Hoja técnica Sistema de detección rápida...

Sistema de detección rápida EZ-Fluo™

Un sistema rápido y no destructivo de detección microbiológica por tinción fluorescente

Hoja técnica

Fácil de integrar en cualquier laboratorioEl sistema de detección rápida EZ-Fluo™ de Merck Millipore le permite reducir significativamente el tiempo para obtener resultados, tratar antes los casos de contaminación y por tanto, controlar mejor su proceso de producción. EZ-Fluo™ es una tecnología fluorescente diseñada para la detección cuantitativa rápida de contaminantes en una amplia gama de muestras filtrables. Este nuevo sistema utiliza la filtración por membrana para detectar microorganismos viables y cultiva-bles hasta 1 UFC por muestra. Los resultados del análisis con EZ-Fluo™ son fácilmente comparables con los resultados del método de referencia, lo que facilita la validación y la

• Tecnología rápida capaz de proporcionar resultados en una tercera parte del tiempo requerido cuando se utilizan las técnicas tradicionales

• Método flexible basado en la filtración por membrana e incubación reducida en medio de cultivo

• Método no destructivo, compatible con cualquier técnica de identificación

• Equipo compacto que se adapta a cualquier mesa de laboratorio

• Solución eficaz a nivel de costes para uso rutinario y de investigación

integración de este sistema rápido en cualquier laboratorio sin causar interrupciones. La contaminación microbiológica detectada se puede identificar después utilizando su técnica de identificación habitual.

Liberación más rápida de producto Actualmente, los laboratorios de Control de Calidad están cambiando a métodos rápidos para la detección de contaminación microbiológica, ya que los métodos tradicionales requieren varios días para proporcionar resultados y tienen un valor limitado para la liberación rápida del producto, o para la realización de investiga- ciones urgentes cuando sea necesario.

Merck Millipore es una división de

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Protocolo sencillo basado en la filtración por membrana y su incubación El sistema de detección rápida EZ-Fluo™ consta de un lector y de los reactivos de tinción que se utilizan junto con las membranas de 47 mm y medio de cultivo estándar. Se pueden obtener resultados óptimos utilizando membranas Merck Millipore y una gama amplia de medios de cultivo. El uso de la cámara (opcional) permite la trazabilidad de los resultados y aumentar la comodidad de la lectura.

1. Preparación de muestrasFiltración utilizando el sistema Microfil® e incubación en medio de cultivo: simplemente filtre su muestra e incube la membrana en su medio de cultivo de la misma forma que lo realiza habitualmente.

2. Tinción fluorescenteTransferir la membrana a una placa Petri-Pad humectada con reactivo de tinción e incubar durante 30 minutos.

3. Recuento de UFCContar las colonias fluorescentes a través de la ventana del lector EZ-Fluo™, o utilizar la cámara (opcional) para ver las colonias en la pantalla de su ordenador.

AplicacionesEZ-Fluo™ puede detectar y cuantificar la contaminación microbiológica en cualquier muestra filtrable. Las posibles aplicaciones son numerosas e incluyen el análisis de los siguientes tipos de muestras:

• Materias primas

• Muestras en proceso

• Producto final

• Muestras ambientales

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EZ-Fluo™ es un método no destructivo que le permite seguir cultivando los microorganismos después de haberlos teñido con el fin de identificarlos utilizando cualquier tecnología

Paso de reincubaciónColoque la membrana en una placa de medio agar y vuelva a incubar.Recoger y aislar los microorganismos e identificar con la técnica de identificación habitual.

Después de la reincubación, las colonias son visibles a simple vista.

Las colonias no se ven fuera del lector.

Visualizar la placa después de la tinción. Imagen de la membrana en el lector.

estándar de identificación. Esto es una enorme ventaja comparado con otros sistemas de análisis rápidos que no permiten la identificación de los microorganismos.

Ejemplo: Muestra analizada de agua de proceso no estéril, utilizando el sistema EZ-Fluo™. Después de la detección, la membrana se volvió a incubar para crecimiento completo e identificación.

Tecnología no destructivaEl método EZ-Fluo™ se basa en un marcador fluorescente no destructivo desarrollado por Merck Millipore. Después de la filtración e incubación, se aplica el reactivo de tinción y se tiñen todos los microorganismos viables y cultivables. El reactivo, que es inicialmente no fluorescente, entra en el interior de los microorganismos y es escindido por una enzima propia del metabolismo activo celular.

Reactivo Cartón

Microorganismo antes de la tinción Incubación de la membrana en el cartón de tinción (incubación durante 30 minutos)

Microorganismo teñido

Principio de tinción fluorescente

La reacción libera el fluoróforo que se irá acumulando dentro de las células, lo que permite que la señal se amplifique de manera natural. Después se exponen las células a la longitud de onda de excitación del tinte fluorescente en el lector EZ-Fluo™ de forma que puedan contarse visualmente.

Reincubación para identificación de microorganismos

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Lector CámaraDimensiones

Longitud: 24,9 cm 9,7 cm

Ancho: 14,2 cm 6,6 cm

Altura: 12,5 cm 11,4 cm

Peso 4,4 kg 0,5 kg

Voltaje

Entrada: 100 – 240 V50 – 60 Hz Alimentada por el ordenador

Salida: 24 V CCConsumo Nominal: 670 mA 200 mA Máxima: 2080 mA 430 mAPotencia Nominal: 16 vatios 1 vatio Máxima: 50 vatios 2,15 vatios

NOTA: El lector se suministra con su cable de alimentación según la región.

Temperatura ambiente de trabajo 15 a 40 °C

Humedad < 90 %Altitud < 3.000 mInformación reglamentaria

Certificamos que el lector y la cámara EZ-Fluo™ se han diseñado y fabricado cumpliendo las siguientes directivas del Consejo Europeo: • Compatibilidad electromagnética 2004/108/CE• Restricción del uso de determinadas sustancias peligrosas en equipo eléctrico (RoHS) 2002/95/CE

Materiales Lector CámaraCarcasa: Lámina pintada de

aluminio 1050Placa frontal: Acero inoxidable 304L

Cámara óptica: Acero inoxidable 304L Carcasa: Aleación de aluminio pintado

Asa: Acero inoxidable 304L Ventana: CristalFiltro óptico: Cristal Protector de luz: Polimetilmetacrilato

transparente (PMMA) Protector LED: Policarbonato

transparentePatas: Cloruro de polivinilo

(PVC)Etiquetas: PoliésterPantalla: Poliéster protector

Especificaciones

Soporte técnico y serviciosMerck Millipore ofrece una gama completa de soporte técnico y servicios para ayudarle a ahorrar sus recursos de Control de Calidad y facilitar la implementación de su sistema EZ-Fluo™ en su rutina diaria de análisis. Nuestros técnicos pueden ayudarle con las siguientes actividades:

• Estudio de viabilidad, evaluación in situ• Desarrollo de métodos y consultoría

para el desarrollo de métodos• Instalación del equipo

• Formación del usuario• Calificación del sistema in situ (IQ/OQ)• Mantenimiento preventivo anual• Plan de servicios

Para obtener más información sobre nuestra oferta de soporte técnico y servicios, comuníquese con su Especialista en Aplicaciones.

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Información para pedidosDescripción Pq/ Referencia

Kits del sistema EZ-Fluo™

Kit estándar del sistema EZ-Fluo™ que incluye 1 lector, 1 cámara y un CD de instalación

1 EZFKIT001WW*

Equipo EZ-Fluo™

Lector EZ-Fluo™ 1 EZFREAD01WW*

Cámara EZ-Fluo™ 1 EZFCAM001

Material fungible

Kit de reactivos EZ-Fluo™ 57 tests EZFREAG57

Embudos Microfil® de 100 ml y membranas S-Pak® de 0,45 µm, negra y cuadriculada, de 47 mm

150 MIHABG100

Embudos Microfil® de 100 ml y membranas S-Pak® de 0,45 µm, blanca y cuadriculada, de 47 mm

150 MIHAWG100

Embudos Microfil® de 250 ml y membranas S-Pak® de 0,45 µm, negra y cuadriculada, de 47 mm

150 MIHABG250

Embudos Microfil® de 250 ml y membranas S-Pak® de 0,45 µm, blanca y cuadriculada, de 47 mm

150 MIHAWG250

Embudos Microfil® de 100 ml y membranas EZ-Pak® de 0,45 µm, negra y cuadriculada, de 47 mm

150 MZHABG101

Embudos Microfil® de 100 ml y membranas EZ-Pak® de 0,45 µm, blanca y cuadriculada, de 47 mm

150 MZHAWG101

Embudos Microfil® de 250 ml y membranas EZ-Pak® de 0,45 µm, negra y cuadriculada, de 47 mm

150 MZHABG251

Embudos Microfil® de 250 ml y membranas EZ-Pak® de 0,45 µm, blanca y cuadriculada, de 47 mm

150 MZHAWG251

Membranas EZ-Pak® de 0,45 µm, negra y cuadriculada, de 47 mm 600 MSP000814

Membranas EZ-Pak® de 0,45 µm, blanca y cuadriculada, de 47 mm 600 EZHAWG474

Membranas S-Pak® de 0,45µm, negra y cuadriculada, de 47 mm 600 HABG047S6

Membranas S-Pak® de 0,45µm, blanca y cuadriculada, de 47 mm 600 HAWG047S6

Placas Petri-Pad™, estéril, de 47 mm 150 PD20047S0

Placas Petri-Pad™, estéril, de 47 mm 600 PD20047S5

Accesorios EZ-Fluo™

Dispensador de embudos Microfil® de 100 ml 1 MIACFD101

Dispensador de embudos Microfil® de 250 ml 1 MIACFD201

Dispensador de membranas EZ-Pak® 1 EZDISP001

Rampa Microfil® de 3 puestos de filtración 1 MIAC03P01

Bomba de vacío EZ-Stream™ 1 EZSTREAM1

Tubo de silicona para bomba EZ-Stream™ Autoclavable Diámetro interno: 9,5 mm Longitud: 5,0 m

1 STREAMTUB

Tubo de PVC para bomba EZ-Stream™ No autoclavable Diámetro interno: 9,5 mm Longitud: 3,0 m

1 XX6700034

Pinzas de bordes planos 3 XX6200006P

Etiquetas de trazabilidad Programa para impresión de etiquetas disponible en: www.millipore.com

1000 TRLABEL01

* El código del país se debe definir en el paso de pedido.

Kit del sistema EZ-Fluo™

Kit de reactivos EZ-Fluo™

El sistema de detección rápida EZ-Fluo™ y accesorios

Merck KGaAFrankfurter Straße 25064293 Darmstadt, AlemaniaE-mail: [email protected]/biomonitoring

EZ-Fluo, EZ-Stream, Petri-Pad, Merck Millipore y la marca M son marcas comerciales de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania. EZ-Pak, Microfil, S-Pak son marcas comerciales registradas de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania. Lit N° W286361 / DS5588ES00 11/2012 BM-SBU-12-06307© 2012 Merck KGaA, Darmstadt, Alemania. Todos los derechos reservados.

Para realizar un pedido o recibir asistencia técnicaEncuentre la información de contacto de su país en: www.merckmillipore.com/offices

Para servicio técnico, visite: www.merckmillipore.com/techservice

Ofrecemos información y soporte a nuestros clientes sobre las tecnologías de aplicaciones y temas normativos según nuestro conocimiento y experiencia, pero sin obligación o responsabilidad alguna. Nuestros clientes deben respetar en todos los casos las normativas y leyes existentes. Esto también aplica a todo derecho de terceros. Nuestra información y soporte no exime a nuestros clientes de su propia responsabilidad de comprobar la idoneidad de nuestros productos para el propósito dado.

www.merckmillipore.com/ez-fluo

EZ-Fluo™ SystemFor rapid detection of spoilage organisms in wine

Many beverage manufacturing processes are susceptible to spoilage organisms like yeast or bacteria contamination. Contamination can alter the odor, flavor or turbidity of a beverage, resulting in customer dissatisfaction and, in some cases, in product recall. For these microorganisms, traditional monitoring methods require up to 10 days to obtain microbiological results allowing the release of the product. A rapid microbiology system that can detect potential contamination 3 times faster than traditional monitoring methods would result in a significant cost saving and preserved company reputation. The EZ-Fluo™ System uses fluorescence-based technology and is a convenient and a sensitive platform for the quantitative detection of contaminants in filterable samples. This rapid microbiological method is based on a universal enzymatic fluorescent staining of viable and culturable microorganisms. The fluorescent staining procedure is non-destructive, allowing microorganism identification following a positive result.

The EZ-Fluo™ system offers a fast and reliable alternative for the rapid detection of spoilage microorganisms in wines. This evaluation study, performed by the accreditated lab Centro de Investigación y Asistencia Técnica a la Industria (CIATI AC) in Argentina, shows that the system enables a faster response and corrective action when used during the wine manufacturing process. It improves process control, product yield and the faster release of final product to market.

Materials:EZ-Fluo™ system Reader (EZFKIT001WW) Membrane Filtration systems (EZFTIMIC01)

Equipment:EZ-Fluo™ system Reagent Kits (EZFREAG57)

Media:MRS agar + tomato juice Brettanomyces agar Carr agar YEPD agar

Matrices tested:Red Wine

Microorganisms:Lactic Acid Bacteria / Oenococcus oeni strain Brettanomyces spp. Strain Acetic acid bacteria (AAB) Yeast Counts / Saccharomyces cerevisiae strain

Application Note

The life science business of Merck operates as MilliporeSigma in the U.S. and Canada.

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Principle of detectionThe principle of the fluorescence detection is based on an enzymatic reaction. The fluorogenic substrate used is a non–fluorescent viability marker which is cleaved by non-specific ubiquitous intracellular enzymes resulting in a fluorescent product. Natural amplification of fluorescence by accumulation inside cells is an indicator of microbial metabolism. The dye is diluted in a staining buffer allowing cell membrane permeability and thus dye introduction into cells.

Note: Fluorescence detection is a non-destructive method that enables the microorganisms to continue to grow after they have been stained in order to identify them using standard ID technology.

Protocol for rapid detectionThe procedure used was a standard protocol to detect spoilage microorganisms in samples of interest with the fluorescence detection:

• A filtration unit is installed onto the filtration system

• The appropriate volume of sample is poured into the filtration unit

• After filtration, the membrane is disconnected from the device and aseptically transferred onto a media cassette

• The incubation is performed according to the specifications

• After the incubation, the membrane is stained with the fluorogenic reagent for 30 min at 32.5°C (± 2.5)

• The fluorescent micro-colonies are counted using the fluorescence reader

• After detection, the stained membrane can be re-incubated on fresh media for traditional plate count and identification if required

Definition of a rapid incubation timeAn appropriate incubation time is defined as the minimal time which allows a percentage of recovery above 70% compared to the traditional method. The calculation is based on both formulas:

• The fluorescence recovery is the fluorescent dot count compared to the traditional method count. Fluorescence recovery (%) = (average of fluorescence counts / average of traditional method count) x 100

• The viability recovery is the colony count on stained membranes after re-incubation compared to the traditional method count. Viability recovery (%) = (average of Colony-Forming Units counts after re-incubation / average of traditional method counts) x 100

An optimal incubation time should allow a sufficient fluorescent signal intensity and fluorescence and viability recoveries above 70%.

Figure 2:

The picture on the right illustrates a sufficient fluorescent signal intensity translating to an appropriate incubation time. The picture on the left shows that an accurate count is not possible if the intensity of fluorescence is too low due to an insufficient incubation time.

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CIATI AC Evaluation ResultsA series of tests on red wine were carried out to determine the performance of the rapid count system compared to traditional microbiological analysis, as established by the OIV and wine industry. Results in the tables are average counts of the performed tests.

b) Naturally contaminated samples

Results

SamplesTraditional microbiological test

(CFU/10 mL) (10 days)EZ-Fluo™ System

(CFU/10 mL) (5 days)Visible colonies at counting time with EZ-Fluo™ System (5 days)

1 49 45 0

2 570 601 0

3 1 2 0

4 2 1 0

5 55 37 0

Results

Sample detailsDays of incubation

(25 °C)Traditional microbiological test

(CFU/10 mL)EZ-Fluo™ System

(CFU/10 mL)

Sample 1, estimated N0 = 3 CFU/10 mL

3 <1 <1

5 <1 3

7 2 2

10 3 4


3 <1 6

5 <1 28

7 13 33

10 29 30

Sample 3, estimated N0 = 30 x 102 CFU/10 mL

3 <1 52

5 <1 295

7 252 283

10 304 307

Five (n = 5) samples of red wine naturally contaminated with Brettanomyces spp were analyzed.

Counts were performed using both the traditional method (filtration through a 0.45 μm membrane, and

incubation on Brettanomyces agar at 25°C (±2) for 10 days) and the EZ-Fluo™ rapid system (with incubation at 25°C (±2) for 5 days).

1) Brettanomyces spp. counts

Counts of the test yeast were performed using both the traditional method (filtration through a 0.45 μm membrane, and incubation on Brettanomyces agar at 25°C (± 2) for 10 days under aerobic conditions) and the EZ-Fluo™ rapid system. The results were read at several times during incubation.

a) Inoculated samples

Three (n = 3) 500 mL samples of red wine were inoculated with different concentrations (N0) of a Brettanomyces spp. strain previously isolated and characterized in CIATI AC microbiology laboratory.

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2) Lactic acid bacteria (LAB) counts

Results




1 144 152 9

2 3 2 0

3 623 489 21

4 105 97 6

5 18 22 0

Results




(CFU/10 mL)


3 <1 2

5 1 3

7 2 2

10 4 5


3 <1 14

5 3 21

7 23 30

10 36 31


3 <1 42

5 17 310

7 254 303

10 311 320

Counts were performed using both the traditional method (filtration through a 0.45 μm membrane, and incubation on MRS agar + tomato juice at 30°C (± 2) for 10 days under aerobic conditions) and the EZ-Fluo™ rapid system. The results were read at several times during incubation.


Three (n = 3) 500 mL samples of red wine were inoculated with different concentrations (N0) of an Oenococcus oeni strain previously isolated and characterized at the CIATI AC.


Five (n = 5) samples of red wine naturally contaminated with lactic acid bacteria were analyzed.


incubation on MRS agar + tomato juice at 30°C (± 2) for 10 days) and the EZ-Fluo™ rapid system (with incubation at 25°C (± 2) for 5 days).

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3) Acetic acid bacteria (AAB) counts


Results




1 6 9 0

2 70 101 9

3 26 18 3

4 12 16 1

5 137 145 11

Results




(CFU/10 mL)


1 <1 <1

2 <1 3

3 2 4

4 5 2


1 <1 <1

2 <1 17

3 11 25

4 27 22


1 <1 <1

2 <1 252

3 199 277

4 246 280

a) Inoculated samples:

Three (n = 3) 500 mL samples of red wine were inoculated with different concentrations (N0) of an Acetobacter spp. strain previously isolated and characterized at the CIATI AC.

Counts were performed using both the traditional method (filtration through a 0.45 μm membrane, and incubation on Carr agar at 25°C (± 2) for 4 days under aerobic conditions) and the EZ-Fluo™ rapid system. The results were read at several times during incubation.

Five (n = 5) samples of red wine naturally contaminated with acetic acid bacteria were analyzed.


incubation on Carr agar at 25°C (± 2) for 4 days) and the EZ-Fluo™ rapid system (with incubation at 25°C (± 2) for 2 days).

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Results




1 28 24 7

2 1.97 x 103 2.33 x 103 46

3 115 175 15

4 42 36 9

5 5 3 0

Results




(CFU/10 mL)


1 <1 <1

2 <1 2

3 2 3

4 3 2


1 <1 <1

2 <1 32

3 18 35

4 33 29


1 <1 <1

2 <1 289

3 125 307

4 296 301

4) Yeast counts

Counts were performed using both the traditional method (filtration through a 0.45 μm membrane, and incubation on YEPD agar at 25°C (± 2) for 4 days under aerobic conditions) and the EZ-Fluo™ rapid system. The results were read at several times during incubation.


Three (n = 3) 500 mL samples of red wine were inoculated with different concentrations (N0) of a Saccharomyces cerevisiae strain previously isolated and characterized at the CIATI AC.


Five (n = 5) samples of red wine naturally contaminated with yeasts were analyzed.


incubation on YEPD agar at 25°C (± 2) for 4 days) and the EZ-Fluo™ rapid system (with incubation at 25°C (± 2) for 2 days).

Main outcomes of the CIATI AC evaluation study• According to the results obtained, the EZ-Fluo™

rapid system performed very well in obtaining counts of wine spoilage microorganisms, since it reduced the incubation time by at least 50% in every case analyzed, in comparison to that required for traditional methods (OIV).

• The EZ-Fluo™ rapid system enabled the detection and quantification of Brettanomyces spp. and lactic acid bacteria (LAB) in as little as 5 days of incubation, and of acetic acid bacteria (AAB) and yeasts in as little as 2 days of incubation.

• The EZ-Fluo™ system is a useful tool for the rapid (and non-destructive) detection and quantification of wine spoilage microorganisms.

We provide information and advice to our customers on application technologies and regulatory matters to the best of our knowledge and ability, but without obligation or liability. Existing laws and regulations are to be observed in all cases by our customers. This also applies in respect to any rights of third parties. Our information and advice do not relieve our customers of their own responsibility for checking the suitability of our products for the envisaged purpose.

Author:

Juan Martin Oteiza Laboratorio de Microbiología de Alimentos CIATI AC-CONICET Neuquén, Argentina [email protected] www.ciati.com.ar

Copyright © 2016 Merck KGaA. All Rights Reserved. Merck and Millipore are registered trademarks and the vibrant M and EZ-Fluo are trademarks of Merck KGaA.

Lit. No. AN1259EN00 Ver. 0.1 BM-16-13523

11/2016

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www.merckmillipore.com/biomonitoring

ConclusionUsing our fluorescence-based technology as a microbiology quality control tool reduces the time needed to detect yeast and bacterial contaminations in wine dramatically. This study demonstrated that this technology could easily replace the compendial microbiological method with a 2 to 4 times faster time to result, and a full compatibility with the standard culture media traditionally used for the detection of spoilage organisms in beverages.

Moreover, as the method is non-destructive, each fluorescent micro-colony detected will continue to grow to yield visible colonies allowing the identification of the contaminants using available identification methods.

With the EZ-Fluo™ system, beverage manufacturers can improve their quality control by detecting contaminations earlier, and implementing corrective actions faster. This early answer creates savings of raw materials and manufacturing capacities. It can also help in the root cause analysis of a process failure, giving a better knowledge and confidence in the process and an increased quality control. Most importantly the product release can be accelerated and storage time decreased, resulting in a financial saving for the manufacturer.

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