMASCARA AL
EPITOPE.
CORTE HISTOLOGICO
LAS LAMINAS
DEBEN TENER
CARGAS + PARA
QUE EL TEJIDO SE
ADHIERA Y NO SE
CAIGA.
NO USAR LAMINAS
PREPARADA EN EL
LABORATORIO.
PORQUE EL TEJIDO
SE CAE.
LAS CAJAS DE LAS
LAMINAS DEBEN
PERMANECER
CERRADAS UNA VEZ
QUE SE USAN.
YA QUE LA
HUMEDAD HACE
QUE SE PIERDA LAS
CARGAS + DE LA
LAMINA.
EL CORTE TIENE
UN VENCIMIENTO.
SI EL CORTE DEL
CONTROL YA ESTA
PRECORTADO.
SI EL CONTROL
POSITIVO NO
MARCA PUEDE
DEBERSE A QUE
ESTADO MUCHO
TIEMPO YA
PRECORTADO.
CORTES A 4
MICRAS PARA QUE
EL TEJIDO NO SE
CAIGA, Y QUE SE
PUEDA OBSERVAR
MEJOR LA SEÑAL.
RECOMENDACION
DEL COLEGIO
AMERICANO DE
PATÓLOGOS ES
QUE NO ESTÉN
MÁS DE 6
SEMANAS
ALMACENADOS.
PASO DE DESPARAFINAR EN EL
HORNO
EL HORNO DEBE
TENER UNA
TEMPERATURA DE
55°-56°C
SE PUEDE DEJAR
OVERNIGHT
O UNA HORA.
UNA TEMPERATURA
MAYOR PRODUCE
QUE EL EPITOPE SE
DESTRUYA POR
CONSIGUIENTE SE
PIERDE.
GRACIAS
