“biofilms” Staphylococcus aureus 8 Staphylococcus...
1
CSIC Grupo de Fermentos Lácticos y Bioconservación (DairySafe). Departamento de Tecnología y Biotecnología. Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC). Paseo Río Linares s/n, 33300, Villaviciosa, Asturias. e-mail: [email protected] Diana Gutiérrez , Beatriz Martínez, Ana Rodríguez y Pilar García Los “biofilms” (biopelículas) producidos por algunas especies pertenecientes al género Staphylococcus, en especial Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis, constituyen un serio problema en los sectores alimentario y hospitalario. En estos ecosistemas bacterianos los microorganismos quedan protegidos por una matriz extracelular que impide la penetración de antibióticos y desinfectantes, dificultando su eliminación. Los bacteriófagos y en concreto las proteínas líticas derivadas de ellos (endolisinas), son alternativas prometedoras para combatir este problema. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar la eficacia de la endolisina LysH5, codificada por el fago vB_SauSIPLA88 de S. aureus, para eliminar biofilms formados por S. aureus y por S. epidermidis. Se determinó además la sensibilidad de las células supervivientes a esta proteína y su capacidad para volver a formar biofilms. Finalmente, se comprobó la ausencia de bacterias “persisters” (células en estado durmiente, que resisten la acción de antibióticos, y que están relacionadas directamente con el fallo de los tratamientos antibióticos en terapia clínica) tras el tratamiento de cultivos con LysH5, así como la capacidad de esta proteína para eliminar este tipo de bacterias. Figura 2. LTSEM (low-temperature scanning electron microscopy) de los biofilms formados por S. aureus 15981 y S epidermidis YLIC17, sin tratamiento y tratados con LysH5. Sin tratamiento S. aureus S. epidermidis Tratamiento con LysH5 Dos tratamientos consecutivos con la endolisina LysH5 (0,15 μM) permiten la eliminación total del biofilm (Fig.3). Microscopía electrónica Eliminación total Figura 3. Eliminación de biofilms de 6 horas, formados por S. aureus 15981 y S. epidermidis YLIC17, tras dos tratamientos consecutivos con LysH5. Células adheridas al pocillo sin tratamiento (morado) y tratadas con LysH5 (gris). El tratamiento de cultivos de S. aureus con endolisina no genera bacterias “persisters”. LysH5, además, es capaz de eliminar completamente las bacterias “persisters” seleccionadas por dos antibióticos (rifampicina y ciprofloxacina) tras 2 h de tratamiento (Fig. 5). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Log (ufc/ml) Time (h) Figura 5. Selección y eliminación de bacterias “persisters”. Cultivos de S. aureus en fase exponencial fueron tratados con ciprofloxacina (gris), rifampicina (morado) y LysH5 (negro) durante 4 h. Las bacterias “persisters” seleccionadas tras el tratamiento inicial con ciprofloxacina y rifampicina, se trataron con LysH5 (gris oscuro y morado oscuro, respectivamente). Adición de LysH5 La endolisina LysH5 parece ser, a la vista de estos resultados, una alternativa factible a los sistemas actualmente en uso de eliminación de biofilms generados por S. aureus y S. epidermidis: ES ALTAMENTE EFICAZ NO GENERA RESISTENCIAS NO GENERA “PERSISTERS” ELIMINA “PERSISTERS” PREVIAMENTE SELECCIONADAS POR ANTIBIÓTICOS En algunas cepas (S. aureus 15981 y S. epidermidis B), la utilización de concentraciones sub- inhibitorias de LysH5 previene la formación del biofilm, aunque el crecimiento celular no varía (Fig. 4). Figura 4. Comportamiento del biofilm formado por S. aureus 15981 bajo concentraciones sub- inhibitorias de LysH5 (×MIC), expresado mediante la absorbancia relativa (gris) de las células adheridas al pocillo (absorbancia medida en presencia de una concentración de LysH5 determinada / absorbancia del biofim control); y el número de células viables en el sobrenadante (morado). Este efecto lo comparten los biofilms de S. epidermidis B 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 Log(cfu/ml) Absorbancia relativa(OD 595 nm) LysH5 ( MIC) 0 1 2 3 4 5 6 15981 YLIC17 Log(ufc/pocillo) El tratamiento con 0,15 μM LysH5 permite la eliminación de 2-3 unidades logarítmicas (Fig. 1A), así como la disminución de más de un 60% de la biomasa total (Fig. 1B). Figura 1. Actividad de LysH5 frente a biofilms de 6 horas formados por S. aureus 15981 y V329 y S. epidermidis Be YLIC17. (A) Células adheridas al pocillo sin tratamiento (morado) y tratadas con LysH5 (gris). (B) Fotografías de los pocillos teñidos con cristal violeta. (c) control (t) tratado. 0 1 2 3 4 5 6 15981 V329 B YLIC17 Log(ufc/pocillo) c t c t c t c t A B NO SON RESISTENTES: Tienen la misma sensibilidad a la endolisina que las células sin tratar. NO FORMAN MEJORES BIOFILMS: Forman la misma biomasa total que las no tratadas. Células supervivientes del biofilm Recuentos de viables
Transcript of “biofilms” Staphylococcus aureus 8 Staphylococcus...
CSIC
Grupo de Fermentos Lácticos y Bioconservación (DairySafe). Departamento de Tecnología y Biotecnología.
Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC). Paseo Río Linares s/n, 33300, Villaviciosa, Asturias.
e-mail: [email protected]
Diana Gutiérrez, Beatriz Martínez, Ana Rodríguez y Pilar García
Los “biofilms” (biopelículas) producidos por algunas especies pertenecientes al género Staphylococcus, en especial Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis, constituyen un serio
problema en los sectores alimentario y hospitalario. En estos ecosistemas bacterianos los microorganismos quedan protegidos por una matriz extracelular que impide la penetración de
antibióticos y desinfectantes, dificultando su eliminación. Los bacteriófagos y en concreto las proteínas líticas derivadas de ellos (endolisinas), son alternativas prometedoras para combatir este
problema.
El objetivo de este trabajo ha sido estudiar la eficacia de la endolisina LysH5, codificada por el fago vB_SauSIPLA88 de S. aureus, para eliminar biofilms formados por S. aureus y por S.
epidermidis. Se determinó además la sensibilidad de las células supervivientes a esta proteína y su capacidad para volver a formar biofilms. Finalmente, se comprobó la ausencia de bacterias
“persisters” (células en estado durmiente, que resisten la acción de antibióticos, y que están relacionadas directamente con el fallo de los tratamientos antibióticos en terapia clínica) tras el
tratamiento de cultivos con LysH5, así como la capacidad de esta proteína para eliminar este tipo de bacterias.
Figura 2. LTSEM (low-temperature scanning electron microscopy) de
los biofilms formados por S. aureus 15981 y S epidermidis YLIC17, sin
tratamiento y tratados con LysH5.
Sin tratamiento
S. au
reu
sS
. ep
ider
mid
is
Tratamiento con
LysH5Dos tratamientos consecutivos con la endolisina LysH5
(0,15 µM) permiten la eliminación total del biofilm
(Fig.3).
Microscopía electrónica Eliminación total
Figura 3. Eliminación de biofilms de 6 horas, formados por S.
aureus 15981 y S. epidermidis YLIC17, tras dos tratamientos
consecutivos con LysH5. Células adheridas al pocillo sin
tratamiento (morado) y tratadas con LysH5 (gris).
El tratamiento de cultivos de S. aureus con endolisina no genera bacterias “persisters”.
LysH5, además, es capaz de eliminar completamente las bacterias “persisters”
seleccionadas por dos antibióticos (rifampicina y ciprofloxacina) tras 2 h de tratamiento
(Fig. 5).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Log (
ufc
/ml)
Time (h)
Figura 5. Selección y eliminación de
bacterias “persisters”. Cultivos de S. aureus
en fase exponencial fueron tratados con
ciprofloxacina (gris), rifampicina (morado) y
LysH5 (negro) durante 4 h. Las bacterias
“persisters” seleccionadas tras el tratamiento
inicial con ciprofloxacina y rifampicina, se
trataron con LysH5 (gris oscuro y morado
oscuro, respectivamente).
Adición de LysH5
La endolisina LysH5 parece ser, a la vista de estos resultados, una alternativa factible a los sistemas actualmente en uso de eliminación de biofilms generados por
S. aureus y S. epidermidis:
ES ALTAMENTE EFICAZ NO GENERA RESISTENCIAS NO GENERA “PERSISTERS”ELIMINA “PERSISTERS” PREVIAMENTE
SELECCIONADAS POR ANTIBIÓTICOS
En algunas cepas (S. aureus 15981 y S. epidermidis B), la utilización de concentraciones sub-
inhibitorias de LysH5 previene la formación del biofilm, aunque el crecimiento celular no varía
(Fig. 4).
Figura 4. Comportamiento del biofilm formado
por S. aureus 15981 bajo concentraciones sub-
inhibitorias de LysH5 (×MIC), expresado
mediante la absorbancia relativa (gris) de las
células adheridas al pocillo (absorbancia medida
en presencia de una concentración de LysH5
determinada / absorbancia del biofim control); y
el número de células viables en el sobrenadante
(morado). Este efecto lo comparten los biofilms
de S. epidermidis B
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00
Lo
g(c
fu/m
l)
Ab
sorb
an
cia
rel
ati
va
(OD
59
5n
m)
LysH5 ( MIC)
0
1
2
3
4
5
6
15981YLIC17
Log(u
fc/p
ocil
lo)
El tratamiento con 0,15 µM LysH5 permite la
eliminación de 2-3 unidades logarítmicas (Fig. 1A), así
como la disminución de más de un 60% de la biomasa
total (Fig. 1B).
Figura 1. Actividad de LysH5 frente a biofilms de 6 horas
formados por S. aureus 15981 y V329 y S. epidermidis B e
YLIC17. (A) Células adheridas al pocillo sin tratamiento
(morado) y tratadas con LysH5 (gris). (B) Fotografías de los
pocillos teñidos con cristal violeta. (c) control (t) tratado.
0
1
2
3
4
5
6
15981V329
BYLIC17
Lo
g(u
fc/p
ocil
lo)
c t c t
c t c t
A
B
NO SON RESISTENTES: Tienen la misma
sensibilidad a la endolisina que las células sin tratar.
NO FORMAN MEJORES BIOFILMS: Forman
la misma biomasa total que las no tratadas.
Células supervivientes del biofilm
Recuentos de viables
