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AnyplexTM II HPV HR Detección

1 12/2013 V1.00

ANYPLEXTM II

HPV HR Detection

(Cat. No. HP7E00X)

Sistema de PCR Anyplex II para la detección de 14 Virus del Papiloma Humano de alto riesgo

(VPH) (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) a partir de muestras citología

de base líquida e hisopados cervicales.

Para usar con el sistema de PCR en tiempo real: CFX96TM (Bio-Rad)

Unión Europea: (uso diagnóstico In Vitro)

Este producto puede ser utilizado para los propósitos de IVD en la Unión Europea.

Otros países: (uso exclusivo en investigación)

Este producto debe ser utilizado con fines RUO en otros países.

No está disponible en los EE.UU.


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TABLA DE CONTENIDOS

NOTAS

PROPÓSITO DE USO

DESCRIPCIÓN DE PRINCIPIOS Y PROCEDIMIENTOS

INFORMACIÓN GENERAL

REACTIVOS

ALMACENAMIENTO Y MANIPULACIÓN

MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS

PROTOCOLO

CONFIGURACIÓN DEL INSTRUMENTO PARA PCR EN TIEMPO REAL Y ANALISIS DE RESULTADOS

RESULTADOS

SOLUCIÓN DE PROBLEMAS

RENDIMIENTO

REFERENCIAS

EXPLICACIÓN DE LOS SÍMBOLOS

INFORMACIÓN SOBRE PEDIDOS


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NOTAS:

Este producto puede ser usado con propósito para diagnostico in vitro (IVD) en la unión

europea (EU) puesto que la marca IVD CE es revisado por las directivas de EU (98/79), pero

debe usado como RUO (Researh Use Only) en otros países.

Si este producto es usado con MICROLAB NIMBUS IVD y MICROLAB STARlet, máximo en 5

corridas separadas.

Esta prueba ha sido validada para los siguientes tipos de muestras: hisopados cervicales y

muestras de citología líquida. Esta prueba no ha sido validada en otros tipos de muestras.

Almacene las muestras de ADN a -70°C y mantenga en hielo mientras las usa.

La sensibilidad de un ensayo puede disminuir si se congelan y descongelan repetidamente

las muestras y se almacenan por un largo periodo de tiempo.

La confiabilidad de los resultados depende de la adecuada toma, transporte, y

almacenamiento de la muestra y ejecución del procedimiento.

El flujo de trabajo en el laboratorio debe proceder unidireccionalmente.

Siempre use guantes desechables en cada área y cámbielos antes de entrar en diferentes

áreas. Cambie los guantes inmediatamente si estos se contaminan o trátelos con un reactivo

descontaminante de ADN.

Destine consumibles y equipos a cada área de trabajo y no los mueva de una área a la otra.

No pipetee con la boca.

No coma, beba o fume en las áreas de trabajo en el laboratorio. Use guantes libres de polvo,

batas de laboratorio, y gafas de protección cuando manipule muestras y reactivos. Lave sus

manos a fondo después de manipular reactivos y muestras.

Evite contaminación de los reactivos cuando haga alícuotas desde los tubos de los reactivos.

Se recomienda el uso de puntas desechables estériles resistentes a aerosoles.

No mezclar reactivos de diferentes lotes o de diferentes tubos del mismo lote.

No use el producto después de su fecha de expiración.

Use tubos tapa rosca y evite cualquier tipo de contaminación cruzada de las muestras

durante las preparaciones.

Por favor tenga cuidado de no contaminar los reactivos con ácidos nucleicos extraídos,

productos de PCR, y controles positivos. Para prevenir la contaminación de los reactivos se

recomienda el uso de puntas con filtro.

Use áreas separadas para cada experimento.

Use un juego de pipetas diferente para cada área: extracción de ácidos nucleicos, mezcla de

reactivos, adición del templado de ácidos nucleicos, y adición del producto de PCR.

Únicamente en el área designada, abra los tubos o tiras después de la amplificación, para

evitar contaminación con amplicones.

Almacene el material positivo aparte de los reactivos del kit.

Tener en cuenta los procedimientos de bioseguridad del laboratorio (con referencia de

Bioseguridad en microbiología y laboratorio Biomédicos y los documentos de la CLSI)

cuando se manejen muestras. Limpie y desinfecte a fondo todas la superficies de trabajo

con hipoclorito de sodio al 0,5% (en agua desionizada o destilada).


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PROPOSITO DE USO:

El kit de detección Anyplex TM II HPV HR es una prueba cuantitativa in vitro para la detección de 14

tipos de alto riesgo del VPH (Virus del Papiloma Humano) (16, 18, 31, 33. 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58,

59, 66, 68) en citología en base liquida e hisopados cervicales.

DESCRIPCIÓN DE PRINCIPIOS Y PROCEDIMIENTOS

El kit Anyplex TM II HPV HR representa las tecnologías patentadas de Seegene, y está basada en la

tecnología TOCETM recientemente desarrollada, la cual hace posible detectar múltiples patógenos

en un solo canal fluorescente en un equipo para PCR en tiempo real.

En el análisis de curvas melting actual, se observan a menudo diferencias en las temperaturas entre

ADNs que tienen alta variación en la secuencia, resultando en problemas en el campo del

diagnóstico clínico donde los resultados precisos y reproducibles son críticos. Sin embargo, la

tecnología TOCE está diseñada para que no sea afectada por la variaciones en la secuencia,

garantizando valores de Tm consistentes.

El kit Anyplex TM II HPV HR, puede realizar múltiples análisis bien sea por CMTA – Punto Final (End

point- CMTA (End point-Catcher Melting Temperature Analysis) o por CMTA – cíclico (cyclic- CMTA

(Cyclic- Catcher Melting Temperature Analysis). El método CMTA – cíclico representa una nueva

clase de prueba molecular que puede discriminar patógenos importantes en las muestras co-

infectadas. El kit Anyplex TM II HPV HR es una prueba de PCR de tiempo real multiplex, que permite

la amplificación simultánea, detección y diferenciación de ácidos nucleicos diana de 14 tipos de alto

riesgo de VPH (16, 18, 31, 33. 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68), así como el control interno (IC).

En la PCR, la eficiencia puede ser reducida por los inhibidores que pueden estar presentes en las

muestras clínicas.

Se incorpora un control interno (IC) en el producto como un control endógeno de todo el proceso

con el fin de controlar el aislamiento del ácido nucleico, y para verificar la posible inhibición de la

PCR. El IC es co-amplificado con los ácidos nucleicos objetivo dentro de las muestras clínicas. El kit

Anyplex TM II HPV HR utiliza un gen humano como un control interno endógeno que puede asegurar

la purificación de ADN, la verificación de la reacción de PCR y la clarificación sobre la suficiencia

celular de cada espécimen.

El sistema uracil-ADN glicosilasa (UDG)-dUTP se emplea en el kit El kit de detección Anyplex TM II HPV HR. El sistema UDG-dUTP es un sistema comúnmente usado cuando se realiza PCR para eliminar contaminación por amplicones usando escisiones por UDG de residuos de uracilo desde ADN clivando el enlace N-glicosílicos.


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1. Procedimiento:

<Descripción del procedimiento con AnyplexTM II HPV HR>

INFORMACION GENERAL

El Virus del Papiloma Humano (VPH) está relacionado con el cáncer cervical. El Virus del Papiloma

Humano se puede dividir en grupos de "alto riesgo (HR)" y "bajo riesgo (LR)" sobre la base de su

asociación con lesiones cervicales.

Por lo tanto, es muy importante saber qué tipo de VPH está infectado en los pacientes para prevenir

el desarrollo del cáncer y la transmisión de la enfermedad. Actualmente, los productos principales

disponibles comercialmente para el diagnóstico de VPH están basados en el método de sondas de

hibridación para detectar y / o genotipificar VPH. Sin embargo, el principal defecto de los métodos

basados en sondas de hibridación es el alto rango de falsos positivos debido a la tasa de reactividad

cruzada entre las sondas y diversos tipos de ADN viral o amplicones para PCR usados para la

hibridación. Presentamos un ensayo innovador para la detección y genotipificación de VPH, que

amplifica sólo los blancos específicos sin ninguna reactividad cruzada, y es un sistema automatizado

en la detección usando PCR en tiempo real. El kit Anyplex TM II HPV HR solo detecta verdaderos VPH

y los genotipifica adecuadamente. También contiene un control Interno endógeno para verificar

cualquier inhibición que pudiera ocurrir durante la reacción de PCR.

El cáncer de cuello uterino, que avanza desde la etapa precancerosa a un cáncer invasor, tiene desde

7 a 20 años de estado pre-cancerígeno; por consiguiente, el diagnóstico precoz es posible cuando la

infección por VPH se sospecha. El VPH de alto riesgo puede conducir al desarrollo de cáncer de

cuello de útero; especialmente VPH 16 y 18 están asociados con 70% de casos de cáncer cervical.

Aislamiento del ácido nucleico

Ácido nucleico

Amplificación y detección

usando el sistema AnyplexTM II

Análisis de resultados

Muestras (citología en base

líquida e hisopado cervical).


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Anyplex TM II HPV HR puede identificar 14 tipos de alto riesgo de VPH, incluyendo VPH16 y 18 al

mismo tiempo.

REACTIVOS:

Los reactivos contenidos en un kit son suficientes para 100 determinaciones.

REF. HPS07SX

ANYPLEXTM II HPV 28

SIMBOLO CONTENIDO VOLUMEN DESCRIPCION

4X HPV HR TOM

500 UL TOCE Oligo Mix (TOM):

- Reactivos de Amplificación y detección.

4X Anyplex

PCR Master Mix (con UDG)

500 ul - ADN Polimerasa. - Uracil-ADN Glicosilasa. - Tampón conteniendo dNTPS.

HPV HR PC1

50 ul

Control Positivo (PC): - Mezcal de clones patógenos.

HPV HR PC2

50 ul

Control Positivo (PC): - Mezcal de clones patógenos

HPV HR PC3

50 ul

Control Positivo(PC): - Mezcal de clones patógenos

Agua libre de RNasas

1000 ul

Calidad ultrapura, grado PCR Control negativo (NC):

- Agua esterilizada como control negativo.

Manual de usuario

Anyplex II es una marca comercial de Seegene Inc.

ALMACENAMIENTO Y MANIPULACIÓN

Los componentes del kit de detección Anyplex TM II HPV HR deben almacenarse a -20 ℃. Todos los

componentes son estables en las condiciones de almacenamiento recomendadas hasta la fecha de

caducidad que aparece en la etiqueta. Se debe evitar la descongelación y congelación, ya que esto

puede reducir la sensibilidad. Si los reactivos se van a utilizar en forma intermitente, deben ser

congelados en alícuotas.


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MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS:

Guantes desechables libres de polvo (de látex o nitrilo).

Pipetas (ajustables) y puntas estériles para pipetas.

Tubos de microcentrífuga de 1.5 ml.

Kit de aislamiento de ácido nucleico (ver aislamiento de ácido nucleico).

Ice Maker.

Centrífuga de mesa.

Vortex mezclador.

Sistema CFX96TM PCR en tiempo real (Bio-Rad).

Tira de 8 tapas ópticas (Cat. No. TCS0803, Bio-Rad).

Tiras de 8 tubos sin tapas (color blanco, ref. Núm TLS0851, Bio-Rad).

Plato de 96 pozos para PCR, blanco (art. HSP-9655, Bio-Rad).

PROTOCOLO

1. TOMA DE MUESTRA, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE.

Nota: todas las muestras tienen que ser tratadas como materiales potencialmente infecciosos.

Serán permitidas sólo las muestras que sean recogidas, transportadas, almacenadas y que atiendan

estrictamente las siguientes normas e instrucciones:

Nota: para garantizar una alta calidad de las muestras, se deben transportarse lo más rápidamente

posible. Las muestras tienen que ser transportadas en las condiciones de temperatura indicadas.

A. Toma de muestras

Muestra de citología en base líquida

Siga las instrucciones del fabricante para la toma de muestras de células cervicales en medio

ThinPrep ® o SurePath TM

Muestra de hisopado Cervical

Para la toma de la muestra de hisopado cervical, por favor use los siguientes materiales:

La muestra de hisopado cervical puede ser recolectada y transportada en los siguientes

medios:

- ENAT (COPAN)

KIT DE RECOLECCIÓN DE MUESTRAS CERVICALES FABRICANTE REFERENCIA

ENAT PM 2ML L- SHAPE APPLICATOR COPAN 606CS01L

Deje el escobillón en el medio de transporte. Cierre y marque el contenedor de la muestra.

Siga las instrucciones para el almacenamiento y el transporte.


8 12/2013 V1.00

Por favor siga las recomendaciones del protocolo para la recolección de células epiteliales

de columna y escamosas después de remover el moco cervical.

B. Almacenamiento de muestras:

La sensibilidad de un ensayo puede disminuir si se congela y descongela repetidamente las

muestras o si se almacenan por largos periodos de tiempo.

Muestra de Citología Cervical Liquida:

Las muestras de células cervicales tomadas en ThinPrep® se pueden almacenar de 2°C a 8°C

hasta por 6 semanas. Las muestras cervicales tomadas en el medio SurePath™ pueden ser

nuevamente almacenadas de 2-8°C hasta por dos semanas.

Nota: La extracción de ácidos nucleicos debe hacerse lo más pronto posible.

Hisopado Cervical:

Si las muestras de hisopado no se procesan inmediatamente después de la recepción de la

muestra en el laboratorio, se deben almacenar a temperatura de 2°C a 8°C y se tienen que

procesarse dentro de 7 días.

C. Transporte de muestras:

Para asegurar una alta calidad de las muestras deben ser transportadas tan pronto como sea posible

a la temperatura indicada.

Muestra de citología en base líquida:

Las muestras colectadas en medio ThinPrep pueden ser transportadas de 2°C a 25°C. Las

muestras recolectadas en los medios SurePath deben ser transportadas a temperatura de

2°C a 8°C.

Muestras de hisopados cervicales:

Las muestras de hisopados cervicales deben ser transportadas refrigeradas.

Muestras de hisopados cervicales se deben enviar al laboratorio tan pronto como sea

posible después de la toma, siguiendo las instrucciones de laboratorio para el transporte

bajo refrigeración. Las muestras deben ser transportadas siguiendo también las

disposiciones locales y nacionales para el transporte de material patógeno.

2. Aislamiento de Ácidos Nucleicos:

Varios fabricantes ofrecen kits de aislamiento de ácidos nucleicos. Use la cantidad correcta de la

muestra según el protocolo en uso. Los siguientes kits de aislamiento han sido validados para su uso

con este kit.


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A. Pre-tratamiento de la muestra de citología cervical en base líquida

* Se equilibran las muestras a temperatura ambiente (19 a 25 ℃).

* Centrifugar 1 ml de muestra de citología en base líquida durante 15 minutos a 15.000 xg (13.000

rpm).

* El sobrenadante tiene que ser descartado. Posteriormente, el volumen recomendado remanente

(200-450 uL, ver las recomendaciones Vol. de 2-C, D), debe ser re suspendido en PBS 1X por vórtex

vigorosamente.

Nota: procesar el paso de pre-tratamiento de la muestra usando el buffer de lisis en el kit de

extracción y no el PBS 1X si las muestras son recolectadas en el medio SurePathTM y se analizarán

con el NIMBUS o STARlet.

* Seguir el protocolo del fabricante.

B. Muestra de hisopado cervical

*Se equilibran las muestras a temperatura ambiente (19 a 25 ℃).

*Para muestras de hisopados cervicales que contienen un hisopo en el medio de transporte, se

deben mezclar por vórtex.

*Las tapas de los tubos de muestras tienen que ser removidas cuidadosamente para evitar

contaminaciones. Cualquier exceso de moco en la muestra se debe quitar en este momento

recogiéndolo en el hisopo. Cualquier líquido residual del moco y del hisopo debe ser exprimido

presionando el hisopo contra la pared del tubo. Por último, el hisopo y la mucosidad se deben retirar

y desechar.

* Especímenes tomados en ENAT se pueden procesar directamente desde su envase primario.

C. KIT DE PREPARACIÓN MANUAL

KIT DE AISLAMIENTO FABRICANTE CAT. NO. VOLUMEN

RECOMENDADO

QIAamp DNA Mini Kit* QIAGEN 51304

Muestra: 200 uL Elución: 50 uL

Ribo_spin vRD** (Viral RNA/DNA Etraction Kit)

GeneAll 302-150 SG1701***


* El paso de la lisis debe realizarse usando 180 uL del buffer de ATL en lugar del Buffer AL en el caso

del medio SurePath.

** Ribo_spin vRD no es compatible con el medio SurePath.

*** Si desea comprar los productos de arriba desde Seegene, Inc., por favor usar este número de

catálogo.


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D. SISTEMA DE PURIFICACIÓN AUTOMATIZADA:

D-1. MICROLAB NIMBUS IVD:

Nota: ver el manual de operación del MICROLAB NIMBUS IVD.

SISTEMA DE PURIFICACION AUTOMATIZADO

FABRICANTE CAT. NO. VOLUMEN

RECOMENDADO

MICROLAB NIMBUS IVD Hamilton 65415-02*

STARMag 96 TISSUE Seegene 744300.4. 205875


STARMag 48x8 Tissue Cartridge Kit Seegene 744300.4 TC 384


* Si desea comprar los productos de arriba desde Seegene, Inc., por favor usar este número de

catálogo.

D-2. MICROLAB STARlet:

Nota: ver el manual del operador del MICROLAB STARlet



RECOMENDADO

MICROLAB STARlet Hamilton 173000-075*

STARMag 96 TISSUE Seegene 744300.4. 205875


STARMag 48x8 Kit Tissue Cartridge Kit Seegene 744300.4 TC 384



catálogo.

D-3 SEEPREP12TM :



RECOMENDADO

SEEPREP 12TM NorDiag SPN1200*

SEEPREP12 Viral NA kit NorDiag SPN1004* Muestra: 240 uL Elución: 60 uL


catálogo.


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Adicionar 10uL de proteinasa K (20 mg/mL; ordénelo por separado) a cada tubo de muestras

de 1,5 ml.

Transferir 240 uL de la muestra al tubo que contiene 10uL de proteinasa K, mezcle por

golpecitos gentilmente.

El cartucho y la bomba de ensamble se colocan en el instrumento.

Colocar el tubo de elución de 1,5 ml dentro del instrumento.

Presione “CONTINUAR”, en la primera pantalla del equipo para dejar que el instrumento

inicie.

Presionar “INICIO DE PROTOCOLO/ START PROTOCOL” en el SEEPREP12TM.

En el menú del protocolo selección, presione “SPN Viral NA-HT”.

En la selección del menú del volumen de la muestra, presionar “250 uL” y en la selección de

volumen de elución presione“60 uL”.

Siga las instrucciones de la pantalla para cargar el equipo.

Después de completar todos los pasos, cierre la puerta e inicie el equipo.

E RESUMEN:

QIAGEN 1 GeneAll2 SEEPREP12™ NIMBUS/STARlet

Hisopado ENAT O O O O

LBC ThinPrep® O O O O

SurePath™ O 3 X O O4

1. QIAam® DNA Mini Kit

2. Ribo_spin vRD (Viral RNA/DNA kit de extracción)

3. El paso de la lisis debe realizarse usando 180 uL del buffer de ATL en lugar del Buffer AL.

4. Si el ADN es extraído de una muestra tomada en el medio SurePath con el NIMBUS o el

STARlet, existe la posibilidad de que la sensibilidad se pueda reducir en comparación con

otros métodos de extracción.

3. Preparación de la PCR en tiempo real:

Nota: se deben utilizar los tubos y las tapas correctas. (ver MATERIALES REQUERIDOS PERO NO

SUMINISTRADOS).

Nota: Use puntas con filtro resistente a aerosoles y guantes ajustados para la preparación de

muestras. Utilizar con cuidado extremo para asegurar que no se presente contaminación cruzada.

Nota: descongelar completamente los reactivos sobre hielo.

Nota: centrifugar los tubos de reactivos para retirar las gotas del interior de la tapa.


12 12/2013 V1.00

5 ul 4X HPV HR TOM

5 ul 4X Anyplex PCR Master Mix (con UDG)

5 ul Agua libre de RNAsa

5 ul Muestra de Ácido Nucleico

20 ul Volumen total de reacción dePCR

Nota: calcular la cantidad necesaria de cada reactivo requerido basándose en el número de

reacciones (muestras y controles).

Nota: utilizar una nueva punta estéril de pipeta para cada muestra.

Nota: para el control negativo, utilice 5 ul de agua libre RNasas en lugar de ácido nucleico.

Nota: para el control positivo, utilice 5 ul de cada HPV HR, PC1, PC2 y PC3.

Nota: por favor tenga cuidado de generar contaminación cruzada de la mezcla maestra de PCR y las

muestras con el control positivo.

Nota: no etiquetar la tapa de los tubos de reacción ya que la fluorescencia se detecta a través de

la tapa.

Control positivo

Hay tres tubos de control positivo incluidos en el kit; HPV HR PC1, PC2 y PC3.

Cada PC incluye clones para 5 blancos.

Nota: para ejecutar la reacción de control positivo, preparar tres tubos de PCR

Control Positivo


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CONFIGURACIÓN DEL INSTRUMENTO PARA PCR EN TIEMPO REAL Y ANALISIS DE RESULTADOS

1. Sistema PCR en tiempo real CFX-96TM (BioRad).

1.1 Configuración del Instrumento para PCR en tiempo real

Nota: La configuración del programa en el sistema de PCR en tiempo real CFX-96TM (BioRad)

para la detección de 14 tipos de VPH y el IC, puede ser dividida en los tres siguientes pasos:

- Configuración del Protocolo.

- Configuración de la placa.

- Inicio de la corrida.

A. Configuración del Protocolo:

En el menú principal, haga click en protocolo para abrir la configuración del ensayo.

Figura 1. Configuración del protocolo. Crear un nuevo protocolo o cargar un protocolo existente

para el experimento.


14 12/2013 V1.00

2.) En el editor del protocolo defina el perfil térmico como sigue:

Nota: Lectura de placa en segmentos 8, 14 y 20. La fluorescencia es detectada en “Melting”.


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ii) CMTA – Punto final (Análisis melting de un tiempo):

NOTA: Por favor leer en el Segmento 8. La fluorescencia es detectada en “Melting”.

Figura 2. Editor del protocolo. (CMTA - cíclico)


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Figura 3. Editor del protocolo. (CMTA – punto final)

3.) Haga click sobre Volumen de muestra para editar directamente 20µl.

4.) Haga click en OK. La ventana de configuración del experimento se abrirá.

Figura 4. Protocolo de configuración del experimento. (CMTA-cíclico).


17 12/2013 V1.00

Figura 5. Protocolo de configuración del experimento. (CMTA-punto final)

B. Configuración de la Placa

1.) En Configuración de Placa del experimento, haga click en crear nuevo para abrir el editor de

placa para crear un nuevo plato.


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Figura 6. Editor de Plato. Crear un nuevo plato o cargar uno existente para el experimento.

2.) Haga click sobre selección de fluoróforos para indicar los fluoróforos (FAM, HEX, Cal Red 610, Quasar 670 y Quasar 705) que serán usados en el experimento.

Figura 7. Seleccionar los fluoróforos (FAM, HEX, Cal Red 610, Quasar 670 and Quasar 705).

3.) Escoja el pozo adecuado y haga click en tipo de muestra del menú desplegable. - Desconocido: Muestra clínica. - Control Positivo - Control Negativo 4.) Escoja las casillas apropiadas de verificación (FAM, HEX, Cal Red 610, Quasar 670 y Quasar 705), para especificar los fluoróforos en los pozos seleccionados.


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5.) Digite el nombre de la muestra y el control PC1, PC2, PC3 y presione la tecla enter.

6.) En ajustes del menú principal del editor de plato, escoja tamaño de plato (96 pozos) y tipo de plato (BR BLANCO).

Figura. 8 Configuración de plato.

7.) Haga click en OK y guarde en un nuevo archivo de configuración de plato. 8.) La ventana de configuración de experimento se abrirá.


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Figura 9. Configuración de plato del experimento.

C. INICIAR CORRIDO

1.) En configuración del experimento iniciar corrido, hacer click en cerrar tapa, para cerrar la tapa.

Figura 10. Cerrar la tapa.

2.) Hacer click en iniciar corrido. 3.) Almacene el archivo de corrido en mis documentos en la carpeta designada. Llene el

nombre del archivo, haga click en guardar y la maquina iniciará.


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1.2 Análisis de datos.

A. Crear una carpeta específica para guardar datos.

A.1 CMTA-cíclico

Cuando use la función “Exportar todos los datos a Excel“ (ver la página 23). 1. Para guardar los datos de cada punto de fusión del archivo de resultados, cree tres

carpetas. 2. El nombre de la carpeta para el primer dato de punto de fusión es “1”, para el segundo

“2”, y para el tercero “3”.

Cuando use la función “Exportación Seegene” (ver la página 26). 1. Para guardar los datos de punto de fusión del archivo de resultados, cree una

carpeta. 2. El nombre de la carpeta puede ser configurado como el usuario lo desee. 3. En el caso de usar “Exportación Seegene”, los nombres de las carpetas 1, 2, 3 se

crean automáticamente para guardar los datos de cada punto de fusión en la carpeta configurada por el usuario.

A.2 CMTA – punto final 1. Para guardar los datos de punto de fusión desde el archivo de resultados, se debe crear una carpeta. 2. El nombre del archivo puede ser determinado por el usuario como él lo determine.

B. Pre-ajustes para análisis de datos en el CFX-96. B-1 Usando la función “Exportación de todos los datos a Excel”. 1. Después del ensayo, haga click en el campo curva de fusión para confirmar los

resultados de los picos de fusión.

Figura 11. Resultados de picos de fusión.


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2. Haga click sobre Paso número “8” y seleccione exportar todos los datos a Excel desde el menú herramientas.

Nota: Seleccionar “Exportar todos los datos a Excel” directamente en el caso de CMTA-punto final.

Figura 12. Exportar todos los datos a Excel.


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3. Guarde el resultado en la carpeta“1”, cuando una ventana nueva esté abierta.

Nota: Guarde el resultado en la carpeta arbitraria en el caso de CMTA-punto final.

Figura 13. Exportar todos los datos desde las hojas de cálculo en análisis de datos a la carpeta designada.

4. Asegúrese que el resultado haya sido guardado en el archivo.

Figura 14. Archivos de los resultados exportados. Nota: Salte los pasos 5 y 8 en el proceso del siguiente estado de análisis para el caso de CMTA-punto final.


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5. Regrese al paso 2 y seleccione “Paso número 14”. Repita pasos 3 y 4 y guarde los datos en la carpeta “2”.

6. Regrese al paso 2 y seleccione “Paso número 20”.

7. Es necesario regular el umbral antes de la exportación de los datos desde el paso 20. Seleccione solo Quasar 670, el umbral del pico de fusión debe ser ajustada a cero.

Figura 15. Umbral de pico de fusión de Quasar 670

8. Repetir los pasos 3 y 4 y guardar los datos en la carpeta “3”. Los datos de cada paso son guardados como se muestra abajo.

B-2 Usando la función “Exportación Seegene”

1. Después de realizar la prueba, seleccione la curva de fusión para confirmar los resultados de los picos de fusión.


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Figura 16. Resultado del pico de fusión. 2. Es necesario regular el umbral antes de la exportación de los datos desde el paso 20.

Seleccione solo Quasar 670, el umbral del pico de fusión debe ser ajustado a cero.

Figura 17. Umbral del pico de fusión del Quasar 670


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3. Seleccione “Exportación Seegene” desde la barra de herramientas.

Figura. 18. Exportación Seegene.

4. Escoja la ubicación y presione él botón de “OK”.

Figura. 19. Exportación Seegene en la carpeta seleccionada.


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C. Configuración para el análisis de datos en Seegene Viewer.

1. Abra el programa Seegene Viewer en la pantalla, y click en abrir para encontrar los datos guardados en la “Carpeta 1”.

Nota: por favor encuentre los datos en la carpeta arbitraria en el caso de CMTA-punto final.

Figura 20. Seegene Viewer.

2. Después de abrir los archivos de los resultados, escoja la columna “PRODUCTO” y seleccione el kit en las listas.

Fig. 21. Configuración para el análisis de los datos en Seegene Viewer.

Nota: Por favor compruebe el tipo de tubo, el tiempo y el kit seleccionado (tiras de 8, placa de 96).


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3. Compruebe los resultados de cada pozo.

Figura 22. Resultado de CFX96TM en Seegene Viewer.


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RESULTADOS:

1. Información de los analitos.


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2. Interpretación de resultados.

A. CMTA- Cíclico.

Resultados VPH*

Resultado Control Interno*

Interpretación

+++ o ++ o + +++ o ++ Ácido nucleico blanco detectado.

- Identificación de tipo de VPH blanco.

+++ o ++ o + + o -

Ácido nucleico blanco detectado. ** - Identificación de tipo de VPH blanco. - Genotipos de VPH adicionales que no fueron

detectados pueden estar presentes.

- +++ o ++ Ácido nucleico blanco no detectado.

- + o -

Inválido. - Señal débil o negativa del control interno es

indicativa de una toma de muestra inadecuada, errores en el procedimiento o presencia de inhibidores.

- Procese otra alícuota de la muestra original y repita la prueba.

Resultado

CMTA- cíclico (Análisis de temperatura Melting de Catcher cíclico)

Primer punto CMTA Segundo punto

CMTA Tercer punto CMTA

+++ + + +

++ - + +

+ - - +

- - - -

* Si el control Interno o alguna otra señal no es detectada: ver SOLUCIÓN DE PROBLEMAS.

** La señal del control interno puede verse reducida o ausentarse por un alto título de patógenos.


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B. CMTA-punto final.

Resultados VPH*

Resultado Control

Interno* Interpretación

+ + Ácido nucleico blanco detectado.

- Identificación de tipo de VPH blanco.

+ -

Ácido nucleico blanco detectado. ** - Identificación de tipo de VPH blanco. - Genotipos de VPH adicionales que no fueron

detectados pueden estar presentes.

- + - Ácido nucleico blanco no detectado.

- -

Inválido - Señal débil o negativa del control interno es

indicativa de una toma de muestra inadecuada, errores en el procedimiento o presencia de inhibidores.

- Procese otra alícuota de la muestra original y repita la prueba.

* Si el control Interno o alguna otra señal no es detectada: ver SOLUCIÓN DE PROBLEMAS.

** La señal del control interno puede verse reducida o ausentarse por un alto título de patógenos.


32 12/2013 V1.00

3. Aplicación a muestras clínicas.

A. CMTA-cíclico. Primer Pico Melt (Primer punto CMTA)

Segundo Pico Melt (Segundo punto CMTA)

Tercer Pico Melt (Tercer punto CMTA)


33 12/2013 V1.00

B. CMTA-punto final.


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SOLUCION DE PROBLEMAS

ANYPLEX II HPV HR DETECCION

OBSERVACION CAUSA PROBABLE SOLUCIÓN

Control Interno a alguna otra señal no

son observadas.

Los fluoróforos para análisis de datos no cumplen con el protocolo.

Seleccione los fluoróforos correctos para el análisis de datos.

Temperatura de la máquina o ciclos de PCR incorrectos.

Verifique la condiciones de la PCR y repita la PCR bajos lo nuevos ajustes si es necesario.

Se dejaron los reactivos por largo tiempo a temperatura ambiente o se almacenaron en condiciones no apropiadas.

Verifique las condiciones de almacenamiento, y fecha de vencimiento de los reactivos (ver la etiqueta del kit), repita el ensayo con un kit nuevos si es necesario.

Programación incorrecta Repita el procedimiento de detección con una configuración correcta.

Fallo en la extracción de ácidos nucleicos

Asegúrese de está usando un método recomendado para el aislamiento de ácidos nucleicos.

Error en la toma de muestra.

Si las señales del control interno y del blanco no se observaron significa que hubo un error en la toma de la muestra.

La señal del control interno no es observada.

Alta carga del ácido nucleico del patógeno.

Si la señal del blanco es observada, el resultado es “detectado” para el patógeno blanco, aunque la señal del IC no se observe. Si desea verificar el control interno, diluya la muestra en PBS (10-100X), y repita el paso de extracción con la muestra diluida.

Presencia de inhibidores de PCR.

Diluya la muestra en PBS (10-100X), y repita el paso de extracción.

Falsos positivos o señal observada en el control negativo.

Presencia de contaminación cruzada.

Descontamine todas las superficies e instrumentos con hipoclorito de sodio y etanol. Use solo puntas con filtro durante el procedimiento de extracción. Cambie puntas entre tubos. Repita el procedimiento de extracción de ácidos nucleicos con un nuevo set de reactivos.

Contaminación cruzada entre PC1, 2 y 3.

Reinicie desde el paso de extracción o desde la PCR tiempo real.


35 12/2013 V1.00

ANYPLEX II HPV HR DETECCION OBSERVACION CAUSA PROBABLE SOLUCIÓN

Falso negativo o no se observa señal en

los controles positivos.

Error en la toma de muestra.

Tome una nueva muestra.

Almacenamiento incorrecto de la muestra.

Tome una nueva muestra y repita el procedimiento completo. Asegure que la muestra sea almacenada en las condiciones apropiadas.

Error en la extracción de ácido nucleico.

Repita la extracción del ácido nucleico.

Error en la adición de los ácidos nucleicos a los tubos de PCR correspondientes.

Verifique el número de tubos que contienen ácidos nucleicos y asegurarse de adicionar el ácido nucleico al tubo de PCR correcto durante el proceso de detección.

Presencia de inhibidores. Diluya la muestra en PBS (10-100X) y repita el paso de extracción con la muestra diluida.

Los fluoróforos para el análisis de datos no cumplen con el protocolo.

Seleccione los fluoróforos correctos para el análisis de datos.

Programación incorrecta. Repita la PCR con la configuración corregida.

Mezcla de reacción de PCR incorrecta.

Verifique que todos los componentes se hayan adicionado (si suele pre-componer la premix, la sensibilidad se reducirá). Cada reactivo se debe homogenizar y centrifugar para que el contenido de las tapas baje, antes de iniciar la PCR en tiempo real.

Se dejaron los reactivos por largo tiempo a temperatura ambiente o se almacenaron en condiciones no apropiadas.

Verifique las condiciones de almacenamiento y la fecha de vencimiento de los reactivos (ver el rótulo del kit), y use un nuevo kit si es necesario.


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RENDIMIENTO

1. Especificidad: La alta especificidad del kit AnyplexTM II HPV HR Detection está garantizada por los

cebadores específicamente diseñados para los objetivos de interés y las condiciones de

reacción. El kit Anyplex II HPV HR detection ha sido probado para reactividad cruzada en

85 diferentes patógenos. Los resultados mostraron amplificaciones por PCR en los blancos

únicamente.


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Para probar la validez de los resultados, el experimento se repitió 3 veces.


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2. Sensibilidad

Para determinar la sensibilidad del kit AnyplexTM II HPV HR Detection, se hizo una dilución

serial estándar desde 106 a 100 copias/reacción de ADN plasmÍdico, y se analizaron con el

kit AnyplexTM II HPV HR. El límite de detección para sensibilidad es de 50 copias/reacción.

3. Reproducibilidad

Las pruebas de reproducibilidad fueron realizadas en tres diferentes tiempos, en el

transcurso de 10 días, por tres diferentes experimentadores. Los mismos resultados fueron

obtenidos en cada prueba, confirmando la reproducibilidad del producto.


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REFERENCIAS

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EXPLICACION DE SIMBOLOS Explicación de símbolos usados en la etiqueta y en el manual.


42 12/2013 V1.00

INFORMACION SOBRE PEDIDOS

Cat. No. Product Size

AnyplexTM II HPV Series

HP7E00X AnyplexTM II HPV HR Detection 100 rxns

HP7S00X AnyplexTM II HPV28 Detection 100 rxns

Seeplex® HPV Series

HP6401Y Seeplex® HPV4A ACE Screening 50 rxns

Manual extraction system

SG1701 Ribo_spin vRD(Viral RNA/DNA Extraction Kit)

50 preps

Automated extraction system

SPN1200 SEEPREP12TM EA

SPN1004 SEEPREP12TM Viral NA kit 96 preps

SPN1101 SEEPREP12TM Tip Set 96 tips

65415-02 MICROLAB NIMBUS IVD EA

173000-075 MICROLAB STARlet EA

744300.4.205875 STARMag 96 Tissue 384T / 1box

744300.4.TC384 STARMag 48 X 8 Tissue Cartridge Kit

384T / 1box

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