Remoción de Biofilms

7/24/2019 Remocin de Biofilms

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REMOCIN DE BIOFILMSBlga. Mariela Vinces

Ing. Alan Castillo


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Qu un biofilm?

Es una poblacin de clulas creciendo adheridas a unasuperficie y/o, entre ellas, en agregados y embebidas en unamatriz de sustancias polimricas extracelulares (SPE)

Thallinger, et. al., 2013


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El biofilm puede estar compuesto de:

Monoespecies

AB D

C Mezcla de fenotipos de una especie dada

Diversas especies

Qu tipos de biofilms se forman?


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Superficiesde trabajo

Personal

Contactodirecto

Vas de contaminacin en la industria

Los microorganismos patgenos o de alteracin

pueden introducirse en el proceso de elaboracin:

Higiene deficiente

Equipocontaminad

o

Recontaminacin

PRODUCTO FINAL

Aireambiental

MateriaprimaProductos

delimpieza


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Superficies duras

Vidrio

Metal

Polmeros

Materiales (superficiespintadas, linleum andazulejos plsticos)

Superficies blandas

Algodn

Polister

Rayn

Nylon

Lana

Celulosa

En qu tipos de superficies crece un biofilm?


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Biofilms y biocorrosin

Segn un estimado, aproximadamente el 20% de lacorrosin anual, los daos metales y no metales deequipos industriales han sido causados porbiocorrosin o corrosin microbiana inducida (MIC)

Vlvula


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Microorganismos en biofilms y corrosion

Algunos microorganismos en biofilms catalizanreacciones qumicas y biolgicas.

Son causantes de corrosin del metal en tuberas,maquinaria de bombeo y tanques de almacenamiento


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Bacterias Sulfato-reductoras

Las bacterias reductoras de sulfato (SRB), se hanencontrado como responsables de los casos mximos debiocorrosin.

Forman biofilms sobre metales y su actividad genera H2S,

que tienden a promover la corrosin y el ataquelocalizado.


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2 3 41

De izquierda a derecha de un acero inoxidable tipo 304 2bcon acabo normal (1) hasta el final con electropulido (4)

Adhesin dependiente del tipo de acabado


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Etapas de formacin de un biofilm

b

2 3 4 51

a

1) Adhesin inicial a la superficie

2) Colonizacin y produccin de SPE3) Estructura temprana del biofilm4) Estructura madura del biofilm5) Liberacin y dispersin de clulas

(a) liberacin de clulas planctnicas mviles

(b) liberacin de un fragmento del biofilm.


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1) Fimbria

2) Pili

3) Flagelos

Una vez alcanzado el contacto clula-superficie, intervienenapndices protenicos de la superficie celular para suadhesion:

FAVORECEN LA ADHESIN A LASSUPERFICIES Y ENTRE CLULAS

(20 min 4 h)

Etapa 1: Adhesin inicial(adhesin irreversible)


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Aplicacin de microscopa de fuerza atmica (AFM)

nN

Mide la magnitud ofuerza repulsiva o deatraccin sobrediferentes superficies: minerales, metlicas, macromolculas o superficies

microbianas

Adhesin dependiente del tipo de polmero


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La formacin de la microcolonia ser precedida de laadhesin irreversible dadas las condiciones decrecimiento apropiadas

Resultado simultneo de la agregacin y del crecimientode microorganismos, proceso acompaado por laproduccin de SPE por los mismos microorganismos

Etapa 2: Colonizacin y produccin de SPE(Sustancia polimrica extracelular)


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La produccin de SPE es activada es respuesta aestmulos externos, as como la densidad celular, estrso limitacin de nutrientes

En respuesta a la adhesin y estmulo ambiental, as

como la presin osmtica, pH, temperatura e inanicin



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Un biofilm es un material complejo de SPE:

1) Polisacridos,

2) Protenas,

3) Glicoprotenas,

4) cidos nucleicos

5) Lpidos

3%



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Biofilm Pseudomona aeruginosa desarrollado sobre acero inoxidable durante 48 h

Tincin

VITAL

Un verdaderoBiofilm debecontener al menos104 ufc/cm2

20 m

Estructura de un biofilm maduro

Objetivo

40 X


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Pseudomonas spp. Listeria Enterobacter

Flavobacterium Alcaligenes Staphylococcus Bacillus

Gneros que formancon facilidad

Salmonella spp. Escherichia coli

Listeria monocytogenes

Staphylococcus aureus Campylobacter jejuni

Yersinia enterocolitica

Importancia en

relacin con laseguridad alimentaria

Formacin de biofilms bacterianos


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Saccharomyces cerevisiae Brettanomyces

Hansenula

Pichia

Candida albicans

Candida dubliniensis Aspergillus fumigatus

Hongos (filamentosos ylevaduriformes)

Formacin de biofilms fngicos


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Mecanismo de accin de los biocidas

Citoplasma, produccinATPPeroxygens

Halgenos

ProtenasMetales pesadosYodforos

ParedcelularAldehdos

Membrana celular

Compuestos de amonio cuaternario(QACs)AlcoholesFenlicos

ADN

ARNm

Ribosomas

cidos

nucleicosAldehdosxido de etilenoPeroxygens

Halgenos


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Es un proceso de comunicacin de clula a clula quepermite a la bacteria compartir informacin y detectar ladensidad celular y en consecuencia ajustar la expresingnica

Por qu es resistente un Biofilm:Quorumsensing


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Clulas Autoinductoras

(AIs)

El proceso est mediado por pequeas molculas,producidas y secretadas por las mismas clulas(autoinductoras o de sealizacin)

Cmo funciona quorum sensing?


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MsBiofilm

MenorBiofilm

y su sntesis es dependiente de la densidad celular

As, la concentracin de las molculasAIs representa unamedida del nmero de clulas en el biofilm

Cmo funciona quorum sensing?


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AIs: Hay dos tipos principales de molculas

Homoserinlactonas(A-HSL)

Gram

Negativas

Molculas peptdicas(AIP)

Gram

Positivas

AI R bl d l l i d i


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AIs: Responsables de la regulacin de variosprocesos fisiolgicos


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Molculas antibiofilm

Rendueles, O., Ghigo, JM. (2012) Multispecies-Biofilms: how to avoid unfriendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 118.

Clulas planctnicas

Enzimas

Enzimas

Sustancias que intervengan en cada una de las diferentesetapas de formacin de un biofilm


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Mtodos de deteccin y control


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Mtodos de deteccin

Hisopos

Esponjas

Placas de contacto

Fracciones de superficies

Mtodos convencionales


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Mtodos de deteccin

Tcnicas microscpicas (DEM)

Tincin directa del biofilm por producto

Sensores de higiene + mtodo rpido

Mtodos enzimticos (Deteccin de ATP por bioluminiscencia)

Mtodos rpidos


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Tincin

VITAL

Microscopa de epifluorescencia directa


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Tincin de biofilm con productos


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Deteccin por el mtodo de cristal violeta

Agregar 100 l de agua destila y 25 l de cristal violeta al (1% en agua)

sobre los discos. Incubar 15 min a temperatura ambiente, enjuagar tres veces con 5 ml deagua destilada (total 15ml).

Colocar los discos en frascos con 2 ml de etanol y 3 g de perlas. Agitarpor 15 s.

Leer la absorbancia de 125 l de la solucin cristal violeta-etanol a 595nm con un lector de microplaca.

(OToole and Kolter 1998)


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Lectura en luminmetroUnidades Relativas

de Luz (URL)

Luciferina-luciferasa+ ATP de muestra

O2 + Mg2+

Equivalente a la cantidad de ATP

Luz

Lucirnaga(Photinus pyralis)

+ Oxyluciferin + AMP + PPi + CO2

h

Adenosin trifosfato(Adenosine TriphosPhate)

Propiedad de producir luz quetienen algunos organismos

Deteccin de ATP por bioluminiscencia


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Shama, G., Malik, D.J., The uses and abuses of rapid bioluminescence-based ATP assays. Int. J. Hyg. Environ. Health (2012),http://dx.doi.org/10.1016/j.ijheh.2012.03.009

Contenido de ATP en microorganismos


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Es un producto qumico especializado para ladeteccin de biofilms y contaminacin ensuperficies en la industria alimentaria, farmacuticay en restauracin, etc

Acta como auxiliar en el control de la higiene,diseado especialmente para superficies abiertas

METODO ENZIMATICO


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Composicin:Otros reactivos

Tensioactivos

Blanqueantes oxigenados

Propiedades fsico-qumicasAspecto: Lquido transparente

Viscosidad: 300500 cPColor: Anaranjado

pH: 4,55,5

Composicin y propiedades fsico-qumicas


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Puede ser clasificado como un mtodo rpidomicrobiolgico

Especficamente como un mtodo enzimtico

Se basa en la reaccin del biofilm con el perxido dehidrgeno debido a la presencia de la enzima catalasaproveniente de los microorganismos que forman elbiofilm

BioFinder: Un mtodo rpido


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Por tanto, la reaccin solo es posible enmicroorganismos viables

La reaccin es detectada visualmente

BioFinder (mtodo cualitativo) es similar a ladeteccin de Trifosfato de adenosina (ATP) porbioluminiscencia (mtodo semi-cuantitativo)

BioFinder: Un mtodo enzimtico cualitativo


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La enzima catalasa (naturaleza proteica) cataliza ladegradacin de dos molculas de perxido dehidrgeno a dos molculas de agua y una de oxgeno.

El oxgeno liberado ser el responsable de laformacin de las microburbujas que desarrollarn a suvez una espuma blanquecina

Reaccin enzimtica

Catalasa


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Con microorganismos catalasa-positivos Las enzimas catalasas enzimas antioxidantes(protenas) que est presentes en la mayora de

organismos vivos, incluyendo microorganismos como: La mayora de microorganismos aerobios (bacterias,levaduras y hongos)

Anaerobios facultativos o aerotolerantes, como Lactobacillus

plantarum

Con cules microorganismos reacciona


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Usar puro, no diluir, ni agitar el producto para suaplicacin

Aplicar a temperatura ambiente

Aplicarlo despus de los procesos de limpieza ydesinfeccin*

En caso de una reaccin positiva con el producto,repetir el procedimiento de higienizacin en laszonas afectadas.

Recomendaciones de aplicacin

* Muy importante, ya que de sta manera tendremos la seguridad que la reaccin ser debida a un biofilm


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Pulverizar suavemente con BioFinder lassuperficies de la instalacin a una distancia de1015 cm (temperatura ambiente)

Cmo se aplica?


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Observe the surface

6,60E+04

3,03E+062,01E+06

1,64E+05

Visual reaction

REACCIN DBIL POSITIVAREACCCIN NEGATIVA

Mezcladora (borde debajo de junta plstica)


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REACCIN FUERTEMENE POSITIVA


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Cisterna de leche (toma para la transferencia)


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Tanque receptor de leche (toma para latransferencia)

Rejillas de canal dej


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drenaje

Mesas det b j


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trabajo

Mesas de trabajo


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Mesas de trabajo


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Lateral del separador en bandat t d


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transportadora

Cajas de aceroinoxidable


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inoxidable

Cajas plsticas


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Cajasplsticas


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plsticas

Lavamos


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Lateral plstico de equipo detrabajo


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trabajo

Mquina automtica decorte


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corte

Rodillo de mquina automtica de


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corte


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Mquina picadora decarne

Utensilios de trabajo


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Utensilios detrabajo


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trabajo

Corchos


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Haragn ojalador


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Estropajo


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Biofilm compuesto de una mezcla de Salmonella Typhimurium con

Pseudomonas aeruginosa desarrollado durante 48 h a 37C sobre una

superficiede acero inoxidable.

ANTES DE PRODUCTO ENZIMTICO DESPUS DE PRODUCTO ENZIMTICO


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superficiede acero inoxidable

ANTES DE PRODUCTO ENZIMTICO DESPUS DE PRODUCTO DESINFECTANTE


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SIN PRODUCTO ENZIMTICO Y DESPUS DEPRODUCTO DESINFECTANTEANTES DE PRODUCTO ENZIMTICO



superficiede acero inoxidable

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