UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI

FALCULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUDESCUELA DE LABORATORIO CLINICO

BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR II

TRABAJO DE EXPOSICION

TEMAS: HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS

SONDAS DE ANTICUERPOS PARA PROTEINAS

INTEGRANTES:• FLECHER PALMA JERSON• SALTOS GARCIA KARLA

• SANTANA CANDELA JOSSENKA• PESANTES LUCAS NEXAR• PUCHA BAIRD PAMELA

• ZAMBRANO MENDOZA KAROLDOCENTE: MAYRA PARRAGA

• Clones• Cebador• Hibridación• Northern blotting• Electroforesis• Célula neoplásica• SDS-poliacrilamida• Inmunoprecipitacion• Quimioluminiscencia• Desnaturalizada• Endonucleasa • Nitrocelulosa• Microarrays• ADNc• Hibridación in situ

PALABRAS CLAVES

GLOSARIO• Cebador: Un iniciador o cebador es una secuencia corta de ADN de cadena simple que

se utiliza en una reacción en cadena de la polimerasa• SDS-poliacrilamida: Es una técnica ampliamente utilizada en bioquímica, genética, 

biología molecular y ciencia forense para separar las proteínas• Inmuno-precipitación: Regula procesos que se dan sobre la estructura nucleosomal

como la transcripción, la replicación y la recombinación.• Quimioluminiscencia: Producción de luz que acompaña a algunas reacciones químicas

y bioquímicas.• Desnaturalizadas: Hacer que una proteína pierda total o parcialmente su estructura.• Endonucleasa: Son enzimas que catalizan la ruptura de enlaces fosfodiéster en

diferentes regiones ubicadas en el interior de una cadena polinucleotídica• Nitrocelulosa: Producto resultante de la nitración de la celulosa.• Oligonucleótidos: es una secuencia corta de ADN o ARN, con cincuenta pares de bases

o menos.• Microarrays: (Microarray) Un Chip de ADN es una superficie sólida a la cual se une

una colección de fragmentos de ADN. Las superficies empleadas para fijar el ADN son muy variables y pueden ser de vidrio, plástico e incluso de silicona.

• ADNc: El ADN complementario o ADN copia (ADNc) es una hebra de ADN de doble cadena una de las cuales constituye una secuencia totalmente complementaria del ARN mensajero a partir del cual se ha sintetizado.

• Hibridación in situ: La hibridación in situ es una técnica de laboratorio que consiste en marcar una hebra sencilla de ARN o ADN denominada sonda y permitir que se empareje con su secuencia complementaria en el ARN o el ADN presente en una muestra de tejido o de cromosomas.

Hibridación de Ácidos Nucleicos

La clave para la detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos es el apareamiento de bases entre

hebras complementarias de ARN o ADN.Las hebras complementarias de ADN se separan

dando moléculas de cadena simple.Si dichas hebras desnaturalizadas de ADN se incuban

se renaturalizaran para formar moléculas de doble cadena por apareamiento complementario de bases.

Como se ha descrito anteriormente la hibridación entre cebadores y ADN

molde proporciona la especificidad a la amplificación por PCR.

Adicionalmente, una variedad de otras técnicas emplean la hibridación de ácidos nucleicos como medio para detectar secuencias de ADN o ARN

que son complementarias a cualquier acido nucleico aislado, como una

secuencia de ADN clonado. EL ADN clonado es marcado con nucleótidos radioactivos o con

nucleótidos modificados que pueden detectarse por fluorescencia.

Transferencia Southern

Se utiliza de modo generalizado para la detección de genes específicos en el ADN celular. El ADN problema es digerido por una endonucleasa de

restricción y los fragmentos obtenidos se separan por electroforesis.

El gel se adhiere a un filtro de nitrocelulosa o nylon, al cual se

transfieren los fragmentos de ADN, para dar una replica del gel. El filtro es entonces incubado con una sonda

marcada, que hibrida con los fragmentos de ADN.

La transferencia Northern o Northern blotting es una variante de la técnica de transferencia de

Southern, utilizada para la detección de ARN en vez de ADN.

La hibridación de ácidos nucleicos también puede emplearse para

identificar clones moleculares que contienen insertos específicos de

ADN celular.

. El primer paso en el aislamiento tanto de ADN genómico o de clones de ADNc es frecuentemente la preparación de bibliotecas de ADN recombinante

Los fagos recombinantes son sembrados en E. coli, y cada fago se replica produciendo una placa de lisis sobre un césped de bacterias

Una variedad de sondas pueden ser empleadas para estos experimentos

La placa adecuada puede entonces ser aislada a partir de la placa original para propagar el fago recombinante que porta el inserto de ADN celular de interés.

En lugar de analizar un gen cada vez, como en la transferencia Southern o Northen, la hibridación a microarrays de ADN permite el análisis simultáneo de miles de genes.

A medida que se han hecho disponibles las secuencias completas de genes eucarióticos, la hibridación a microarrays de ADN ha permitido a los investigadores realizar análisis globales de secuencias presentes en muestras celulares de ADN o ARN.

Una micromatriz de ADN consiste en una placa de cristal o silicona en la que se imprimen oligonucleótidos en puntos pequeños con una densidad elevada mediante un sistema robotizado.

Cada punto de la matriz consiste en un solo oligonucleótido.

En una placa normal pueden imprimirse decenas de miles de sondas únicas, de modo que es posible producir fácilmente microarrays de ADN que contengan secuencias representativas de todos los genes de genomas celulares.

Es una aplicación muy extendida de microarrays de ADN es en los estudios de expresión génica; ej., para comparar los genes expresados por dos tipos distintos de células.

En uno de estos experimentos, se sintetizan sondas de ADNc a partir de los ARNm expresados en los dos tipos de células (Células cancerosas y normales).

Los ADNc se marcan con tinciones fluorescentes y se hibridan a microarrays de ADN en las que están representadas 25000 o más genes humanos mediante puntos de oligonucleótidos.

A continuación se analizan las matrices mediante un escáner láser de alta resolución, y la cuantía relativa de transcripción de cada gen queda indicada por la intensidad de fluorescencia en el punto específico de la matriz.

La hibridación de ácidos nucleicos se emplea para detectar secuencias de ADN o ARN homólogas no sólo en extractos celulares, sino también en cromosomas o células intactas, proceso llamado hibridación in situ.

SONDAS DE ANTICUERPOS PARA PROTEINAS

Los anticuerpos ocupan el lugar de las sondas de ácidos nucleicos como reactantes que interaccionan de modo selectivo con moléculas proteínicas. Los anticuerpos son proteínas sintetizadas por determinadas células del sistema inmune que reaccionan con moléculas que el organismo huésped ha reconocido como exógenas. Los sistemas inmunes a los vertebrados son capaces de sintetizar millones de anticuerpos diferentes, cada uno de los cuales reconoce de forma especifica un antígeno particular.

Cada linfocito produce un único tipo de anticuerpo, pero los genes responsables de la

codificación de anticuerpos varían de un linfocito a otro como resultado de un proceso programado de reordenamiento génico que tiene lugar durante el desarrollo del sistema

inmune.Los anticuerpos se generan mediante

inoculación de una proteína extraña en un animal.

Pueden utilizarse otros materiales para producir inmunización y sintetizar anticuerpos

(una célula neoplásica)

Dado que los anticuerpos contra estos péptidos sintéticos habitualmente también reaccionan contra la proteína completa.

La inmunotransferencia ‘’transferencia de Western o Western Blotting’’ y la inmunoprecipitación

Las proteínas se separan por una técnica denominada electroforesis en gel de SDS-poliacrilaminaTras la electroforesis las proteínas se transfieren a un filtro, que se incuba a los anticuerpos que reaccionan con la proteína de interes

Quimioluminiscencia

En la inmunoprecipitación los anticuerpos son utilizados para aislar

las proteínas contra las que reaccionan. Pro ejemplo las células son

incubadas con aminoácidos radioactivos para marcar sus

proteínas. Al extracto celular marcado se le añade un anticuerpo, que se une

a su antígeno proteínico diana. Los complejos Antígeno-anticuerpo

resultantes se aislan y se someten a electroforesis, permitiendo la

detección del antígeno radioactivo por autorradiografia.

La inmunoprecipitación también puede emplearse para detectar interacciones proteína-proteína en el interior celular, mediante la co-inmunoprecipitación de dos proteínas que se encuentran interaccionando. Como se describió en el Capítulo 2, una técnica para la identificación de complejos de proteínas es inmunoprecipitar una proteína a partir de células bajo condiciones suaves de modo que permanece asociada con las proteínas con las que normalmente interactúa Como fue expuesto en el capitulo 1

los anticuerpos pueden ser utilizados para visualizar proteínas en el interior de las células, así como en la células lisadas. Las células se tiñen con anticuerpos marcados con pigmentos fluorescentes, tras lo cual al ser examinados con el microscopio de fluorescencia se la localización subcelular de las proteínas antigénicas.