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SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE CENTRO NACIONAL DE HOTELERÍA, TURISMO Y ALIMENTOS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

RECUENTO DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES - TÉCNICA FILTRACIÓN POR MEMBRANA

1. OBJETIVO Este procedimiento tiene por objeto explicar los pasos a seguir para realizar el ensayo: Coliformes Termotolerantes en muestras de agua; empleando la técnica filtración por membrana. 2. ALCANCE Este procedimiento es aplicable para las matrices relacionadas a continuación:

Agua subterránea (Agua de pozo). Aguas recreativas (Piscinas).

3. DEFINICIONES CEPA: Conjunto de células vivas que poseen las mismas características morfológicas, fisiológicas y genéticas. COLIFORMES: Están conformados por todas las bacterias aerobias y anaerobias facultativas cuyas características se definen a continuación:

Gram negativas. No esporuladas. Forma de bacilos. Fermentadores de lactosa. Productores de gas y ácido.

Del grupo coliformes forman parte varios géneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cáscara de huevo, etc. COLIFORMES TERMOTOLERANTES: Los coliformes termotolerantes conforman un subgrupo de los coliformes totales que a diferencia de los demás coliformes, tienen la capacidad de fermentar la lactosa en presencia de sales biliares; con producción de ácido y gas en 24 horas a temperaturas entre 44 y 45ºC. Los coliformes termotolerantes comprenden principalmente Escherichia coli y algunas especies de los géneros Enterobacter y Klebsiella. Su origen es principalmente fecal y por esa razón se considera a este grupo como índice de contaminación fecal.

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FERMENTACIÓN: Proceso catabólico (de obtención de energía) llevado a cabo en ausencia de oxígeno, dando como producto final compuestos orgánicos. FILTRACIÓN: Proceso físico que hace que una sustancia sea dividido en partes de acuerdo al diámetro, tamaño o grosor de las partículas que lo conforman. Se entiende también como un proceso mecánico que no necesita ser estimulado artificialmente mediante el uso de químicos u otras sustancias. FILTROS DE MEMBRANA (Estéril): Lámina en forma de circunferencia elaborada con celulosa. Posee un diámetro de poro equivalente a 0,45 µ y funciona como una pared de separación selectiva. A través de ella se hace pasar el volumen de muestra a evaluar, quedando en el filtro las células bacterianas que se presume están presentes en la muestra. Dependiendo el analito, es seleccionado el diámetro del poro en los filtros de membrana. 4. DESARROLLO DE ACTIVIDADES 4.1. FUNDAMENTO El método consiste en hacer pasar una muestra de agua a través de un filtro de celulosa con 0,45 μm de diámetro de poro, aplicando vacío parcial; con el fin que queden retenidas las células bacterianas. Posteriormente al proceso, el filtro es colocado en un medio de cultivo específico para el microorganismo que se desea evaluar en la muestra (Coliformes termotolerantes), y luego se incuba a la temperatura y durante un periodo adecuado. 4.2. TOMA Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS Antes de esterilizar las botellas, para muestras de agua subterránea y aguas recreativas, agregar 0.1 ml por cada 120 ml de muestra a examinar; de solución Tiosulfato de Sodio al 3% con el fin de inhibir la acción del Cloro Residual. Luego de tomar las muestras homogenizar para favorecer la distribución uniforme del agregado en las botellas. Mantener las muestras en refrigeración entre 2 y 6 °C, hasta entregar al laboratorio. 4.3. INTERFERENCIAS

Contaminación cruzada en el transporte, recepción y almacenamiento de las muestras. Alta concentración del analito. Presencia de sólidos suspendidos en la muestra. Homogeneización inadecuada. Condiciones higiénicas del equipo de filtración. Temperatura de incubación fuera del rango de especificación para el analito. Dilución de nutrientes y estabilidad del pH en los medios de cultivos.

4.4. EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS. 4.4.1. Equipos.

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Cabina de flujo laminar. Cuenta colonias. Equipo de filtración. Baño serológico. Incubadora 44.5 °C. Nevera 2 – 6 °C.

4.4.2. Materiales.

Asa de inoculación en aro. Bandejas de transporte. Botellas de vidrio con capacidad de 250, 500 ml. Cajas Petri grandes y pequeñas. Dispensador de pipetas. Encendedor. Filtros de membrana 0,47 mm x 0,45 µ. Frascos y recipientes para descarte. Mechero de Bunsen. Micropipetas de 100 y 1000 µL. Pipetas graduadas estériles de 1, 5 y 10 ml. Tips para micropipetas, azules y amarillas. Toallas de papel absorbente.

4.4.3. Medios de cultivos y reactivos.

Peptona universal. NaCl (Cloruro de Sodio). Agar m-FC Agua destilada estéril.

4.4.3.1. Indicaciones para la preparación del Agar m-FC. Agregar 52 g del polvo en 1 litro de agua desmineralizada y calentar en baño de agua hirviendo hasta disolver completamente el medio de cultivo. Seguidamente añadir 10 ml de solución Acido Rosólico 1% en 0,2 N NaOH, mezclar bien y calentar nuevamente durante un minuto. ¡No esterilizar en autoclave!. El pH final debe ser 7,4 ± 0,2. Dejar enfriar a 50 °C. Distribuir de 4 a 6 ml (4 – 5 mm de profundidad) del preparado en cajas Petri pequeñas y dejar solidificar. Refrigerar protegiendo las cajas con papel plástico para evitar pérdida de humedad. Desechar los cultivos sin utilizar luego de 2 semanas. Nota: No esterilizar en autoclave debido a que el Ácido Rosólico puede descomponerse. Refrigerar la solución madre en la oscuridad y desechar después de 2 semanas, o antes si su color cambia de rojo oscuro a marrón oscuro. 4.4.4. Soluciones.

Peptona 0,1 %. Cloruro de Sodio 0,85 %. Alcohol Etílico 96 %.

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4.5. CONSIDERACIONES DE SALUD, SEGURIDAD Y MANEJO AMBIENTAL. Usar bata blanca, guantes, mascarilla, gorro y lentes de protección. Lavarse las manos antes y después de trabajar. Desinfectar el área de trabajo antes y después de realizar una tarea. No comer, beber, fumar, aplicarse maquillaje o cremas en el área de trabajo. No almacenar alimentos y bebidas en refrigeradores donde se encuentren las muestras, medios

de cultivos, reactivos, soluciones y materiales de trabajo. Tener en cuenta los avisos de advertencia en lo relacionado con las lámparas UV. No ingresar al

área mientras se encuentre encendida. Al salir del laboratorio, verificar que las llaves del gas se encuentren cerradas. 4.6. PROCEDIMIENTO 4.6.1. Filtración

Rotular las cajas de petri con el código de la muestra, fecha y dilución utilizada, cuando este sea el caso.

Preparar el equipo de filtración. Adicionar de 20 a 30 ml de agua destilada estéril al inicio y al final de cada serie de filtración,

para verificar la presencia de contaminación. Si los controles indican contaminación, rechazar todos los datos de las muestras afectadas y solicitar nuevas muestras.

Utilizar una pinza estéril para colocar el portafiltro sobre la base de manifold. Ubicar sobre la parte porosa del receptáculo y utilizando la misma pinza, un filtro de

membrana con la parte cuadriculada hacia arriba. Cuidadosamente, ubicar el embudo de filtración en el receptáculo y fijar con los broches del

manifold. Agitar la muestra vigorosamente, por lo menos 25 veces. Adicionar un volumen de muestra, determinado con base a la naturaleza, apariencia y carga

bacteriana que se asume de la muestra. Tener en cuenta la información contenida en la Tabla N° 1, para seleccionar el volumen de muestra adecuado.

Cuando se desconoce la densidad bacteriana de la muestra, filtrar varios volúmenes o realizar diluciones para obtener un valor dentro del rango (20 – 60 colonias).

Encender la bomba de vacío y dejar filtrar el contenido. Cerrar la válvula en el manifold y adicionar de 20 a 30 ml de agua destilada estéril. Encender nuevamente la bomba de vacío y dejar filtrar el contenido. Filtrar un volumen determinado de la muestra, para cada ensayo a evaluar. Realizar los controles de calidad. Cerrar la válvula en el manifold y apagar la bomba de vacío. Aflojar el broche de los embudos y retirarlos de la base del receptáculo. Retirar con una pinza estéril (Flameada en el mechero de Bunsen), el filtro del receptáculo y

ubicarlo con un movimiento de rotación (para evitar que quede aire atrapado entre la superficie del medio de cultivo y el filtro de membrana) en la caja petri con el medio de cultivo m-FC.

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Tabla N° 1. Volúmenes de muestra sugeridos para evaluar coliformes termotolerantes.

Fuente de agua Volumen a filtrar (ml).

100 50 10 1 0.1 0.01 0.001 0.0001

Agua de consumo (Potable). X

Agua de lago, embalses. X X

Agua de pozo, manantiales. X X

Agua de captación X X X

Agua de baños naturales. X X X

Planta de tratamiento de aguas residuales.

X X X

Estanques, ríos. X X X

Agua de escorrentías pluviales. X X X

Aguas residuales domésticas X X X

Lodos de aguas residuales X X X

4.6.2. Incubación: Introducir las cajas petri en bolsas de plástico a prueba de agua o proteger las cajas petri sellando con papel plástico, luego invertir y sumergir en baño de agua, anclando los paquetes de cajas petri debajo de la superficie del agua. Incubar a 44,5 ± 0,2 °C durante 24 ± 2 horas. Colocar las cajas petri en el baño de agua; dentro de los 30 minutos después del proceso de filtrado. 4.6.3. Recuento: Las colonias producidas por coliformes termotolerantes en el medio m-FC son azules de distintos tonos. Otras bacterias diferentes a los coliformes termotolerantes se presentan de color gris a crema. Normalmente se observan pocas bacterias en el medio m-FC, diferentes a los coliformes termotolerantes debido a la acción selectiva de la temperatura y la adición del Ácido Rosólico. Contar en las cajas donde se encuentren entre 20 y 60 colonias y expresar el resultado como UFC/100 ml de coliformes termotolerantes. 4.6.4. Verificación: Verificar cinco colonias típicas (azul) y cinco colonias atípicas (gris a verde) por membrana. Transferir las colonias con la ayuda de una asa estéril; a tubos con Caldo EC, incubar a 44,5 +/- 0,2 °C durante 24 ± 2 horas. Si la prueba es positiva se confirma la presencia de coliformes termotolerantes. 4.7. CÁLCULO DE LA DENSIDAD BACTERIANA Para calcular los resultados tener en cuenta las siguientes pautas:

Para las muestras de agua no potable, si se examinan porciones de 10, 0.1 y 0.01 mL y todos los recuentos son 0, calcular el resultado de la siguiente forma: 1/10 X 100 = <10 UFC/100 ml

Para las colonias de coliformes verificadas, ajustar el recuento inicial basándose en el porcentaje de

verificación positiva, e informe de la siguiente forma:

Coliformes termotolerantes verificados UFC/100 mL = Número de colonias positivas / número total de

colonias evaluadas X 100.

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Si se produce un crecimiento confluente y las colonias no se pueden distinguir o si el número total de colonias bacterianas supera las 200, reportar el resultado como DNPSC (Demasiado numeroso para ser contado). Reportar demasiado numeroso para ser contado (DNPSC); solo, si se ha confirmado por lo menos una colonia de coliformes termotolerantes. Si es necesario solicite una nueva muestra de la misma procedencia dentro de las próximas 24 horas, y evalúe volúmenes de muestra más pequeños para reducir las interferencias. Filtrar porciones de 50 ml a través de dos membranas separadas o porciones de 25 ml a través de cuatro membranas separadas. Observar el crecimiento en todas las membranas para la misma muestra y reportar la sumatoria de los recuentos como UFC/ 100 mL. Este procedimiento también se puede aplicar para muestras de agua no potable, por ejemplo:

Ejemplo N° 1: Al filtrar por duplicado 50 mL de la misma muestra, los conteos obtenidos son 5 y 3

colonias en cada filtro respectivamente. El recuento total de coliformes se reporta como 8 UFC/100

ml:

[(5 + 3) X 100] / (50 + 50) = 8 UFC/100 mL.

Ejemplo N° 2: Si son examinados 50, 25 y 10 mL de muestra, y los conteos obtenidos son 18, 6 y <1

colonias respectivamente, calcular el resultado con base al valor más cercano al límite inferior

aceptable (18), y reportar el resultado final como 36 UFC/100 ml “Estimado”:

[(18) X 100] / (50) = 36 UFC/100 mL “Estimado”.

Ejemplo N° 3: Si son examinados 10, 1 y 0,1 mL de muestra, con conteos obtenidos de 40, 9 y <1

colonias respectivamente, seleccionar el conteo para 10 mL de muestra, para realizar el cálculo de la

densidad; debido a que el recuento está dentro del rango aceptable, y reportar el resultado como 400

UFC/100 mL:

[(40) X 100] / (10) = 400 UFC/100 mL.

Ejemplo N° 4: Si porciones de 10, 1, y 0,1 mL de muestra, arrojan recuentos de DNPSC, 150, y 76

colonias respectivamente, calcular el resultado con base al valor más cercano al límite superior

aceptable e informar el resultado como 76000 UFC/100 mL “Estimado”:

[(976x 100] / (0,1) = 76000 UFC/100 mL “Estimado”.

Ejemplo N° 5: Si son examinados 1, 0,3, 0,1, y 0.03 mL de muestra, con conteos obtenidos de

DNPSC, DNPSC, 78 y 21 colonias respectivamente, sumar los recuentos de coliformes obtenidos en

los dos filtros y dividir entre la suma de sus volúmenes, para obtener el resultado final de 76000

UFC/100 ml:

[(78 + 21) X 100] / (0.1 + 0.03) = 76000 UFC/100 mL.

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Ejemplo N° 6: Si son examinados 1, 0,3 y 0,01 mL de muestra, con conteos de DNPSC obtenidos en

todas las porciones, calcular utilizando el valor correspondiente al límite máximo del rango de

colonias aceptables y el volumen más pequeño de muestra filtrado. Reportar el resultado como

>800.000 UFC/100 mL:

[80 X 100] / (0.01) = > 800 000 UFC/100 mL. 4.8. BIBLIOGRAFÍA

Standard Methods: For the Examination of Water and Wastewater. Edición 22nd 2012: Métodos

9222 D.