HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS

NUCLEICOS

BIOTECNOLOGÍA MÉDICA

Ing. Cinthia Córdova Barrios

Introducción

PATOLOGÍA

MOLECULAR

INGENIERÍA

GENÉTICA

BIOLOGÍA

MOLECULAR

Bases moleculares

Métodos de ensayo

Aplicaciones

Introducción

DNA dúplex desnaturalizado

Renaturalización de dos cadenas sencillas de DNA (bases complementarias)

Híbridos DNA-DNA, RNA-RNA y DNA-RNA

La hibridación se basa en el proceso de renaturalización

Desnaturalizacíón:

DESNATURALIZACIÓN

Rotura de los puentes de hidrógeno entre pares de bases.

Interacciones hidrófobicas entre bases apiladas.

Genera la pérdida de la conformación tridimensional o duplohelicoidal, determinando la

separación de las hebras y una conformación al azar o de ovillo. *RNA

Agentes Desnaturalizantes

Desnaturalizantes

Temperatura

Ácidos y bases

Agentes químicos

Agentes Desnaturalizantes

Temperatura

• Es el más representativo.

• Se debilita las fuerzas estabilizadoras de la doble hélice.

Ácidos y bases

• Valores de pH alejados de la neutralidad (apareaminento)

• Condiciones ácidas: Ruptura de la estructura primaria (enlaces y separación de bases.)

• Condiciones alcalinas: desnaturalización.*

Agentes químicos

• Moléculas polares con grupos amino y carbonilo.

• Frecuentes: urea, formamida, formaldehído.

• Compiten en la formación de enlaces puente de hidrógeno. *

La desnaturalización es reversible o irreversible (recuperación)

Efecto de la temperatura

Influencia de la desnaturalización sobre las

propiedades del DNA

Influencia en las propiedades

Viscosidad

Absorción ultravioleta

Rotación óptica.

Densidad de flotación.

Permiten diferenciar el DNA de doble hebra y el de hebra

sencilla.

Influencia de la desnaturalización sobre las

propiedades del DNA

INFLUENCIA SOBRE LA VISCOSIDAD (Rigidez y forma*)

Influencia de la desnaturalización sobre las

propiedades del DNA

INFLUENCIA SOBRE LA ABSORCIÓN (dobles enlaces*)

Influencia de la desnaturalización sobre las

propiedades del DNA

INFLUENCIA SOBRE LA ABSORCIÓN ULTRAVIOLETA

Curvas de desnaturalización

Carácter

sigmoidalRepresenta

Interacción

cooperativa

Característic

a propia

Curvas de desnaturalización

Temperatura

de fusión, Tm

Curvas de

fusión

Estabilidad

estructural.

Tm y el

contenido de

bases

Curvas de desnaturalización

EvoluciónDogma

central

Curvas de desnaturalización y

renaturalización

Hibridación de ácidos nucleicos

Introducción

La renaturalización depende de la complementariedad de secuencia de las hebras. Lo más probable es su reasociación formando los

dúplex originales.

Formación de moléculas dúplex de DNA cuyas hebras tienen distinto origen (especie o ácido nucleico). Hibridación

La estabilidad del híbrido depende de la proporción de bases complementarias y mayor longitud de las secuencias apareadas.

La hibridación puede tener un carácter artificial (homo y hetero), pero complementario.

La hibridación relaciona el grado de herencia evolutiva o conexión (homología, pe)

Hibridación de ácidos nucleicos

Principio básico:

Secu

enci

a dia

na En uno de los

fragmentos, obtenidos por enzimas de restricción, de la muestra de DNA.

Sonda Fragmento

corto de DNA, de secuencia conocida y complementaria a la secuencia diana, marcado de forma que permita su detección.

Especificidad de la interacción entre base complementarias

Hibridación de ácidos nucleicos

Principio básico:

Hibridación de ácidos nucleicos

Factores que influyen:

Factores

Concentración de ácido nucleico.

Número de copias de la secuencia diana.

Concentración y tamaño de la sonda.

Temperatura.

Tiempo de hibridación.

Características del medio de reacción.

Hibridación de ácidos nucleicos

Rigor de la hibridación:

DEFINICIÓN

Grado de especificidad en el

apareamiento conseguido en los

híbridos

Capacidad de reconocimiento mutuo de dos

secuencias

Apareamiento completo entre sonda

y diana.

CONTROL

Esencial

No alto, que impida la unión estable de la sonda a su diana

No bajo, que permita la hibridación

inespecífica de la sonda. Falso positivo

DEPENDE

Temperatura y tiempo de renaturalización

Composición de bases

Ambiente químico: Presencia de cationes y desnaturalizantes.

Hibridación de ácidos nucleicos

Rigor de la hibridación:

Hibridación de ácidos nucleicos

Métodos de ensayos

MÉTODOS DE HIBRIDACIÓN

En fase líquida

En soporte sólido

In situ

DNA CON SECUENCIA

DIANA

SONDA MARCADA

HIBRIDACIÓN

Hibridación en fase líquida

Método inicialmente empleado

Muestra de DNA o RNA en disolución con la sonda.

Cinética rápida

Técnica cuantitativa..

Hibridación en fase líquida

Hibridación en soporte sólido

Ensayo más simple.

Permite procesar varias muestras simultáneamente.

Cinética lenta.

Fácil control de la hibridación.

Hibridación en soporte sólido

Identificar en colonias bacterianas el gen en forma de plásmido recombinante

Hibridación en soporte sólido: DOT-BLOT Y

SLOT-BLOT

Ensayo más simple y común

Emplea muestras de ácido nucleico sin purificar.

Muestra se aplica gota a gota. Dot blot.

Muestra en manchas alargadas sobre un papel filtro. Slot blot

Hibridación en soporte sólido: DOT-BLOT Y

SLOT-BLOT

Hibridación en soporte sólido: SOUTHERN

BLOT

Técnica simple y fácil.

Detecta fragmentos de DNA (ER) separados por electroforesis.

Transferencia a un soporte sólido o filtro.

Detección

HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO:

SOUTHERN

Separación electroforética

Desnaturalización

Transferencia

Hibridación

Detección

Hibridación en soporte sólido: SOUTHERN

BLOT

Hibridación en soporte sólido: SOUTHERN

BLOT

Hibridación en soporte sólido: NORTHERN

BLOT

Técnica simple y fácil.

Detecta fragmentos de RNA separados por electroforesis.

Transferencia a un soporte sólido o filtro.

Detección

Hibridación in situT

isula

r Se realiza sobre cortes de tejido (fijados con formalina, parafina o congelados)células intactas, núcleos aislados.

Detección: autorradiografía o microscopía de fluorescencia.

Detecta virus patógenos.

Diagnósticos de células cancerosas.

Expresión genética

In s

itu c

rom

osó

mic

a Se realiza en preparaciones fijadas en porta de cromosomas metafásicos.

La secuencia de DNA se trata con enzimas proteolíticas y se desnaturaliza el DNA.

Hibridación con la sonda.

Detección con sondas marcadas con fluorescencia(FISH).

Diagnóstico de cromosomopatías, genes tumorales, virología, trasplantes, cariotipo molecular (pintado de cromosomas)

Transferencia WESTERN BLOT

No existe hibridación

Detecta proteínas separadas por electroforesis en SDS-PAGE

Transferencia a un soporte sólido o filtro.

Detección: anticuerpo marcado o proteína ligante.

Transferencia WESTERN BLOT