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I. INTRODUCCIÓN

Actualmente la seguridad alimentaria plantea problemas como la adhesión

de los microorganismos a las superficies, lo que se conoce como biofilms

uno de los campos en el ámbito alimentario más importantes a tratar. El

término biofilms fue introducido en el año de 1978 según Costerton (1999).

Costerton dirige el Centro para la Ingeniería del Biofilm en la Universidad del

Estado de Montana. Este centro fue fundado en el año 1990 para recoger y

estudiar las diversas y sorprendentes apreciaciones que iban

descubriéndose, por parte de equipos multidisciplinares de ingenieros,

biólogos, químicos y especialistas en medio ambiente. Según Costerton

(1995); Davey y O’Toole (2000); Kraigsley y otros (2002), los biofilms son

comunidades complejas de microorganismos y polímeros extracelulares, fijas

a una superficie, que pueden presentar una única especie o diferentes

especies.

Aunque la composición de los biofilms es variable, en general, el

componente mayoritario es el agua, que puede representar hasta un 97 %

del contenido total. Además de agua y de las células bacterianas, la matriz

de los biofilms es un complejo que está formado principalmente por

exopolisacáridos (Sutherland, 2001). En menor cantidad se encuentran otras

macromoléculas como proteínas, ADN y diversos productos procedentes de

la lisis de las bacterias (Branda y otros 2005).

Según Pedersen (1990), las bacterias son capaces de formar biofilms sobre

muchas superficies, la capacidad de unirse a diversos plásticos, cristal y

metales, depende de las proteínas específicas de su cubierta. Los estudios

muestran que el acero inoxidable puede ser tan susceptible como el plástico.

2

Estudios realizados en botellas de agua mineral muestran que las superficies

lisas de las botellas de PET (tereftalato de polietileno) apenas eran

colonizadas por bacilos mientras que las superficies más rugosas e

hidrofílicas del PEAD (polietileno de alta densidad) de los tapas eran

pobladas por grupos de cocos (Chmielewsky y Frank, 2003).

La formación de biofilms no parece estar restringida a ningún grupo

específico de microorganismos y hoy se considera que, bajo condiciones

ambientales adecuadas, todas las bacterias son capaces de formarlos.

Podemos encontrar biofilms en todos los medios donde existan bacterias: en

el medio natural, clínico o industrial. Sólo necesitan un entorno hidratado y

una mínima presencia de nutrientes (Donlan, 2002) y (Lasa y otros, 2009).

Según González (2005), si bien son numerosas las especies susceptibles de

formar biofilms en la industria de producción de alimentos se citan a

continuación algunas de especial importancia en relación con la seguridad

alimentaria: Listeria monocytogenes, Salmonella spp, Escherichia coli,

Pseudomonas spp, Campylobacter jejuni, Bacillus spp, Staphylococcus

aureus.

En la industria alimentaria es muy común la presencia de biofilms en

diferentes superficies, en conducciones, equipos y materiales y así se

pueden observar en industrias lácteas, fábricas de cerveza, etc. Su presencia

puede ser perjudicial e indeseable puesto que en muchos casos producen

contaminaciones del producto acabado lo que se traduce en una disminución

del periodo de conservación e incluso en una transmisión potencial de

enfermedades alimentarias (Serra, 2003) (Fuster i Valls, 2006).

3

El problema planteado para esta investigación fue:

¿Cuál será el efecto del tipo envase (Polietileno tereftalato y polietileno de

baja densidad) y tiempo de incubación (6, 12, 24 y 48 horas), sobre la

formación de biofilms bajo condiciones in vitro de bacterias de interés

alimentario (Salmonella spp, Escherichia coli ATCC 35218, Staphylococcus

aureus ATCC 25923)?

Los objetivos propuestos fueron:

Evaluar el efecto del tipo de envase y tiempo de incubación sobre la


alimentario.

Determinar el tiempo de incubación y tipo de envase que permita la

mayor formación de biofilms bajo condiciones in vitro de bacterias de

interés alimentario.

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II. REVISION BIBLIOGRAFICA

2.1 Los biofilms

Según Donlan (2002), realizó una descripción ampliamente aceptada de los

biofilms, estableciendo lo siguiente: Los biofilms se definen como una

comunidad microbiana sésil y que pueden presentar una única especie

microbiana o varias especies diferentes, caracterizada por células que están

adheridas irreversiblemente a un substrato o interfase, encerradas en una

matriz de sustancias poliméricas extracelulares que ellas han producido, y

exhiben un fenotipo alterado en relación con la tasa de crecimiento y

trascripción génica.

2.2 Composición de los biofilms

Toda comunidad microbiana desarrollada en biofilm es única en su género,

aunque algunos atributos estructurales pueden generalmente ser

considerados universales.

En el Cuadro 1 se muestra la composición de los biofilms.

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Cuadro 1. Composición de los biofilms.

Composición de los biofilms

Agua 97 %, células bacterianas 15 a 20 %, elementos de lisis bacteriana.

Exopolisacáridos (EPS): Componente fundamental producido por las

propias bacterias.

En menos cantidad: Sustancias polimétricas extracelulares (SPE)

compuestas por proteínas ácidos nucleicos y polisacáridos

Material no bacteriano: cristales de sales minerales partículas de corrosión

y/o sedimento o componentes sanguíneos según el medio donde se

desarrolla el biofilms.

Los EPS pueden tener carga neutra o carga polianiónica según el

exopolisacárido que le permite interactuar con diferentes antimicrobianos

sin capacidad de actuar sobre las bacterias.

Fuente: Donlan (2002), Chole y Faddis (2003).

2.3 Factores que influyen en el desarrollo del biofilms

Según González (2005); Fuster y Valls (2006), existen varios factores que

afectan al desarrollo de los biofilms como son:

Las propiedades de las superficies de contacto.

El tiempo de contacto.

Las características de la superficie celular.

La disponibilidad de nutrientes.

La composición de la comunidad microbiana.

La disponibilidad de agua.

6

2.3.1 Las propiedades de las superficies de contacto

El tipo de sustrato influye en las características de la unión. Las bacterias

tienden a unirse a las superficies hidrófilas uniformemente en una capa,

mientras que en el caso de las superficies hidrófobas tienden a unirse en

grupos Fuster y Valls (2006).

González (2005), en algunos trabajos ha demostrado que las bacterias

quedan retenidas en las imperfecciones de las superficies; además, las

superficies rugosas son más difíciles de limpiar y acumulan suciedad

permitiendo que las bacterias vuelvan a multiplicarse.

Según Fuster y Valls (2006), demostraron que los niveles de higiene en las

superficies de contacto podían verse disminuidos con el uso y provocar que

la superficie se deteriorase. Los defectos de las superficies pueden actuar

como puntos de retención de microorganismos y materia orgánica. En

consecuencia, los defectos de las superficies proporcionan inseguridad a la

suciedad y los microorganismos, lo que hace que las bacterias

supervivientes puedan volver a multiplicarse y formar un biofilm.

2.3.2 El tiempo de contacto

Un mayor tiempo en contacto (exposición) entre las células y el sustrato

permite que se establezca un mayor número de uniones haciendo la

adhesión irreversible, y por tanto, factores, como las condiciones

ambientales, tipo de microorganismo, sustrato y presión en el caso de

superficies de trabajo o utensilios, pueden también influir de manera

importante en la mayor posibilidad de formación de biofilm Pérez-Rodríguez

y otros (2008).

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2.3.3 Las características de la superficie celular

Las características de la superficie celular como los flagelos, pili, proteínas

de adhesión y cápsulas ejercen también su influencia. Los pilis actúan como

un velcro para anclar las bacterias a algunas superficies y también actúan

como quimiorreceptores, dirigiendo a la bacteria hacia a algunos sitios

específicos. La pérdida de estos apéndices cambia las propiedades de

superficie de la bacteria, lo que puede provocar una menor capacidad de

adhesión. También se conoce que las esporas se adhieren mejor a la

superficie que las células vegetativas debido al grado de hidrofobicidad de su

superficie González (2005).

2.3.4 La disponibilidad de nutrientes

La disponibilidad de nutrientes ejerce una influencia mayor sobre la

estructura y composición de biofilm. Estudios realizados sobre biofilms de

Listeria spp. han puesto de manifiesto que niveles bajos de fosfatos

estimulan el desarrollo de biofilms, aunque el efecto se reducía después de

varios días Chmielewsky y Frank (2003). Asimismo su desarrollo depende

también del tipo de azúcar utilizado, siendo la trehalosa y manosa las que

proporcionan un nivel más pobre de formación de biofilms.

2.3.5 La composición de la comunidad microbiana

Los biofilms multiespecies son más gruesos y estables frente al estrés

ambiental que los monoespecies. En una superficie, el grosor medio de los

biofilms de Klebsiella pneumoniae y P. aeruginosa monoespecie son de 15 y

30 µm respectivamente, mientras que un biofilm formado por ambas

especies bacterianas presenta un grosor de 40 µm (Kumar y Anand, 1998).

Esto se atribuye a la secreción combinada de las distintas sustancias

poliméricas extracelulares resultantes de los diferentes microorganismos

Chmielewsky y Frank (2003).

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La implicación de la diversidad microbiana en los biofilms relacionados con la

industria alimentaria no se ha determinado, ya que la mayoría de los estudios

están focalizados hacia biofilms en aguas y sistemas de agua residuales. En

una planta de procesado existen lugares como los desagües del suelo que

son proclives a la formación de biofilms multiespecie debido a su alta

diversidad bacteriana y otras, como una placa de calor, propicias a la

formación de biofilms monoespecies Chmielewsky y Frank (2003).

Se ha observado la asociación de varias especies patógenas, incluyendo S.

aureus, L. monocytogenes, Campylobacter spp., E. coli O157:H7, V. cholerae

y Helicobacter pylori, en la formación de biofilms multiespecie. A pesar de

que todas ellas son capaces de adherirse a una superficie y comenzar el

crecimiento, la mayoría no tiene capacidad por si sola de completar el

desarrollo del biofilm. Cada vez se tiene más la percepción de que los

biofilms son comunidades biológicas heterogéneas que se adaptan a la

evolución de las condiciones ambientales y a la composición de la

Comunidad Donlan (2002).

2.3.6 La disponibilidad de agua

Pérez-Rodríguez y otros (2008), la disponibilidad de agua es un factor crucial

para la viabilidad del biofilm. Una humedad relativa en torno al 90-100 %

posibilita el desarrollo del biofilm, por ello la mayoría de los biofilms se

encuentran en ambientes acuosos como pueden ser los sistemas de

conducción o tuberías de las industrias lácteas.

Sin embargo, también se ha encontrado que valores en torno al 70-80 %

humedad relativa pueden ser suficientes para permitir el desarrollo del biofilm

Keskinen y otros (2008) indicando que ambientes con humedad relativa alta

pueden incrementar significativamente el riesgo de su aparición. La

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temperatura es un factor también determinante y a la vez relacionado con la

humedad relativa, ya que se ha observado que valores en el rango 20-30 ºC

incrementan la probabilidad de formación del biofilm, mientras que valores

por encima de este rango inciden negativamente sobre ese proceso Else y

otros (2003).

En el Cuadro 2 se muestran alguna de las variables más importantes que

intervienen en el proceso de adherencia y crecimiento de los biofilms.

Cuadro 2. Variables más importantes en el proceso de adherencia y

crecimiento de los biofilms.

Propiedades

de la

superficie

Propiedades del fluido

Propiedades de la

bacteria

Textura

Hidrofobicidad

material

Velocidad del flujo

pH

Temperatura

Cationes

Presencia de antimicrobianos

Hidrofobicidad de la

superficie celular

Fimbrias

Flagelos

Sustancias extracelulares

poliméricas

Fuente: Donlan (2002).

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2.4 Quorum Sensing (QS) en los biofilms

Según Donlan (2002); Lasa y otros (2009), es un mecanismo de

comunicación entre bacterias que permite la formación de biofilms. El

lenguaje usado para la comunicación intercelular es basado en pequeñas

moléculas generadoras de señal llamadas autoinductores.

El proceso quorum sensing funciona debido a que cada bacteria que se une

a una superficie produce una molécula señal “yo estoy aquí”, de manera tal

que mientras más bacterias se unen, se incrementa la concentración local de

esta señal.

El sistema de QS es un mecanismo de regulación dependiente de la

acumulación en el medio ambiente de una molécula señal, autoinductor, que

permite a la bacteria sentir la densidad de la población existente. En

bacterias Gram negativas el principal autoinductor es la acil-

homoserinalactona, mientras que en bacterias Gram positivas los

autoinductores suelen ser de naturaleza peptídica Donlan (2002); Lasa y

otros (2009).

2.5 Proceso de formación de los biofilms

El desarrollo de un biofilm es una forma habitual de crecimiento de las

bacterias en la naturaleza. En la actualidad se considera que en condiciones

ambientales adecuadas, la mayoría de los microorganismos son capaces de

formar biofilms Donlan, (2002); Lasa y otros (2009). El ciclo vital de los

biofilms es un proceso dinámico que puede ser dividido en 3 fases:

Adhesión

Crecimiento

Separación o desprendimiento.

11

2.5.1 Fase de adhesión

La adhesión de la bacteria a la superficie es un proceso rápido que con

frecuencia se produce entre 5 y 30 segundos según González (2005).

Durante esta fase las bacterias una vez percibida una superficie o sustrato,

proceden a formar una unión activa vía apéndices, como fimbrias, flagelos o

pili. Mediante microscopía electrónica se ha descrito que las bacterias

adheridas se encuentran conectadas a la superficie por medio de finas

fibrillas poliméricas extracelulares. Las fimbrias, probablemente luego de

superar la barrera de repulsión electroestática inicial que existe entre el

germen y el sustrato, contribuyen a la adhesión bacteriana Donlan (2002);

Ramadan y otros (2005).

En la adhesión las bacterias sintetizan la matriz de exopolisacáridos para

establecer un contacto físico entre ellas y la superficie. Durante este proceso

las bacterias cambian su fenotipo y llegan a ser básicamente diferentes

respecto a su forma planctónica. Este cambio implica la expresión de genes

específicos, se producen variaciones y alteraciones en su morfología y

cambia su tasa de crecimiento según Donlan y Costerton (2002);


La utilidad de la matriz es retener el agua y los nutrientes y proteger a las

células de los cambios del ambiente y del ataque de los antibióticos y

biocidas Sutherland, 2001), (Donlan, 2002).

2.5.2 Fase de crecimiento

En esta segunda fase, una vez que la bacteria se ha adherido a la superficie,

comienza a dividirse y las células bacterianas hijas se extienden alrededor

del sitio de unión, formando una microcolonia similar a como sucede durante

12

el proceso de formación de colonias en las placas de medios con agar

(Kumar y Anand, 1998); (Lasa y otros, 2009).

Si las condiciones son adecuadas para un crecimiento suficiente del biofilm

se desarrollará una estructura organizada, a este proceso se le denomina

maduración. Un biofilm maduro puede consistir en una simple capa de

bacterias. Este desarrollo y maduración del biofilm depende de factores

como la disponibilidad de nutrientes, la diversidad microbiana de la

comunidad, la disponibilidad de agua y el transporte celular según


A medida que madura el biofilm, se va adaptando a la presencia de

nutrientes, al oxígeno y a los cambios poblacionales formando microcolonias

discretas separadas por canales de agua. El número de bacterias viables se

reduce con la edad del biofilm; así en un biofilm joven se han detectado

cerca de un 80 % de células bacterianas viables, y tan solo un 50 % en un

biofilm maduro (Branda y otros 2005); (Fuster y Valls, 2006).

2.5.3 Fase de separación

Según Donlan (2002); Lasa y otros (2009), nos dice que finalmente en la

tercera fase, algunas bacterias de la matriz del biofilm se liberan del mismo

para poder colonizar nuevas superficies cerrando el proceso. La liberación de

las bacterias desde el biofilm es la parte del proceso que menos se conoce.

Se puede deber a modificaciones internas en la estructura del biofilm o

producirse por actuación de fuerzas físicas.

13

2.6 Envases de plásticos

El plástico es un material que se obtiene a partir del petróleo, los plásticos

son materiales formados por polímeros y aditivos, que combinados en

distintas proporciones presentan propiedades diferentes. Los envases de

plásticos se utilizan para ayudar en el transporte, como protección de los

productos en los almacenes y para comunicar información al consumidor. El

uso de envases plásticos en la industria alimentaria debe asegurar su

inocuidad para no transmitir algún riesgo al alimento según Marriott (1999).

En general, debe cumplir con ciertas características que le permitan ejercer

sus funciones básicas: protección, funcionalidad y motivación. La protección

se relaciona con la capacidad que tiene el envase de mantener al producto

en condiciones óptimas, de tal manera que no se modifiquen sus

propiedades; o en el caso de los alimentos que no se altere su estabilidad, ya

sea protegiéndolo del medio ambiente o del mismo envase como tal. La

funcionalidad toma importancia desde el punto de vista del manejo

productivo y disposición del producto, así como el facilitar su identificación y

ubicación en un lugar determinado. La motivación se relaciona con la forma

como se ofrece el producto al consumidor, así como con su promoción y

proyección frente al mercado (Marriott, 1999).

Existen varios tipos de envases, de diferentes materiales, que buscan

cumplir con estas tres funciones. Entre ellos se encuentran los envases de

plástico formados principalmente por resinas o residuos de polímeros, como

polietileno de baja densidad (PEBD), polietileno tereftalato (PET), y cloruro

de polivinilo (PVC). La importancia de los envases utilizados en la industria

farmacéutica, de cosméticos y de alimentos, radica principalmente en la

calidad integral con la que son diseñados y elaborados, así como en la

capacidad de protección que ellos ofrecen a los productos envasados,

14

protección que debe ser considerada dentro del diseño de los productos,

garantizando de esta manera su estabilidad (Ficha de datos de seguridad,

2008).

2.7 Identificación de los materiales de plásticos a través de sus códigos

Los plásticos tienen códigos para facilitar su identificación y sus

características tal como se observa en el Cuadro 3.

Cuadro 3. Nombre, sigla, símbolo y número de los materiales de

plásticos.

Nombre Siglas Símbolo y número

Polietileno tereftalato PET

Polietileno de alta densidad PEAD

Cloruro de polivinilo PVC

Polietileno de baja densidad PEBD

Polipropileno PP

Poliestireno PS

Otros plásticos -

Fuente: Acoplasticos (2002).

15

2.8 Tipos de envases de plásticos utilizados en la industria alimentaria

Los plásticos que hoy en día utilizamos, son económicos, livianos,

transparentes y nos hace más práctica la vida. Sin embargo los plásticos

más comunes que usamos cotidianamente y que emplearemos para este

estudio son: Polietileno tereftalato (PET) y polietileno de baja densidad

(PEBD) ya que estos son los más utilizados en la industria alimentaria.

2.8.1 Polietileno tereftalato

Se produce a partir del ácido tereftálico y etilenglicol, por poli condensación;

existiendo dos tipos: grado textil y grado botella. Para el grado botella se lo

debe post condensar, existiendo diversos colores para estos usos

(Tecnología en Comunicación Visual II., 2006).

Las aplicaciones que se da son envases para gaseosas, aceites, agua

mineral, frascos varios (mayonesa, salsa, etc.), fibras textiles, laminados de

productos alimenticios, envases al vacío, bolsas y bandejas para

microondas, cintas de video y audio, películas radiográficas (Tecnología en

Comunicación Visual II., 2006).

Algunos beneficios: transparente, irrompible, liviano, impermeable, atóxico,

inerte (al contenido) (Tecnología en Comunicación Visual II., 2006).

16

2.8.2 Polietileno de baja densidad

Se produce a partir del gas natural es de gran versatilidad y se procesa de

diversas formas: inyección, soplado, extrusión.

Su transparencia, flexibilidad, tenacidad y economía hacen que esté presente

en una diversidad de envases, sólo o en conjunto con otros materiales y en

variadas aplicaciones. Es flexible, la superficie es encerada; se puede

colorear ya que tiene un color blanquecino (Tecnología en Comunicación

Visual II., 2006).

La diferencia estructural química ente los dos tipos de envase el PET y

PEBD, el primero posee un anillo aromático bencénico con enlaces doble y

segundo posee solo carbono e hidrogeno con enlaces simples (Jaramillo,

2001)

El contenido microbiano del material del envase depende de su composición

y de las condiciones de almacenamiento. Los envases de plásticos

usualmente poseen un bajo número de microrganismo como resultado de un

mal almacenamiento. Por otra parte, el almacenamiento y transporte de los

envases plásticos en condiciones de poco higiénicas puede ser un factor que

incrementa el número de contaminantes.

Algunas aplicaciones son envases de todo tipo: supermercados, boutiques,

congelados, industriales, etc.; recubrimiento de acequias; envasado para

medicamentos, alimentos y productos industriales, pañales descartables;

bolsas para suero (Tecnología en Comunicación Visual II., 2006).

17

2.9 Formación de biofilms por patógenos alimentarios

A pesar de que la mayoría de las especies bacterianas tienen la capacidad

de formar biofilms, algunos géneros lo forman más fácil y rápidamente que

otros, como es el caso de Pseudomonas, Listeria, Staphylococcus y Bacillus

reportado por Mattila-Sandholm y Wirtanen (1992); Lee Wong (1998).

En un ambiente de procesado de alimentos, la microbiota existente

probablemente esté formada por una mezcla de muchas especies según

Bagge-Ravn y otros (2003). Sin embargo, no se ha podido demostrar hasta

la fecha si la presencia de unas especies u otras es fruto de un fenómeno de

selección natural.

Según González (2005), si bien son numerosas las especies susceptibles de

formar biofilms en la industria de producción de alimentos se citan a

continuación algunas de especial importancia en relación con la seguridad

alimentaria.

2.9.1 Salmonella spp

Al igual que el resto de las enterobacterias, este género está formado por

bacilos cortos Gram negativos, no esporulados, anaerobios facultativos y

móviles en su mayoría. Estas bacterias se encuentran ampliamente

distribuidas por la naturaleza, son bastante resistentes a las condiciones

ambientales y muy poco exigentes en sus requisitos nutricionales lo que les

permite un rápido crecimiento y capacidad de colonización de ambientes muy

diversos, entre ellos el agua y los alimentos según Todar (2008).

Según datos de la European Food Safety Authority, Salmonella spp. es el

primer causante de brotes de toxiinfección alimentaria en la Unión Europea

(UE) en los últimos años EFSA (2009).

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Varios estudios han demostrado que Salmonella se puede adherir y formar

biofilms en superficies que se encuentran en las plantas de procesado de

alimentos y entre las que se incluyen plástico, cemento y acero según

Joseph y otros (2001); Chmielewsky y Frank (2003).

Según Lasa y otros (2009), diversos estudios han demostrado que

Salmonella, E. coli y muchas otras enterobacterias producen celulosa como

exopolisacárido principal de la matriz del biofilm y que la formación de éste

resulta esencial para la supervivencia de la bacteria en el ambiente.

2.9.2 Escherichia coli ATCC 35218

Todar (2008), reportaron que este género bacteriano está formado por

bacilos Gram negativos, catalasa positivos y oxidasa negativos, no

formadores de esporas, anaerobios facultativos con un amplio rango de

incubación, inmóviles o móviles mediante flagelos peritricos y con

necesidades nutricionales sencillas.

Para la formación de biofilms, E. coli emplea flagelos, pilis y proteínas de

membrana para iniciar la adhesión. Cuando ya está unida a la superficie

pierde sus flagelos e incrementa la producción de sustancias poliméricas

extracelulares según González (2005); Houdt y Michiels (2005).

Estudios han encontrado que algunas cepas de E. coli ATCC 35218 pueden

desarrollar biofilms como resultado de una mayor producción de

exopolisacáridos según Ryu y Beuchat (2004). Además, se ha demostrado

que la formación de biofilm proporciona una mayor resistencia a E. coli ATCC

35218 cuando se expone a soluciones de hipoclorito, uno de los

desinfectantes de mayor uso en la industria alimentaria según Ryu y Beuchat

(2005).

19

2.9.3 Staphylococcus aureus ATCC 25923

Las bacterias del género Staphylococcus son microorganismos ubicuos

difíciles de eliminar que colonizan ambientes muy dispares formando parte

de la microbiota habitual de la piel, la garganta y las fosas nasales de sus

hospedadores vertebrados.

Staphylococcus aureus es un coco Gram positivo aerobio o anaerobio

facultativo que produce fermentación láctica y es catalasa y coagulasa

positivo. Posee numerosos factores de virulencia, en su mayoría

componentes de la pared celular, y una variedad de exoproteínas que

facilitan la colonización de nuevos hábitats. Estas propiedades, hacen que

los estafilococos sean la causa de numerosas infecciones en mamíferos, que

van desde afecciones superficiales de la piel a patologías severas como

neumonías, meningitis, intoxicaciones alimentarias, shock séptico y

desórdenes autoinmunes Todar (2008).

Es un importante patógeno alimentario, y la intoxicación estafilocócica es una

de las causas más prevalentes de gastroenteritis en el mundo. Según datos

de la EFSA, S. aureus fue el causante del 4,1 % de los brotes de infecciones

alimentarias acaecidos en 2006 en la UE según EFSA (2007).

Esta bacteria se puede encontrar en alimentos crudos, equipos o

manipuladores y puede pasar a otros alimentos por contaminación cruzada,

si bien necesita multiplicarse hasta alcanzar concentraciones de 105 ufc/g

para producir la toxina y provocar la enfermedad. Los tiempos de

supervivencia de Staphylococcus aureus se ven incrementados con bajas

temperaturas, altos pH según González (2005).

20

2.10 Importancia de los biofilms en la industria alimentaria

Por esto hoy en día la industria alimentaria ha tratado con gran énfasis en

corregir este tipo de problemas generando programas eficientes de limpieza

y desinfección, que de no ser aplicados generan un fuerte impacto

económico sobre la industria y además pueden traducirse en un serio

problema de sanidad para los consumidores.

Sin embargo, su presencia puede ser perjudicial e indeseable puesto que en

muchos casos producen contaminaciones del producto acabado. Lo que se

traduce en una disminución del periodo de conservación o incluso en una

transmisión potencial de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA).

Gracias a la globalización en el comercio de alimentos, hoy en día lo que se

produce en un país se vende y consume en todo el mundo. Esto significa que

un producto alimentario contaminado puede causar brotes de enfermedad en

muchos países al mismo tiempo, involucrando a cientos, e incluso miles de

personas. La vigilancia por tanto, debe tener una sensibilidad tal que permita

tomar medidas oportunas para el control de brotes, y que también permita su

prevención, constituyéndose en un componente esencial de cualquier

sistema de inocuidad alimentaria.

Desde un punto de vista tecnológico, hoy día se sabe que los biofilms

pueden ocasionar reducción de la transmisión del calor, pérdidas

energéticas, bloqueo de los poros de membranas y la corrosión de metales.

En resumidas cuentas, todo ello se traduce en pérdidas económicas para las

industrias.

21

III. MATERIALES Y METODOS.

3.1 Lugar de ejecución

Laboratorio de Microbiología y Biotecnología del Departamento de Ciencia de

la Universidad Privada Antenor Orrego.

3.1.1 Materiales y equipo

Materiales

Material biológico

Salmonella spp, Escherichia coli ATCC 35218 y Staphylococcus

aureus ATCC 25923.

Reactivos

Agua destilada

Cristal Violeta

Alcohol

Instrumentos

Gradilla

Asa bacteriológica en asa y punta

Placa Petri

Pinza

Mechero

Micropipeta 10 – 100 uL Marca Brand

Puntas de micropipetas estériles

Espátula o asa drigalski

Pipeta de 10 mL ± 0.1

22

Pipeta de 5 mL ± 0.1

Piseta

Tubos de ensayo pyrex

Tubos de ensayo pyrex con tapa rosca

Frasco con tapa rosca de 100 mL Marca Boeco

Matraz de 1000 mL

Probeta de 1000 mL

Medios de cultivo nutritivo

Agar MacConkey

Agar Manitol Salado

Medio Luria Bertani (LB)

Agar Tres Azucares y Hierro (TSI)

Agar Triptona Soya (TSA)

Envases

Polietileno tereftalato (PET)

Polietileno de baja densidad (PEBD)

Equipos

Cámara de radiación ultravioleta (UV)

Balanza. Marca Lantescale. Estándar Features

Espectrofotómetro. Marca Genesys 6

Autoclave. All American. Rango 100 – 133 oC. 15 lb.

Horno. Marca Thomas Elektrogeräte. Rango 100 – 250 oC

Hornilla eléctrica. Marca USA Ilumi. Rango min. 1 - max. 9

Incubadora. Marca Memmert. Made in west Germany. Rango 0 - 70 oC

http://www.google.com.pe/url?sa=t&rct=j&q=agar%20macconkey&source=web&cd=2&cad=rja&sqi=2&ved=0CEkQFjAB&url=http%3A%2F%2Fwww.britanialab.com.ar%2Fesp%2Fproductos%2Fb02%2Fmaconkeyagar.htm&ei=T8o1UOCCDI--9QTd7oGICw&usg=AFQjCNEHJFkGVc1URYHXlFPd4M1mGvdyAw

23

Refrigeradora. Marca Bosch Extra Cool +2 +4 +6 +8 +10 oC

Congeladora. Marca Bosch -24 -18 oC

3.2 Metodología

3.2.1 El esquema experimental

El esquema experimental para la formación de biofilms bajo condiciones in

vitro, tiene como variables independientes las bacterias Salmonella spp,

Escherichia coli ATCC 35218 y Staphylococcus aureus ATCC 25923, los

envases (Polietileno tereftalato y polietileno de baja densidad) y los tiempos

de incubación (6, 12, 24 y 48 horas), y como variable dependiente la

formación de biofilms como se aprecia en la figura 1.

24

Viales criogénicos

M1 M2 M3

E1 E2

T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4 T1 T2 T3 T4

E1 E2 E1 E2

Figura 1. Esquema experimental para la formación de biofilms bajo condiciones in vitro.

37 ºC

M1: Salmonella spp.

M2: Escherichia coli ATCC 35218.

M3: Staphylococcus aureus ATCC 25923.

E1: Polietileno tereftalato (PET).

E2: Polietileno de baja densidad (PEBD).

T1: Tiempo de incubación a 6 h




Formación de biofilms bajo condiciones in vitro

Densidad óptica

25

3.2.2 Método experimental

3.2.2.1 Proceso de formación de biofilms bajo condiciones in vitro.

En la figura 2, se muestra el diagrama de flujo para el proceso de formación

de biofilms bajo condiciones in vitro.

VIAL CRIOGÉNICO

ACONDICIONAMIENTO 1

ACONDICIONAMIENTO 2

IE

FORMACIÓN DE BIOFILMS

Figura 2. Diagrama de flujo para el proceso de formación de

biofilms bajo condiciones in vitro.

REFRIGERACION

INCUBACION 1

INCUBACION 2

INCUBACION 3

INOCULACION 1

INOCULACION 2

INCUBACION 4

26

Descripción de cada operación:

A continuación se detalla la descripción para el proceso de formación de


Refrigeración. Las diferentes cepas microbianas de Salmonella spp,

Escherichia coli ATCC 35218 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 fueron

obtenidas de los viales criogénicos que están a -24 °C, que luego pasaron a

refrigeración a 4 °C por 6 h.

Acondicionamiento 1. Luego de la refrigeración las cepas microbianas

pasaron a temperatura ambiente a 25 °C, se realizaron estriados de las

cepas sobre las placas (siembra) con medio de cultivo de acuerdo al tipo de

microorganismo.

Incubación 1. Las placas sembradas se incubaron a 37 ºC x 24 h.

Inoculación 1. De las placas sembradas se realizó una azada en 20 mL en

caldo Luria Bertani para cada tratamiento.

Incubación 2. Luego de la inoculación se incubó de noche (overnight) a 37

ºC x 16 h.

Acondicionamiento 2. Se realizó una resiembra, se tomó 4 mL de la

incubación de noche en 16 mL de caldo Luria Bertani fresco.

Incubación 3. La resiembra se incubó a 37 ºC por 1 h.

27

Inoculación 2. A cada tubo de ensayo que contenía 4 mL de caldo Luria

Bertani fresco y el tipo de envase, se procedió a inocular con 10 µL de la

resiembra.

Incubación 4. Después de inocular cada tratamiento, se incubó a diferentes

tiempos 6, 12, 24 y 48 h.

3.3 Metodología de análisis

3.1 Cuantificación de la formación de biofilms bajo condiciones in vitro

La cuantificación de la formación de biofilms bajo condiciones in vitro, se

realizó según el método descrito por O`Toole y Kolter (1998) con algunas

modificaciones. Este método se realizó en tubos de ensayo que contuvieron

4 mL de caldo Luria Bertani fresco y un tipo de envase (3 cm x 1 cm), luego

se inoculo 10 µL de cada bacteria para cada tratamiento, como control

negativo se tuvo un tubo de ensayo que solo contenía caldo Luria Bertani

fresco y el tipo de envase sin inoculo y como control positivo la formación de

biofilm. Luego de transcurrido cada período de incubación se procedió a

eliminar el contenido de caldo Luria Bertani de los tubos de ensayo y se

realizó dos lavados con agua destilada estéril, los tubos de ensayo que

contienen el tipo de envase (PET o PEBD) para la formación de biofilms se

dejaron secar a temperatura ambiente, seguidamente se agregaron 4 mL de

cristal violeta al 0.01 % (Deighton y otros, 2001) por 2 minutos, luego se

vertió el contenido de cristal violeta y se realizó un nuevo lavado con agua

destilada estéril. Finalmente se adiciono 4 mL de alcohol y pasado 5 minutos

se cuantificó su densidad óptica en el espectrofotómetro a 620nm. Para

medir la formación de biofilms (FM) se utilizó la siguiente fórmula:

FB = DOa620nm – DOb620nm (Kadurugamuwa y otros, 2003)

DOa620nm es la densidad óptica a 620 nm de las bacterias adheridas y

DOb620nm es la densidad óptica a 620 nm del control negativo (no inoculado)

28

3.2 Método estadístico.

Para esta investigación se consideró un diseño de bloque completo al azar

con arreglo trifactorial de 3 bacterias x 2 envases x 4 tiempo de incubación x

5 repeticiones. A los datos obtenidos se aplicó una prueba de Levene

modificada para determinar homogeneidad de varianzas, seguido de un

análisis de varianza (ANOVA) con un nivel de significación de 0.05 para

determinar diferencias significativas y finalmente se aplicó una prueba de

Duncan para determinar tendencias hacia el tratamiento que brinde la mejor

formación e biofilms.

Los análisis estadísticos se realizaron usando el software estadístico SPSS

(Statistical Package for the Social Sciences) versión 20. El nivel de confianza

usado fue de 95 %.

29

IV. RESULTADOS Y DISCUSION

4.1 Formación de biofilms bajo condiciones in vitro.

En la figura 3, se muestra la formación de biofilms bajo condiciones in vitro,

donde se observa una tendencia creciente a medida que pasan las horas de

incubación, induciendo la mayor formación de biofilms bajo condiciones in

vitro M1E1 (Salmonella spp. y el envase de polietileno tereftalato) y M2E1

(Escherichia coli ATCC 35218 y el envase de polietileno tereftalato), mientras

que M3E2 (Staphylococcus aureus ATCC 25923 y el envase polietileno de

baja densidad) presentó menor formación de biofilms.

Den

sid

ad

óp

tic

a (

620

nm

)

Tiempo

(horas)

Figura 3. Formación de biofilms bajo condiciones in vitro.

Dónde:

M1: Salmonella spp. E1: Polietileno (PET)

M2: Escherichia coli ATCC 35218 E2: Polietileno de baja densidad (PEBD)

M3: Staphylococcus aureus ATCC 25923

Tiempo (horas)

T

30

En la mayoría de los estudios, la formación de biofilms por diferentes

especies de microorganismos es estimada por densidad óptica, luego las

bacterias adheridas al vidrio, plástico u otro material son teñidas con cristal

violeta (CV) u otros colorantes que indican la biomasa total. El CV es un

colorante básico que se une a moléculas superficiales cargadas

negativamente y a polisacáridos en la matriz celular (Peeters y otros 2008)

Al-Shuneigat y otros (2005), determinaron la formación de biofilms mediante

un ensayo en microplacas de poliestireno (90 pozos), utilizando coliformes

totales y coliformes termotolerantes incubadas a 35 ºC y 44,5 ºC

respectivamente por 18 h. Para cuantificar la densidad óptica como una

estimación de la capacidad de formación de biofilms, la medición se realizó a

490nm. Un porcentaje significativo en ambos grupos, demostró la capacidad

de formación de biofilms, los coliformes totales el 50,0 %, y los coliformes

termotolerantes un 65,5 % formaron biofilms.

Danese y otros (2000), evaluaron la formación de biofilms por cuatro cepas

(E. coli 1, E.coli 2, E. coli 3 y E. coli ATCC), el estudio se realizó en cuatro

caldos de cultivo distintos M63 (US Biological, Swampscott, EEUU), M9

(Sigma), LB (Luria Bertani) y MH-II (Mueller-Hinton II) respectivamente, se

incubaron a 30 ºC durante 24 h. Utilizaron pocillos con los distintos caldos no

inoculados como controles negativos. Los biofilms adheridos en los pocillos

de poliestireno fueron teñidos con 130 µL de cristal violeta al 1 % durante 5

minutos, luego los pocillos lavados 4 veces con 150 µL de agua destilada, y

se obtuvieron la densidad óptica (630 nm) del crecimiento de la formación de

biofilms en lector de placas.

31

Hernández y otros (2009), investigaron la formación de biofilms, utilizaron en

su estudio 15 cepas de Salmonella. Emplearon dos placas de poliestireno

con 24 pozos cada una, las placas inoculadas se incubaron a 37 ºC por 24,

48 y 72 horas. Los valores de densidad óptica registrados en cada ensayo se

promediaron y se clasificaron en las categorías de: productora de biofilms

moderada o biofilms fuerte.

4.2 Efecto del tipo envase y tiempo de incubación sobre la formación de


En el Cuadro 4, se presentó la prueba de Levenne modificada con los datos

transformados (raíz cuadrada), donde se observó homogeneidad de varianza

(p>0.05), por lo que se procedió a realizar un análisis de varianza y

posteriormente la prueba de Duncan.

Cuadro 4. Prueba de Levenne modificada con los datos transformados

(raíz cuadrada) para la formación de biofilms bajo condiciones in vitro.

Estadístico de

Levenne

Grados de

Libertad 1

Grados de

Libertad 2

p

1.000 23 96 0.476

32

En el Cuadro 5, se presentó el análisis de varianza, donde se observó efecto

significativo para cada bacteria, tipo de envase y tiempo de incubación sobre

la formación de biofilms bajo condiciones in vitro a un nivel de confianza del

95 %.

Cuadro 5. Análisis de varianza para formación de biofilms bajo

condiciones in vitro.

Variable Fuente de variación

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Cuadrados medios

F p

Formación de

biofilms

Bacteria: A 1.033 2.000 0.517 202.651 0.000

Envase: B 1.285 1.000 1.285 503.925 0.000

Tiempo: C 0.681 3.000 0.227 89.051 0.000

A*B 0.496 2.000 0.248 97.218 0.000

A*C 0.593 6.000 0.099 38.728 0.000

B*C 0.246 3.000 0.082 32.138 0.000

A*B*C 0.811 6.000 0.135 52.987 0.000

Error 0.245 96.000 0.003

Total 5.389 119.000

Resultado similar fue reportado por Martínez (2010), quien estudió la

formación de biofilms en placas de polietileno, se evaluó el tiempo de

incubación, la proporción de inóculo, con el fin de validar las diferencias entre

estos parámetros y determinar la combinación de variables que favorecen la

formación de biofilm. Realizó un análisis de varianza que justifica que los

tratamientos tienen una influencia significativa en la formación de biofilm, con

un error p < 0.05 y un nivel de significancia del 95 %.

33

En el Cuadro 6, se muestran los resultados de la prueba de Duncan para la

formación de biofilms bajo condiciones in vitro, donde se observó que los

tratamientos M1E1 (Salmonella spp y envase de polietileno tereftalato) en el

subconjunto 8 y M2E1 (Escherichia coli ATCC 35218 y envase de polietileno

tereftalato) en el subconjunto 7, presentaron mayor formación de biofilms

bajo condiciones in vitro a las 24 horas.

34

Cuadro 6. Prueba de Duncan para la formación de biofilms bajo

condiciones in vitro.

Variables Subconjunto

Bacteria Envase Tiempo (horas)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

M3 E2 12 0.134

M3 E1 6 0.150 0.150

M3 E2 6 0.193 0.193

M2 E2 6 0.195 0.195 0.195

M3 E2 24 0.198 0.198 0.198

M1 E2 12 0.229 0.229 0.229

M1 E2 6 0.231 0.231 0.231

M3 E1 12 0.239 0.239 0.239 0.239

M3 E2 48 0.242 0.242 0.242 0.242

M1 E2 24 0.248 0.248 0.248 0.248

M3 E1 24 0.248 0.248 0.248 0.248

M2 E2 12 0.250 0.250 0.250 0.250

M3 E1 48 0.253 0.253 0.253 0.253

M2 E2 24 0.261 0.261 0.261 0.261

M1 E2 48 0.267 0.267 0.267

M1 E1 6 0.279 0.279 0.279

M1 E1 12 0.282 0.282 0.282

M2 E2 48 0.518

M2 E1 48 0.518

M2 E1 6 0.543

M2 E1 12 0.549

M2 E1 24 0.574

M1 E1 24 0.979

M1 E1 48 1.723

Dónde:




35

Para cuantificar mejor los tratamientos con respecto a la formación de

biofilms, se podría explicar teniendo en cuenta la mayor concentración de

bacterias; pero si bien hay una mayor concentración de bacterias, no

necesariamente se dará una mayor formación de biofilm, esto se debe a

todos los factores que pueden influir en su mecanismo de formación, desde

la adhesión hasta la maduración del mismo (Donlan y otros, 2000).

Las propiedades fisicoquímicas de la superficie también pueden ejercer una

fuerte influencia en el grado de adhesión y formación de biofilms, se ha

encontrado que la variación en la concentración de diversos cationes (sodio,

calcio, hierro) afecta la adhesión de algunas bacterias Characklis (1981). Las

características de la superficie celular como los flagelos, pili, proteínas de

adhesión y cápsulas ejercen también su influencia en la formación de

biofilms. Los flagelos, que proporcionan movimiento; los pilis, son más cortos

que los flagelos pero actúan como un sistema de cierre que permite su unión

y desunión con facilidad para fijarse a las superficies y también actúan como

quimiorreceptores dirigiendo a la bacteria hacia a algunos sitios específicos;

y las capsulas que sirven de adhesión permitiendo la colonización de

bacterias. La pérdida de estos apéndices cambia las propiedades de

superficie de la bacteria, lo que puede provocar una menor capacidad de

adhesión y en consecuencia menor desarrollo de formación de biofilms.

González (2005).

Sin embargo, los resultados mostraron que, quienes registraron una mayor

formación de biofilms sobre el tipo de envase de polietileno tereftalato fueron

las bacterias Salmonella spp. con una densidad óptica igual 0.979 y la

Escherichia coli ATCC 35218 con una densidad óptica igual 0.574 a las 24

horas de incubación.

36

V. CONCLUSIONES

El efecto del tipo de envase y tiempo de incubación fue significativo sobre la


alimentario.

Se determinó que el tiempo de incubación de 24 horas y el tipo de envase

de polietileno de tereftalato permitió la mayor formación de biofilms bajo

condiciones in vitro con la bacteria Salmonella spp.

37

VI. RECOMENDACIONES

Es necesario en trabajos futuros, estudiar otras bacterias que puedan

favorecer la formación de biofilms, de manera que se puedan desarrollar

metodologías que permitan reducir y/o eliminar la formación de las mismas

en las plantas de procesamiento de alimentos y así asegurar productos

inocuos y de buena calidad microbiológica.

Realizar ensayos sustituyendo el plástico por el vidrio para observar que

efecto tienen las bacterias sobre la formación de biofilms.

Se recomienda que todos los tipos de materiales para envasar alimentos o

bebidas, deban ser almacenados adecuadamente para evitar su

contaminación o que sufran modificaciones que posteriormente puedan

favorecer el crecimiento de los microrganismo.

Según los resultados obtenidos en esta investigación, es recomendable para

cualquier tipo alimento envasar en polietileno tereftalato teniendo en cuenta

las condiciones higiénicas adecuadas, ya que dicho envase mencionado

inducen con mayor facilidad a la formación de biofilms.

38

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45

VIII. ANEXOS

Anexo 1. Medidas estadísticas de la formación de biofilms.

Bacteria Envase Medida estadística

Tiempo (horas)

6 12 24 48

M1

E1 Media 0.279 0.282 0.979 1.723

Desv. típ. 0.019 0.029 0.045 0.045

E2 Media 0.231 0.229 0.248 0.267

Desv. típ. 0.074 0.030 0.031 0.037

M2

E1 Media 0.543 0.549 0.574 0.518

Desv. típ. 0.161 0.080 0.045 0.070

E2 Media 0.195 0.250 0.261 0.315

Desv. típ. 0.043 0.050 0.053 0.050

M3

E1 Media 0.150 0.239 0.248 0.253

Desv. típ. 0.038 0.021 0.024 0.024

E2 Media 0.193 0.134 0.198 0.242

Desv. típ. 0.080 0.071 0.025 0.051

Dónde:




46

Anexo 2. Desviación estándar de los valores promedios de la formación

de biofilms.

6 12 24 48

Y

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

Den

sid

ad

óp

tic

a (

62

0 n

m)

M1E1

M1E2

M2E1

M2E2

M3E1

M3E2

Tiempo (horas) X

Dónde:




47

Anexo 3. Prueba de Levenne modificada sin datos transformados para

la formación de biofilms bajo condiciones in vitro.

Anexo 4. Promedio de los resultados de la formación de biofilms por

densidad óptica (620 nm) de la bacteria Salmonella spp. sobre el envase

de polietileno tereftalato.

Tiempo (h)

Densidad óptica (DO) 6 12 24 48

DO1 0.380 0.366 1.134 1.854

DO2 0.342 0.337 1.041 1.846

DO3 0.370 0.407 1.097 1.741

DO4 0.358 0.353 1.038 1.808

DO5 0.391 0.393 1.031 1.810

Promedio de la formación de biofilms 0.3682 0.3712 1.0682 1.8118

Estadístico de

Levenne

Grados de

libertad 1

Grados de

libertad 2

p

1.690 23 96 0.042

48

Anexo 5. Promedio de los resultado de la formación de biofilms por

densidad (620 nm) de la bacteria Escherichia coli ATCC 35218 sobre el

envase de polietileno tereftalato.

Tiempo (h)


DO1 0.780 0.636 0.643 0.547

DO2 0.783 0.625 0.709 0.655

DO3 0.632 0.756 0.617 0.514

DO4 0.442 0.535 0.611 0.598

DO5 0.481 0.600 0.694 0.681



densidad óptica (620 nm) de la bacteria Staphylococcus aureus ATCC

25923 sobre el envase de polietileno tereftalato.

Tiempo (h)


DO1 0.313 0.325 0.330 0.334

DO2 0.212 0.356 0.370 0.383

DO3 0.244 0.335 0.340 0.362

DO4 0.246 0.335 0.348 0.337

DO5 0.271 0.378 0.388 0.384


49


densidad óptica (620 nm) de la bacteria Salmonella spp. sobre el envase

de polietileno de baja densidad.

Tiempo (h)


DO1 0.335 0.234 0.229 0.260

DO2 0.212 0.209 0.309 0.352

DO3 0.335 0.283 0.274 0.278

DO4 0.181 0.268 0.257 0.269

DO5 0.213 0.270 0.292 0.295



densidad óptica (620 nm) de la bacteria Escherichia coli ATCC 35218

sobre el envase de polietileno de baja densidad.

Tiempo (h)


DO1 0.243 0.313 0.208 0.393

DO2 0.199 0.215 0.341 0.396

DO3 0.298 0.341 0.298 0.272

DO4 0.191 0.257 0.3 0.344

DO5 0.223 0.306 0.336 0.349


50


densidad óptica (620 nm) de la bacteria Staphylococcus aureus ATCC

25923 sobre el envase de polietileno de baja densidad

Tiempo (h)


DO1 0.200 0.137 0.272 0.218

DO2 0.206 0.158 0.214 0.239

DO3 0.376 0.3 0.256 0.335

DO4 0.198 0.135 0.228 0.31

DO5 0.184 0.138 0.219 0.31


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