Guia Tecnica de Histologia

1 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL

HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL

GUIA TEORICA


CATEDRA DE HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA ESCUELA DE MEDICINA J.M.VARGAS U.C.V. AO LECTIVO 2010 - 2011

Introduccin La Ctedra de Histologa y Embriologa ha preparado la presente publicacin a fin de cumplir con los objetivos que la adopcin del rgimen anual aspira. El personal docente ha escrito esta gua con la intencin de orientar al alumno en el estudio del contenido terico de la asignatura. En ella cada uno de los temas se ha desarrollado en forma breve, aunque todos han sido tratados en la misma extensin; sin embargo, se trat de conservar un estilo uniforme. El estudiante, para hacer un buen uso de est gua, debe tomarla como tal. Bajo ninguna condicin constituir el texto nico de estudio de la materia; con ella se aspira a que el alumno puntualice los aspectos ms resaltantes de cada tema, y que luego con la ayuda de los libros recomendados y la informacin impartida en el aula, obtenga un conocimiento completo e integral. Tampoco el contenido terico aqu impreso ser la totalidad del sujeto a evaluacin.


CAPITULO 1

METODOS DE ESTUDIO DE LAS CELULAS

Objetivos de Aprendizaje Objetivo General: Al trmino del tema el estudiante deber estar en capacidad de poseer los conocimientos sobre el manejo y uso del microscopio ptico adems de conocer los diferentes mtodos aplicables a los tejidos para su estudio morfolgico. Objetivos Especficos: Enumerar y definir las partes del microscopio ptico y electrnico. Hacer una correlacin entre las partes del microscopio ptico y electrnico de transmisin. Conocer el poder de resolucin del microscopio ptico y electrnico, dando ejemplo de las estructuras observables en cada uno de ellos. Enumerar los pasos bsicos en el proceso de obtencin en un corte histolgico. Definir y describir el proceso de fijacin. Clasificar los agentes fijadores. Describir el mecanismo de accin de los agentes fijadores. Dar ejemplos de fijadores ms usados. Definir y describir el proceso de deshidratacin y clarificacin e inclusin. Dar ejemplos de medios de inclusin. Describir el proceso del corte de los tejidos. Describir las partes esenciales del Micrtomo. Definir coloracin y conocer los principios bsicos de accin de los colorantes. Enumerar las coloraciones habituales y las tricrmicas ms comunes. Describir el proceso de contraste para los cortes de microscopa electrnica de transmisin. Definir y describir brevemente las tcnicas especiales de anlisis utilizadas en Biologa Celular e Histologa.

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Microscopa

1. El trmino Histologa significa estudio de los tejidos. 2.El anlisis de los tejidos se realiza con la ayuda de microscopio ptico. La microscopa ptica y la electrnica comparten principios bsicos en el anlisis de las clulas y los tejidos. 3. La Histologa se puede considerar como una subdisciplina de la anatoma macroscpica, ya que con sus mtodos de estudio se realizan cortes de los diferentes rganos para su examen microscpico. 4. El propsito de los mtodos histolgicos es de realizar el anlisis de las muestras con la ayuda de los microscopios ptico y electrnico. 5. En la preparacin de un tejido para su anlisis se utilizan procedimientos de preparacin que incluyen cortes y tinciones. 6. La microscopa ptica y electrnica comparten los tipos bsicos de preparacin sealados antes pero difieren en detalles importantes. 7. El microscopio ptico consta de 3 lentes en serie. a. Condensador Enfoca la luz en la muestra. b. Objetivo Produce una imagen ampliada de la muestra. c. Ocular Aumenta la imagen mucho ms. 8. El microscopio electrnico tiene tres lentes similares, pero de naturaleza electromagntica. A una lente proyectora sustituye a los oculares, enfocando la imagen electrnica en una pantalla fluorescente para observacin directa o sobre una placa fotogrfica para su registro. La fuente de electrones es un filamento de tungsteno desde el cual son expelidos a travs de las lentes y la muestra por alto voltaje (100.000 V). 9. El microscopio ptico tiene una resolucin de 0.2 (aumento til 1000X). El microscopio electrnico tiene una resolucin de 0,2 nm. 10. Unidades de Medida1nm

Nanmetro (nm) = 109m = 106mm = 103 = m = 10 Micrmetro (m) = 106mm = 103

5 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL Preparacin de los tejidos Se llama tcnica histolgica a la serie de pasos que han de darse para obtener un preparado observable con el microscopio ptico. Es un proceso largo que abarca desde el momento en que se toma el material hasta que el preparado puede observarse. PASOS: 1.- Toma de material. 2.- Fijacin 3.- Deshidratacin 4.- Preparacin para la inclusin 5.- Inclusin 6.- Modelado del bloque catalogacin 7.- seccin con el micrtomo extendido de los cortes pegado 8.- Coloraciones: de rutina o especiales

1.- Toma de material:Introduccin: Tratndose de un rea de Histologa el material ha de ser de un animal sano y normal. Si es posible debe extraerse de un animal vivo y anestesiado, en caso contrario, al menos han de extraerse l o los rganos sanos lo ms rpidamente posible despus de la muerte. La mayora de las clulas consisten en una compleja membrana externa que rodea el protoplasma fluido, mezcla de soluciones de sales, protenas, hidratos de carbono, lpidos, cidos orgnicos y enzimas. Si las clulas no fueron fijadas, muchas de estas sustancias se perdern por solucin simple, por dilisis o por ingurgitacin osmtica de las clulas en el proceso que debe preceder al corte y a la tincin. En la tcnica histolgica muchos componentes texturales se pierden durante los sucesivos pasos de la misma. Los componentes que perduran son en gran medida molculas grandes que no se disuelven con facilidad en especial despus de aplicar el fijador. Las molculas grandes, particularmente aquellas que forman complejos con otras molculas de gran tamao, para producir compuestos macromoleculares, son las que mejor se conservan en un corte: Ej.: cidos nucleicos asociados con una protena (nucleoprotena) - Protenas intracelulares del citoesqueleto que forman complejos con otras protenas. Protenas extracelulares en grandes agregados insolubles asociados con otras molculas vecinas similares, a travs de enlaces cruzados (como sucede en las fibras colgenas) y los fosfolpidos de las membranas. Las protenas y cidos nucleicos pequeos como el ARN de transferencia en general se pierden durante la preparacin de la muestra de tejido. Adems pueden perderse molculas grandes, por ej. estas pueden ser hidrolizadas por un pH desfavorable en las soluciones fijadoras. Son ej. de molculas grandes, que desaparecen durante la fijacin de rutina en fijadores acuosos: el glucgeno, proteoglucanos y glucosaminoglucanos. Tambin suelen perderse los lpidos neutros.

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6 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL Al preparar muestras para su inclusin en parafina tambin se pierden molculas pequeas solubles o iones. Adems y con el mismo propsito, la fijacin debe hacerse muy cuidadosamente antes de proceder a la deshidratacin. En cuanto la sangre deja de llevar oxgeno a los tejidos y de extraerles el anhdrido carbnico, las enzimas de las clulas que componen los tejidos comienzan a actuar y se produce la autlisis, las propias estructuras moleculares son deformadas, que es lo que precisamente se ha de evitar. Los tejidos y rganos se han de extraer considerando las siguientes prioridades: Las glndulas exocrinas y endocrinas lo ms rpidamente posible. El pncreas y el rin deben extraerse no ms de 10 a 15 min. post-mortem. Otros rganos tales como intestino delgado y/o grueso, estmago, hgado, se deben extraer no ms all de los 30 min. Los msculos esquelticos, huesos, piel, encfalo, mdula, ganglios nerviosos no deben extraerse ms all de 60 min. post mortem. El examen necrpsico debe ser realizado lo ms rpidamente posible despus de la muerte, si esto no es posible el animal debe ser colocado a 4 C. o sometido a embalsamamiento por va arterial. Procedimientos generales: Si se extraen varios rganos se debe tener cuidado en registrar cada trozo de rgano envolvindolo en una gasa o bien pasando un hilo directamente por un extremo del rgano, mientras quede el extremo opuesto se coloca un trozo de cartulina resistente donde se escribe con lpiz las indicaciones (rgano, porcin, etc.) del caso, todo esto es necesario si las muestras a extraerse son muchas pues luego se ver dificultado el reconocimiento. La cantidad de lquido fijador en microscopia ptica debe ser aproximadamente 10 a 20 veces el volumen de la muestra. Los fragmentos de rganos no deben ser mayores de 1 cm de espesor; deben ser tomados en ngulos rectos a la superficie de los rganos y deben ser suficientemente profundos para comprender los constituyentes anatmicos normales como por ej. cpsula, corteza, mdula, etc. A veces pueden cortarse trozos de rganos de mayor tamao, 2 o 3 cm y luego de algunas horas en fijador en que las piezas estn ms fciles de manejar, se realizan cortes ms pequeos de los mismos. Cmo realizar las secciones? Los trozos de rganos tubulares se seccionan directamente con tijeras, los macizos han de ser desprendidos con las tijeras. Extrados los rganos deben seccionarse en fragmentos, para esto se debe utilizar una hoja de afeitar o de bistur (se utilizan a manera de serrucho sin presionar). Los bordes cortados con tijeras se seccionan y se desechan, porque comprimen los rganos y los deforman.

Muestreo:

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Material de necropsia:


2.- Fijacin:Concepto: La fijacin es una operacin destinada a matar las clulas, conservndolas, cuanto sea posible en el estado en que estn durante la vida. Introduccin: Una buen a fijacin debe: - inmovilizar la clula. - conservar exactamente todas las partes constitutivas. - no hacer aparecer artificialmente otros detalles en la estructura. Tal fijacin es por ahora imposible de realizar. Una accin rpida y enrgica del reactivo impide bien las alteraciones espontneas post mortem, pero este modifica tambin la estructura celular. Los mejores fijadores son los que adems de actuar rpidamente producen el menor numero posible de reacciones (modificaciones) secundarias o artificios, capaces de darnos una idea muy falseada de la morfologa interna de la clula. Un tejido bien fijado mostrar clulas plenas, no vacuolizadas, ni hinchadas, ni arrugadas, sino presentando muchos detalles de estructura fina. En qu consiste esencialmente la fijacin? : Es verdad que la masa celular, formada de albuminoides, no puede ser conservada exactamente, sino es por un proceso que la solidifique. Esta solidificacin se obtiene por coagulacin o precipitacin. La coagulacin es producida por agentes fsicos, la precipitacin, siempre acompaada de modificaciones qumicas, es producida por agentes qumicos. El verdadero papel de la fijacin es el de producir una coagulacin o una precipitacin lo ms completa posible de todos los albuminoides celulares, conservando la configuracin correspondiente a su naturaleza amorfa (citoplasma), granulosa (grnulos de secrecin), filamentosa (condrioma), etc. Conservacin morfolgica de los Tejidos: Debe endurecerlos suficientemente para permitirles resistir sin deformarse, todas las manipulaciones subsiguientes (deshidratacin, inclusin, cortes, etc.). La fijacin debe producir al mismo tiempo la insolubilizacin de los elementos constitutivos de la clula y de los tejidos. Es pues necesario que los detalles de estructura, conservados por el fijador no sean destruidos enseguida por la accin de los lquidos de lavado o de las soluciones colorantes. Esta insolubilizacin puede ser producida por la deshidratacin, coagulacin y principalmente por la combinacin qumica del reactivo fijador con los albuminoides celulares. Preparacin para la coloracin: Ciertas combinaciones formadas entre fijadores y tejidos tienen la propiedad de combinarse con ciertas materias colorantes, estas as pueden mordentar los tejidos y permitir coloraciones especficas.

8 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL Funcin del equilibrio fsico: Cuando hablamos de fijacin debemos tener en cuenta las reglas del equilibrio fsico que se relacionan con las membranas permeables. Desde el punto de vista fsico, la fijacin es la penetracin de un producto extrao a travs de una membrana permeable, es ante todo un fenmeno de smosis. La rapidez de la difusin est en razn directa con la concentracin de la sustancia que se difunde, conviene regular esta concentracin de manera que la clula pueda conservar lo ms intacta posible su forma, volumen y contenido, asegurando una penetracin rpida y completa. La rapidez de la penetracin est en funcin directa a la concentracin y en funcin inversa del peso molecular de las sales; esta es mayor para los cuerpos minerales que para los cuerpos orgnicos. Cuando una pieza es sumergida en un fijador, pueden suceder tres cosas: - La pieza cae al fondo, en este caso el fijador es hipotnico, y la fijacin tiene bastantes probabilidades de ser incompleta e irregular. - La pieza permanece flotando en la superficie, el fijador es hipertnico, muy denso y las clulas se contraern. - La pieza se sumerge, pero queda por encima del fondo del recipiente, hay equilibrio fsico y la fijacin ser buena si los ingredientes del fijador fueron bien elegidos. Cualidades de los fijadores: El fijador ideal sera aquel que conservase la clula en un estado idntico al estado viviente, este fijador en realidad no existe, por eso debemos buscar una serie de cualidades en el fijador a utilizar que nos acerquen lo ms posible al fijador ideal. Cualidades: Potencia o poder de penetracin: al menos en lo que concierne a los tejidos de manera que el lquido pueda fijar muy bien las zonas ms profundas e igualmente las capas superficiales. El fijador debe producir una coagulacin total de los albuminoides, pero esto no quiere decir que la coagulacin haya de ser violenta e instantnea, por el contrario, conviene que la coagulacin sea en cierto modo fraccionada para evitar las contracciones. La rapidez de accin de un fijador debe tener por objeto el de matar lo ms pronto posible las clulas. La precipitacin total, por el contrario, debe producirse adecuadamente de modo que no se produzcan contracciones. La muerte de la clula debe ser inmediata y su coagulacin debe ser mediata. Agentes fijadores: Los agentes fijadores pueden ser de orden fsico o de orden qumico. Agentes Fsicos: - Fro: No puede ejercer ninguna accin fijadora a temperaturas que no pasen de 0 C. Endurece los tejidos y suspende las

9 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL alteraciones celulares debidas a la necrosis y a la auto digestin. Este agente no sera ms que una ayuda. La congelacin de los tejidos frescos parece ser a priori, un detestable procedimiento histolgico. El aumento de volumen de los lquidos que los llenan y la formacin de agujas de cristales no puede evitar la produccin de verdaderos deterioros. Su nica ventaja es la de no precipitar los albuminoides y de no alterarlos. - Calor: Ejerce una accin muy diferente segn se aplique a objetos secos o hmedos. La fijacin por agua hirviendo o por diversos fijadores en ebullicin presta servicios para invertebrados y bsquedas histoqumicas. Agentes qumicos: - cido actico: Incoloro, cristalizable por debajo de 17 C. Aumenta el contraste entre ncleo y citoplasma. Forma parte de la mayora de las mezclas fijadoras como fijador de la cromatina. - cido smico: Se presenta bajo la forma de cristales amarillentos. Se obtiene comercialmente en pequeos tubitos de vidrio sellados, contienen cantidades que varan de 0.1 a 1 g. El manejo de este cuerpo presenta dificultades, es muy voltil y emite sin cesar vapores extremadamente irritantes. Es un enrgico oxidante por lo cual es reducido rpidamente por trazas de materia orgnica, por lo que se debe tener especial precaucin para preparar las soluciones. El ttulo habitual es de 1 a 2 %, puede prepararse en agua destilada o en cido crmico. Desde el punto de vista morfolgico, fija sin precipitar, impidiendo adems la precipitacin por el alcohol durante la deshidratacin. Mata rpidamente las clulas y fija bien el citoplasma y el condrioma pero no muy bien el ncleo. El osmio es un buen fijador de sustancias grasas y de la mielina. Es poco difusible y por consiguiente poco penetrante de manera que las capas superficiales de las piezas estn superfijadas mucho antes que el reactivo haya llegado al interior. - cido pcrico: Pequeos cristales amarillentos que se emplean en soluciones acuosas saturadas o en soluciones alcohlicas. Solubles en fro en agua, mayor solubilidad con temperatura. Es un reactivo muy penetrante que no se lo emplea solo, sino formando parte de mezclas, como en el lquido de Bouin. El cido pcrico es un excelente fijador, sobre todo desde el punto de vista tintorial. Se fija con intensidad sobre los citoplasmas, facilita todas las coloraciones. Contrae pero endurece poco. - Alcohol metlico: Reactivo importante en la tcnica de frotis desecados. - Alcohol etlico: Puede servir como fijador el alcohol absoluto o el de 96 .

10 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL El alcohol 100, puede dar excelentes fijaciones, por ej. para el sistema nervioso o frotis desecados. Disuelve los lpidos, precipita el glucgeno sin fijarlo y da con los nucleoprtidos un precipitado hidrosoluble. Es poco penetrante, fija mal los ncleos y poco los citoplasmas. - Bicloruro de Mercurio: Pequeos cristales blancos muy venenosos, solubles en agua, en fro (7%) en ebullicin (54%), muy soluble en alcohol (32%). En solucin acuosa precipita enrgicamente los albuminoides, principalmente los del ncleo. Estas propiedades se exaltan por la adicin de cido actico, que vuelve ms penetrante el fijador. Una vez terminada la fijacin es necesario eliminarlo de los tejidos para evitar la formacin de cristales. - Bicromatos: Los bicromatos alcalinos, (Potasio, sodio, Magnesio, Estroncio, Zinc) fijan bien los citoplasmas pero destruyen los ncleos. Los bicromatos de Bario, Calcio, Cobre, fijan bien las mitosis pero no los citoplasmas. El ms empleado de los bicromatos es el de Potasio, gruesos cristales de color rojo anaranjado, fcilmente solubles en agua (12.4%). - Formaldehdo: Este cuerpo es un gas cuya solucin acuosa lleva el nombre de formalina o de formol. Toda vez que hablemos de formol puro tendremos en vista la solucin comercial al 40%. El formol es el fijador ms utilizado, a causa de su bajo precio y la facilidad de su empleo. Es un fijador importante a causa de su poder coagulante y su notable capacidad de penetracin. El formol comercial es un lquido incoloro, que emite vapores irritantes. A veces los vapores del formol pueden producir accidentes febriles, bronquitis, queratitis. Resulta muy desagradable manejar piezas embebidas en formol a causa de las violentas punzadas que no se tarda en sentir en los ojos, la accin sobre la mucosa olfatoria, es tal vez menos sensible, pero ms durable y la capacidad de oler puede terminar por quedar notablemente disminuida. Conviene no poner los dedos en contacto con las soluciones que contienen formol porque la epidermis se fija rpidamente y endurece de manera poco agradable, adems de poder ocasionar dermatitis alrgicas por contacto. Para manejar piezas que han permanecido en formol sin sufrir los inconvenientes mencionados, se las lava con agua y luego se las introduce en agua ligeramente amoniacal, as se suprime todo olor. El formol de comercio casi siempre contiene una cantidad ms o menos considerable de cido frmico. Esta impureza daa muchas veces la fijacin, produce precipitacin en los tejidos, destruye las clulas mucosas y daa seriamente los citoplasmas por lo que es necesario emplear siempre formol neutro. Es conveniente adoptar una convencin para formular el ttulo de las diluciones: El porcentaje mirar siempre la solucin comercial de 40%, para preparar una solucin al 5% se mezcla 5 cc. de formol con 95 cc. de agua. La solucin comercial presenta a veces una alteracin particular que se manifiesta por un aspecto

11 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL lechoso y por la formacin de precipitado blando ms o menos abundante, el fro interviene mucho en este fenmeno. Estas transformaciones se explican por la existencia de tres ismeros: a.- El formol con una molcula de formaldehdo, b.-el paraformol con dos molculas, c.- el trioximetileno con tres molculas. El formol y el paraformol coexisten en las soluciones lmpidas, bajo la influencia del fro o por otras causas, se polimerizan y dan trioximetileno, insoluble, que forma un precipitado blanco. Tericamente el formaldehdo es un no-electrolito, por consiguiente incapaz de formar sales, pero s de formar compuestos de adicin. El formol solo, puro o diluido es un mal fijador, produce hinchamiento de los tejidos y vacuoliza las clulas o bien les da un aspecto de sobrefijados, disminuye los contrastes entre citoplasma y ncleo. La adicin de cido actico, corrige el defecto del formol y aumenta notablemente la coloreabilidad del ncleo. En los rganos muy vascularizados el formol a veces forma precipitados negruzcos muy incmodos, que pueden pasar por pigmentos. Para eliminarlos pueden tratarse los cortes con potasa. El formol forma parte de gran cantidad de mezclas fijadoras y es uno de los mejores fijadores para el sistema nervioso y para las mitocondrias. Mezclas Fijadoras: Las mezclas fijadoras se utilizan para tcnicas de rutina o para tcnicas especiales. Las mezclas fijadoras son combinaciones de agentes fijadores, cada uno de los cuales es por si solo insuficiente para dar una fijacin que responda a todas las exigencias.q

de von Tellyesniczki: A base de bicromato de potasio cido actico y agua destilada (3 g, 5 cc, 100cc). el bicromato conserva bien el citoplasma. El cido actico conserva bien los ncleos. Las muestras no deben ser mayores de 0.5 cm de dimetro. El tiempo de fijacin no debe superar los dos das, al trmino del mismo debe hacerse un lavado en agua corriente de 24 h.

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de Bouin: Para hacer esta mezcla es conveniente tener una solucin saturada de cido pcrico. Componentes: solucin saturada de cido pcrico 15 cc, formol 40% 5 cc, cido actico 1 cc. Es uno de los mejores fijadores para el estudio del glucgeno; penetra rpidamente a los tejidos, es un buen fijador general, salvo para el rin. Es muy adecuado para las coloraciones de Masson y Mallory. Produce poco encogimiento. Segn el tamao de la pieza la fijacin requiere de 1 a 24 h. El lquido completo es una solucin estable. Este fijador produce lisis de los glbulos rojos y disminuye la cantidad de hierro frrico demostrable. Los tejidos no deben permanecer por ms de 12 a 24 h. pues sino se vuelven duros y quebradizos. Una vez terminada la fijacin se debe pasar directamente a la deshidratacin con alcohol 80.

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De Carnoy:

Los componentes de esta mezcla son los siguientes: alcohol etlico, cloroformo, cido actico glacial (60 ml, 30 ml, 10 ml ). Este fijador es muy adecuado para pequeos fragmentos tisulares, por ej. obtenidos por raspado, que se fijan bien en 30 min. a 2 h. Tambin inicia la deshidratacin, es un buen fijador para el glucgeno, los ncleos se tien bien. Como inconvenientes podemos citar que produce lisis y encogimiento importante. Disuelve los lpidos y la mielina. Fija bien el glucgeno.

3.- Deshidratacin:Concepto: Los tejidos contienen grandes cantidades de agua, tanto intracelular como extracelular, que debe ser eliminada y reemplazada por parafina. Detencin de la fijacin: Una vez transcurrido el tiempo de fijacin deseado es preciso detenerlo rpidamente. El fijador que rodea la pieza puede ser eliminado por lavado en: Se hace en agua corriente de 2 a 24 h. Piezas que han estado en alcohol, cido pcrico o formol, se llevan directamente al alcohol 70 o 80%, llevndose as a cabo el lavado y el inicio de la deshidratacin. La deshidratacin se realiza por medio de un reactivo anhidro pero vido de agua. Puede utilizarse la acetona o el alcohol etlico (es el ms utilizado). La deshidratacin se hace en forma progresiva con sucesivos baos de alcohol, cada vez menos hidratados 70 80 90 96 100.

a.- agua: b.- alcohol

Tiempos de permanencia en cada lquido: Alcohol 70 las piezas pueden permanecer varios das. Alcohol 96 2 baos en un lapso de 24 h. Alcohol 100 3 baos de una hora c/u. Como se deben introducir las piezas: Las piezas se han de envolver en gasa a manera de bolsitas, colocarlas en cartulina, etc. Pero siempre suspendidas. Para la deshidratacin debern emplearse frascos anchos y de cierre hermtico. Los recipientes deben ser agitados peridicamente para que la mezcla de alcohol y agua sea lo ms perfecta posible. En cada etapa la cantidad de deshidratante debe ser superior a 10 veces el volumen del tejido por deshidratar. Una mala deshidratacin es siempre perjudicial por lo que es necesario controlar el resultado de la misma. Los disolventes utilizados antes de la parafina son el xileno, benceno, tolueno, butilo, si la pieza ha sido mal deshidratada los lquidos se tornan opalinos.


4.- Preparacin para la Inclusin:El aclaramiento o desalcoholizacin permite que el alcohol de los tejidos sea reemplazado por un lquido (solvente) que disuelva la parafina con la cual el tejido va a ser impregnado. La parafina es un hidrocarburo slido, con escasa elasticidad que ha de penetrar a los tejidos, ocupando hasta sus ltimos intersticios. Para lo cual ha de licuarse mediante temperatura. Solventes: Benceno xileno tolueno cloroformo fenol en alcohol carbolxilol etc. La palabra aclarar proviene de que adems de eliminar el alcohol muchas de estas sustancias tienen la propiedad de trasparentar los tejidos. Xileno: Es un excelente agente aclarante pero tiende a hacer que los tejidos sean excesivamente duros y quebradizos y esto nunca deben dejarse en este lquido ms de 3 horas. El xileno es inadecuado para el encfalo y los ganglios linfticos, pues los hace demasiado quebradizos, para estos rganos es mejor utilizar cloroformo. Tolueno: Cloroformo: Tiene las mismas propiedades generales que el xileno pero resulta mejor porque endurece mucho menos los tejidos.

Resulta excelente para el tejido nervioso, ganglios linfticos y embriones pues produce poco encogimiento y no endurece mucho los tejidos. Cmo se realiza el aclaramiento? : Las piezas se trasladan a un frasco que contenga el volumen adecuado del solvente (30 veces). Si cuando las piezas son colocadas en el solvente se observa que estn formando nubosidades opalinas y que estas no desaparecen de inmediato, quiere decir que la deshidratacin no ha sido completa. Debe volverse al alcohol absoluto. Cundo esta terminado este paso? La finalizacin de este paso es tarea de la vista, si las piezas se han vuelto difanas, trasparentes, lo est. Las piezas pueden ser trasladadas a la parafina.

5.- Inclusin:La parafina es un hidrocarburo no cclico. A la temperatura ambiente es slido. La temperatura suave la disuelve por completo. Una temperatura mayor de 65 llega a disolverla, producindose vapores de olor desagradable, inflamables y tambin txicos. Hay parafinas que funden a distintas temperaturas, para la mayora de los trabajos pueden utilizarse las que lo hacen a 56-58. En la estufa debe haber cuatro vasijas con parafina ya disuelta. En cada vasija ha de haber un volumen suficiente como para cubrir por completo las piezas que se han de colocar. Es conveniente que cada vasija posea su nmero de orden 1, 2, 3 y 4. El recipiente nmero 1 debe tener parafina ya fundida a la que se mezclar una pequea

14 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL cantidad de solvente, el 2 y 3 deben contener parafina pura, que poco a poco ira adquiriendo algo de solvente cuando las piezas vayan pasando por ellas. El 4 debe tener parafina completamente pura. Tiempo de cada bao: Depende un poco del tamao de cada pieza. En cada recipiente pueden estar de 2 a 3 h. Lo que se ha hecho hasta ahora mediante los baos de parafina se conoce con el nombre de impregnacin. La inclusin consiste en encerrar cada pieza dentro de un bloque de parafina pura. Pasos de la inclusin: Se ha de preparar tantos moldes cuantas piezas han de incluirse. Se extrae una pieza, se la libera de la envoltura de gasa, se la ubica en el fondo del molde, orientndola para saber luego por donde ha de ser cortada. Sobre la pieza puesta en el molde se vierte parafina fundida, pura de la cuarta vasija. Se deja el molde sobre una superficie plana y fra, se espera que la falta de calor solidifique toda la parafina, formndose as un bloque. Mientras se trabaja en una pieza las dems deben estar en la estufa. Los moldes: Los hay de varias clases: barras de Leukart, cajas de papel, hormas de metal. Barras de Leukart: Consisten en un par de barras de metal, dobladas en ngulo recto a manera de escuadras. A su vez cada rama de la escuadra tiene un ngulo recto en el extremo. Esta disposicin permite que una barra se aplique contra la otra, como permite deslizamiento es posible agrandar o achicar el molde conforme las necesidades. Las cajas de papel : Se construyen con una tira de cartulina delgada o con papel resistente. Son muy econmicas con respecto a las barras dado que aquellas son sumamente caras. Hormas de metal: Se pueden hacer de dos maneras circulares o cuadradas . Las circulares se hacen cortando transversalmente rodajas de caos de metal o de plstico, las cuadradas se hacen cortando lminas de aluminio o de hojalata que se doblan sobre un molde de madera, los extremos libres pueden soldarse. Ambos tipos de hormas carecen de piso, por lo que es necesario colocarlas al hacer la inclusin sobre una superficie lisa (ej. un azulejo).

6.- Modelado del bloque catalogacin:La forma de los bloques deben ser preferentemente de pirmide truncada. Las caras opuestas han de resultar paralelas entre s, lo mismo que las aristas.

15 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL Catalogacin: Cada pieza lleva un hilo con una tarjeta donde se indica de qu rgano o porcin del mismo se trata. Esta medida es la base para catalogar los bloques. La catalogacin puede hacerse de diferentes maneras de acuerdo a las necesidades particulares. Siempre se tendr en cuenta que en la misma conste, animal, fijador, fecha, cdigo, bloques, etc.

7.- Seccin con el micrtomo extendido de los cortes pegado:Como la finalidad de todos estos pasos es poder observar los tejidos con el microscopio, es necesario reducir las piezas histolgicas a delgadas secciones. Las secciones finas y parejas se obtienen con el micrtomo. Este aparato consiste bsicamente en una base pesada que soporta una superficie por la que se desliza una cuchilla, un tornillo que acerque el material y lo ponga al alcance del filo de la navaja, de modo que siempre su avance ofrezca la misma medida del material. Como el tipo de micrtomo ms utilizado es el de deslizamiento, las indicaciones se harn siempre con referencia a este tipo. El bloque se debe pegar en un taco de madera, de la siguiente forma: se calienta una esptula en la llama de un mechero, la que se aplica a la cara inferior del bloque, que se sostiene algo inclinado sobre el taco de madera, a fin de que algunas gotas de parafina fundida caigan sobre su cara superior, una segunda aplicacin de la esptula calentada contra la parafina, disolvern otra porcin de parafina, que no ser necesario dejar caer sobre el taco, y el bloque se aplica y presiona entonces contra el taco y luego se deja enfriar. El micrtomo lleva una pieza que posee una morsa, entre sus ramas se coloca el taco de madera y luego se aprietan con el tornillo de presin hasta que este muy firme. Es conveniente que la navaja del micrtomo ya este colocada en el cepo de la pieza portacuchilla. Una vez colocado el bloque se hace deslizar la cuchilla hasta que su filo est ubicado sobre el bloque. La pieza portabloque posee una cremallera que permite bajar o subir el bloque, que deber hacerse contactar con el filo de la navaja. La cara inferior de la cuchilla no debe ser paralela a la cara del corte. Cmo se regula el espesor de los cortes? Se hace mediante un tornillo micromtrico, sus pasos de rosca son muy estrechos. Al avanzar, empuja el bloque porta material por una rampa oblicua al plano de deslizamiento de la cuchilla. Para hacerlo avanzar hay una palanca lateral, una especie de brazo y un tope. Elegido el espesor que se desea dar a los cortes, se desliza la cuchilla. Se hace el primer corte. Este si ha salido entero, se recoge con un pincel hmedo y se deposita en la superficie del agua contenida en una bandeja o cubeta. Es mejor que sea agua fra. Los cortes que naturalmente salen ondulados se extienden y alisan por completo mediante el agregado a la bandeja de agua tibia.

16 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL Pegado de los cortes: Para la mayor parte de los preparados de histologa normal, la tcnica exige que los cortes estn fijos. El portaobjeto debe estar limpio, para recoger cortes se toma un portaobjeto seco, se deposita en su centro una gota pequea de albmina de Mayer, se extiende esta gota con el borde externo del dedo meique. La gota debe quedar extendida por completo, formando una pelcula sumamente delgada, casi invisible. Ahora se lleva el porta al agua de modo que su cara untada est arriba. Se coloca esta cara por debajo de un corte sin defectos. El corte puede ser sujetado por un pincel. Se levanta el porta y se extrae del agua junto con el corte en el centro del porta. Todava el corte est libre, para que se adhiera hay que hacer evaporar el agua y coagular la pelcula de albmina de Mayer mediante calor, esto se consigue llevando el porta a una estufa a 37 0 40 , durante unos 30 min. como mnimo.

8.- Coloraciones de rutina y especiales:Las manipulaciones siguientes son inmediatamente previas al proceso de coloracin. Para que el corte pueda ser coloreado debe estar completamente libre de parafina y suficientemente hidratado. Los colorantes son cuerpos qumicos disueltos en agua destilada o a veces el alcohol. La parafina no se mezcla con ellos, como aquella ha penetrado en el interior de las clulas estas no podrn ser teidas. Desparafinacin de los cortes: Para realizar la desparafinacin de los cortes los mismos son introducidos en un frasco de boca ancha que contenga xileno. Lo ideal es hacer dos baos de aproximadamente 10 min. c/u, de esta forma se asegura una perfecta desparafinacin de los cortes. El xileno puede utilizarse varias veces. En los pasos siguiente el xileno debe ser eliminado porque sino la hidratacin del corte ser imposible. Se elimina mediante el alcohol etlico. Se realizan sucesivos lavados en alcohol 100.96 y 70. Una vez realizados los baos con alcohol se puede proceder a la hidratacin de los cortes. La hidratacin es una operacin necesaria. Debe eliminarse el resto de alcohol que hay en el corte. Se realiza sumergiendo los mismos en un frasco que contenga agua destilada, durante dos o tres min. De esta forma el corte estar listo para comenzar algn proceso de coloracin. Teora de la coloracin: Se sabe que las imgenes producidas por absorcin, en preparaciones coloreadas, son mucho ms fciles de interpretar que las imgenes de difracciones dada por preparaciones no coloreadas, adems los diversos elementos de los tejidos poseen poco ms o menos el mismo ndice de refraccin lo que hace que el reconocimiento sea una tarea difcil.

17 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL Estos dos argumentos hacen comprender la necesidad de las coloraciones para el estudio morfolgico de clulas y tejidos. Un colorante es un cuerpo coloreado que puede comunicar su color a otro cuerpo. La mayor parte de los colorantes artificiales (y an los naturales como la hematoxilina), derivan de cuerpos incoloros, por ej. de carburos aromticos. La coloracin es la propiedad que tienen ciertos cuerpos de ejercer una absorcin selectiva sobre la luz. Dicho de otra manera un cuerpo se ve de tal color porque trasmite por trasparencia o por difusin las radiaciones complementarias de las que l absorbe. Tipos de coloraciones: Directas: se producen por inmersin en el bao colorante. Indirectas: en este tipo de coloracin, el colorante no puede actuar directamente, el objeto que ha de colorearse debe ser tratado de antemano por otra sustancia que lo prepare para admitir el colorante, esta se llama mordiente. Clasificacin de los colorantes: Puede hacerse desde el punto de vista qumico (por su naturaleza) o desde el punto de vista histolgico (por su uso). Desde el punto de vista qumico los colorantes se agrupan conforme a su constitucin. Desde el punto de vista histolgico se los clasifica en naturales y artificiales. Colorantes naturales: En todos ellos hay un principio colorante producido por la naturaleza que luego la tcnica del hombre ha sabido extraer, componer y hacerlo efectivo. Hematoxilina: La hematoxilina es una sustancia capaz de colorear, extrada de la madera de un rbol conocido como rbol de Campeche, originario de Centroamrica. La hematoxilina se expende en polvo, el cual es cristalino, casi incoloro o algo amarillento a veces ms oscuro. La hematoxilina, como tal, aunque est disuelta en agua o en alcohol de 96 o de 100, es incapaz de colorear, para poder hacerlo, debe sufrir una oxidacin. La hematoxilina oxidada es hematena y bajo este cambio fsico -qumico y la unin con una base es capaz de colorear. La base es conocida como mordiente, hay muchas bases que actan como tal, la ms conocida es el alumbre que puede ser de potasio, hierro o cromo. El mordiente es un intermediario entre el colorante y el tejido y en general entre dos cuerpos que qumicamente carecen de afinidad. De alguna manera activa las molculas del tejido y forma con ellas una unin firme y estable. Con el colorante forma un precipitado que presenta una fuerte coloracin y es, adems insoluble en agua y otros lquidos. Este tipo de precipitado coloreado se llama laca. Los mordientes deben ser cidos nunca bsicos. Orcena: Es un principio colorante extrado de ciertos lquenes. Es un cido dbil. Utilizando una mezcla en que el cido actico acta como mordiente se utiliza para colorear cromosomas. Tambin colorea las fibras elsticas.

18 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL Colorantes artificiales: Algunos son colorantes del ncleo y otros del citoplasma. Son sales producidas de la unin de una base y un cido. Colorantes para el ncleo: su base es la que se combina con los cidos nucleicos, por lo tanto sta es la coloreada. El cido es el incoloro. Colorantes para el citoplasma: el cido del colorante es el que se combina con el citoplasma. La base es la incolora. Colorantes artificiales ms comunes: vesubina, tionina, azul de toluidina, azul de metileno, fucsina bsica, violeta de metilo, verde de metilo, anaranjado de acridina. Se ha dividido a los colorantes segn su afinidad que presentan con el ncleo o con el citoplasma: Colorantes nucleares o bsicos su componente colorante activo es una base coloreada. Colorantes citoplasmticos o cidos: su componente activo es un cido coloreado. Colorantes neutros. La mayor parte de los colorantes que se utilizan son sales. Los colorantes bsicos son sales cuya base es coloreada y su cido es incoloro, Ej. azul de metilenoclorhidrato de tetrametiltionina o sea es una sal formada por la combinacin de la tetrametiltionina (base coloreada) de azul de metileno con el cido clorhdrico. Reaccionan con los grupos fosfato de los cidos nucleicos (DNA-RNA), los grupos sulfato de los glucosaminoglucanos y los grupos carboxilo de las protenas. Los colorantes cidos llevan una base que es incolora combinada con un cido coloreado, Ej. eosinaeosinato de potasio (base incolora) combinada con el cido eosnico (tetrabromofluorescena) que es coloreado. Los colorantes neutros tanto el cido como la base son coloreados Ej. eosinato de azul de metileno. Los componentes que se tien con colorantes cidos se dicen que son acidfilos (filamentos citoplasmticos, la mayor parte del citoplasma no especializado, y las fibras extracelulares). Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante bsico se dice que es basfilo (heterocromatina, nucleolos, ergastoplasma, matriz del cartlago). Proceso de coloracin: Tomaremos como base para la descripcin de este proceso a la coloracin de hematoxilina y eosina considerada como la coloracin de rutina.

Coloracin de hematoxilina y eosina: Desparafinar los cortes: realizar dos baos de xileno de 10 a 15 min. c/u. Eliminamos el solvente por sucesivos baos en: alcohol de 100, 96, 70 de 1 a 2 min. c/u. Hidratacin de los cortes: en agua destilada durante 1 a 2 min.

19 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL Tincin nuclear: en hematoxilina durante 2 a 12 min. de acuerdo a la formula utilizada. Viraje de la hematoxilina: en agua corriente hasta desprendimiento total del color (3 a 5 min.). Lavado en agua destilada o corriente. Coloracin citoplasmtica: eosina al 0.5% o en una mezcla de eosina/floxina al 0.5% durante 15 a 30 seg. Lavado en agua destilada. Deshidratar, aclarar y montar. Los pasos de la deshidratacin pueden ser suplidos dejando secar el corte en estufa a 37 por 15 a 20 min. Coloraciones especiales: Las coloraciones especiales comprenden un conjunto de tinciones o impregnaciones utilizadas para poner de manifiesto o resaltar determinadas estructuras de los tejidos. Para tejido conectivo: Fibras colgenas: Tricrmico de Van Gieson: las fibras colgenas se observan de color rojo. Tricrmico de Gomori: se observan de color rojo. Tricrmico de Masson: las fibras colgenas se observan de azul. Fibras Elsticas: Mtodo de Gomori: las fibras elsticas se tien de prpura oscuro. Orcena: se tien de prpura. Mtodo de Gomori para la impregnacin argntica de la reticulina: las fibras reticulares se observan negras.

Fibras reticulares:

Tejido adiposo:

Sudan black: el tejido adiposo se observa de color negro. Sudan IV-rojo Escarlata: - grasas neutras: se observan de color rojo vino. - lipoides: rojo anaranjado - fosfolpidos: se tien poco o nada. Carbohidratos y mucopolisacridos: cido Perydico de Schiff (PAS): los mucopolisacridos bsicos o neutros se observan de color rojo. Azul alcian: los mucopolisacridos cidos se observan de color azul. Coloracin para el estudio neurohistoqumico: Coloracin de la sustancia de Nissl- mtodo de la tionina fenicada: los grumos de Nissl y ncleos aparecen teidos de color azul profundo. Luxol fast blue-PAS-hematoxilina: la mielina se observa azul brillante. Modificacin de la tcnica de Glees-mtodo de Marsland, de impregnacin argntica a cortes de parafina: clulas nerviosas, neurofibrillas y clulas de la glia en diversas tonalidades de negro, fondo de color habano.


Tcnicas analticas especiales

1. Fraccionamiento tisular. El microscopio electrnico revel que las clulas contienen una pltora de organelos limitados por membranas, teniendo cada uno de ellos propiedades morfolgicas y, presumiblemente metablicas, distintivas. a. El principal mtodo por el cual la funcin de cada organelo fue dilucidada fue el fraccionamiento tisular. b. Con este procedimiento, el tejido es cortado en pequeos fragmentos los cuales son luego triturados en un mortero de madera que rompa a las clulas pero no a los organelos. c. El homogeneizado tisular es luego centrifugado progresivamente a una serie de altas velocidades a fin de separar a los diferentes organelos de acuerdo a su densidad. d. Con adaptaciones de este proceso, se analizaron las propiedades fundamentales de las mitocondrias lisosomas, perixosomas, y retculo endoplsmico. 2. Histoqumica. a. Su objetivo es mostrar la composicin qumica y bioqumica de los tejidos y clulas ms all de la distribucin cido bsica mostrada mediante los mtodos de tincin estndar, sin alterar la distribucin normal de las sustancias qumicas. Para lograr este objetivo se deben satisfacer los siguientes criterios: conservar la distribucin y composicin qumica normal, el mtodo debe ser muy especfico para la sustancia o grupo qumico que se desee analizar. El producto de la reaccin debe ser insoluble y ser visible de manera que pueda ser observado con el microscopio ptico o electrnico. Entre las sustancias biolgicas importantes a detectar por esta tcnica podemos citar. b. Las enzimas que conservan sus funciones despus que han sido inmovilizadas por el fijador, las mismas pueden ser localizadas hacindolas reaccionar en un sustrato soluble. Su producto de la reaccin es luego precipitado, por otro agente reactivo en un medio de incubacin, como una sustancia coloreada o electrn densa, identificando el sitio donde se localiza la enzima. Por ejemplo, la fosfatasa cida, una enzima lisosomal, desdobla sus grupos fosfato a partir del glicerol fosfato en un pH cido. Los iones de plomo, en un medio de incubacin, precipitan el fosfato liberado en la forma de fosfato de plomo, los cuales constituyen un precipitado electrn denso en el sitio de la enzima.


3. Marcaje de anticuerpos. a. Los anticuerpos no son visibles con la microscopa estndar, y se deben marcar de manera que no interfieran con su especificidad de unin. Los marcadores comunes incluyen fluorocromos (por ejemplo fluorescena, rodamina); enzimas demostrables mediante las tcnicas histoqumicas enzimticas (por ejemplo peroxidasa, fosfatasa alcalina) y compuestos diseminadores de electrones para uso en la microscopa electrnica (por ejemplo ferritina, oro coloidal). b. Los anticuerpos son molculas proteicas, sintetizadas por las clulas plasmticas, las cuales se unen en sitios antignicos con otras molculas. Los sitios antignicos son, usualmente grupos de alrededor de cinco aminocidos o azcares residuales en una macromolcula. Los anticuerpos son altamente especficos para cada antgeno. c. Un anticuerpo, especfico para una protena particular, puede ser marcado acoplndolo a un compuesto que pueda ser visualizado al microscopio ptico o electrnico, por ejemplo un colorante fluorescente o una partcula electrn densa. d. El marcaje de anticuerpos puede, entonces, ser usada como una coloracin altamente especfica para la localizacin de antgenos proteicos en el tejido. Hibridacin in Situ Es un nuevo mtodo que permite analizar la presencia y distribucin de una secuencia particular de nuclotidos en el DNA (por ejemplo genes especficos) y en el RNA (por ejemplo RNA especfico). La hibridacin se refiere a la unin de secuencias complementarias de nucletidos entre s con alta especificidad. La tecnologa de recombinacin del DNA permite copias de secuencias seleccionadas de nucletidos de una sola tira para ser sintetizadas en gran cantidad. Las secuencias complementarias sintticas a la secuencia de RNA o DNA que un investigador desee localizar se denominan exploradores y se pueden marcar con radioistopos durante la sntesis o despus de la sntesis con biotina. Los exploradores con marcadores radioactivos se muestran con enzimas (por ejemplo peroxidasa) o fluorocromos unidos en forma covalente con avidina, una molcula con gran afinidad a la biotina. El trmino in situ se refiere a la aplicacin de esta tcnica a cortes de tejidos cuando estas muestras se incuban con exploradores marcados, los exploradores se unen a las secuencias complementarias, revelando as su presencia.

22 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL 4. Anlisis tridimensional de las muestras a. El microscopio electrnico de barrido es usado en la observacin de superficie tisulares expuestas y nos permite observar la tridimensionalidad de los tejidos. La muestra de tejido es primero fijada y secada. Su superficie es cubierta por una delgada capa de oro. b. El tejido es colocado en el EMB donde su superficie es barrida por un pequeo haz de electrones. El haz no penetra la cubierta superficial de oro. Cuando los electrones incidentes chocan con la cubierta de oro, hace que se emitan electrones secundarios. El nmero de electrones secundarios emitidos depende de la orientacin de la cubierta superficial de oro y del haz de electrones. c. Los electrones secundarios son recogidos y enviados a un monitor de TV donde es creada la imagen de la superficie del tejido. 5. Fractura por congelacin. a. Las membranas celulares son bicapas lipdicas en las cuales las protenas integrales estn incluidas. Las protenas de membrana ms grandes pueden ser visualizadas al microscopio electrnico mediante la tcnica de fractura por congelacin. b. En esta tcnica utilizada a nivel de microscopa electrnica, los tejidos son expuestos a una fijacin fsica mediante la congelacin del tejido a temperaturas bajas seguido a una fractura del material criofijado. c. El tejido, fijado o no, despus de haber sido protegido por glicerol que permite reducir la formacin de cristales de hielo, es rpidamente congelado en un lquido crigeno (nitrgeno lquido, helio lquido). d. El tejido congelado, se corta con una cuchilla de metal (criofractura). El plano de fractura escinde la bicapa fosfolipdica removiendo las dos mitades y exponiendo las protenas intermembrana. e. La muestra se conserva al vaco en tanto que los cristales de hielo se subliman disminuyendo as el nivel de hielo en su superficie. A los planos de fractura expuestos se les evaporan una pelcula de platino. La pelcula de metal es evaporada en forma angular a fin de dar la impresin de profundidad con la formacin de sombras. La rplica es fortalecida por la evaporacin de una capa fina de carbono. f. La rplica es examinada al microscopio electrnico una vez que el tejido ha sido eliminado con un cido fuerte. La misma provee una imagen tridimensional de la superficie de la membrana expuesta, mostrando las partculas intramembranosas en su superficie.

23 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL 6. Tincin negativa. a. Esta tcnica es usada para estudiar la estructura de protenas y pequeas partculas como los virus. b. Las partculas a ser estudiadas son colocadas en una gota de solucin de metales pesados (ej. Acetato de uranilo o cido fosfotngstico) sobre un pelcula transparente. La gota es dejada secar sobre la pelcula. El metal pesado es incapaz de penetrar las partculas. c. La pelcula es examinada al microscopio electrnico. La capa de metal pesado aparece negra debido a que los electrones no pueden pasar a travs de ella. En contraste, las partculas tisulares aparecen brillantes debido a que son atravesadas fcilmente por los electrones. Los detalles de sus estructuras son fcilmente visibles por contrastar con la cubierta de metal pesado. 7. Autoradiografa. Esta tcnica usada en la identificacin de vas de biosntesis o transporte en las clulas. Las clulas son expuestas a una sustancia radiactiva la cual ingieren o incorporan como constituyente o producto. La sustancia radiactiva experimenta declinacin y emite radiaciones. La sustancia radiactiva puede ser localizada en el tejido cubriendo el corte con una delgada emulsin fotogrfica. La localizacin de los granos fotogrficos que han sido expuestos a los electrones emitidos, son observables luego del revelado. Los granos se superponen al sitio donde se encuentra la sustancia radiactiva. A fin de trazar la va de la sustancia radiactiva a travs de diferentes compartimientos celulares, la exposicin inicial a la sustancia radiactiva en breve y seguida por el lavado del exceso de sustancias no radiactivas. Las muestras tisulares son luego fijadas despus de una serie de intervalos de tiempo para delinear la va. Alzola, Ricardo Gua de Estudio de Tcnicas Histolgicas. Fac. Ciencias Veterinarias, Dpto. Ciencias Biolgicas, UNCPBA, 2001. Celani M. S., Fernndez Surribas J., von Lawzewitsch I. Lecciones de Histologa Veterinaria. Volumen I Microscopia y Tcnicas Histolgicas. I. Ed. Hemisferio sur S. A. 3ra. Ed. 1984. Jaulmes Ch., Jude A., Querangal J., Delga J. Prctica de Laboratorio. Toray/Masson. 1970. Luna L. G. Edited. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Mc Graw Hill Book company. 3 ed. 1992. Lynch M., Raphael S., Mellor L., Spare P., Inwood M. Mtodos de laboratorio. 2da. Ed. Interamericana. Mxico. 1972. Martoja R., Tcnica de Histologa Animal. Toray-Masson S. A. Barcelona 1 Ed. 1970.

BIBLIOGRAFA

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CAPITULO 2

ESTRUCTURA Y FUNCION CELULARObjetivos de Aprendizaje: Objetivo General: Al finalizar el presente captulo el alumno estar en capacidad de describir la estructura general de la clula y de comprender la estructura y funcin de sus elementos constituyentes. Objetivos Especficos: Identificar las caractersticas de las clulas procariticas y eucariticas. Comprender la importancia existente entre morfologa y funcin celular. Conocer algunos modelos bsicos de clulas. Describir la estructura general de una clula eucaritica, enumerando sus elementos constituyentes y categorizndolos de acuerdo a su estructura y funcin. Definir la membrana plasmtica, su estructura, constitucin qumica, funciones y modelos funcionales descriptivos ms aceptados. Describir la estructura y funcin del retculo endoplasmtico, diferenciando sus elementos morfofuncionales liso y rugoso e identificando las caractersticas y actividades particulares de cada uno. Describir la estructura y funcin del aparato de Golgi. Describir la estructura, clasificacin y funcin de los lisosomas. Describir la estructura y funcin de las mitocondrias. Describir la estructura y funcin del ncleo y sus elementos constitutivos, a saber: envoltura nuclear, cromatina y nuclolo. Describir al citoesqueleto y a sus componentes: microtbulos, filamentos intermedios y microfilamentos. Describir la composicin qumica y las propiedades particulares que caracterizan a la fase soluble del citoplasma celular.

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Definicin

Es la unidad anatmica, funcional y gentica de los seres vivos, capaz de establecer y mantener sus propios mecanismos de regulacin interna, preservacin transgeneracional e interaccin con su entorno.


Modelos fundamentales de clulas de acuerdo a su organizacin celular: Existen bsicamente dos tipos:1. Clulas procariticas.

Constituidas por organismos de pequeo tamao, generalmente unicelulares; que carecen de estructura citoplasmtica en compartimientos rodeados de membrana u organelos; presentan un ADN circular que forma un cromosoma nico en dplex, el cul no est relacionado a protenas histnicas. Ej. : Las bacterias.2. Clulas eucariticas.

Constituidas por organismos unicelulares o multicelulares, que presentan un ncleo definido rodeado de una envoltura nuclear; un complejo sistema de compartimientos rodeados de membrana u organelos y un ADN ligado a histonas de ubicacin intranuclear conformado por ms de un cromosoma ligado a protenas de tipo histnico o protamnico. Dado que este texto est relacionado directamente con el estudio de la histologa de los tejidos del hombre, daremos una descripcin de las clulas eucariticas que nos servir como patrn para la comprensin de los modelos superiores de organizacin que las relacionan entre s: Organizacin de la clula eucaritica. Las clulas eucariticas estn formadas por tres tipos de estructuras: 1. La membrana plasmtica o celular. 2. El ncleo. 3. El citoplasma. 4. Los organelos citoplasmticos. 5. Las inclusiones citoplasmticas. 1. La membrana plasmtica. Son una parte importante de la maquinaria celular. Las clulas, como as tambin sus organelas, se encuentran limitadas por una o mas membranas, cuyos componentes especficos permiten realizar la funcin pertinente. La membrana plasmtica regula la composicin del citoplasma y lo que entra y sale de la clula; las restantes membranas tambin constituyen barreras selectivas para el pasaje de sustancias. Los componentes de las membrana pueden Tener funciones de proteccin Ayudar a la compartimentalizacin subcelular

27 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL Regular el transporte desde y hacia la clula y de los dominios subcelulares Servir de receptores que reconocen seales de determinadas molculas y transducir la seal al citoplasma. Permitir el reconocimiento celular. Proveer sitios de anclaje para los filamentos del citoesqueleto o los componentes de la matriz extracelular lo que permite, entre otras, el mantenimiento de la forma celular Servir de sitio estable para la catlisis enzimtica. Proveer de "puertas" que permitan el pasaje travs de las membranas de diferentes clulas (gap junctions) Regular la fusin de la membrana con otra membrana por medio de uniones (junctions) especializadas Permitir direccionar la motilidad celular La membrana celular funciona como una barrera semipermeable, permitiendo el paso de pocas molculas y manteniendo la mayor parte de los productos producidos dentro de ella. El actual modelo de la estructura de la membrana plasmtica es el resultado de un largo camino que comienza con las observaciones indirectas que determinaron que los compuestos liposolubles pasaban fcilmente esta barrera lo que llev a Overton, ya en 1902, a sostener que su composicin corresponda al de una delgada capa lipdica; posteriormente se agreg a esta propuesta la que sostena que en la composicin tambin intervenan protenas.

Hacia 1935 Danielli y Davson sintetizaron los conocimientos proponiendo que la membrana plasmtica estaba formaba por una "bicapa lipdica" con protenas adheridas a ambas caras de la misma.


Membranas celulares de neuronas opuestas. Dennis Kunkel (M.E., 436.740x http://www.pbrc.hawaii.edu/~kunkel/gallery/fungism1/92386a.html), usada con permiso. La integracin de los datos qumicos, fsico-qumicos y las diversas tcnicas de microscopa llev al actual modelo de " " (Singer S.J., and Nicolson, G.L. (1972) Science, 175:120). La membrana es una estructura cuasi-fluida, en ella sus componentes pueden realizar movimientos de traslacin dentro de la misma. Esta fluidez implica que los componentes en su mayora solo estn unidos por uniones no covalentes. La microscopa electrnica mostr a la membrana plasmtica como una estructura de tres capas, dos de ellas externas y densas, y una clara en el medio. La molcula primaria de la membrana celular es el fosfolpido, posee una "cabeza" polar (hidroflica) y dos "colas" no polares (hidrofbicas), son por tanto simultneamente hidroflicos e hidrofbicos (Anfipticos).

Los fosfolpidos en la membrana se disponen en una bicapa con sus colas hidrofbicas dirigidas hacia el interior, quedando de esta manera entre las cabezas hidroflicas que delimitan la superficie externa e interna de la membrana. El espesor de la membrana es de alrededor de 7 nanmetros.


Esquemas de una molcula de fosfolpido Esquema del modelo fluido de membrana

7. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Bicapa de fosfolpidos) Lado externo membrana Lado interno membrana de de la la 8. 9.

Molculas de fosfolpidos organizadas en bicapa Molculas de colesterol Cadenas de carbohidratos

10. Glicolpidos 11. Regin polar (hidroflica) de la molcula de fosfolpido 12. Regin hidrofbica de la molcula de fosfolpido

Protena intrnseca de la membrana Protena canal inico de la membrana Glicoprotena

www.puc.cl/sw_educ/neurociencias/ html/047.html

30 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL El colesterol es otro componente importante de la membrana. Se encuentra embebido en el rea hidrofbica de la misma, su presencia contribuye a la estabilidad de la membrana al interaccionar con las "colas" de la bicapa lipdica y contribuye a su fluidez evitando que las "colas" se "empaqueten" y vuelvan mas rgida la membrana (este efecto se observa sobre todo a baja temperatura). Las membranas de las clulas vegetales no contienen colesterol, tampoco las de la mayora de las clulas bacterianas. Las arqueobacterias poseen lpidos de membrana diferentes tanto de las bacterias como de los eucariotas (incluyendo enlaces ter en lugar de enlaces ester en sus fosfolpidos). Algunas de ellas poseen esteroles en su membrana celular (una caracterstica de eucariotas). Las protenas pueden estar suspendidas en la membrana, con sus regiones hidrofbicas insertadas en ella y con las hidroflicas que sobresalen ("stick out") hacia el exterior e interior de la clula. Diversas experiencias sugieren que estas protenas no estn fijas en un lugar de la membrana, sino que estn relativamente libres para desplazarse lateralmente, por lo cual se origin el concepto de mosaico fluido. Protenas de la membrana Las protenas de la membrana pueden considerarse, de acuerdo a como se encuentran en la membrana, comprendidas en una de estas dos categoras: integrales: estas protenas tienen uno o mas segmentos que atraviesan la bicapa lipdica

perifricas: estas protenas no tienen segmentos incluidos en la bicapa, interaccionan con las cabezas polares o bien con las protenas integrales La superficie externa de la membrana tiende a ser rica en glicolpidos que tienen su colas hidrofbicas embebidas en la regin hidrofbica de la membrana y sus cabezas hacia el exterior de la clula. Ellos, junto a con los hidratos de carbono pegados a las protenas (glicoprotenas), intervienen en el reconocimiento de lo propio ("self") de un organismo. Los antgenos de diferenciacin, mas conocidos como antgenos CD (por

31 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL Cluster of Differentiation, grupo de diferenciacin) no son otra cosa que glicoprotenas que se expresan sobre la superficie de las membranas

Esquema de un proteoglucano, estas glicoprotenas poseen una proporcin de polisacridos mayor que lo usual.

Esquema de las Protenas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH). Estas molculas resultan claves para distinguir entre lo propio y lo ajeno por el sistema inmunitario.


Esquema de una protena de transmembrana que acta como receptor de quimiocinas La Matriz Extracelular Las interacciones celulares resultan fundamentales para su integracin en tejidos y su relacin con clulas similares o diferentes. Las clulas animales secretan alrededor de ellas un complejo retculo conformado por protenas e hidratos de carbono que les crean un ambiente especial: la matriz extracelular. Entre sus principales componentes se cuentan: el colgeno, fibras proteicas que confieren resistencia y fortaleza a la matriz los proteoglucanos, glicoprotenas que poseen una proporcin de polisacridos mayor que lo usual. y confieren el alto grado de viscosidad caracterstico de la matriz las fibronectinas, protenas multiadhesivas, tienen afinidad tanto para el colgeno como para las integrinas de las clulas. Su funcin principal es la fijacin de clulas a matrices que contienen colgeno. La matriz extracelular de las clulas animales puede equipararse a la pared celular de las clulas vegetales, cuya composicin qumica es muy diferente y se describe mas adelante. Adhesin intercelular Un grupo de protenas denominadas Molculas de Adhesin Celular (MAC o CAM por sus siglas en ingls) es el responsable de las interacciones entre clulas. Estas protenas corresponden a protenas integrales de membrana , entre las mas importantes tenemos: Cadherinas: son responsables de las interacciones entre clulas similares (interacciones homotpicas) y requieren de Ca ++ para dicha interaccin, y entre otras caractersticas , se encuentra las de relacionarse (por su porcin citoslica) al citoesqueleto Un ejemplos de uniones que contiene cadherina lo constituyen los desmosomas y las uniones

33 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL adhesivas celulares y que confieren rigidez y fortaleza al conjunto de clulas que se unen para formar tejidos. Selectinas: son responsables de las interacciones entre clulas diferentes (interacciones hetertpicas), se fijan a los hidratos de carbono de otras molculas de adhesin celular. Esta fijacin es Ca++ dependiente y se realiza por medio de una lectina que se encuentra en el extremo de la molcula. Uniones especializadas entre las clulas

Esquema de un desmosoma

Esquema simplificado de uniones que se establecen entre clulas Desmosomas que, como se observa en la figura superior, constan de una placa adosada a la cara citoslica de las respectivas membranas citoplasmticas de las clulas que unen y, siendo las cadherinas los elementos que unen a las mismas. La placa (formada por protenas denominadas placoglobinas)

34 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL se unen a filamentos intermedios del citoesqueleto (queratina). Las cadherinas (en este caso protenas de trasmembrana denominadas desmoglena y desmocolina) se fijan a la placa y se proyectan al espacio intercelular entrelazndose a las de la otra clula. Uniones adherentes: se las encuentra generalmente en el tejido epitelial conformando una banda continua de molculas de cadherina que en su porcin citoslica se unen a un "cinturn" de protenas adaptadoras que discurre en la cara citoslica de la membrana celular y relaciona a las cadherinas con el citoesqueleto (principalmente actina). Unin estrecha u oclusiva: se las encuentra separando los lquidos extracelulares que baan las regiones apicales y basales de las clulas (con el objeto de que cumplan sus respectivas funciones) y forman barreras que tornan impermeables determinadas cavidades (como la luz del intestino). En este tipo de relacin entre clulas, hileras de protenas integrales de membrana (como la ocludina y la claudina) forman, con la porcin que se proyecta al espacio intercelular, uniones extremadamente fuertes con las similares de la clula adyacente y prcticamente fusionan ambas clulas estableciendo una unin impermeable. La porcin citoslica de estas clulas se relaciona al citoesqueleto. Comunicacin intercelular

Uniones comunicantes ( gap junctions) Un tipo particular de unin entre clulas animales lo constituye la unin comunicante (gap junction), en este caso las membranas de ambas poseen protenas que conforman semicanales de transmembrana, que las interconectan y permiten el paso de molculas entre ambas.


En las clulas vegetales las uniones intercelulares se extienden a travs de las paredes celulares de clulas adyacentes y se denominan plasmodesmos. Al igual que las uniones comunicantes, conectan a ambas clulas permitiendo el paso de molculas, pero en este caso la membrana celular conforma una lmina continua que "tapiza" el plasmodesmo y, por otra parte una extensin del retculo plasmtico (el desmotbulo) lo atraviesa y se conecta al citosol de la clula adyacente. Adhesin entre las clulas y la matriz En los grupos organizado de clulas la matriz, entre otras funciones, cumple la de organizar las clulas en tejidos amn de coordinarlas proporcionando el medio para que se propaguen seales que pueden indicar a las clulas que crezcan y proliferen.

Esquema simplificado de la matriz celular, que muestra una de las relaciones entre componentes de la matriz y componentes del

36 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL citoesqueleto. La adhesin entre las clulas y la matriz esta mediada esencialmente por las integrinas: son las principales clases de Molculas de Adhesin Celular que interaccionan entre la clula y la matriz (aunque las selectinas y proteoglucanos tambin intervienen en la fijacin). Las integrinas estn compuestas por dos subunidades diferentes (heterodmeros) que toman el nombre de alfa (con 17 tipos diferentes) y beta (con ocho tipos diferentes), lo cual permite un gran nmero de combinaciones. Las clulas generalmente presentan en su superficie varios tipos de integrinas. La porcin extracelular de la integrina se fija a las protenas de la matriz y la citoslica se relaciona con protenas adaptadoras que a su vez interactan con el citoesqueleto. Algunas integrinas pueden adems de mediar entre la clula y la matriz, intervenir en interacciones intercelulares. La pared celular La pared celular se encuentra localizada por fuera de la membrana celular dando proteccin y soporte mecnico a las clulas que la poseen. Presenta diferentes caractersticas ya sea que se trate de la pared de las plantas (eucariotas) o de la de bacterias (procariotas). En los respectivos captulos (La pared bacteriana, La pared celular en las plantas) se las trata in extenso. A continuacin se detallan algunas hechos que caracterizan a diferentes grupos en referencia a la misma. Las clulas de los animales y de muchos protistas no tienen pared celular. Las plantas tienen una variedad de productos incorporados en su pared celular, entre ellos la celulosa en la pared primaria y la lignina, y otros productos qumicos en la pared secundaria. Los plasmodesmos son las conexiones por medio de las cuales se comunican las clulas eucariotas cubiertas por paredes celulares. Los hongos poseen quitina en su pared celular. Los procariotas tienen una pared celular formada por un peptidoglicano, que entre sus caractersticas esta el hecho de contener aminocidos de la serie D. Las arqueobacterias no poseen paredes celulares con peptidoglicanos

MOLECULAS DE ADHESION CELULAR (CAMS) http://www.udec.cl/~ofem/remedica/VOL1/cams.htm Matriz extracelular y unin de las clulas entre s http://www.exelinfo.com/espaniol/edicion_02/nota15.html

37 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL From the Lipid Bilayer to the Fluid Mosaic: A Brief History of Membrane Models http://www1.umn.edu/ships/9-2/membrane.htm MEMBRANE STRUCTURE AND http://www.nileshs.k12.il.us/north/science/jacnau/chpt8.html FUNCTION

THE STRUCTURE AND FUNCTION OF MACROMOLECULES taken from Campbell, N., et al. Biology. 5th ed. Menlo Park, California: Benjamin/Cummings, 1998 http://www.nileshs.k12.il.us/north/science/jacnau/chpt5.html MIT Hypertextbook Chapter on Cell Biology: Excellent site with illustrations and additional details to complement the above material; http://esgwww.mit.edu:8001/esgbio/cb/cbdir.html Dictionary of Cell Biology: A searchable dictionary pertinent to this topic; http://www.mblab.gla.ac.uk/~julian/Dict.html Biologa

1. Hipertextos del rea de la http://fai.unne.edu.ar/biologia/cel_euca/inicio

Arqueobacterias (del griego arkhaios = antiguo; bakterion = bastn): grupo de procariotas de unos 3.500 millones de aos de antigedad, presentan una serie de caractersticas diferenciales que hicieron que Carl Woese, profesor de la Universidad de Illinois, Urbana, U.S.A. , [email protected] , proponga su separacin del reino Moneras y la creacin de uno nuevo: Archaea, propuesta que hoy es cada vez mas aceptada Cadherinas: Son molculas de transmembrana que tienen un rol clave en la adhesin celular por medio del establecimiento de interacciones calcio dependientes. Tambin conectan el ambiente extracelular al citoesqueleto interaccionando con una serie de protena relacionadas ( que reciben colectivamente el nombre de cateninas) que a su vez se relaciona con filamentos de actina. CAM (Molculas de Adhesin Celular): Son glicoprotenas ubicadas en la superficie celular que constituye receptores celulares. Tienen en un extremo un grupo carboxilo, el llamado carboxi-terminal, que se encuentra fijo en el citoplasma y en el cito-esqueleto. A continuacin del carboxiterminal se encuentra la regin transmembrana, que atraviesa la membrana celular. El resto de la glicoprotena se ubica extracelularmente y termina en un grupo amino, el amino-terminal que da la especificidad a la molcula para unirse a otras CAMs. Se ha descrito intervencin de las CAMs en mltiples enfermedades, y los reportes bibliogrficos son cada vez ms numerosos. La diseminacin de metstasis estara dada por la alteracin de las CAMs en las clulas tumorales y se estn comunicando alteraciones de estas molculas en diferentes

38 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL enfermedades malignas. Tambin se relacionan receptores con enfermedades reumatolgicas. estos

Celulosa: componente bsico de las paredes celulares de las plantas superiores e inferiores, de las algas y de los oomicetos. Compuesta de glucosas enlazada mediante uniones 1,4 glucosdicas. Eucariotas (del griego eu = bueno, verdadero; karyon = ncleo, nuez): organismos caracterizados por poseer clulas con un ncleo verdadero rodeado por membrana. El registro arqueolgico muestra su presencia en rocas de aproximadamente 1.200 a 1500 millones de aos de antigedad. Fosfolpidos (del griego lipos = grasa): molculas lipdicas asimtricas, con una "cabeza" hidroflica y una "cola" hidrofbica. Posee un grupo fosfato en lugar de uno de los tres cidos grasos que esterifican a la glicerina en las grasas. El grupo fosfato adems se une a bases orgnicas como la colina. Glicerina (del griego glykeros = "sabor dulce"): propanotriol, polialcohol de tres tomos de carbono. Hidroflico (del latn hydro = agua, philios = amigo): Trmino aplicable a las molculas polares que pueden formar puentes hidrgeno con el agua. Hlice alfa: es una apretada hlice formada por una cadena polipeptdica. La cadena polipeptdica principal forma la estructura central, y las cadenas laterales se extienden por fuera de la hlice. El grupo carboxlo (CO) de un aminocido n se une por puente hidrgeno al grupo amino (NH) de otro aminocido que est tres residuos mas all ( n + 4 ). De esta manera cada grupo CO y NH de la estructura central (columna vertebral o "backbone") se encuentra unido por puente hidrgeno. Hidrofbico (del latn hydro = agua, del griego phobeo = "yo temo") Trmino aplicable a las molculas apolares que no pueden formar puentes hidrgeno con el agua. Integrinas: son las principales clases de Molculas de Adhesin Celular que interaccionan entre la clula y la matriz (aunque las selectinas y proteoglucanos tambin intervienen en la fijacin). Las integrinas estn compuestas por dos subunidades diferentes (heterodmeros) que toman el nombre de alfa (con 17 tipos diferentes) y beta (con ocho tipos diferentes), lo cual permite un gran nmero de combinaciones. Un gran nmero de virus y bacterias suelen utilizarlas para penetrar en las clulas Lignina: polmero que se encuentra incrustado en la pared celular secundaria de las clulas de las plantas leosas. Ayuda a robustecer y endurecer las paredes. Qumicamente es muy complicada, sus monmeros son variados y derivan principalmente del fenilpropano. Producto final del metabolismo que a la muerte de la planta es degradado lentamente por hongos y bacterias. Por ello forma la parte principal de la materia orgnica del suelo.

39 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL Microtbulos (del latn mikros = pequeo, tubus = cao, conducto) Conducto hueco, estrecho y alargado de unos 25 nm de dimetro. Se compone de dos subunidades de protenas que se alternan a lo largo del mismo, y, entre otras funciones, mueven a los cromosomas en la divisin celular y proporcionan la estructura interna de cilias y flagelos Mosaico Fluido: Modelo de la membrana plasmtica ampliamente aceptado en los que las protenas (los "mosaicos") estn embebidas en los lpidos (el "fluido"). Murena: heteropolmero que forma el esqueleto de la pared celular bacteriana . El mismo, y las enzimas que intervienen en su sntesis, son una caracterstica general de todas las eubacterias. Las arqueobacterias no poseen murena. Pared celular: estructura producida por algunas clulas por fuera de membrana celular, qumicamente compuesta por quitina (hongos), peptidoglicano murena (bacterias) o celulosa (plantas). Plasmodesmo (del griego plassein = moldear; desmos = banda, ligadura) En plantas, uniones que atraviesan las paredes celulares y las membranas plasmticas permitiendo una comunicacin directa entre los citoplasmas de clulas adyacentes. Polmero(del griego polys = muchos, meros = parte): Molcula compuesta por muchas subunidades idnticas o similares. Procariota (del latn pro = antes, del griego karyon = ncleo, nuez): Tipo de clula que carece de ncleo rodeado por membrana, posee un solo cromosoma circular y ribosomas que sedimentan a 70 S (los de los eucariotas lo hacen a 80 S). Carecen de organelas rodeadas por membranas. Se consideran las primeras formas de vida sobre la Tierra, existen evidencias que indican que ya existan hace unos 3.500.000.000 aos. Protenas: (del griego proteios = primario, del griego Proteo, dios mitolgico que adoptaba numerosas formas). Polmeros constituidos por aminocidos que intervienen en numerosas funciones celulares. Una de las clases de macromolculas orgnicas que tienen funciones estructurales y de control en los sistemas vivientes. Las protenas son polmeros de aminocidos unidos por uniones peptdicas. Protoplasma: del formacin griego protos = primero, plasma =

Quimiocinas y sus receptores: Las quimiocinas son un grupo de molculas de aproximadamente 8-14 kDa, relacionadas estructuralmente entre s que regulan el trfico y afluencia al sitio de la inflamacin de varios tipos celulares. Su accin se lleva a cabo a travs de la interaccin con sus receptores especficos, un subgrupo de receptores de transmemebrana acoplados a la protena G.

40 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL Actividades Actividades Iniciales: 1. Recordando la estructura de la membrana, analice las principales molculas que la integran. Actividades de desarrollo 2. Reconozca las funciones de la membrana 3. De acuerdo a la lectura del contenido de este tema, realice un cuadro comparativo entre la estructura que adoptan para establecer comunicacin las clulas pertenecientes a animales y las pertenecientes a los vegetales. 4. Conteste usando el glosario: o Que significa las siglas CAM.

5. 1. Con algn buscador encuentre enlaces al tema: proteoglucanos, comente brevemente los mismos. Se recomienda usar http://www.google.com/. 6. Elabore un cuadro sinptico que rena las principales caractersticas de la membrana. 7. Confeccione su propio glosario con las palabras que no comprenda de texto. Acerque el mismo a su Jefe de Trabajos Prcticos o lo enve por e-mail para ser incorporado al glosario de este tema. E-mail: [email protected]

8. Deje planteada una pregunta en el Foro de Hipertextos delrea de la Biologa Funciones de la membrana plasmtica. 1.Reconocimiento celular. La superficie de las clulas presenta un sistema de reconocimiento que permite el establecimiento de relaciones con otras clulas, as como un importante grado de especificidad. El glicoclix de la membrana est ntimamente relacionado con esa funcin, en actividades tan fundamentales como lo es el reconocimiento de elementos del propio organismo de aquellos que son exgenos a este. El llamado Complejo Mayor de Histocompatibilidad (HCM) es el principal responsable de esta habilidad, bien a travs de su variedad HCM-1, presente en todas las clulas, excepto en las del sistema inmune que presentan el tipo HCM-2. 2. Transporte a travs de la membrana. Movimiento del agua y los solutos La membrana celular acta como barrera semipermeable impidiendo la entrada de la mayor parte de las molculas, dejando pasar selectivamente a otras. Para entender los sucesos que acontecen es necesario refrescar los conceptos de

41 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL potencial de agua difusin smosis Potencial de agua El potencial de agua es la tendencia del agua a moverse de un rea de mayor concentracin a una de menor concentracin. Las molculas de agua se mueven de acuerdo a la diferencia de energa potencial entre el punto donde se encuentran y el lugar hacia donde se dirigen. La presin y la gravedad son dos de los orgenes de este movimiento. Recuerde por ejemplo el ciclo hidrolgico en el cual el agua fluye de las partes altas a las bajas, al igual que el agua de lluvia cae de las nubes, y para volver a formar parte de ellas es necesario que el sol la evapore. La energa es necesaria tanto para mantener este ciclo, como para llevar el agua a una zona alta. Difusin simple La difusin es el movimiento neto de sustancia (lquida o gaseosa) de un rea de alta concentracin a una de baja concentracin. Dado que las molculas de cualquier sustancia se encuentran en movimiento cuando su temperatura esta por encima de cero absoluto (0 grados Kelvin, o -273 oC), existe una disponibilidad de energa para que las mismas se muevan desde un estado de potencial alto a uno de potencial bajo. La mayora de las molculas se mueven desde una concentracin alta a una baja, es decir el movimiento neto es desde altas concentraciones a bajas concentraciones.

Modificado de: http://www.biosci.uga.edu/almanac/bio_103/notes/may_13.html Eventualmente, si no se agrega energa al sistema las molculas llegan a un estado de equilibrio en el cual se encuentran distribuidas homogneamente en el sistema.

42 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL Clulas y Difusin

Entre las pocas molculas simples que pueden cruzar la membrana celular por difusin se encuentran gases como nitrgeno, el anhdrido carbnico y el oxgeno. Tambin difunden molculas sin carga como el etanol y resulta ligeramente permeable al agua y a la urea. Para que tenga lugar el fenmeno de la difusin, la distribucin espacial de molculas no debe ser homognea, debe existir una diferencia, o gradiente de concentracin entre dos puntos del medio. La difusin constituye una de las principales formas de movimiento de sustancias entre las clulas y una de las formas en que las pequeas molculas cruzan la membrana celular. El intercambio de gases en branquias y pulmones es consecuencia de fenmenos de difusin. El anhdrido carbnico se regenera constantemente dado que es producido en las clulas como consecuencia de fenmenos metablicos, y como la fuente est en el interior de la clula, el flujo neto del CO2 es hacia el exterior de la clula. Los procesos metablicos, requieren usualmente oxgeno, cuya concentracin es mayor en el exterior de la clula, por lo tanto su flujo neto es hacia el interior. El primer paso de la difusin pasiva en el entorno celular, es el movimiento de una molcula desde la solucin acuosa a la porcin hidrofbica de la bicapa fosfolipdica.


La medida de la "fobia" al agua de una molcula, esta dada por su coeficiente de particin K.

Donde K es la constante de equilibrio de la particin entre aceite y agua. (para el caso de la membrana se analiza Cm, la concentracin en el centro de la bicapa hidrfoba). K es una medida de la tendencia de una molcula a "huir" del agua, a mayor K, mayor es la posibilidad de disolucin de una molcula en la bicapa lipdica. La velocidad de difusin (dn/dt expresada en mol/s) de molculas pequeas a travs de una membrana esta dada por una variante de la Ley de Fick y de acuerdo a ella, la misma es proporcional a la diferencia de concentraciones a ambos lados de la membrana (C1aq-C2aq). Adems, para una membrana de superficie A y de espesor x, es proporcional a A e inversamente proporcional a x. Por otra parte resulta proporcional a P (coeficiente de permeabilidad), todo lo cual resulta en:

siendo P proporcional a K

y donde D (caracterstico tanto del soluto como del medio en el que se disuelve) es el coeficiente de difusin de la molcula dentro de la membrana y x el espesor de la misma. Reemplazando nos queda

Por lo tanto la velocidad de difusin es directamente proporcional tanto a la constante de difusin (D) como a la de particin (K) e inversamente proporcional al espesor de la

44 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL membrana (x). Dado que x prcticamente no vara siendo de alrededor de 3 nm. y, por otra parte las diferencia de los coeficientes de difusin D no suelen ser significativo (para bajas concentraciones se mantiene prcticamente constante). Considerando para un rea A constante podramos simplificar mas y dejar

por lo tanto la velocidad con que difunden las molculas depende de su coeficiente de particin y de la diferencia de concentracin ambos lados de la membrana. En otras palabras cuanto mas hidrfoba sea la molcula, con mayor velocidad difundir por la membrana plasmtica y adems esta velocidad se incrementar cuanto mayor sea la diferencia de concentracin de las molculas entre ambos lados de la membrana. Estas relaciones valen para interpretar la difusin de gases y molculas pequeas sin carga como el etanol a travs de la membrana plasmtica. smosis Por smosis se conoce al fenmeno de difusin de agua a travs de una membrana semipermeable (conocidas tambin como de permeabilidad diferencial o de permeabilidad selectiva). Ejemplos de ese tipo de membrana son la membrana celular, como as tambin productos como los tubos de dilisis y las envolturas de acetato de celulosa de algunas salchichas. La presencia de solutos decrece el potencial de agua de una sustancia, por lo tanto existe ms agua por unidad de volumen en un vaso de agua corriente que en el volumen equivalente de agua de mar. En una clula, que posee organelas y molculas grandes, la direccin del flujo del agua es, generalmente, hacia el interior de la clula. La presin osmtica se define como la presin hidrosttica necesaria para detener el flujo neto de agua a travs de una membrana semipermeable que separa soluciones de composicin diferente. La presin osmtica (p) est dada por:

donde p es presin osmtica medida en atmsferas (atm), R la constante de los gases, T la temperatura absoluta y DC la diferencia de las concentraciones de solutos a ambos lados de la membrana. La presin osmtica es una propiedad de tipo coligativa, es decir, depende del nmero de partculas. As por ejemplo una solucin de NaCl 0,5 M, si estuviera totalmente disociada en Na+ y Cl-, sera equivalente a una solucin de glucosa 1M. Las soluciones hipertnicas son aquellas, que con referencias al interior de la clula, contienen mayor cantidad de solutos (y por lo tanto menor potencial de agua). Las hipotnicas son aquellas, que en cambio contienen menor cantidad de solutos (o, en otras palabras, mayor potencial de agua).

45 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL Las soluciones isotnicas tienen concentraciones equivalentes de solutos y, en este caso, al existir igual cantidad de movimiento de agua hacia y desde el exterior, el flujo neto es nulo.

Las clulas animales se hinchan cuando son colocadas en soluciones hipotnica, algunas como los eritrocitos terminan estallando debido al agua que penetra en ellas por flujo osmtico (se lisan), Una de las principales funciones del cuerpo de los animales es el mantenimiento de la isotonicidad del plasma sanguneo, es decir un medio interno isotnico. Esto elimina los problemas asociados con la prdida o ganancia de agua desde y hacia las clulas. Estamos hablando por supuesto de una de las claves de la homeostasis. A diferencia de la clulas animales, las clulas de bacterias y plantas estn rodeadas por una pared celular rgida, en este caso Cuando se encuentran en un medio hipotnico, el agua que penetra por flujo osmtico genera una presin de turgencia que empuja al citosol y la membrana plasmtica contra la pared celular. En cambio en soluciones hipertnicas las clulas se retraen, separndose la membrana de la pared celular como consecuencia de la prdida de agua por flujo osmtico (fenmeno conocido como plasmlisis). Organismos unicelulares como Paramecium, y otros organismos de vida libre en agua dulce, tienen el problema de que son usualmente hipertnicos con relacin a su medio ambiente. Por lo tanto el agua tiende a fluir a travs de la membrana hinchando a la clula y eventualmente rompindola, hecho molesto para cualquier clula. Una vacuola contrctil es la respuesta del Paramecium a este problema, si bien el bombear agua hacia exterior de la clula requiere energa ya que trabaja contra un gradiente de concentracin. Protenas de membrana que intervienen en el transporte Debido a a su interior hidrofbico, la bicapa lipdica de una clula constituye una barrera altamente impermeable a la mayora de las molculas polares. Esta funcin de barrera tiene gran importancia ya que le permite a la clula mantener en su citosol a ciertos solutos a concentraciones diferentes a las que estn en el fluido extracelular; lo mismo ocurre en cada compartimiento intracelular envuelto por una membrana. El desarrollo evolutivo ha creado sistemas

46 HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA NORMAL celulares destinados transportar especficamente molculas hidrosolubles, subsanando el problema del aislamiento celular. El transporte de molculas es realizado por parte de las protenas integradas en la membrana celular. Por lo general es altamente selectivo en lo que se refiere a los productos qumicos que permiten pasar. Las tres clases principales de protenas de membrana (todas ellas de transmembrana) que intervienen en el pasaje de molculas a travs de la misma son: protenas de canal que conforman un "tnel" que permite el paso de agua y electrolitos a favor de un gradiente de concentracin o potencial elctrico (forman un canal que atraviesa la bicapa en todo su espesor). La partcula que pasa se selecciona de acuerdo a su tamao y carga. Suelen estar cerrados y abrirse frente a estmulos especficos. El pasaje se realiza de acuerdo al gradiente de concentracin de las molculas. Las clulas que presentan gran permeabilidad al agua poseen un canal que facilita la entrada de la misma. La protena responsable: la acuoporina, se identific en eritrocitos.

bombas: utilizan energa (provista por el ATP) para transportar molculas contra un gradiente de concentracin

transportadores: este tipo de protenas, luego de fijar las molculas a transportar (A),


Protena transportadora Sufren un cambio de conformacin (B) en manera tal que permite a las molculas fijadas, atravesar la membrana plasmtica. Se conocen tres tipos de transportadores:

Tipos de transportadores o o o "uniport" llevan una soluto por vez "symport" transportan el soluto y co-transportan otro diferente al mismo tiempo y en la misma direccin. "antiport" transportan soluto hacia e

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