V WORKSHOP SOBRE MÉTODOS RÁPIDOS Y...

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MONOGRÁFICO V WORKSHOP MRAMA

ULTRASONIDOS PARA LA DETECCIÓN Y ELANÁLISIS NO INVASIVO DE

MICROORGANISMOS EN PRODUCTOS LÁCTEOS

V WORKSHOP SOBRE MÉTODOS RÁPIDOS YAUTOMATIZACIÓN EN MICROBIOLOGÍA

ALIMENTARIA

Domingo Terroba, José Ramón Iglesias

[email protected] /[email protected]

ANTECEDENTES

Existen trabajos que mencionan la utili-zación de los ultrasonidos para ladetección de la degradación de alimen-tos envasados (Gestrelius et al., 1991),utilizando una técnica ultrasónica demedida por efecto doppler, del “strea-ming” acústico. Con un concepto distin-to, Ahvenainen et al. usaron la ecogra-fía para la detección de microorganis-mos (Ahvenainen et al, 1989). Estemétodo no es apto para su uso enenvases de cartón, ya que los sistemasecográficos carecen de la sensibilidadadecuada para ello. En una patente delaño 1987, M. Nagata et al. describenun método ultrasónico para la detec-ción de microorganismos en productosenvasados a través de la medida detransmisión de propagación ultrasóni-ca. Hæggström (1997) fue capaz demejorar la precisión del sistema deNagata, detectando contaminacionesen leche y sopa en etapas tempranasde crecimiento, aunque se vio obligado

a utilizar envases modificados parapoder sumergirlos en agua.

ESTUDIO PRELIMINAR

Se inició primeramente un estudio demuestras en envases de cristal de labo-ratorio con objeto de determinar lacapacidad de detectar una ampliavariedad de contaminaciones en lechemediante un dispositivo de medida detransmisión de señales ultrasónicas.Los envases de cristal favorecieron laposibilidad de realizar el control térmicoa través de un baño líquido.Las muestras de leche eran inoculadasy envasadas en botellas de vidrio de250 ml. Las botellas con las muestrasse almacenaban en una nevera para suconservación a 4ºC, durante un tiemposiempre inferior a 5 días y hasta su usopara la medida. De forma paralela seinoculaban otras botellas con la mismaconcentración de microorganismospara poder correlacionar las medidasde propagación ultrasónica con las

medidas de crecimiento bacterianomediante PCA.El dispositivo experimental apareceesquematizado en la figura 1. En élpodemos apreciar un sistema emisor,un sistema receptor y el baño donde lasmuestras de leche se mantienen a latemperatura constante de 35ºC. El sis-tema emisor consta de un transductorpiezoeléctrico alimentado eléctricamen-te por un generador de funcionesAgilent 33120, que proporciona a dichotransductor trenes de onda de 10 V picoa pico. El sistema receptor está formadopor un transductor piezoeléctrico queenvía la señal a un osciloscopioTektronix TDS520. Por último, las seña-les capturadas se almacenan en unordenador a través de un software des-arrollado para esta aplicación. Lostransductores (figura 2) están fabrica-dos en base a un disco piezoeléctricoPZ 27 (Ferroperm) de 20 mm de diáme-tro. Se les ha dotado de una contrama-sa de Araldite –Ciba&Geigy- y una líneade retardo de metacrilato. Se realizaronestudios con distintas frecuencias de

Como ya nos hicimos eco, hace unos meses, en las páginas de la revista, el pasadomes de noviembre se celebró en la Facultad de Veterinaria de la Universidad

Autónoma de Barcelona el V Workshop sobre Métodos Rápidos y Automatización enMicrobiología Alimentaria, con el objetivo de ampliar y difundir los conocimientos

teóricos y prácticos sobre métodos innovadores para detectar, contar, aislar ycaracterizar rápidamente los microorganismos habituales en los alimentos y el agua.

Por su alto grado de interés, recogemos en este número los resúmenes de lasprincipales ponencias presentadas en el marco de este evento, que estuvo dirigido a

directores y técnicos de laboratorios e industrias agroalimentarias, inspectoresveterinarios, profesionales de empresas de microbiología, profesores y estudiantes de

tercer ciclo y de diversas diplomaturas y licenciaturas.

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trabajo entre 1 y 4 MHz. El baño termos-tático dispone de un control de tempera-tura con una precisión de 0,01ºC. Sin embargo, al no estar dise-ñado el tanque de agua para esta apli-cación específica, pueden aparecer gra-dientes y fluctuaciones de temperaturadel orden de la décima de grado. Porello, se estimó conveniente realizar lamedida con una referencia de lecheestéril que permita eliminar el errorexperimental que proviene de los defec-tos de control de temperatura del baño.Para obtener los parámetros acústicosrelevantes de cara a la detección delcrecimiento de microorganismos, seadquirieron las señales a través delosciloscopio y se almacenaron en el

ordenador a intervalos de 3 minutos. Elestudio de los parámetros acústicos serealiza a través del espectro en fre-cuencia de la señal adquirida. El módu-lo y la fase de la transformada propor-cionan información de la amplitud de laseñal y de la velocidad de propagación,respectivamente. Las pruebas llevadas a cabo revelaronclaramente la presencia microbiana enla leche. La figura 3 muestra las cur-vas de variación de la velocidad en lascuales se pone de manifiesto la multi-plicación de los microorganismos através del aumento de la diferenciaentre la velocidad de propagacióndesde el comienzo de la incubación a35ºC. El paso de la zona gris a la zona

amarilla podría marcar un posible cri-terio para considerar como positiva ladetección en un ensayo de crecimien-to microbiano. En estas curvas apare-cen notables diferencias entre unosmicroorganismos y otros, lo cualpuede ser indicativo del inóculo y deltipo de contaminante de la muestra deleche. Se aprecia que la medida ultra-sónica de la leche infectada conBacillus cereus es la que pone demanifiesto más precoz y claramente lapresencia bacteriana, mientras que lapresencia de Micrococus, con un lentí-simo crecimiento, se advierte pasadasunas 30 horas y con un leve cambio enla velocidad de propagación. Hay otrosaspectos interesantes, como las distin-tas fases que se aprecian en la detec-ción del crecimiento del B. subtilis quepodrían estar relacionados con distin-tos procesos metabólicos.De esta manera, se estableció lapotencialidad de la medida ultrasónicacomo método de detección de posi-bles contaminaciones microbianas enla leche durante las etapas iniciales decrecimiento de dichas contaminacio-nes. Según esto, la detección tienelugar antes de que se produzcan cam-bios drásticos en las propiedades físi-co-químicas de la leche. Otra impor-tante característica del procedimientode detección ultrasónica de microorga-nismos es su relativa inespecificidad,mostrándose válido para un amplioespectro de contaminaciones, si bienes cierto que la velocidad de detecciónno es la misma para los distintosmicroorganismos. Esto puede propor-cionar pistas acerca de la naturalezadel microorganismo principal respon-sable de una determinada contamina-ción. Sin embargo, para poder realizaruna discriminación entre microbiossería necesario un estudio estadísticomucho más amplio de las posiblescontaminaciones. El hecho de que enmuchos casos, éstas no se deban a unsólo microorganismo dificulta aún másla discriminación entre ellos. La varia-ción de los distintos parámetros quecaracterizan la propagación ultrasóni-ca en leche contaminada parecedepender de distintas causas comoson el tamaño y número de microorga-nismos presentes, el tipo de metabo-lismo y las características del sustratolácteo en el que crecen.

Figura 1.- Esquema de la técnica experimental de medida.

Figura 2.- Vista trasera y delantera de 2 transductores para medidas de transmisión.

Control térmico en paquetes laminadosde cartón

Para llevar a cabo las medidas de pro-pagación ultrasónica a través deenvases de cartón fue necesario cam-biar el sistema de control térmico quepasó de un baño líquido a una estufa.Al igual que el baño de agua, estacámara se estabilizaba a 35ºC Estosupuso realizar cambios en los pro-pios transductores que ahora habíande incorporar unos discos elásticos desilicona de unos 2 mm de espesor y40 mm de diámetro, ligeramente con-vexos, permitiendo una adecuadatransmisión de la onda ultrasónicaentre estos y el envase. La atenuaciónde la onda, por otro lado, es un factorespecialmente importante en envasescon capas de papel, ya que puede darlugar a la pérdida total de la señalultrasónica antes de poder ser recibi-da. Se escogió una frecuencia de tra-bajo de 1 MHz. En la figura 4 semuestra la variación de temperaturaque experimenta el aire del interior dela cámara (rojo) desde que se conec-ta el sistema de control de temperatu-ra, partiendo de temperatura ambien-te. En negro se presenta el calenta-miento de la leche en el interior delenvase, partiendo también de tempe-ratura ambiente. Se puede apreciarque hay una notable diferencia entrela media hora que tarda la cámara enponerse a la temperatura de incuba-

ción de 35ºC, y las 13-15 horas quetarda la leche en alcanzar dicha tem-peratura. Esto es debido a las buenasprestaciones que como aislante térmi-co tienen este tipo de envases.Durante el tiempo que la temperaturava aumentando, también lo hace lavelocidad de propagación. Para poderdistinguir claramente que las variacio-nes de velocidad son debidas a la pre-sencia de microorganismos en laleche y no a un cambio en temperatu-ra es deseable alcanzar la temperatu-ra de incubación lo antes posible. Esto

nos obligó a buscar otras formas máseficaces de calentar la leche en el inte-rior del envase, a través de resisten-cias en contacto directo con los mis-mos. De esta forma, el tiempo de incu-bación se vio reducido apreciablemen-te, según se aprecia en la figura 5.

Control de la humedad

A lo largo de numerosos ensayos sepudo comprobar que, a pesar de quela temperatura de la leche en el inte-rior de los envases llegaba a estabili-zarse al cabo de un tiempo, la veloci-dad de propagación de la señal ultra-sónica no alcanzaba la estabilizaciónni tan siquiera después de 2-3 días demedida. Finalmente se descubrió que,a pesar de las capas plásticas exter-nas del envase, el cartón era capazde intercambiar humedad con elambiente, siendo este intercambiomuy lento. Desafortuna-damente,pequeños cambios en el contenido dehumedad del envase provocan varia-ciones en la medida de la amplitud yvelocidad de propagación compara-bles a las producidas por la presenciade microorganismos en la leche.Estos cambios lentos producidos porlas variaciones en el contenido dehumedad se pueden observar simple-mente añadiendo o retirando un reci-piente con agua del interior de la estu-fa. De esta forma, se midió el tiempo



Figura 3.- Velocidad de propagación en leche entera contaminada por distintos microorganismos.

Figura 4.- Curvas de estabilización térmica de la cámara (rojo) y la leche dentro del envase (negro)partiendo de temperatura ambiente.

de vuelo de una onda ultrasónica alatravesar una capa del laminado delenvase. El resultado aparece en lafigura 6 donde se aprecian los cam-bios evidentes en dicho tiempo alvariar las condiciones de humedad,de manera que cuando ésta decrece,también lo hace el tiempo que tarda laseñal en atravesar el material. Estosresultados indican la necesidad derealizar no sólo un adecuado controltérmico de las muestras de leche, sinotambién de la humedad ambiente enel lugar donde se realizan los ensayosde detección microbiológica.

Esquema del prototipo: descripción de los elementos

A continuación, se diseñó y desarrollóun prototipo con 8 alojamientos parapoder analizar simultáneamente 8envases. Este prototipo se ha realiza-do según las especificaciones con-templadas en la Patente PCT/ES03/00287 (Elvira et al., 2003). El cuer-po principal del sistema de medida loconstituye una cámara climatizada entemperatura y humedad (Figura 7) a lacual van sujetos los 8 alojamientos. Adicha cámara han de llegar las cone-xiones eléctricas pertinentes, tantopara realizar la climatización, comopara la transmisión de señales entrelos emisores y receptores de ultraso-nidos con los sistemas electrónicos de

generación y detección de señales,respectivamente. Asimismo, el siste-ma dispone de una conexión de aguapara llevar a cabo el control de hume-dad. La climatización se controla através de dispositivos tipo PID queregulan la temperatura de cada unode los 8 alojamientos, así como latemperatura y la humedad general dela cámara principal. La electrónica deexcitación y recepción de ultrasonidos(Figura 8) la componen un generadorde señal Agilent 33120, un oscilosco-

pio digital Tektronix 220 y un multiple-xor de 8 canales de emisión y 8 derecepción desarrollado en laUniversidad de Jaén. Este multiplexor,comandado por el ordenador de con-trol vía RS-232, pone en conexión elgenerador y el osciloscopio con lapareja emisor-receptor de ultrasoni-dos de cada canal, sucesivamente.Los transductores ultrasónicos, des-arrollados en el Instituto de Acústicaespecíficamente para este prototipo,se diseñaron para una frecuencia detrabajo de 800 kHz. Las señales cap-turadas por el osciloscopio se envíanvía GPIB a la CPU de control, dondeson tratadas e interpretadas para eva-luar el estado de la leche. Todo el pro-ceso de medida viene comandado porla CPU a través de un software des-arrollado en LabView, mediante elcual se mide la propagación ultrasóni-ca en los 8 canales sucesivamente, seregistran los datos de humedad y tem-peratura y se obtienen y analizan lasseñales del osciloscopio. Por último,el algoritmo de interpretación de datosdesarrollado, activa una alarma en elcaso de que las medidas indiquen uncrecimiento microbiano en un determi-nado paquete.

Resultados experimentales

El desarrollo de las pruebas para eva-luar el funcionamiento del dispositivo

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Figura 5.- Temperatura de la cámara (rojo) y de la leche en el interior del envase (negro) utilizan-do la placa de calentamiento en contacto.

Figura 6.- Variación del tiempo de vuelo de la señal al atravesar una muestra de pared del envasepara distintas condiciones de humedad.

consistió en la medida de paquetes deleche recién envasada, estéril, y otrosinoculados con distintos microorganis-mos. Paralelamente se realizabanrecuentos microbianos por PCA delinóculo, así como de la leche despuésde haber sido analizada medianteultrasonidos, comparándose los resul-tados del prototipo con dichos recuen-tos. Se tomaban 8 paquetes de lechede los cuales 6 eran inoculados y 2 sedejaban como estériles. Tras la incu-bación se procedía al análisis micro-biológico (PCA, Bactometer, Promilite

III de Promicol) y físico-químico (pH,acidez y estabilidad al etanol) de lasmuestras inoculadas.A partir de un conjunto estadística-mente significativo de curvas estériles(amplitud y tiempo de vuelo) pertene-cientes a paquetes recién salidos delínea se estableció el comportamientode la curva de esterilidad de cadaenvase. Dicha curva alude al trazoque se obtendría en la medida en elcaso de que un determinado paquetefuera estéril. Esta curva es calculadapara cada paquete (ya que las medi-

das de cada paquete son ligeramentedistintas unas de otras) durante lasprimeras horas de medida, en particu-lar entre la quinta y séptima horas.Hasta la quinta hora entendemos quelas variaciones obtenidas en las medi-das de los parámetros ultrasónicosresponden a la estabilización en tem-peratura y humedad de los paquetes.En las figuras 9 y 10 se muestranejemplos de detección de B. cereus yP. vulgaris atendiendo a la medida dela amplitud de la onda y de su tiempode vuelo respectivamente. Se hanencontrado distintos comportamientospara la amplitud y el tiempo de vuelopara los distintos microorganismosinoculados. Esto muestra que ladependencia entre los parámetrosultrasónicos y el crecimiento microbia-no responde a diferentes efectos quedicho crecimiento produce en la leche.Podemos estar hablando de aumentoen la viscosidad debido a los produc-tos de desecho del metabolismo, cam-bio en las propiedades elásticas debi-dos a cambios en la estructura de lasproteínas, e incluso a mejora del aco-plamiento transductor-paquete enaquellos casos en los que el creci-miento de bacterias produce gas enabundancia, incrementándose la pre-sión en el interior de los paquetes (loscuales pueden llegar a romperse si nose extraen a tiempo de la cámara demedida). Se pudieron asimismo apre-ciar similitudes entre especies corres-pondientes al mismo género.

CONCLUSIONES

El aumento de la automatización y elcontrol en la industria alimentaria estállevando a la incorporación de nume-rosos sensores. En muchos casos, seutilizan distintas técnicas de medidaque proporcionan información com-plementaria de los procesos analiza-dos. En este escenario es esperablela aparición de nuevos sistemas deultrasonidos junto con otras técnicasde análisis (biosensores, sensoresópticos, infrarrojos,...) en las cadenasde producción y control de calidad dealimentos. En el presente trabajo, se han mostra-do algunas posibles aplicaciones de lamedida de los parámetros de propa-



Figura 7.- Cámara de medida y cuadro de control de climatización

Figura 8.- Electrónica de generación y recepción y CPU de control con el software activo.

gación ultrasónica al control de proce-sos de producción de alimentos. Lastécnicas ultrasónicas son, en gene-ral,muy robustas, pero posiblementesu principal ventaja es la posibilidadde caracterizar materiales de formano invasiva. Esto hace posible ladetección de contaminaciones enleche envasada sin abrir dicho envaseo el seguimiento de un proceso fer-

mentativo sin introducir un sensor enel interior del reactor, según se hadescrito. De esta manera se evitanposibles contaminaciones, peligrosiempre presente en aquellas técni-cas de medida que precisan la extrac-ción de muestras.Sin embargo, las medidas ultrasóni-cas suelen ser medidas indirectas, esdecir, medidas en las que las magnitu-

des detectadas se relacionan conalguna característica del medio quees la que realmente nos proporcionala información que se busca. Estacaracterística pone de manifiesto lacarencia en muchos casos de mode-los válidos y estudios tanto teóricoscomo experimentales que permitanrelacionar las distintas magnitudes.Por ello es necesario realizar un inten-so trabajo en este sentido que aumen-te las capacidades de las técnicasultrasónicas para obtener informaciónde los procesos industriales de elabo-ración de alimentos que pretendan serinspeccionados mediante ellas.

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Figura 9.- Amplitud de la onda medida en leche inoculada con B. cereus (cuadros). A partir de lahora 13 se aprecia una notable diferencia con respecto al comportamiento de la curva de esterilidad(línea continua).

Figura 10.- Tiempo de vuelo de la onda medida en leche inoculada con P. vulgaris (cuadros). A par-tir de la hora 18 se aprecia una notable diferencia con respecto al comportamiento de la curva deesterilidad (línea continua).



MÉTODOS RÁPIDOS Y AUTOMATIZACIÓN ENMICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA

Josep Yuste, Daniel Y. C. Fung y Marta Capellas

CER Planta de Tecnologia dels Aliments (CeRTA, XIT), Departament de Ciència animal i dels aliments, Facultat de Veterinària, UniversitatAutònoma de Barcelona. 08193 Bellaterra, Cerdanyola del Vallès

INTRODUCCIÓN

El número de ensayos microbiológicosaumenta año tras año en muchos sec-tores industriales (alimentación, bebi-das, farmacéutica, cosmética, medioambiente, etc.), con grandes progresosen el desarrollo de métodos fáciles deusar y que aseguran rapidez, precisión,sensibilidad y especificidad en la obten-ción de los resultados, a un costemoderado. En 2003, se hicieron1.136,5 millones de ensayos microbio-lógicos en el mundo, que equivale acasi 2.700 millones de euros. La indus-tria alimentaria es el principal mercado,con un 49%. La de las bebidas repre-senta un 9%. Se prevé que en 2008, elnúmero de ensayos microbiológicosaumentará a 1.505,3 millones (casi4.150 millones de euros).Los métodos microbiológicos rápidos yautomatizados permiten a los industria-les lanzar sus productos más rápida-mente al mercado, garantizando suseguridad y su conservación. Puedeevitarse lo más rápidamente posibleque una materia prima contaminadaentre en la cadena alimentaria, y queun producto final en mal estado micro-

biológico salga de la industria. Y puededeterminarse si, en los diversos puntosde control crítico, el producto y elambiente de la industria están en buenestado microbiológico. Estos métodosposibilitan analizar más tipos de ali-mentos en la industria. Actualmente, seaplican sobre todo a carne, carne deave, productos lácteos y de la pesca,etc., y se prevé que su uso en frutas yverduras aumentará.Un 20% de los ensayos microbiológicoshechos en la industria alimentaria espara analizar patógenos, comoSalmonella spp. y Escherichia coliO157:H7. El 80% restante son ensayosrutinarios, como el recuento total, el decoliformes, y el de mohos y levaduras.Durante los próximos años, el porcen-taje de ensayos en patógenos aumen-tará en un 10%, al aplicarse los nuevoscriterios y las nuevas normativas, y por-que emergen nuevos patógenos. Elreparto del número de ensayos micro-biológicos en la industria alimentaria esaproximadamente: 33% en América delNorte, 33% en Europa y 33% en elresto del mundo. Durante los próximosdiez años, esto cambiará a 25% enAmérica del Norte, 25% en Europa y50% en el resto del mundo, ya que

otros países (China y otros con econo-mías crecientes) están concienciándo-se de la importancia de la seguridad ali-mentaria.Los principales patógenos de interéspara la industria alimentaria sonSalmonella spp., Campylobacter spp.,Clostridium spp., Staphylococcusaureus, E. coli y Listeria monocytoge-nes. Cepas de estas bacterias, a vecesresistentes a algunos antibióticos,están asociadas a muchas enfermeda-des de origen alimentario. Otras bacte-rias y hongos también son importantes,y no hay que olvidar los virus y los pro-tozoos. Actualmente, ante un brote delcual no se sabe la causa, se tiende apensar, erróneamente, en bacterias uhongos más que en virus o protozoos.Durante los próximos años, aumentarála actividad en los campos de la virolo-gía y la parasitología alimentarias. Losvirus son difíciles de detectar; puedehacerse mediante biología molecular.Se proponen técnicas como la ultracen-trifugación para extraerlos de los ali-mentos, seguida de la aplicación de latranscriptasa inversa para traducir elARN vírico a su ADN complementario, ydespués usar la técnica de la polymera-se chain reaction (PCR).

RESUMEN

El número de ensayos microbiológicos aumenta año tras año, con grandes progresos en el desarrollo de métodos fáci-les de usar y que aseguran rapidez, precisión, sensibilidad y especificidad en la obtención de los resultados, a un costemoderado. Los métodos microbiológicos rápidos y automatizados permiten a los industriales lanzar sus productos másrápidamente al mercado, garantizando su seguridad y su conservación.Los avances en instrumentación están posibilitando contar las células viables más rápida y eficientemente. El testELISA/ELFA (enzyme-linked immunosorbent assay/enzyme-linked fluorescent assay), el método inmunológico másusado, está totalmente automatizado y consolidado en muchas empresas alimentarias. La detección de ATP se usaactualmente para evaluar en tiempo real la limpieza y la desinfección en la industria alimentaria, con sistemas de bio-luminiscencia.La aplicación de la biología molecular en los alimentos está ganando importancia. El método más usado es la PCR(polymerase chain reaction), sobre todo en tiempo real. En el futuro, los biosensores estarán en las líneas de proce-sado de alimentos. Y en este campo, también se trabaja en biochips y microchips.

Palabras clave: microbiología alimentaria / métodos rápidos / automatización / patógenos / seguridad / conserva-ción.

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TOMA Y PREPARACIÓNDE MUESTRAS,RECUENTO DE CÉLULASVIABLES,MINIATURIZACIÓN,GALERÍAS DEIDENTIFICACIÓNEn cuanto a los avances en la toma y lapreparación de muestras, hay equiposque recuperan los microorganismos porvibraciones que los hacen pasar al dilu-yente, sin romper la estructura del alimen-to. Así, al contener las suspensionesobtenidas muy pocos restos de alimento,no hay interferencia en el recuento enplaca y, además, dichas suspensionespueden usarse en técnicas como la de labioluminiscencia (análisis de ATP), lasenzimáticas (enzyme-linked immunosor-bent assay/enzyme-linked fluorescentassay, ELISA/ELFA) y las genéticas(PCR).Los avances en instrumentación relativosa la preparación, la dilución y la sembra delas muestras, están haciendo posible con-tar las células viables más rápida y eficien-temente. Por ejemplo, la miniaturización yla automatización del método del númeromás probable (NMP), permiten aumentarsu eficacia.En cuanto al recuento total de microorga-nismos, hay que destacar los métodosque cuentan las células en tiempo real. Esmuy importante saber si las células micro-bianas están vivas o no. Hay tincionesvitales, con colorante muy específicos,para diferenciar las células vivas de lasmuertas en menos de 1 h. Consisten enatrapar las células en un filtro o una mem-brana y después teñirlas con un colorantefluorescente, que posibilita su posteriorobservación directa al microscopio.Posterior al crecimiento de las coloniasen medio selectivo, la identificación congalerías que se basan en reaccionesdebidas al metabolismo microbiano, tam-bién ha avanzado considerablemente.Inicialmente, estos métodos se desarro-llaron para enterobacterias, pero actual-mente también están disponibles paraidentificar, entre otros, bacterias Gram-positivas, como L. monocytogenes y S.aureus, y mohos y levaduras. En algunoscasos, permiten identificar en muy pocotiempo (2-4 h).

MÉTODOSINMUNOLÓGICOSLos métodos inmunológicos, con el usode anticuerpos monoclonales y policlo-nales, se aplican desde hace décadas, yse están automatizando y usando cadavez más. La técnica más popular es eltest ELISA/ELFA, ya totalmente automa-tizada y consolidada en muchas indus-trias alimentarias. Actualmente, existensistemas que permiten analizar unamuestra, previamente incubada durantetoda la noche, en 45 a 120 min. Ahora, seintenta aumentar su sensibilidad (104-105

organismos) y acortar su duración (8 hen total), sobre todo la de la fase de incu-bación. Otra mejora de esta técnica es lacombinación de la inmunocaptura con eltest ELISA.Es difícil separar y concentrar eficazmen-te las células diana; siempre se requiereun paso de enriquecimiento. Hoy en día,éste es un gran inconveniente para elmicrobiológo de alimentos. Por ello, esimportante desarrollar tecnologías comola separación inmunomagnética, la filtra-ción, la centrifugación y la atracción elec-trostática, porque pueden acortar laduración del análisis, sobre todo la de lafase de enriquecimiento (se puede aho-rrar, al menos, 1 día), y así se identificanlas células más rápidamente. Además,para aprovechar al máximo el potencialde nuevas tecnologías de análisis comolos biosensores, los biochips y los micro-chips, es necesario encontrar sistemasóptimos para separar y concentrar losorganismos diana, para que la señal seacorrecta y los resultados no sean erróneos. La captura inmunomagnética es unainnovación en la que se usan partículasmetálicas recubiertas de anticuerposespecíficos para un determinado micro-organismo. Así, las células del microor-ganismo que se quiere identificar se aís-lan en una suspensión que despuéspuede utilizarse para sembrar placas, ohibridar con sondas genéticas, o hacer eltest de la PCR o ELISA/ELFA. Por ejem-plo, se propone un sistema que combinala separación inmunomagnética y el testELISA, que permite detectar E. coliO157:H7 en 5 h y 15 min, el tiempo máscorto actualmente: 4 h y 30 min de enri-quecimiento + 30 min (circulando) deinmunocaptura + 15 min de ELISA. Seintenta acortar el enriquecimiento a 3 h,

con la ayuda de la enzima oxirasa, paraque el proceso dure menos de 4 h entotal.

INSTRUMENTACIÓN,MEDIDAS DE BIOMASAOtro grupo de técnicas rápidas lo consti-tuyen los instrumentos que miden seña-les originadas por el crecimiento micro-biano. Estas señales son, por ejemplo, elATP, algunas enzimas específicas, el pH,el potencial redox, la conductancia, laimpedancia y la capacidad eléctricas, elcalor y el CO2. Existen equipos en que lamedida de alguna de estas señales,como el CO2, el pH, el potencial redox ylos grupos amino libres, es por deteccióncolorimétrica. Algunos de estos sistemasson fáciles de usar, permiten analizarmuchas muestras a la vez, y están dise-ñados para determinar indirectamentelos recuentos totales, de coliformes,Escherichia coli, bacterias acidolácticas,mohos y levaduras, y de muestrasambientales y de superfícies. La pruebade la catalasa, las placas de contacto, ylos métodos automatizados basados enimpedancia y óptica, facilitan al industrialel control de la higiene. También existenmuy diversos dispositivos, que contienenunos reactivos, y un escobillón o unmaterial absorbente, basados en biolu-miniscencia, colorimetría o inmunología,que proporcionan resultados muy rápida-mente (10 min). Hoy en día, requieren unpreenriquecimiento para alcanzar 106organismos, pero ahora se está aumen-tando su sensibilidad. Los dispositivosinmunológicos se utilizan en la industriaalimentaria para detectar patógenos, ytambién sus toxinas.La deteción de ATP de cualquier origense usa actualmente para evaluar entiempo real la limpieza y la desinfecciónen la industria alimentaria (utensilios,equipos, instalaciones), con sistemas debioluminiscencia muy sencillos y de lec-tura immediata, que encuentran su apli-cación en el Análisis de Peligros y Puntosde Control Crítico (APPCC), y mejoransu eficacia. La capacidad de muchas bacterias mari-nas de emitir luz (bioluminiscencia), com-binada con los métodos de genéticamolecular, permite obtener microorganis-mos patógenos bioluminiscentes. Estosmicroorganismos recombinantes, cuan-

do se inoculan en los alimentos, puedenutilizarse para estudiar el metabolismo, laresistencia a tratamientos letales y suble-tales, y la formación de biopelículas. Apartir de estos estudios, pueden estable-cerse modelos predictivos que conside-ren las interacciones microbianas que seproducen en los alimentos. También existen métodos que permitenacortar el tiempo de detección de mohosy micotoxinas en los alimentos, como ladeterminación del ergosterol, un compo-nente de la pared celular de la mayoríade mohos. El análisis es por cromatogra-fía en capa fina, previa extracción conhexanol, y la cantidad de ergosterol esun indicador del crecimiento fúngico y lapresencia de micotoxinas. Si hay queidentificar los géneros y las especies pre-sentes en los alimentos, puede hacersecon el test de la PCR o ELISA/ELFA.

MÉTODOS GENÉTICOS

Todos los métodos mencionados hasta elmomento miden características fenotípi-cas de las células. Las genotípicas, sinembargo, son mucho más estables y,cada vez, existen más sistemas de identi-ficación genética. Los primeros en apare-cer usaban sondas para hibridar secuen-cias de ADN de las bacterias.Actualmente, se utilizan sondas que hibri-dan el ARN, con la ventaja que existenmás copias de éste en la célula, y ladetección es más fácil. El método másusado es la PCR, que amplifica secuen-cias de ADN del microorganismo. Paradetectarlo e identificarlo, posteriormente,cada vez más, se aplican técnicas de fluo-rescencia que permiten obtener resulta-dos en tiempo real. Hay que considerarque estos métodos pueden detectar elADN de microorganismos no viables pre-sentes en los alimentos, aunque esto pier-de importancia al ser necesario un enri-quecimiento previo de la muestra. Muchoslaboratorios e industrias agroalimentariosestán incorporando métodos genéticos(sobre todo la PCR), ya que son específi-cos, rápidos y, pese a su sofisticación,fáciles de usar. La aplicación de la biolo-gía molecular a los alimentos está ganan-do importancia, y aumentará todavía másen un futuro próximo, para detectar e iden-tificar rápidamente el material genético demuy diversos organismos diana: bacte-rias, mohos, levaduras, virus, parásitos e,incluso, organismos superiores.

BIOSENSORES, BIOCHIPSY MICROCHIPSEl último grupo de técnicas es el de losbiosensores, esencialmente formadospor moléculas o grupos de moléculasacoplados a un material (transductor)que permite reconocer una señal.Pueden diseñarse para detectar patóge-nos como Salmonella spp.,Campylobacter spp., E. coli O157:H7,Clostridium spp. etc., incorporando, porejemplo y como más habituales, las enzi-mas (catalasa u otras), los anticuerpos olas moléculas de ADN apropiados.También puede analizarse la actividadmicrobiana detectando el ATP, el oxíge-no, el hidrógeno u otros metabolitos; olos cambios de pH, conductancia, impe-dancia, capacidad o microcalorimetría.Pero la tecnología disponible todavía nopermite usarlos para detectar en tiemporeal en el alimento ya que, por una parte,es necesario preparar la muestra paraque no queden restos de alimento queinterfieran en el sensor y, por otra, hayque multiplicar las células. En algunoscasos, los biosensores no permitensaber si el microorganismo es viable,sino que tan sólo detectan su presencia.En el futuro, los biosensores estarán enlas líneas de procesado de alimentos,ejerciendo su función dentro de los pro-gramas de APPCC.Se trabaja en biochips y microchips quepermiten detectar los genes de patóge-nos por hibridación, poniéndolo de mani-fiesto con colorantes específicos. Puedeobtenerse la reacción con el patógenomuy rápidamente y, además, se puedetrabajar con diversos patógenos a la vez(análisis de 10 genes específicos decada uno de 10 patógenos distintos enun solo chip y, pronto, de 100 patóge-nos). Existirán microchips que, rápida ysimultáneamente, detectarán todos lospatógenos importantes y, a la vez, conta-rán las células viables; todo en unamisma unidad, un mismo análisis, casiinstantáneamente.

EL CONSUMIDOR, LOSMÉTODOS RÁPIDOS Y EL FUTURO

Están diseñándose sistemas de alerta enlos envases alimentarios y tests de aler-

ta para detectar rápidamente organismosalteradores y patógenos. Serán herra-mientas útiles para el consumidor, quepodrá darse cuenta de la peligrosidad oel estado de un alimento. Conviene que,además, el test indique las condicionesadecuadas de cocción y almacenamien-to para garantizar la seguridad y la con-servación del alimento. Por y para todoello, habrá que educar y preparar muybien al consumidor. Estos diseños sebasan en sensores o códigos de barrascon reactivos que detectan los organis-mos; o por cambios de color (entreotros), las variaciones de pH o la presen-cia de determinados compuestos sinteti-zados por los microorganismos (CO2,amoníaco, sulfuro de hidrógeno y otros).En el caso de los códigos de barras,podrá saberse el grado de deterioro delalimento según el número de barras quecambie de color. También se propone laincorporación de anticuerpos en el enva-se para detectar los organismos automá-ticamente con el test ELISA. Así, el con-sumidor podrá examinar los alimentos ylos envases en su casa.

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Métodos rápidos y automatización en microbiolo-

gía alimentaria. Actas del V workshop MRAMA.

Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra

(Cerdanyola del Vallès).



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RECENT TRENDS IN FOOD MICROBIOLOGY ATEUROPEAN LEVEL

Cécile Lahellec (F)

Honorary Research Director. French Food Safety Agency (AFSSA) [email protected]

Along time ago ( i.e more than 40years), the European Communitybegan to “re-model” its face. Brain

storming meetings took the first place inorder to reach harmonization in differentfields.Due to different factors, including the cul-tural diversities, existing regulations, thatrepresented, of course, a big challengeand it was the case, especially in the fieldof Food Safety . That is the reason why this morning, Iwould like to share with you a few dataand comments concerning the changeswhich, during the past decade especially,re-modelled Food Safety at a Europeanlevel . That is very important for us asFood microbiology and techniques arefundamental for the implementation ofthe new regulations .In order to do so, we shall begin by a fewhistorical data; we shall remember thecreation of the European Food SafetyAuthority, have a look at the mainEuropean regulations; then, before tryingto draw some conclusions, we shallspeak about the incidence of new regula-tions for the laboratories .

A FEW “HISTORICAL”DATA Probably, everybody remembers the cre-ation of the Common Agricultural Policy;it happened in 1962 and was the conse-quence of the obvious necessity to builda regulated frame in order to regulate thetrade . It seems of interest to mentionthat, from 1964 to a recent period, therewere 17 sectorial directives; the differen-ces in the approach of member stateswere not neglectible! Concerning theexpertise, it was carried on by differentgroups with different approaches, evenin the same country.An important date has now to be mentio-ned: 12 January 2000, David BYRNE,nominated to the European

Commission in 1999, serving asCommissioner with responsibility toHealth and Consumer Protection, pre-sented what has been called the“White Paper”. It was originated fromthe “Green Paper” published in 1997;its purpose was to reach the highestlevel of Food Safety in Europe.In order to do so, it was considered asnecessary to set up an important pro-gram of new regulations taking the “ NewApproach”, from farm to fork into accountand to create a Food Safety Authority, inorder to harmonise the expertise of theEuropean scientific community.The publication of “The Food Law” (regu-lation (EC) n° 178/2002, applicable fromJanuary 2005) was the consequence ofthe presentation of “The White Paper”.The main objectives of the “Food law”were as follows:- Improvement of the Community secto-

rial legislation.- Improvement of the control of their

implementation.- Improvement of the consumer’s infor-

mation.All those improvements should result ina large simplification.The general principles took into account:- The “Risk Analysis” and precaution

principle.- The duties resulting from the interna-

tional trade.- The safety prescriptions.- The responsibility which is given to the

professionals.- The traceability.- The existence of an “Alert system”.- The Emergency measures which have

to be taken.And reference was made to theEuropean Food Safety Authority for acommon expertise.All steps had to be considered from theprimary production, industry of animalfeed, veterinary pharmacy till further pro-cessing plants, all types of foods and allplaces including importations, exporta-tions.

THE EUROPEAN FOODSAFETY AUTHORITY (EFSA)

The main objective of the creation ofEFSA presented in the “White Paper”was to reach the broadest acceptance ofRisk Assessment which is essential toensure that the action is appropriate andrapid, that may cancel the diversities inthe approaches of different member sta-tes.Presently, EFSA is located in Parma (It).Of course, national agencies participateto the evaluation works carried out at theCommunity level but the collaborationbetween EFSA and national agencies isstill under construction.

THE MAIN EUROPEANNEW REGULATIONS Following the “Food Law” publication, aset of new regulations has been prepa-red which is called “Hygiene Package”,including:

• General hygiene rules for all types offoods.

• Specific regulations for foods of animalorigin.

And, in addition, specific regulations foranimal feed have been prepared.- General hygiene rules are provided inthe regulation (EC)n 852/2004.The main statement is surely represen-ted by The Good Hygiene Practices. The guides are written by professionals,for professionals, expertised and valida-ted by the administrations. In fact, it is anexcellent tool to justify the manufacturinghygiene practices taken by professionals. The regulation (EC) n°853/2004 gives thespecific rules for foods of animal origin.It concerns: The approval of plants.- Safety marks; identification.- Information of the Food chain.And annexes concerning the sectorial



activities (i.e bovine slaughtering, dairyproducts processing...).The regulation (EC) n°183/2005 con-cerns specific rules for animal feed.And gives procedures based onHACCP, rules of traceability and finan-cial guarantees; of course, it includesgeneral and specific hygiene rules.Moreover, some other regulations con-cern official controls, inspections.In that context, the regulation (EC)n°882/2004 is related to:• Harmonisation of procedures and ins-

tructions.• Frequency of inspections based on

Risk Analysis.• Approvals.While the regulation( EC) n°854/ 2004gives: • Specific rules for the organisation of

official controls for foods of animalorigin.

• Practical conditions of the official con-trols in processing plants, further-pro-cessing plants, shelfish, seafood, rawmilk and dairy products.

It introduces the notion of pilot progressin the context of national measures.As CONCLUSIONS concerning thenew regulations, we can say they showa simplification of European legislationan harmonisation between MemberStates.Moreover it is easier to read as there isa clear separation between the mis-sions of professionals and those of offi-cial controls.

THE INCIDENCE OFRECENT REGULATIONSFOR THE LABORATORIES

As a consequence of those mentio-ned regulations, and in order to eva-luate the acceptability of the processas well as the safety of food products,it was necessary to set up MICROBIO-LOGICAL CRITERIA. Till recently, a lot of microbiological crite-ria did exist in the different Europeancountries and most of them concernedfood of animal origin.NOW, HARMONISED CRITERIA HAVEBEEN SET UP AT A EUROPEANLEVEL.(Regulation (EC) n°2073/2005 of theCommission 15 November 2005).

OBJECTIVES

The main objective of the new micro-biological criteria is to validate andverify the procedures based onHACCP and other measures to controlhygiene but Microbiological criteriahave also to define the acceptability ofthe products and also to set up micro-biological safety criteria. All operators of the food chain have torefer to those criteria which include:• SAMPLING.• ANALYSIS.• CORRECTIVE MEASURES.Consequently, it is necessary to set upapplication measures which include:The sampling plan, including the num-ber of samples to be tested.The microbiological limits.The methods of analysis and even-tually uncertainty measurement.It is also necessary TO TAKE MEASU-RES CONCERNING FOODS ASWELL AS THE CRITICAL CONTROLPOINTS TO WHICH THOSE CRITE-RIA HAVE TO BE APPLIED OR MEA-SURES TO BE TAKEN WHEN THOSECRITERIA ARE NOT OBSERVED . Those measures concern especially: The control of raw materials.The control of hygiene.The control of temperature and shelflife of a given food.So, we can see that the changes arefundamental. In order to reach a goodharmonisation, the regulation (EC) n°882/2004 of the European Parliamentrequests from Member States OFFI-CIAL CONTROLS, regularly perfor-med in connection with the RISK andwith an APPROVED FREQUENCY. THOSE CONTROLS MUST BEAPPLIED AT APPROPRIATE POINTSOF PRODUCTION, FURTHER-PRO-CESSING AND DISTRIBUTION. Even before the creation of EFSA,some recommendations had beenproposed by the Scientific Committeewhich was preparing the new micro-biological criteria: 23 September1999, the Scientific Committee forveterinary measures in terms of PublicHealth has underlined the importanceof setting microbiological criteriabased on a formal RISK ASSES-MENT. They have to take PUBLIC HEALTHunder consideration.

It was of course a great challenge toadopt common views among theMember States and the recommenda-tions which are presented hereafterare, of course, the result of a consen-sus. So, a recommendation forListeria monocytogenes (less than100/g) has been approved on 22 June2004 by the Scientific Committee forHuman Nutrition.The opinion on Vibrio vulnificus andVibrio parahaemolyticus of 19 and 20September 2001 is that there is nojustification to set up specific criteria. On 30/31 January 2002, it was recog-nised that conventional indicators arenot suitable to demonstrate the possi-ble contamination by the Norwalkvirus.It was also recommended to use E.coliinstead of fecal coliforms.• 27 February 2002: a special recom-

mendation for gelatine says that amicrobiological criteria must bemandatory for Salmonella only.

• 21/ 22 January 2003, foods in whichthe presence of VTEC represent arisk for Public Health have beenidentified.

• 26/ 27 March 2003: criteria applica-ble to coagulase positiveStaphylococcus and staphylococcalenterotoxins in cheese, raw milkHave to be revised.

• 14/15 April 2003: recommendationfor Salmonella: it is necessary tolook for when a problem of PublicHealth does appear.

• 9 September 2004: (group BIOLO-GICAL HAZARD of EFSA): mostproblems for baby foods concernSalmonella and Enterobacter saka-zakii. However, routinely,Enterobacteriaceae can be used formonitoring.

IN THAT CONTEXT, IT IS IMPOR-TANT TO KEEP IN MIND THE FACTTHAT HARMONISATION OF CRITE-RIA INCLUDES HARMONISATIONOF METHODS OF ANALYSIS.In Food Microbiology, European stan-dards are set up by CEN (ComitéEuropéen de Normalisation) whichworks in connection with ISO(International StandardisationOrganisation), according to what iscalled the “Vienna Agreement”.However, for a long time in Europe,standards were set up in different pla-

ces by different groups and CEN stan-dards were not always recognised…But, something very important happe-ned in 2006, i.e A MANDATE FORSTANDARDISATION HAS BEENADDRESSED BY EC TO CEN IN THEFIELD OF METHODS OF ANALYSISOF FOODSTUFFS CONCERNINGHYGIENE. It will finance collaborativestudies to fully validate the set of 15CEN/ISO reference methods. ONE OTHER IMPORTANT FACTCONCERNS THE COMMUNITYREFERNCE LABORATORIES WHICHHAVE TO USE THE STANDARDSRECOMMENDED BY CEN.Another decision seems also to be ofmost importance: The Draft IDF/ISO, version 3, April2006. THE PROTOCOL FOR THEESTABLISHMENT OF PRECISIONCHARACTERISTICS OF QUANTITA-TIVE METHODS BY INTER-LABORA-TORY STUDIES FOR THE EUROPE-AN MANDATE IN MICROBIOLOGY,TOGETHER WITH EN ISO 16140.Recently, a new working group (WG3)has been created under ISOTC34/SC9: its purpose is to standardi-se the validation of microbiologicalmethods, especially EN/ISO 16140(for intra-laboratories validation, vali-dation between 2 or 3 laboratories,verification of methods for accredita-tion, for reference laboratories).

CONCLUSIONS

A lot of work has been done from the dayof the presentation of the “White Paper”by David BYRNE, 12 January 2000. The result may be considered as animportant revolution in the field of FoodSafety in order to afford the consumersthe highest safety level. The approach is complete, ambitiousand should lead to a lot of improvementsin different sectors, including the labora-tories, their ways of thinking and working.However, a lot of work remains to bedone in terms of harmonisation in diffe-rent fields. One more question: There are so many Member StatesMay Europe be considered as a “labo-ratory for the world”?AT LEAST, THE CHANGES FROM2000 ARE SPECTACULAR.

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SPANISH RAPID METHODS AND AUTOMATION INFOOD MICROBIOLOGY: A STAR IS BORN

Daniel Y. C. Fung

Professor of Food Science, Kansas State University, Manhattan, Kansas, USA and Distinguished Professor of Veterinary School of Universitat Autònoma de Barcelona, Spain

In the history of Arts and Scienceonce in a while something importanthappens and that development will

have an impact for a long time in a par-ticular field and location. Such is thecase of the Spanish Rapid Methods andAutomation in Food Microbiology orga-nized by Dr. Josep Yuste and Dra.Marta Capellas at the UniversitatAutònoma de Barcelona (UAB), Spain,a university with about 50,000 students.Yuste visited my laboratory as a post-doc fellow with a NATO grant in 2000and immediately immersed in severalsuccessful research projects whichresulted in several Journal publications.More importantly, he observed andassisted in the World renowned KansasState University (KSU) InternationalWorkshop on Rapid Methods andAutomation in Microbiology in Summerof 2000. After he completed the ninemonth post-doc training, he returnedhome to UAB to continue his career asa food microbiologist. The experienceshe had at the KSU impressed him somuch that he decided to start a works-hop similar to the one held at KSU since1980. In 2002, he worked diligently andfollowed many of the strategies of theKSU workshop and decided to start hisown workshop in Barcelona with thecooperation of Marta Capellas as theco-director. He invited me to be theKey-note speaker as well as the princi-pal lecturer in this 4 day workshopwhich they named “Métodos Rápidos yAutomatización en MicrobiologíaAlimentaria”. The first workshop occu-rred in November, 2002.It was a great success with about 200scientists and students who attendedthe 4 day workshop. After the first suc-cessful workshop, Yuste and Capellascontinued the series in 2003, 2004,2005 and 2006 averaging about 200participants per workshop. I was fortu-nate enough to be the key-note speakerof the budding workshop series in allthese workshops. Our scientific interac-tions and friendships developed rapidly

and positively. At the 25th QuarterCentury Celebration of the KSU works-hop in 2005, I appointed both Yuste andCapellas as “Quarter Century Fellow” toManhattan, Kansas and they presenteda delightful lecture in the celebration.What makes this Spanish Workshop asuccess?

EXCELLENT LECTURESAND PRESENTATIONS Yuste and Capellas not only invited meas the key-note speaker and principallecturer in the workshop, they invitedmany outstanding scientists at theirown university and other institutions topresent world class lectures. I gave sixlectures during the workshop and usedmy 2002 article “Fung, D. Y. C. 2002.Rapid Methods and Automation inMicrobiology” as the key article to deve-lop the six lectures. These lectureswere delivered in English and simulta-neously translated into Spanish by ateam of truly excellent translators to theparticipants. They also invited Dr.Cécile Lahellec, one of the most res-pected microbiologists in Europe andthe former Director of Food Hygiene ofParis and Associate Director of theFrench Agricultural Experiment Stationin Ploufragan to give the opening lectu-re in this workshop series concerningthe current status of microbiologicaldevelopments in Europe and internatio-nal harmonization of microbiologicalmethods.I was truly honored that at the end ofthe 2006 workshop, the Dean of theVeterinary School presented to me theprestigious title of “DistinguishedProfessor” of Veterinary School of UABdue to my contributions to this works-hop series. I was the first scientist sohonored at UAB. It was one of the hig-hest honors of my long career inMicrobiology since 1969.Besides these academic lectures, theco-directors invited outstanding experts

from major companies to present thetheories and applications of the cuttingedge diagnostic kits, instruments, andsystems for rapid detection, enumera-tion, and characterization of all kinds ofmicrobes in food science. These werenot “sales” talks but rather scientificexpositions of the newest systems inthe world in rapid methods and automa-tion in Microbiology. As a scientist wor-king in the field for more than 30 years,I can attest to the fact that the standardof the Spanish workshop is second tonone in intellectual presentation as wellas practical implications of the methodsin the field.

PRACTICALEXPERIENCESThe majority of the participants atten-ded the two day lectures but a smallergroup of participants took part in theday long intensive practical experienceof the newest and best diagnosticsystems and instrumentation. Many ofthe systems were tested in a spaciousand well equipped laboratory with theassistance of company representativesand special assistants. The participantswere also involved in “rotations” of spe-cific systems throughout the day. It wasa long day but many important conceptsand actual contact of valuable systemswere made. I even spend about an houreach day to demonstrate some of myunique developments in applied micro-biology such as the Fung Double tube,Fung-Yu Tube, adhesive tape method,miniaturized microbiology technologies,etc. to the group. It was a most enjoya-ble interaction for all concerned.

EXCELLENT MANUALAND HANDOUTS Yuste and Capellas spent inordinateamong of time in constructing a worldclass Rapid Microbiology Manual for

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the Workshop (198 pages!!). Most ofthe information were presented inEnglish but many were also presentedin Spanish. I have seen many Manualslike this in my traveling and lecturing,and I consider this one of the best. As amatter of fact, I held the Manual up highin the first day of the workshop andsaid: “Just getting this valuable Manualis worth your while to come to thisworkshop”. Commercial companiesalso provided the participants with newand valuable handouts.

FACILITIES,ENVIRONMENT ANDCAMARADERIE

UAB is located in a lovely wooded areajust outside of Barcelona. The campusis full of students, faculty members, andvisitors involved in many educationalactivities. The campus is tranquil andvery orderly. The dinner facilities weregreat, and transportation was efficientand easily assessable. One of the mostenjoyable activities during the works-hop is the random distribution of souve-nir from Kansas State University. Eachyear, I sent a big box of all kinds of“goodies” to the Spanish workshop andat the end of the workshop I would openthe box and start throwing T-shirts,pens, medallions, and even foldingchairs to the participants. It was truly ajoyful event. We all enjoy that activitygreatly. Along with Yuste and Capellas,I also sign each certificate myself. Onthe first day we were strangers but atthe end of the workshop we were allgreat friends. We lined up outside of theVeterinary School each year and had apicture taken to remember the lovelyworkshop in Barcelona.So, indeed, a star is borne in RapidMethods and Automation in FoodMicrobiology in Spain. I am sure it willlast for at least 25 more years. I willcome as long as I am able and willalways bless this new star to shinebrightly in the field of Microbiology inEurope and in the World.This article was written to introduce thehistory and activities of the Spanishworkshop. Further scientific informationcan be obtained through:Dr. Josep Yuste and Dra. Marta

Capellas, at Centre Especial deRecerca Planta de Tecnologia delsAliments (CeRTA, XIT), Departamentde Ciència Animal i dels Aliments,Facultat de Veterinària, UniversitatAutònoma de Barcelona; e-mails:[email protected], [email protected]; and Dr. Daniel Y. C.Fung, 207 Call Hall, Department ofAnimal Sciences and Industry, KansasState University, Manhattan, Kansas66506, USA; e-mail: [email protected].

References1.- Fung, Daniel Y. C. 2002. Rapid Methods and

Automation in Microbiology. Inaugural Issue of

Comprehensive Reviews in Food Science and

Food Safety, vol. 1 issue 1, pages 3 to 22.

(Electronic version through www.ift.org or contact

Fung at [email protected])



SEGURIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIASCON MICROSISTEMAS

L. Fonseca, C. Cané

Centro Nacional de Microelectrónica, Campus UAB, Bellaterra [email protected]

INTRODUCCIÓN

La comunidad agroalimentaria recu-rre hoy día a análisis de laboratoriobien aceptados por su excelente pre-cisión, pero que adolecen de flexibili-dad, son costosos y se dilatan en eltiempo. La combinación de técnicasde micro y nanofabricación, biotecno-logía y herramientas avanzadas decomunicaciones y tratamiento dedatos abren la puerta a un nuevo tipode instrumentación ventajoso, demenor tamaño, más económico, másrápido y más autónomo. Inmunosen-sores, chips de ADN, sistemas portá-tiles multisensores… incrementaránsu importancia en un futuro próximosi se benefician de la introducción delas micro y nanotecnologías. Estabatería de nuevos dispositivos y sis-temas serán útiles en la detección decontaminación de origen natural(micotoxinas, hongos toxigénicos,bacterias patógenas) y artificial (anti-bióticos, plaguicidas), así como pue-den ayudar a determinar el estado deconservación de los alimentos a lolargo de la cadena alimentaria.

¿QUÉ SON LOSMICROSISTEMAS?Los microsistemas, conocidos comoMEMS en gran parte del mundo, sonsistemas miniaturizados, es decir,una colección de elementos que inter-actúan apropiadamente entre ellosmismos y con el entorno. En el casomás general, puede distinguirse den-tro de un microsistema la existenciade sensores, unidades de procesa-miento y actuadores (Figura 1). Estoselementos son diferentes tipos dechip, fabricados de forma parecida, yen factorías similares, a los micropro-cesadores y las memorias de nues-tros ordenadores. De hecho, parafabricar microsistemas se ha de com-

plementar las técnicas habituales defabricación microelectrónica con pro-cesos de micromecanizado del silicioque son los que permiten definir eneste material membranas y partesmóviles susceptibles de interactuarcon el entorno, de acuerdo con dife-rentes principios de transducción quese ven favorecidos por factores deescala que aparecen al pasar delmundo macro al micro. Conviene des-tacar que los microsistemas se bene-fician igualmente de la economía deescala típico de los productos microe-lectrónicos: aunque las instalacionesy los procesos necesarios son muycostosos, todo está preparado paraprocesar simultáneamente decenasde obleas de silicio, conteniendocada una centenares de chips, deforma que el coste por unidad puedeser arbitrariamente bajo si se acome-

ten grandes volúmenes de produc-ción. Una pequeña disgresión con respec-to a la, a veces, engañosa cuestióndel tamaño. Un chip lo podemos sos-tener en la punta de los dedos, peroun sistema basado en chips es obvia-mente más grande. De la mismamanera que un ordenador es másgrande que el microprocesador quecontiene, un instrumento de medidafabricado alrededor de un microsiste-ma es, en su conjunto, más grandeque los sensores miniaturizados quepueda albergar. En cualquier caso, laventaja en tamaño final de estos sis-temas continua siendo importante yaque estos instrumentos suelen serportables. Podríamos decir que alpasar del chip al sistema pasamos dela punta de los dedos a la palma dela mano.

Figura 1.- La combinación de técnicas estándar microelectrónicas con técnicas de micromecanizacióndel silicio hacen posible la fabricación de sensores y actuadores miniaturizados y de bajo coste con losque pueden diseñarse sistemas inteligentes de pequeño tamaño que interactúen con el entorno.

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UN SISTEMA DESEGURIDAD Y CALIDADALIMENTARIA BASADOEN LAS TECNOLOGÍASDE LA INFORMACIÓN

¿Por qué mezclar microtecnologías y elcontrol de los alimentos? ¿Qué aportanlas tecnologías de la información a laseguridad y calidad alimentarias? Esbien sabido que las crisis alimentariasdel siglo pasado han obligado a unreplanteamiento de la seguridad alimen-taria que ha comportado asumir nuevosconceptos y aproximaciones a diferen-tes niveles. Por ejemplo, a nivel deagencias de regulación se ha impulsadoel análisis de riesgos (evaluación, ges-tión y comunicación de riesgos), y a nivelde producción se ha potenciado el con-cepto de ‘Buenas Prácticas’ y el Análisisde Peligros y Puntos Críticos de Control(APPCC). Este tipo de aproximacionesson, de hecho, sistemas de controlbasados en la información y, por tanto,susceptibles de beneficiarse de las tec-nologías más punteras de lo que seconoce como Sociedad de laInformación. Es más, las solucionesactuales para garantizar la seguridad ycalidad alimentaria se basan en análisiscostosos y nada rápidos que tienenlugar en laboratorios cada vez más cen-tralizados y que precisan un personalaltamente cualificado. Las alternativasmicrotecnológicas con sus dimensionesmás pequeñas, aportan portabilidad yproximidad al producto, una respuestamás rápida y un menor consumo dereactivos. Como ya se ha dicho, su

coste puede ser bajo. Además, estassoluciones se articulan en torno a unaseñal eléctrica (después de la oportunatransducción física, química o biológica)que puede ser fácilmente procesado ytransmitido, permitiendo un funciona-miento más autónomo, sin la necesidadde un operario experto, o incluso sin elconcurso de operario alguno, abriendola puerta a soluciones en red y ubicuas.Un sistema de seguridad y calidad ali-mentaria basada en la información nosolo nos ha de permitir hacer mejor lo quehicimos en el pasado, sino que nos debeayudar a afrontar los nuevos retos socia-les y económicos que están incrementan-do las situaciones de riesgo asociadas alos alimentos y a su consumo. En lanueva economía global el origen del ali-mento es más diverso y la consiguientecadena logística transnacional se hacemás compleja: la distancia entre produc-

tores y consumidores crece mientras quelos tiempos de entrega se acortan.También la logística doméstica merecemás atención ya que el gusto actual favo-rece alimentos menos procesados y lasdistancias que recorremos para realizarnuestras compras aumentan. Sin olvidarque en las poblaciones modernas (yenvejecidas) crecen los desórdenesinmunológicos incrementándose el riesgode reacciones adversas a los alimentos.En este contexto (origen diverso de losalimentos, multiplicación de riesgos yacortamiento de los tiempos de respues-ta) los microsistemas rápidos, baratos yautónomos pueden ayudar a proteger lacadena alimentaria con una armadurablanda de información (Figura 2).

EL PROYECTO GOODFOOD

GoodFood es un Proyecto IntegradoEuropeo. Estos proyectos fueronintroducidos por la Comisión Europeadurante el 6º Programa Marco deInvestigación en un intento de aumen-tar la masa crítica y multidisciplinari-dad, así como fomentar aproximacio-nes orientadas a la aplicación deresultados. En consecuencia, losProyectos Europeos son proyectosrealmente grandes. En particular,GoodFood se coordina desde elCentro Nacional de Microelectrónica(CNM-CSIC) e involucra a 29 sociosde 10 países diferentes. Aproximada-mente, una tercera parte de estos

Figura 2.- Instrumentos de pequeño tamaño basados en microsistemas multisensores que permitanuna monitorización automática y en continuo pueden extender el control a lo largo de la cadena ali-mentaria más allá incluso del concepto de trazabilidad.

Tabla 1.- Campos de aplicación y objetivos cubiertos por GoodFood en los diferentes escenariospropuestos.

socios son empresas (desde PYMEShasta grandes compañías, desde pro-veedores de tecnología hasta usua-rios finales), otra tercera parte soncentros de investigación y el últimotercio corresponde a universidades.Un gran consorcio, en definitiva, queaglutina un amplio abanico de visio-nes y experiencia.Más en detalle, en el proyectoGoodFood se trabaja en la detecciónde antibióticos, plaguicidas y micotoxi-nas, así como de hongos responsa-bles de estas toxinas y bacteriaspatógenas. Se investiga, igualmente,en calidad alimentaria, logística y,finalmente, en el desarrollo de solu-ciones de Inteligencia Ambiental. Losdemostradores en los que se trabajaestán pensados para ser aplicados atres grupos básicos de alimentos:leche y derivados, fruta, zumos y vino,y, por último, pescado. Para cubrireste amplio escenario de aplicaciónlos socios del proyecto están investi-gando en materiales, estructuras, dis-positivos, sistemas y redes (Figura 3).A pesar de no agotar, obviamente,todas las posibilidades, los grupos dealimentos mencionados fueron esco-gidos para fijar unos objetivos repre-sentativos para los demostradores.En cualquier caso, la casuísticacubierta es suficientemente ampliacomo para poder transferir algunas deestas soluciones a otros grupos de ali-mentos (pasar del pescado a la carne,por ejemplo) con los mínimos ajustesnecesarios. Así mismo, aunque el pro-yecto se centra en la seguridad y cali-dad alimentaria, soluciones similarespueden resultar útiles en la detecciónde fraudes, en el análisis de materiasprimas, o en el control de procesosdentro de la industria transformadorade alimentos.

APLICACIONES PARA LASEGURIDADALIMENTARIA

A continuación, se describen algunasde las actividades enmarcadas en losdiferentes escenarios descritos conanterioridad. En el caso de detecciónde antibióticos se persigue un instru-mento del tamaño de una ‘caja de

zapatos’, multicanal (que permita ladetección simultanea de diferentesantibióticos) basado en un inmunosen-sor y en detección por fluorescencia.De esta forma, nos encontramos conbioquímica en el corazón del instru-mento (la reacción inmunológica) ymicrotecnología todo alrededor: en elláser usado para excitar los marcado-res fluorescentes, en la microcámarapara detectar la fluorescencia, en lared de difracción necesaria para aco-plar y desacoplar la luz incidente ysaliente de la zona de medida, y en elsistema microfluídico que ha de guiarla muestra con ayuda de micropartícu-las magnéticas. La detección de plaguicidas y micoto-xinas es otro objetivo del proyectoGoodFood. Para ello también se recu-rre al mismo principio de inmunosen-sado, pero, en esta ocasión, se buscaun mecanismo de detección que nosea óptico para así conseguir un ins-trumento aún menos voluminoso ymás robusto. Los anticuerpos emplea-dos para los distintos inmunosensoresmencionados son de origen comercial,pero también se ha dado el caso deque, dentro del consorcio, se ha desarrollado algún anticuerpo novedo-

so. También se está estudiando eldiseño de receptores artificiales quejueguen un papel similar para evitar laproblemática asociada a los anticuer-pos de origen animal. Las micotoxinas las producen hongostoxigénicos y, de esta forma, nosmovemos hacia otro escenario dedetección, el de microorganismosvivos. Aparte de los hongos, tambiénse está detrás de la detección rápidade determinadas bacterias patógenas,como la Salmonella y la Listeria. Laaproximación en estos casos es laidentificación de la huella genética deestos organismos mediante los chipsde ADN. En otro ejemplo de multidisci-plinaridad, hay grupos trabajando parareducir el tamaño de la plataformamultisensora, donde la reacción dehibridación del material genético debeverificarse y para que este fenómenopueda ser puesto de manifiesto sinrecorrer a sistemas ópticos. Por otrolado, otros grupos trabajan en la deter-minación de los fragmentos de ADNapropiados para cada caso y en sim-plificar y acortar los protocolos previosa la necesaria reacción de la PCRpara la amplificación del materialgenético.



Figura 3.- En el proyecto GoodFood tienen lugar tareas de I+D a diferentes niveles (materiales,estructuras, dispositivos, sistemas y redes) para su aplicación en diferentes escenarios de interés enel campo agroalimentario.

APLICACIONES PARA LACALIDAD ALIMENTARIAMás allá de la seguridad alimentaria,los microsistemas también puedentener una incidencia positiva en elcampo de la calidad de los alimentos.La determinación del punto de madurezde la fruta o de la frescura del pescadopueden ser buenos ejemplos. Lo quese persigue, en este caso, es fabricarsistemas cromatográficos miniaturiza-dos y compactos, tanto para gasescomo para líquidos. Detrás de la micro-columna de separación se pueden dis-poner diferentes microsensores para laidentificación de sustancias. En el casode análisis de muestras líquidas podrí-an ser micro o nanoelectrodos. En elcaso de gases, podrían ser sensoresde óxidos metálicos (sensores quími-cos basados en el cambio de resisten-cia eléctrica de una capa al reaccionarcon determinados gases a temperatu-ras de unas pocas centenas de grados;fabricarlos sobre microestructuras bienaisladas térmicamente permite calentarlocalmente una pequeña cantidad dematerial sin despilfarrar energía) omicropalancas debidamente funcionali-zadas (estructuras micromecanizadasque resuenan a una frecuencia alta quecambia apreciablemente si la masa dela palanca se ve incrementada por laadsorción de moléculas de gas). Deesta manera, se podrían analizar deter-minados constituyentes de la leche, olos gases desprendidos por la fruta o elpescado, o, incluso, combinandoambos sistemas se podría analizartanto la fase líquida como la gaseosadel vino, que tiene tanto una químicalíquida rica como una mezcla complejade aromas.

APLICACIONES EN ELCAMPO DE LA LOGÍSTICAEl escenario logístico contemplado enel proyecto se centra en la conserva-ción y transporte de fruta climatérica(manzanas, por ejemplo). En el primercaso, un fotómetro de infrarrojo, multi-canal y miniaturizado permitirá contro-lar dentro de las cámaras de conserva-ción los gases relacionados con el esta-do de la fruta, como por ejemplo, el eti-leno, que está directamente relaciona-

do con su punto de madurez. En elcaso del transporte se están desarro-llando tarjetas flexibles de radiofre-cuencia (RFID) y su correspondientelector. El paso adelante es integrar enestas tarjetas capacidad de sensartemperatura, humedad, intensidad deluz y, muy especialmente, gases.

MÁS ALLÁ DE LOSSENSORESINDIVIDUALES

Inteligencia Ambiental es un conceptocomplejo acuñado en Europa hacepocos años en el campo de las tecnolo-gías de la Sociedad de la Información.Para simplificar nos referiremos en loque sigue a lo que es su implementa-ción física: redes inalámbricas de sen-sores. Una de estas redes autoorgani-zables (en cuanto al camino que siguela información entre los distintos nodos)de sensores se ha desplegado en unaviña con el propósito de monitorizarparámetros de interés, tanto ambienta-les como de las propias plantas: tempe-ratura, humedad del terreno a dos pro-fundidades, insolación, diámetro derama... Esta información se recoge encampo y se transmite a una unidad cen-tral de control donde es agregada, mos-trada de forma práctica para un usuariono entrenado, y almacenada en basesde datos. Esta información permiteextraer un conocimiento útil del estadode la viña a nivel muy local (estréshídrico, crecimiento vegetativo, predic-ción de ataques de hongos a partir dela evolución histórica de temperatura yhumedad...), permitiendo a los produc-tores tratar diferentes zonas de formadiferenciada ahorrando recursos (agua,plaguicidas...) y posibilitando una cose-cha selectiva. Como conclusión general, los microsis-temas pueden jugar un papel importan-te en la industria agroalimentaria. Unbuen número de tecnologías, ya pues-tas a prueba en otras aplicaciones,pueden adaptarse a este campo.Nuestro objetivo es abundar en lainvestigación necesaria a nivel demateriales, dispositivos y sistemas conel fin de obtener demostradores tecno-lógicos aptos para su prueba en condi-ciones reales

Bibliografía1.- Información adicional sobre los microsiste-

mas y sobre el proyecto GoodFood puede con-

sultarse en www.goodfood-project.org. El estado

de las actividades del proyecto puede seguirse

en www.goodfood-project.org/www/Newsletter.

Las publicaciones derivadas de estas activida-

des se encuentran recogidas en www.goodfood-

project.org/www/Results.

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LA POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)Dr. Armand Sánchez Bonastre

Dpto. de Ciencia Animal y de los Alimentos. Facultad de Veterinaria.Universidad Autónoma de Barcelona. [email protected]

La reacción en cadena de la poli-merasa (conocida como PCRpor sus siglas en inglés,

Polymerase Chain Reaction) es unmétodo de análisis de ácidos nuclei-cos, desarrollado por Kary Mullis amediados de los años 80, para produ-cir grandes cantidades de un frag-mento específico de ADN de secuen-cia y longitud definida a partir de unapequeña cantidad de material inicial.La técnica permite amplificar selecti-vamente una molécula de ADN o ARNvarios millones de veces en pocashoras. Mediante la PCR podemosrealizar la detección y análisis desecuencias específicas de un gen sinnecesidad de aislarlo previamentepor técnicas de clonación de ADN.Los análisis pueden realizarse a par-tir de unas pocas células o de unamínima cantidad de muestra biológicasin la necesidad de aislar previamen-te grandes cantidades de ácidosnucleicos.La PCR ha revolucionado el campodel diagnóstico molecular y se haconvertido en una técnica de rutinaen el ámbito de la genética, la micro-biología y la biotecnología.

PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA PCR La PCR se fundamenta en la amplifi-cación enzimática de un fragmento deADN flanqueado por dos secuenciasde oligonucleótidos que hibridan en lacadena complementaria de la molé-cula molde que se va a amplificar(cebadores o “primers”) y que son uti-lizados por una ADN polimerasa ter-moresistente (generalmente, seemplea la de la bacteria termófilaThermus Aquaticus, capaz de crecera elevadas temperaturas) para copiarla secuencia de la misma.La reacción es un proceso que cons-ta de 3 etapas (repetidas unas 30-35veces): desnaturalización, hibridaciónde los cebadores y extensión de losmismos.

Desnaturalización: Para que puedainiciarse la reacción es preciso que lasmoléculas de ADN molde se encuen-tren en forma de cadena simple. Estose consigue calentando a temperatu-ras de 90 a 95ºC para que produzca larotura de los enlaces puente de hidró-geno intercatenarios y la separaciónde ambas cadenas. Para asegurar lacompleta separación de la doble cade-na del ADN esta temperatura debemantenerse unos minutos. Si el ADNsolo se desnaturaliza parcialmente,éste tenderá a renaturalizarse muyrápidamente dificultándose una efi-ciente hibridación de los primeros y laposterior extensión de los mismos.Hibridación: Una vez que el ADN estádesnaturalizado se disminuye la tem-peratura de la reacción hasta un rangocomprendido entre los 40 y los 60ºCpara que se pueda producir la hibrida-ción específica de los cebadores a lassecuencias flanqueantes del fragmen-to que se desea amplificar. Esta etapase denomina también fase de “annea-ling” y la temperatura a la que se reali-za debe establecerse para cada reac-ción en función de la longitud de loscebadores y su secuencia (temperatu-ras inferiores a la óptima nos produci-rán hibridaciones inespecíficas de loscebadores y temperaturas superioresnos dificultarán la eficiencia de lamisma). Extensión: Durante esta etapa la ADNpolimerasa termoresistente incorporanucleótidos en el extremo 3' del ceba-dor utilizando como molde la cadenade ADN previamente desnaturalizada.La temperatura a la que se realiza estaetapa de la reacción suele ser de 72ºCya que es la temperatura a la que laTaq polimerasa alcanza su máximaactividad. Normalmente una extensiónde 20 segundos es suficiente parafragmentos menores de 500 pares debases, y 40 segundos para fragmentospor encima de 1.2Kb. Al finalizar cada uno de los ciclos elnúmero de copias obtenidas se dupli-ca y después de 20 ciclos ya tenemosaproximadamente 1 millón de copias

de cada una de las moléculas moldeiniciales de ADN.La técnica puede usarse para la ampli-ficación de moléculas de ARN si pre-viamente se realiza una copia de lasmismas mediante la enzima transcrip-tasa reversa. De este modo podemosrealizar estudios sobre moléculas deARNm o bien la podemos aplicar parala detección de virus ARN.La elección de los cebadores y eltamaño del fragmento amplificado esde gran importancia para el resultadofinal. En pruebas de diagnóstico eltamaño del fragmento amplificado nodebe superar los 100-150 pares debases de ADN si partimos de muestrasque puedan haber sufrido una degra-dación de los ácidos nucleicos y laelección de los cebadores debe reali-zarse para fragmentos específicos dela diana que queramos amplificar paraevitar falsos positivos.Una vez realizada la amplificación, seprocede a la identificación de lasecuencia obtenida mediante electro-foresis, hibridación con sondas com-plementarias o técnicas de análisis depolimorfismos.El análisis por PCR puede ser de dostipos: cualitativo (detección de la pre-sencia o ausencia de un fragmento deADN determinado) o cuantitativo(detección de la cantidad de un frag-mento de ADN determinado).

ANÁLISIS CUALITATIVODE ADN MEDIANTE PCREste tipo de análisis se suele realizarcuando tan sólo es necesario conocer lapresencia o ausencia de alguna secuen-cia específica de ADN o ARN, como porejemplo la detección de la presencia deun patógeno en una muestra. El análisisdel producto amplificado suele realizar-se mediante electroforesis en gel o capi-lar y su visualización por tinción en bro-muro de etidio o por detección fluores-cente si previamente hemos utilizadouno de los cebadores marcado conalgún tipo de fluorescencia.

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En algunos análisis resulta necesarioidentificar la secuencia del productoamplificado y el producto de la PCRdebe ser sometido a un análisis espe-cífico (secuenciación, digestión conenzimas de restricción, etc.).

ANÁLISIS CUANTITATIVODE ADN MEDIANTE PCRLa PCR convencional no es una técni-ca cuantitativa ya que la amplificaciónexponencial del ADN molde no semantiene constante especialmente enlos últimos ciclos de la reacción.Para poder realizar estimas cuantitati-vas se han desarrollado técnicas dePCR en “tiempo real” (PCR cuantitati-va) en las que es posible determinar lafase exponencial de la amplificación ypoder extrapolar de forma cuantitativala cantidad de molde inicial que seesta amplificando.La metodología de PCR cuantitativafacilita, además, la automatización y nosuele requerir el procesamiento ulteriordel producto amplificado, lo que reduceel riesgo de contaminación. En la actualidad, existen en el merca-do varios equipos y protocolos para larealización de esta técnica. Desde elpunto de vista de la detección del pro-ducto amplificado en cada ciclo, exis-ten tres métodos principales de análi-sis de PCR cuantitativa basados entécnicas de fluorescencia y que sediferencian en el tipo de detección delos productos de PCR. Estos métodosson: el que emplea una sonda condoble marcado fluorescente (TaqMan®)específica de la secuencia amplifica-da, los basados en el uso de dos son-das que hibridan de forma adyacenteen el fragmento que amplificamos y,por último, el que utiliza una sustanciaintercalante que se une a la doblecadena de ADN denominado SYBRGreen I y produce emisión de fluores-cencia.El método más difundido es el queemplea sondas TaqMan®. Este métodose basa en la actividad 5’-exonucleasade la Taq polimerasa y en la amplifica-ción mediante PCR de una determina-da secuencia diana en presencia deuna sonda fluorescente específica(sonda TaqMan®) que hibrida con lasecuencia diana que estamos amplifi-

cando. La sonda TaqMan®, de untamaño aproximado de 20-30 bases,tiene unido un fluorocromo en posición5’ y un segundo fluorocromo que actuapor interferencia con el primero cómoamortiguador de fluorescencia enposición 3’. Además, esta sonda estáfosforilada en 3’ para evitar su exten-sión durante la reacción de PCR. Si lasecuencia diana está presente en lamuestra, la sonda TaqMan hibridaráespecíficamente con ella, situándoseentre los dos cebadores. Cuando seproduce la etapa de extensión en lareacción de PCR, la actividad 5’-exo-nucleasa de la Taq polimerasa degra-da a la sonda TaqMan liberando elfluorocromo que, al quedar separadodel amortiguador, emitirá una señalque puede ser captada por el sistemaóptico del equipo. Este proceso dedegradación de la sonda tiene lugar encada uno de los ciclos y es directa-mente proporcional al número demoléculas que están siendo extendi-das en cada uno de ellos que pode-mos visualizar por el incremento de laseñal de fluorescencia.Además, la Taq polimerasa no digierela sonda libre sino únicamente la hibri-dada, por lo que la cantidad de señalfluorescente emitida es proporcional ala cantidad de producto acumulado. Lamedición de la intensidad de fluores-cencia se realiza de forma continúa loque nos proporciona una informacióndinámica en tiempo real del proceso.El sistema de detección permite esta-blecer el ciclo umbral (Ct-cycle thres-hold), ciclo de la PCR a partir del cualla cantidad de fluorescencia emitidaalcanza el nivel de detección quehayamos fijado, lo que a su vez secorrelaciona directamente con la canti-dad de ADN molde de la muestra ana-lizada. La cuantificación del númerode copias de una muestra se realizamediante la comparación de la Ct de lamuestra problema con la Ct de unaserie de diluciones de una muestra-control positiva. La cuantificación de lamuestra control positiva permite esta-blecer una curva estándar que reflejael número de copias y el número deciclo en el que ha sido realizada ladetección de forma objetiva y reprodu-cible.Cuando se realiza la cuantificación deuna muestra problema, el ciclo umbral

de su detección se lleva a la curvaestándar lo que permite conocer elnúmero de copias de la secuenciadiana existente en la muestra analiza-da.El método de PCR cuantitativa basadoen la química por hibridación de son-das, emplea dos sondas secuencia-específicas que hibridan en regionesadyacentes espaciadas entre uno ycinco nucleótidos. Una sonda estámarcada con un fluorocromo emisor enposición 3’ y la otra sonda está marca-da con un fluorocromo aceptor en suextremo 5’. Esta sonda además tienebloqueado su extremo 3’ con un grupofosfato para evitar su extensión. Sólocuando las dos sondas han hibridado yestán próximas se origina una emisiónde fluorescencia por el fluorocromoaceptor cuya intensidad aumenta pro-porcionalmente a la cantidad desecuencia diana formada en la reac-ción de PCR. Esta metodología se dife-rencia de la química de sondasTaqMan® en que no se requiere lahidrólisis de sonda para la emisión defluorescencia.El tercer tipo de detección de los pro-ductos específicos de PCR de lasecuencia molde consiste en la utiliza-ción del agente intercalante SYBRGreen I. Esta sustancia se une especí-ficamente a la doble hélice de las molé-culas de ADN formadas en cada ciclode la reacción de PCR produciendo laemisión de fluorescencia. De estaforma, la señal fluorescente se incre-menta en función de la cantidad deproducto amplificado. La ventaja deesta opción es que no se precisa lasíntesis de sondas fluorescentes espe-cíficas para cada tipo de detección,aunque su inconveniente reside en suinespecificidad ya que se detecta fluo-rescencia para todos los productos deADN de doble cadena presentes en lareacción (incluyendo los dímeros decebador que suelen producirse en lamayor parte de reacciones de PCR).La realización de estas técnicas dePCR en tiempo real requiere disponerde un equipo que disponga de un siste-ma de detección de fluorescencia.Existen, actualmente, en el mercadodistintas alternativas cuyo coste sueleestar relacionado con los niveles desensibilidad y capacidad de análisis demuestras de los mismos.

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LOS ALIMENTOS TRANSGÉNICOS: GENERALIDADES Y DETECCIÓN

Dr. Daniel Ramón Vidal / Dr. José Vicente Gil Ponce

[email protected] / [email protected]

BIOTECNOLOGÍA DEALIMENTOS: EL JUEGOANCESTRAL DE LAGENÉTICA Y LAALIMENTACIÓN

Muchas son las voces que actual-mente hablan sobre la comercializa-ción de los alimentos transgénicos.Se cuestiona, en primer lugar, suseguridad sanitaria y medioambientaly también su impacto sobre la econo-mía de los países en desarrollo. Larespuesta a estas cuestiones, lejosde ser unánime, parece polarizada endos frentes bien diferenciados: losque se oponen a cualquier tipo de ali-mento transgénico por ser negativosen prácticamente todos los aspectosposibles y los que defienden su segu-ridad y su papel en el futuro de laagricultura mundial. En medio de estedebate, aparecen confusos términoscomo biotecnología, ingeniería gené-tica o el propio alimento transgénico,que conviene clarificar si se quieretener una opinión bien fundamentada.Desde la Ciencia, la Biotecnología esel empleo, con fines industriales, deorganismos vivos completos o dealgunas de sus biomoléculas. Así, uti-lizar un cultivo del hongo Penicilliumchrysogenum para obtener un frascode penicilina, un cultivo de la bacteriaLactobacillus delbrueeckii para fabri-car un yogur o el gen de la bacteriadel suelo Bacillus thuringiensis paragenerar una planta resistente a unaplaga son ejemplos claros de lo quelos científicos entienden porBiotecnología. El ciudadano europeopiensa, sin embargo, que la biotecno-logía es tan sólo la modificacióngenética de los alimentos, es decir,poner genes en su sopa, lo que unidoa las fuertes campañas en contra dela comercialización de los alimentostransgénicos ha provocado que tantoestos alimentos como todo tipo de

biotecnología tengan una percepciónsocial claramente negativa. Todo estoes posible, en gran medida, gracias alalto grado de desinformación y dedesconocimiento de la biotecnologíadel ciudadano medio, algo tremenda-mente complejo de solucionar a cortoo medio plazo. No obstante, si seempieza explicando que la genética yla alimentación han ido de la manodesde los albores de la civilización yque, además, gracias a los mejorado-res genéticos de los últimos 12.000años disponemos de la variedadactual de alimentos, quizás esta per-cepción negativa comience a cambiar (1).En efecto, desde entonces el hombreha mejorado genéticamente las razasde animales de consumo, las varieda-des vegetales comestibles o losmicroorganismos responsables de laproducción de alimentos y bebidasfermentadas (2). Lo ha hecho deforma empírica, utilizando distintastécnicas genéticas entre las que des-tacan la hibridación, también llamadacruce sexual, y la variabilidad naturalgenerada por la aparición de mutan-tes espontáneos. Muy poco de lo quecomemos se ha librado de estasmejoras, quizás tan sólo algunasespecies animales que se cazan opescan en estado salvaje. El resto,por muy “natural” o “ecológico” que aalgunos les parezca, no está exentode modificación genética dirigida porparte del hombre. Es fácil entenderlocon un par de ejemplos. El primero serefiere al uso de la hibridación, dondese cruzan al azar los genomas de dosprogenitores intentando buscar en ladescendencia una combinación degenes más adecuada. Un ejemplohace referencia a las variedades detrigo con las que se producen hoy endía el pan y las pastas alimenticias.Se obtuvieron por un trabajo de siglosque incluyó mutaciones y sucesivoscruces, al extremo que en la actuali-dad podemos definirlas como puzzlesgenéticos en los que, a diferencia de

las especies progenitoras de trigo,donde había dos copias de cada cro-mosoma como en la especie humana,las actuales tienen seis (3). La segun-da se refiere al uso de la mutación enla mejora de alimentos. En esta técni-ca un gen de entre los varios miles degenes de un genoma muta al azar ycomo consecuencia aparece unnuevo mutante con una característicade interés. Este fue el caso de lascoles. Hace unos cuantos miles deaños, un ancestro de las mismasmutó en un gen que controlaba eltamaño de las yemas terminales ycomo consecuencia apareció unmonstruo en el que las mismas habí-an aumentado de forma descontrola-da. Un agricultor lo vio, le parecióatractivo, lo cultivó y llegó hastanuestros días con el nombre de col.De forma similar, aunque en mutacio-nes en genes distintos, surgieron lascoliflores, el brócoli o las coles deBruselas. Coles y panes son sólo dosde los miles de ejemplos del empleode la genética en la alimentación.De esta forma totalmente empírica, yno por ello menos eficaz, funcionó latecnología de alimentos durantesiglos hasta que, a finales del sigloXIX, Mendel estableció las bases dela herencia. Hace tan sólo treintaaños, la genética ha ofrecido a la ali-mentación una nueva herramientacon la que mejorar nuestros alimen-tos. Se denomina ingeniería genéticay en ella ya no se hibridan o mutanmiles de genes al azar. Se trabaja congenes aislados en el laboratorio queestán perfectamente identificados anivel molecular. Estos genes se intro-ducen en el genoma deseado gene-rando los organismos que llamamostransgénicos. Por eso, cuando en eldiseño de un alimento empleamos laingeniería genética se producen losalimentos transgénicos (4). Estadenominación es la habitual en lospaíses castellanoparlantes, aunqueen los países anglófonos y francófo-nos se habla de ellos como alimentos



modificados genéticamente. Nadademasiado nuevo desde la tecnologíade alimentos, ya que sigue siendoaplicar genética en la alimentación.

¿QUÉ TIENE DE NUEVOUN ALIMENTOTRANSGÉNICO?

Como se deduce de lo expuesto enlos párrafos anteriores, la diferenciaentre un alimento transgénico y otroconvencional sólo es tecnológica, yaque se basa en la técnica genéticautilizada en su diseño: ingenieríagenética frente al cruce sexual omutagénesis. En muchas ocasiones,se ha hecho una simplificación exce-siva de este hecho por parte de algu-nos defensores de esta nueva tecno-logía que concluyen que, al no hacer-se nada nuevo, sobran evaluacionese información. Por el contrario, otrosautores, aun reconociendo esta míni-ma diferencia tecnológica, hablan delas consecuencias que la misma aca-rrea.En primer lugar, tal y como antes seindicó, en el diseño de un alimentotransgénico la direccionalidad seimpone al azar, ya que no se mutanni mezclan genes en una ruleta gené-tica. Se selecciona uno, se diseccio-na molecularmente y se trabaja conél. Con ello, podemos afirmar que elconocimiento de lo genéticamentevariado en el caso de un alimentotransgénico es muy superior al quetenemos de las modificaciones intro-ducidas en el resto de alimentos. Porejemplo, al generar un cruce sexualel producto resultante presenta cam-bios en su genoma que pueden eva-luarse entre el 30 y el 50% con res-pecto a los genomas de los parenta-les. Por el contrario, al generar unaplanta transgénica estos cambios nosuperan un valor del 0.1% con res-pecto a la variedad convencional.En segundo lugar, en el diseño de unalimento transgénico se obtienen losresultados de una forma mucho másrápida, lo que es de importancia radi-cal para las compañías agroalimenta-rias. Por ejemplo, un programa demejora de melón comercial que impli-que introducir tres características de

relevancia agroalimentaria es un pro-yecto a tres años por ingenieríagenética y a diez por tecnologíasconvencionales. Es necesario aclararque el hecho de obtener antes eldesarrollo no implica necesariamenteque este llegue antes al mercado.Como discutiremos posteriormente,todos los alimentos transgénicosdeben ser evaluados sanitaria y toxi-cológicamente antes de obtener elpermiso de comercialización y estostrabajos suelen llevar una media desiete años.Finalmente, al construir un alimentotransgénico es posible saltar labarrera de especie. Todos los orga-nismos vivos tienen el mismo mate-rial hereditario: el DNA. En el labora-torio es imposible mutar una perahasta obtener un plátano o cruzarsexualmente estas dos frutas porqueson sexualmente incompatibles. Peronada impide transferir un gen delgenoma de un plátano al genoma deuna pera porque ambos estánhechos del mismo DNA. Esta diferen-cia tiene claras repercusiones éticas.Por ejemplo, un hipotético vegetaltransgénico que porte un gen de unanimal puede ser un problema paraun vegetariano de dieta estricta. Dela misma forma, aquellos consumido-res que profesan una religión conlimitaciones alimentarias, por ejem-plo, la ingesta de carne de cerdo, noquerrán tomar un alimento transgéni-co que contenga un gen provenientedel genoma de este animal. La solu-ción a este problema debe pasar porel etiquetado correcto de estos ali-mentos.

PRODUCCIÓN YDETECCIÓN DEORGANISMOSTRANSGÉNICOSLa generación de organismos transgé-nicos se puede simplificar en tres eta-pas básicas, con independencia quese trate de un animal, una planta o unmicroorganismo. En primer lugar, hayque aislar el gen o genes a introducir apartir del organismo donador y cono-cer todo lo posible acerca de él y susimplicaciones fisiológicas. Esta prime-

ra etapa implica, generalmente, clonarel gen de interés en un vector adecua-do que servirá para introducirlo en elorganismo receptor. La segunda etapadel proceso consiste en conseguir quenuestro gen se introduzca y expreseen el organismo receptor. A este even-to se le llama transformación y existennumerosas técnicas que van desde eluso de pulsos eléctricos para abrirporos en las membranas de los micro-organismos por los que se puedeintroducir el vector, el uso de la capa-cidad infectiva de virus o de bacteriasespecializadas en introducir fragmen-tos de su DNA en el huesped, el bom-bardeo con partículas impregnadascon ADN o la microinyección delmismo directamente en el núcleo de lacélula a transformar. Por último, y sihemos tenido éxito en las dos etapasanteriores, sólo nos quedaría conse-guir regenerar organismos transgéni-cos viables y estables a partir de losque hayan sido transformados conéxito y evaluar el efecto de dichatransformación para seleccionar aque-llos individuos que presenten lascaracterísticas que se perseguían. Ladificultad y rapidez para conseguir cul-minar las tres etapas puede variarenormemente en función de la natura-leza del organismo receptor o del sis-tema de transformación empleado,desde unos pocos meses hasta variosaños de trabajo.La nueva legislación europea referen-te al etiquetado y trazabilidad de ali-mentos transgénicos obliga a disponerde métodos eficaces y validados paradetectar y cuantificar la presencia deingredientes provenientes de organis-mos transgénicos en los alimentos. Lacuantificación es imprescindible debi-do a que la legislación establece, en elcaso de contaminación involuntaria,un umbral por encima del cual es obli-gatorio etiquetar. Actualmente, existenlaboratorios especializados capacesde realizar esta tarea y certificar lapresencia de ingrediente transgénicoasí como su cantidad. Para ello, se uti-liza generalmente la técnica de ampli-ficación de secuencias concretas deDNA mediante la reacción en cadenade la polimerasa, conocida como PCRpor sus siglas en inglés o la deteccióninmunológica de la proteína recombi-nante.

TRANSGÉNICOS EN ELMERCADOPara entender la problemática de losalimentos transgénicos es necesarioconocer los productos que ya están enel mercado y los que están próximos allegar. En todo el mundo, hasta lafecha, se ha autorizado la comerciali-zación de unos 80 alimentos transgé-nicos. La mayoría se venden enEstados Unidos, Australia y Canadá.Se calcula que hay más de 500 en últi-mas fases de experimentación o desolicitud del permiso de comercializa-ción. De ellos, en la UE sólo unospocos productos habían recibido elpermiso de comercialización hastaoctubre del año 2003, que se reducena variedades de soja, maíz o colza contolerancia a herbicidas o a plagas.Se han desarrollado alimentos trans-génicos de origen animal, vegetal ofermentado. Un gran porcentaje sehan obtenido en laboratorios de com-pañías privadas, pero otros lo han sidoen los de organismos públicos deinvestigación. Contrariamente a lo quese piensa, no todos benefician a losprimeros eslabones de la cadenaagroalimentaria, es decir, a las compa-ñías de semillas y a los agricultores.Algunos favorecen a las industrias detransformación, otros al consumidor eincluso algunos a los profesionales delsector evitando enfermedades profe-sionales. Por ello, es conveniente ana-lizar algunos ejemplos que enumera-mos a continuación.Un porcentaje muy elevado de lostransgénicos en agroalimentación seha dirigido a construir plantas transgé-nicas que resisten el ataque por distin-tos parásitos como viroides, virus,bacterias, hongos o insectos. Paraello, se ha trabajado con variedadesde claro interés agronómico en paísesdesarrollados como son el maíz, lapatata, la soja o el tomate. En ellas, esposible eliminar el uso de plaguicidas,ya que la propia planta es resistente alataque merced al gen introducido,reduciéndose considerablemente eluso de estos productos y su posibleimpacto negativo en el medio ambien-te. El ejemplo más conocido es el maíztransgénico autorizado en la UE encuyo genoma se ha introducido un genproveniente de la bacteria del suelo

Bacillus thuringiensis que sintetiza unaproteína que destruye el estómago deltaladro, una de las plagas más impor-tantes de este cultivo. La mejora deproductividad mediante el empleo deestas variedades, denominadas Bt, sesitúa entre el 10 y el 20% y, además,con su empleo no es necesario utilizarinsecticidas. Todo ello explica elamplio uso de este producto transgéni-co en la agricultura americana. Ennuestro país se ha plantado, funda-mentalmente en Aragón, con unosresultados similares a los obtenidos enEstados Unidos (5). Hay otras muchasvariedades vegetales transgénicasque resisten plagas y algunas de ellasya disfrutan de la autorización para lacomercialización en Estados Unidos.De particular relevancia es el caso dela generación de resistencia a virus, yaque, a diferencia de los insecticidas,fungicidas o antibióticos, no existencompuestos antivirales efectivos, porlo que la generación de transgénicoses una solución única (6).Otro gran grupo de vegetales transgé-nicos presenta resistencia a herbici-das. Es el representado por la llama-da soja transgénica autorizada en laUE. El cultivo de este vegetal, como elde muchos otros, tiene el inconve-niente del crecimiento conjunto demalas hierbas que, al competir con lasoja por los nutrientes del suelo, pro-ducen descensos importantes en laproducción. Por ello, se trata de elimi-nar las malas hierbas, lo que es facti-ble mediante el uso de herbicidas.Ahora bien, de la misma forma que elherbicida acaba con la mala hierbaelimina también la soja que es sensi-ble a dicho compuesto. Para solventareste problema, se han obtenido varie-dades transgénicas de soja que con-tienen en su genoma un gen prove-niente del genoma de la petunia queda resistencia al herbicida (7). De estaforma es posible tratar la plantacióntransgénica con el herbicida y eliminarsólo las malas hierbas. Los aumentosde producción por el uso de estaestrategia se sitúan en torno al 20%,por lo que el uso de semillas de sojatransgénica alcanzó el año pasadoporcentajes de mercado del 56% enEstados Unidos y del 96% enArgentina, dos de los mayores pro-ductores mundiales.

Otros desarrollos transgénicos se handirigido a mejorar las propiedades físi-cas o químicas en los alimentos.Existen tomates transgénicos queretrasan su ablandamiento y puedealmacenarse durante largos períodos(8) y también se han desarrolladopatatas transgénicas con cambios enlos contenidos de almidón, lo querepercute en su capacidad de reteneraceite durante la fritura (9). Hay plan-tas transgénicas de girasol o colza concambios en los contenidos de ácidosgrasos saturados u ovejas en las quese ha expresado el gen de la lactoal-búmina humana de forma que produ-cen leche con una composición bioquí-mica distinta (10). Recientemente, sehan generado vacas transgénicas quetienen modificados los niveles de dis-tintas caseínas, de forma que su lechetiene propiedades funcionales nuevas(11). Incluso en el campo de los ali-mentos y bebidas fermentadas se hangenerado bacterias lácticas que acor-tan los tiempos de maduración de losquesos (12) o levaduras vínicas queincrementan el aroma afrutado (13) oevitan problemas de filtrabilidad (14)en el proceso de vinificación. Algunosde estos desarrollos ya han sido eva-luados y otros lo están siendo ahora.En cualquier caso, son alimentostransgénicos para el futuro inmediato.Pero el objetivo clave para el futuro esmejorar las propiedades nutricionalesde los alimentos mediante ingenieríagenética, algo que a buen seguro elconsumidor percibirá positivamente alimplicar una mejora de su salud. Ya sehan conseguido logros importantes.Se han desarrollado vegetales trans-génicos denominados vacunas oralesque inmunizan contra enfermedadesinfecciosas. Por ejemplo, se ha des-arrollado una variedad de patata trans-génica que contiene el gen que codifi-ca una subunidad de la toxina del cóle-ra y es capaz de inmunizar contra estaenfermedad (15). Hay muchas más,tanto en vegetales (16) como en bac-terias ácido lácticas productoras dederivados lácteos (17), e incluso algu-nos de ellos han sido ensayados conéxito en voluntarios humanos (18).También se ha investigado la mejoraen composición vitamínica de los ali-mentos. Ya se han conseguido varie-dades de arroz transgénico con un alto

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contenido en provitamina A capacesde solventar los problemas de avitami-nosis en zonas del sudeste asiáticodonde este cereal es la base de ladieta (19), se han generado fresastransgénicas con contenidos elevadosde vitamina C (20) o tomates con dis-tintas proporciones de tocoferoles(21). Incluso se han conseguido leva-duras panaderas que obvian proble-mas de alergenicidad (22) o levadurasvínicas que producen vinos con máscontenido de agentes con un posibleefecto cardiosaludable (23). Son másalimentos transgénicos para el futuro.

LOS RIESGOS

Con frecuencia, aunque con una faltaabsoluta de pruebas, se acusa a losalimentos transgénicos de ser unveneno para la salud y el medioam-biente. Desde la seguridad alimenta-ria, las cosas se perciben de otramanera. Desde hace más de quinceaños, organismos internacionalescomo la FAO, la OCDE o la OMS hanestablecido grupos de trabajo paraevaluar la seguridad para el consumi-dor de los alimentos transgénicos,estableciendo un sistema de trabajodonde se da prioridad a la elaboraciónde principios científicos de evaluación.En todos los alimentos transgénicosque han obtenido el permiso decomercialización se ha llevado a cabouna evaluación de riesgos sanitariosatendiendo al contenido nutricional, laposible presencia de alérgenos y elnivel de toxicidad (24). Podemos afir-mar, sin miedo a equivocarnos, queningún alimento en la historia ha sidoevaluado como estos. El resultado esque no existe un solo dato científicoque indique que dichos alimentos, porel hecho de ser transgénicos, repre-senten un riesgo para la salud del con-sumidor superior al que implica laingestión del alimento convencionalcorrespondiente (25), algo que recien-temente ha sido puesto de manifiestopor la OMS en su página de Internet( h t t p : / / w w w . w h o . i n t / f s f /GMfood/). La afirmación de la OMSestablece un nuevo marco, ya que elciudadano deberá elegir quién lemerece mayor credibilidad en seguri-dad alimentaria: la OMS o las organi-

zaciones ecologistas. Es interesantedestacar que, tras la publicación deesta decisión, los grupos ecologistashan variado sus estrategias y apenashablan ya de riesgos sanitarios car-gando las tintas en los riesgosambientales.Es en esa parcela donde las cosasson, desde el punto de vista científico,menos claras, ya que hay una falta demetodologías para analizar riesgosmedioambientales, tanto de las plan-tas transgénicas como de las conven-cionales (26). Desde los sectores quese oponen a la transgenia se aducenposibles transferencias de los genesexógenos desde la variedad transgéni-ca a variedades silvestres. Sin dudasucederán, ya que esta transferenciase produce frecuentemente en la natu-raleza siempre que exista compatibili-dad sexual y presión selectiva. Porello, en Europa la transferencia degenes del maíz transgénico es impro-bable y probable si utilizamos sojatransgénica (27). Pero no olvidemosque ese riesgo también se da y sedará con cualquier variedad vegetalresistente a una plaga que haya sidogenerada por cruce sexual o mutagé-nesis. Otro posible riesgo medioam-biental es la pérdida de biodiversidadagrícola asociada al cultivo de plantastransgénicas. Nada nuevo en agricul-tura, pues padecemos este problemadesde que el hombre decidió cultivar.El freno racional a este problema,venga de las transgénicas, venga delas convencionales, es potenciar losbancos de germoplasma y las colec-ciones de cultivo. Un último riesgomedioambiental es el referente a losefectos dañinos que ciertas plantastransgénicas resistentes a insectospueden tener sobre poblaciones deotros insectos distintos de aquelloscontra los que protegen. Es una posi-bilidad que, en el caso de los transgé-nicos, a diferencia de las variedadesconvencionales, antes de conceder elpermiso de comercialización se obligaa analizar. En resumen, no se percibe la apari-ción de nuevos posible riesgosambientales por el uso de las varieda-des transgénicas. Son los mismos dela agricultura convencional, aunque eneste caso se intentan determinar apriori mediante la realización de libera-

ciones controladas al medio ambientede las que ya se llevan realizadasdecenas de miles en todo el mundo(28). La pregunta clave es, por lotanto, ¿acelerará el empleo de trans-génicos la aparición de estos riesgos?La respuesta desde la ciencia es quesiempre que se mantengan las normasestrictas de evaluación que emplea-mos actualmente parece poco proba-ble.

LOS BENEFICIOS

¿Para qué sirven los alimentos trans-génicos? Los grupos que se oponen aeste nuevo tipo de alimentos lanzanesta pregunta en la UE. Ante la tristerealidad de la moratoria que se dio enEuropa en los últimos años, sólo sepuede comercializar un maíz resisten-te a un insecto y una soja resistente aun herbicida, variedades que tan sólobenefician a los productores y no a losconsumidores. Sin embargo, hemosvisto que puede haber mucho más yde extrema utilidad. Pero no sólo paranosotros sino sobre todo para los paí-ses del Tercer Mundo (29-30). De ellose han aprovechado muchas empre-sas del sector agroalimentario y algu-nos biotecnólogos entusiastas que, sinruborizarse, afirman que los alimentostransgénicos acabarán con el proble-ma del hambre en el mundo. Este pro-blema tiene solución hoy en día al pro-ducirse la suficiente cantidad de ali-mentos para que nadie pase hambre,pero, por desgracia, el reparto deexcedentes alimentarios es un proble-ma social y político sin solución. Porello, sin esas medidas de poco valenlos transgénicos. Resulta particular-mente lamentable que algunas com-pañías del sector hayan hecho uso deeste mensaje cuando ninguna de ellastrabaja en los cultivos que plantan ycomen los habitantes de los paísescon problemas nutricionales y deabastecimiento. Pero si esas medidasse toman, los alimentos transgénicospueden ser el complemento ideal. Enesta filosofía se enmarcan los esfuer-zos de algunos países del TercerMundo como China, India o Keniafinanciando investigación públicasobre alimentos transgénicos. Ya haydesarrollos: patatas con mejor conteni-



do proteico (31), papayas con incre-mentos de productividad (32) o bonia-tos resistentes al ataque de virus queacaban con la cosecha en algunospaíses africanos. ¿Tenemos derecho aprohibirles solucionar sus problemasen base a unos posibles riesgos que,hasta ahora, a pesar de las miles deevaluaciones realizadas, no se handetectado? Aún a sabiendas de quepueda interpretarse como reaccionariopor parte de algunos, debemos recor-dar que resulta penosa la actitud dealguna afamada organización ecolo-gista cuando gira la vista a otro ladofrente a todas estas evidencias.

EL FUTURO

A pesar de que las campañas contra-rias a la comercialización de los ali-mentos transgénicos se mantienen enlas mismas posiciones desde hacemás diez años, las evidencias científi-cas tan solo se han acumulado en unlado de la balanza, en el de demostrarla seguridad de estos productos.Además, los muchos años de cultivo,comercialización y consumo en paísescomo Estados Unidos, Canadá oAustralia suponen una sólida confir-mación de que todos los miedos y peli-gros que se esgrimieron desde el prin-cipio carecen del fundamento quedesde entonces ya les negaba lacomunidad científica y de que el únicocamino válido, era entonces y lo siguesiendo ahora, la evaluación caso porcaso y riesgo por riesgo.Como ha ocurrido siempre en la histo-ria de la ciencia y la tecnología, la ver-dad y el progreso acaban imponiéndo-se al fundamentalismo y la sinrazón.Nada está exento de riesgo y por ellonunca se puede bajar la guardia, perode nada sirve partir de posiciones pre-juzgadas e inamovibles y las solucio-nes siempre pasan por atender a eva-luaciones exhaustivas y avalar lasconclusiones y las decisiones que deellas se deriven con argumentos cien-tíficos contrastables. En el futuro pró-ximo nos espera una avalancha denuevos alimentos transgénicos en losque el consumidor encontrará ventajaspara su salud o para sus sentidos. Sinduda la percepción social de los trans-génicos en Europa se verá profunda-

mente alterada cuando los ciudadanospuedan encontrarle la utilidad a estosproductos, tal y como ocurrió, ya hacedécadas, cuando empezaron a produ-cirse vacunas o insulina transgénicaque representaban claras ventajaseconómicas y sanitarias y que ni en suorigen ni en la actualidad han genera-do el más mínimo revuelo social.

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VALIDACIÓN DE UN MÉTODO INMUNOLÓGICOPARA MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA

Dra. Estefanía Escartín

SPM CONTROLER. Santa Maria 40-42, 08340-Vilassar de Mar Tel. 937502392, fax 937597143, e-mail: [email protected]

INTRODUCCIÓN

Para poder realizar una validación ade-cuada de un método analítico, en pri-mer lugar, hay que decidir el modeloestadístico a seguir para evaluar losresultados obtenidos.Existen diversos tipos de distribucionespara conocer la disposición espacial deelementos en una población (muestras)y el número de elementos que conten-ga dicha población (analitos).Los modelos estadísticos existentespermiten establecer distribuciones deprobabilidad y su selección dependedel tipo de variable que se pretendamanejar:- Para variables discretas, se aplican la

distribución de Poisson, la binomial yla binomial negativa.

- Para variables continuas se aplica ladistribución normal (no útil paramedidas microbiológicas).

Una característica que define a las dis-tribuciones de variables discretas esque la media y la varianza no son inde-pendientes la una de la otra, mientrasque ésta es una característica de la dis-tribución normal.Para evaluar datos microbiológicos nopodremos utilizar nunca una distribu-ción normal, ya que es el modelo al quese adaptan la mayoría de las variablescontinuas como medidas de volumen,de masa, etc. En cambio, la distribución de Poissones uno de los modelos fundamentalesen el análisis estadístico de datosmicrobiológicos. Está basado en una

distribución espacial totalmente aleato-ria de los elementos que la forma, noexistiendo ningún tipo de interferenciasentre ellos. Podemos asumir que, altomar una submuestra y homogenei-zarla 1/10 con el medio líquido corres-pondiente, obtendremos una distribu-ción aleatoria según Poisson, en la quela media y la varianza son iguales (S2 =x).Pero, en la naturaleza, la distribuciónde los microorganismos no es perfecta-mente homogénea sino que interactúanentre ellos y forman agrupaciones. Estadistribución se conoce como distribu-ción de agrupamiento y se la denominadistribución binomial negativa, en laque la varianza es mayor que la media(S2 > x). Así, podemos asumir que losmicroorganismos en una muestra dealimentos seguirán una distribuciónbinomial negativa, y que a partir de aquítomaremos las diferentes submuestraspara el análisis.

SISTEMÁTICA DE LAVALIDACIÓN

EEvaluación de los factores que influyen en los resultados

Antes de empezar a diseñar la vali-dación, hemos de comprobar que losposibles factores que pueden afectaral resultado final, están controlados.Dicha evaluación y las medidasadoptadas para controlar estos fac-tores se presentan en la tabla 1.

Definición de los parámetros a estudiaren función del tipo de método y de loscriterios de aceptaciión “a priori”

En métodos microbiológicos tipoausencia/presencia (detectado/ nodetectado), los parámetros a estudiarserán los siguientes:

SELECTIVIDADCapacidad de un método microbiológi-co para inhibir el crecimiento de micro-organismos no esperados.Un método para determinar la selectivi-dad es el estudio de la inhibición demicroorganismos.

SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD YEFICACIASensibilidad: proporción de muestrasque contienen el microorganismoinvestigado y responden positiva-mente al método.Especificidad: proporción de mues-tras que no contienen el microorga-nismo investigado y respondennegativamente al método.Eficacia: Es un parámetro general yúnico que indica la fracción de mues-tras atribuidas correctamente. Es elcociente entre la suma de verdade-ros positivos y verdaderos negativosy el total de muestras analizadas.Los tres parámetros se determinanen una misma experiencia. Para ello,se analiza un número de muestrasno inferior a 30. Para cada muestradebe existir un valor de referencia,que se establecerá adicionando unaconcentración conocida del microor-

RESUMEN

En un estudio de validación de métodos microbiológicos ausencia/presencia es muy importante, tanto el diseño expe-

rimental, como el cálculo estadístico posterior de los resultados para poder evaluar los parámetros necesarios (selec-

tividad, sensibilidad, especificidad, eficacia y límite de detección). En esta publicación se expondrán los resultados

obtenidos en la validación de la investigación de Salmonella spp. y Listeria monocytogenes en muestras de alimentos

mediante sistemas ELFA.



ganismo investigado a muestrasnegativas. En el estudio se debenincluir, aproximadamente, un 50% demuestras positivas y un 50% demuestras negativas. El estudio debeser ciego, la persona que prepare lasmuestras no debe intervenir en ningu-na etapa del procedimiento analítico.Antes de realizar los cálculos, sedeben confirmar tanto las desviacio-nes positivas como las negativas. Laconfirmación consiste en identificarhasta un nivel suficiente los microor-ganismos aislados que han dadolugar al resultado positivo.Así, a efectos del método de estudio:• Las desviaciones positivas confir-

madas se consideran verdaderospositivos. Las no confirmadasserán falsos positivos.

• Las desviaciones negativas noconfirmadas se considerarán ver-daderos negativos. Las desviacio-nes negativas confirmadas seránfalsos negativos.

• Los verdaderos positivos serán lasuma de CP y DP confirmadas.

• Los verdaderos negativos serán lasuma de CN y DN no confirmadas.

Finalmente, se determinarán losparámetros de validación aplicandolas siguientes fórmulas:

• Sensibilidad:

• Especificidad:

• Eficacia:

Siendo: VP: el número de verdade-ros positivos detectadospor el método de estu-dio.

VN: el número de verdade-ros negativos detecta-dos por el método deestudio.

FP: el número de falsospositivos obtenidos porel método de estudio.

FN: el número de falsosnegativos obtenidos porel método de estudio.

N: el número total de mues-tras estudiadas.

Criterio de aceptación: se aceptaráque un método presente una sensibi-lidad, especificidad y eficacia igual osuperior al 90%.

LÍMITE DE DETECCIÓNEl límite de detección de un métodomicrobiológico es el número más bajode microorganismos cultivables quedebe existir en una muestra parapoder obtener un resultado positivocon una determinada probabilidad.Asumiendo una distribución dePoisson, se puede calcular qué con-centración de microorganismos esnecesaria para obtener un resultadopositivo con una determinada probabi-lidad. Para ello, se parte de la fórmulaque expresa la probabilidad de regis-trar un resultado positivo en una distri-bución de Poisson:

Despejando m en la anterior fórmulatenemos:

Siendo: p(+): la probabilidad de encon-trar un resultado positivo.

e: la base de los logaritmosnaturales.

m: el número medio demicroorganismos por por-ción analítica.

Aplicando la fórmula, es posible cons-truir la tabla 2, que indica para cadaprobabilidad esperada, qué concentra-ción media m se requiere:Es decir, para tener una probabilidaddel 95% de obtener un resultado positi-vo en una técnica microbiológica cuali-tativa, se requiere un recuento mínimode 3 UFC/porción analizada. Si lo queinteresa es una probabilidad mayor, del99%, el recuento medio debe ser 5UFC/porción analizada.A la hora de seleccionar las concentra-ciones de microorganismos con las quese va a trabajar en el estudio del límitede detección de un método, hay quetener en cuenta esta distribución deprobabilidades, ya que si se trabaja conconcentraciones muy bajas. Es posibleobtener resultados negativos en unaporción elevada y achacarlos a unafalta de sensibilidad del método.En el caso de que lo que interese cono-cer sean las probabilidades que existende obtener un número determinado demuestras positivas cuando se parte deun determinado recuento medio y se

Medios de cultivo Control proveedores y control calidad internoHomogeneización Verificación diaria y Calibración

(diluidor y stomacher) periódica del diluidorALIMENTOS: Temperatura de incubación Control en continuo de la temperatura y Ausencia/presencia (estufa) Calibración de uniformidad y estabilidad periódica

Recuento visual Control de calidad interno: recuentos cruzados entre analistas

Obtención resultado Mini-VIDAS Verificación periódica equipo y control consumibles

Confirmación Control consumibles y medios

Método de análisis Factor Medida adoptada para minimizar su influencia en el ensayo

p(+) 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 0.99m 0.69 0.80 0.92 1.05 1.20 1.39 1.61 1.90 2.30 3.00 4.61

Tabla 1.-

Tabla 2.- Concentración media m requerida para cada probabilidad esperada.

analiza un número determinado de sub-muestras, el modelo más adecuadopara este caso es el binomial negativo,mediante la siguiente fórmula:

Siendo: A: número de submuestrasanalizadas.

x: número de muestras ana-lizadas con resultadopositivo.

A – x: número de muestras ana-lizadas con resultadonegativo.

p(x): probabilidad de obtener xresultados positivos.

p(neg): probabilidad de obtener unresultado negativo.

Así, por ejemplo, partiendo de unamuestra con un recuento medio de 5UFC/porción analizada y estudiando 20submuestras, vamos a calcular la pro-babilidad de obtener 18 resultadospositivos:

Con esta fórmula podemos calcularsucesivamente la probabilidad de obte-ner todos los resultados positivos, sólo19, sólo 18, etc.:• 20 resultados positivos de 20 analiza-

dos: 0.874.• 19 resultados positivos de 20 analiza-

dos: 0.119.• 18 resultados positivos de 20 analiza-

dos: 0.00756.Por tanto, si se analizan 20 muestrascon un recuento medio de 5 UFC/por-ción, se tiene una probabilidad de 0.993(0.874+0.119) de obtener 20 o 19muestras positivas. El resto de posiblesresultados tienen una probabilidad tanbaja de suceder que asumiendo que ladistribución binomial es real, estosresultados serían debidos a una faltade sensibilidad del método.Diseño del estudio del límite de detec-ción: Se utilizarán muestras reales conuna concentración conocida del micro-organismo a determinar. Para ello, seseleccionarán diferentes tipos demuestras en función de los microorga-nismos que se van a investigar y elalcance del método en estudio.Previamente, se analizan las muestras

para confirmar que son negativas almicroorganismo en estudio, seleccio-nando 20 muestras. A continuación, seinoculan las muestras: se toma unaporción de la muestra y a cada una sele añade el inóculo previamente prepa-rado. El inóculo consistirá en una dilu-ción de un cultivo puro del microorga-nismo a estudiar, y se inoculará unvolumen suficiente para obtener entre1-10 UFC/porción analizada. Paraconocer la concentración real del inócu-lo se hará un recuento de la dilución uti-lizada del inóculo, utilizando una placano selectiva (PCA) y la técnica de siem-bra en superficie. En este recuento serealizarán 3 replicados.Tras la inoculación, se homogeniza laporción a analizar: líquidos medianteagitación fuerte y sólidos añadiendo eldiluyente y homogenizando en el sto-macher, según se indica en el PNT delmétodo en estudio. Finalmente, se pro-cede a aplicar el método y se registranlos resultados obtenidos.Criterio de aceptación: el número demuestras positivas debe corresponderal esperado, teniendo en cuenta elinóculo empleado, y el número demuestras analizado y asumiendo unaprobabilidad del 95%. El límite dedetección será el correspondiente alinóculo empleado. Así, por ejemplo, siinoculamos 20 muestras diversas con5 UFC/porción muestra analizada ycomo resultado obtenemos 19 ó 20muestras positivas podemos decir queel límite de detección será 5 UFC/por-ción muestra analizada. En el caso deque no se cumpla el porcentaje depositivos, se preparará otra serie demuestras inoculadas con dilucionesmenores, que garanticen un recuentomás elevado. El intervalo de diluciónsiguiente es conveniente que tenga elvalor más bajo entre 2 ó 3 veces elvalor superior del intervalo anterior (20– 50 UFC/porción muestra analizadaen este caso).

Elección de muestras con matriz representativa y de la flora acompañante

En el presente estudio se pretendíavalidar el método para alimentos engeneral, y se escogieron las matricesque más se analizan en nuestro labora-torio. Se utilizaron 9 matrices diferentes

de alimentos de procedencias distintas.Estos alimentos se autoclavaron y seanalizaron adicionándolos con cepasno diana y diana a tres niveles de con-centración diferentes: 1-10 UFC/25g,20-50 UFC/25 g y 150-1500 UFC/g. Losalimentos fueron procesados en tresdías diferentes y por tres analistas dife-rentes, obteniendo un total de 162resultados, la mitad positivos y la otramitad negativos.Además de la cepa diana, se adiciona-ron diferentes cepas de distribucióncomún en alimentos, a concentracionessimilares a las de la cepa diana, parasimular la flora acompañante de los ali-mentos. Las muestras codificadascomo -004, -005, -006, -013, -014, -015, -016, -017 y-018 se adicionaroncon el microorganismo diana (muestraspositivas) y todas las cepas restantes,mientras que las codificadas como -001, -002, -003, -007, -008, -009, -010,-011 y -012 se adicionaron con todaslas cepas menos con el microorganis-mo diana (muestras negativas).A continuación se describen brevemen-te las matrices utilizadas en el presenteestudio:• Salchichas de carne picada de cerdo

(producto cárnico a base de carnedistinta a la de ave de corral, destina-do a su consumo cocinado).

• Postre lácteo (yogurt pasteurizadonatural azucarado).

• Ensalada de lentejas (comida prepa-rada con ingredientes sometidos atratamiento térmico).

• Salsa mahonesa.• Ensalada (comida preparada envasa-

da a base de vegetales crudos).• Pechugas de pollo sin piel (producto

a base de carne de ave de corral des-tinado a su consumo cocido).

• Tarta de crema y manzana (productode pastelería envasado).

• Menestra de verduras (producto ultracongelado a base de verduras).

• Filetes de pescado sin piel (merluzaultracongelada).

RESULTADOS OBTENIDOS

A continuación, se presenta el esque-ma de los métodos analíticos a validar,para la detección de Salmonella spp. yListeria monocytogenes medianteELFA (figura 1).

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Figura 1.- Métodos analíticos a validar para la detección de Salmonella spp. y Listeria monocytogenes mediante ELFA.

Salmonella spp método ELFA

SELECTIVIDADSe comprobó la selectividad del méto-do al detectar Salmonella frente alresto de microorganismos, y sobretodo, frente a otras enterobacteriascomo Escherichia coli, Shighella soneiiy Klebsiella pneumoniae. Además,todas las muestras negativas contení-an todas las cepas menos Salmonella.Todas las muestras dopadas conSalmonella y el resto de cepas interfe-rentes dieron positivo, mientras quetodas las muestras dopadas con todaslas cepas interferentes menosSalmonella dieron negativo, por lo quepodemos decir que el método dedetección mediante ELFA es muyselectivo.

SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD YEFICACIAUna vez obtenidos los resultados serecogen en una tabla de datos como latabla 3.VP: el número de verdaderos positi-

vos detectados por el método deestudio = 81.

VN: el número de verdaderos negati-vos detectados por el método deestudio = 81.

FP: el número de falsos positivos obte-nidos por el método de estudio =0.

FN: el número de falsos negativosobtenidos por el método de estu-dio = 0.

N: el número total de muestras estu-diadas = 162.

Finalmente se determinan los paráme-tros de validación aplicando lassiguientes fórmulas:

• Sensibilidad:

• Especificidad:

• Eficacia: En el presente estudio de validaciónhemos obtenido una sensibilidad el100%, una especificidad del 100% yuna eficacia del 100%.

LÍMITE DE DETECCIÓNPara el estudio de este parámetro, seutilizarán las muestras dopadas a nivelmuy bajo, en este estudio R 3 UFC/g.Se han analizado 27 muestras con unrecuento medio de 3 UFC/25g, por loque, si las muestras siguen una distri-bución binomial negativa, se tiene unaprobabilidad de 0.9568(0.2519+0.3563+0.2427+0.1060) deobtener 24, 25, 26 o 27 muestras posi-tivas. Así, en el presente estudio en elque hemos analizado 27 muestras con3 UFC/25g y como resultado hemosobtenido 27 muestras positivas, pode-mos concluir que el límite de detecciónes de 3 UFC/25g.

Listeria monocytogenes método ELFA

SELECTIVIDADSe comprobó la selectividad del méto-do al detectar Listeria monocytogenesfrente al resto de microorganismos y,

sobre todo, frente a otras especiescomo Listeria inocua y Listeria ivanovii.Todas las muestras dopadas contodas las cepas interferentes, menosListeria monocytogenes (incluyendo L.inoccua y L. ivanovii), dieron negativo,por lo que podemos decir que el méto-do de detección mediante ELFA esmuy selectivo.

SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD YEFICACIAUna vez obtenidos los resultados serecogen en una tabla de datos como latabla 4.VP: el número de verdaderos positivos

detectados por el método de estu-dio = 75.

VN: el número de verdaderos negati-vos detectados por el método deestudio = 81.

FP: el número de falsos positivos obte-nidos por el método de estudio =0.

FN: el número de falsos negativosobtenidos por el método de estu-dio = 6.

N: el número total de muestras estu-diadas = 162.

Finalmente, se determinan los pará-metros de validación aplicando lassiguientes fórmulas:

• Sensibilidad:

• Especificidad:

• Eficacia:

103


Positivo Concordancia positiva (CP): Desviación positiva (DP): 81+/81 dopadas= 81 0-/81 dopadas= 0

Negativo Desviación negativa (DN): Concordancia negativa (CN): 0+/81 autoclavadas= 0 81-/81 autoclavadas= 81

Resultado Resultado de referencia método en estudio Positivo Negativo

Positivo Concordancia positiva (CP): Desviación positiva (DP): 75+/81 dopadas= 75 6-/81 dopadas= 6

Negativo Desviación negativa (DN): Concordancia negativa (CN):0+/81 autoclavadas= 0 81-/81 autoclavadas= 81

Resultado Resultado de referencia método en estudio Positivo Negativo

Tabla 3.-

Tabla 4.-

En el presente estudio de validación,hemos obtenido una sensibilidad del93%, una especificidad del 100% yuna eficacia del 96%.

LÍMITE DE DETECCIÓNSe han analizado 27 muestras conun recuento medio de 3 UFC/25g,por lo que si las muestras siguenuna distribución binomial negativa,se tiene una probabilidad de 0.9568(0.2519+0.3563+0.2427+0.1060) deobtener 24, 25, 26 o 27 muestraspositivas. Así en el presente estudioen el que hemos analizado 27muestras con 3 UFC/25g y, comoresultado, hemos obtenido 27muestras positivas, podemos con-cluir que el límite de detección esde 3 UFC/25g.

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4.- ISO/TR 13843:2000. Calidad del agua: guía

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6.- ISO/DIS 17994. Calidad del agua: criterios

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métodos microbiológicos.

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10.- Decisión de la Comisión de 12 de agosto de

2002 por la que se aplica la Directiva 96/23/CE

del Consejo en cuanto al funcionamiento de los

métodos analíticos y la interpretación de los

resultados.



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