Herramientas Analiticas - Espectrofotometria.pptx.pdf
19
Transcript of Herramientas Analiticas - Espectrofotometria.pptx.pdf
BT2008Diagnós.coMolecular1
Espectrometría/Espectroscopía Estudiosparaobtenerlacuan.ficacióndelespectroelectromagné.codeemisión
BT2008Diagnós.coMolecular1
EspectrovsEspectrograma
Dinámicoconrespectodel.empo
hHp://faculty.irsc.edu/FACULTY/TFischer/bio%201%20files/absorp.on%20spectrum2.jpg hHp://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/77/Spectrogram_‐iua‐.png/800px‐Spectrogram_‐iua‐.png
Está.coconrespectoal.empo
BT2008Diagnós.coMolecular1
Espectro
hHp://www1.sura.org/2000/SURA_Electromagne.c_Spectrum_Full_Chart.jpg
BT2008Diagnós.coMolecular1
TiposdeMoléculas DNA
RNA
Proteínas
Cualquierotro.poqueabsorba(cercanoalavisible): Industriatex.l,pinturas,.nciones,impresoras,imprentas
BT2008Diagnós.coMolecular1
ComposicióndeunEspectrofotómetroFuenteUV
Filtro Muestra Filtro Detector
BT2008Diagnós.coMolecular1
CalibraciónoBlanco Antesdehacercualquiermedición,se.enequecalibrarelespectrofotómetroalasmismaslongitudesdeondaquesevanausar
Seusalamismasolución(solvente)enlacubetasinmuestrayseajustalalecturaaCERO
Seenjuagalacubeta,seagregalamuestraysehacelalectura
BT2008Diagnós.coMolecular1
MedicióndeRNAyDNA Losácidosnucléicosabsorbenlamáximaenergíaenλ=260nm
Proteínasabsorbenaλ=280nm
Siseusanambas,sepuedencalculartantolaconcentracióncomolapurezadeácidosnucléicos
BT2008Diagnós.coMolecular1
MedicióndeRNAyDNA Absorbancia=DensidadÓp.ca(OD)
1Abs=1OD=50μg/mLDNAcadenadoble(aprox.)
1Abs=1OD=40μg/mLRNA/DNAcadenasencilla(aprox.)
Pureza(contaminaciónconproteínasyalgodefenolocloroformo)seob.eneconlarelación:
Abs260nm/Abs280nm~=[1.8–2]
Entremasbajalarelación,máscontaminación.ene
pHafecta,usarbuffers,pH~7.5
BT2008Diagnós.coMolecular1
MedicióndeProteínas Tipicamenteaλ=280nm
Debidoa
Fenilalanina
Tirosina
Triptófano
BiochemistryTheChemicalReac.onsOfLivingCells2dEdVols1&2‐DavidE.Metzler
BT2008Diagnós.coMolecular1
Ejemplos–CálculodeConcentracióndeRNA/DNA Beer’sLaw
A=εbc A–Absorbancia ε–AbsobabilidadMolar(L/cm) b–longitud(cm) c–Concentración(mg/L)
Ejemplo:Lecturaa260nmde0.422,deunadiluciónde1:100deDNA
c=0.422*50ug/ml=21.1ug/ml(encubeta)
C=c*100=2.11mg/ml(ensolución)
1Abs=50mg/L=50μg/mldsDNA
1Abs=40mg/L=40μg/mlssRNA
1Abs=33mg/L=33μg/mlssDNA?
MolecularDiagnos.csFundamentalsMethodsandClinicalApplica.ons‐Buckingham‐Flaws‐Davis
hHp://www.bmglabtech.com/applica.on‐notes/absorbance/absorbance‐dna‐quan.ta.on‐168.cfm
BT2008Diagnós.coMolecular1
CurvasdeCalibración Ayudana…
Lecturasconsistentes(aparato)
Muestraconfiable Cubetaenbuenestado DetectarerroresdePipeteo
DeterminacióndeLINEARIDAD Determinacióndelmejorlugarpara
mediryhacersolo1mediciónenfuturosensayos
Seob.eneconlecturasrepe.dasendilucionesseriadas
BT2008Diagnós.coMolecular1
EjerciciodeCálculodeCurvadeCalibración Enequiposde4ó5personas
CalcularcorrelaciónusandoExcel
BT2008Diagnós.coMolecular1
Consideraciones Simplesin.nciones
pHafecta
Dejarcalentarelespectro,.picamente10a15minutos
Lascubetasnodebenabsorveralaλdelectura.
MezclasdeRNA/DNA/Proteínas
ParaconcentracionesPRECISASdeentre10y100ng/mL,fluorometríaespreferida
Calibraciones
MantenimientoAnual,calibrandoconfiltrosconocidosentodoelrangodelongitudesdeonda,
Rangolinealdelaparato,absorbancias.picamenteentre0.05y0.8(vermanualdelaparato)
BT2008Diagnós.coMolecular1
OtrosTiposdeEspectrofotometría UV
FTIR
“MASS”?
Par.cleSize
BT2008Diagnós.coMolecular1
Tarea Amano,1ó2cuar.llasmáximo,paralasiguienteclase
Queescromatogra{ay2aplicaciones
