Coliformes Coliformes totales, totales, termotolerantes termotolerantes y y Escherichia coli Escherichia coli por el método por el método

de filtración de membrana ( FM )de filtración de membrana ( FM )Bióloga: Carmen Vargas G.

OPS / CEPIS

Curso sobre métodos bacteriológicosCurso sobre métodos bacteriológicospara el análisis de Agua Potablepara el análisis de Agua Potable

23- 27 de octubre del 200023- 27 de octubre del 2000Lima - PerúLima - Perú

Centro Panamericano de Ingeniería Sanitaria y Ciencias del Ambiente Enviromental Protection Agency

Coliformes totales

Coliformestermotolerantes

RELACIÓN ENTRE COLIFORMESRELACIÓN ENTRE COLIFORMESTOTALES, TERMOTOLERANTES Y TOTALES, TERMOTOLERANTES Y E. E. colicoli

EscherichiaEscherichia coli coli

ORGANISMOS COLIFORMES

3 Bacterias Gram-negativas, forma de bastoncillos

3Se desarrollan en presencia de sales biliares u otros

agentes tensoactivos

3Tienen propiedades de inhibición.

3Fermentan la lactosa a 35-37°C, produciendo gas,

ácido y aldehído en 24-48 horas.

3Son oxidasa negativa y no forman esporas.

3Presentan actividad a la ββ-galactosidasa

DEFINICIÓN

GRUPO COLIFORME ( FM )

Bacterias aerobias y anaerobias facultativas,

gram negativas, no esporuladas y de forma alargada

que desarrollan una colonia roja con brillo metálico

en un medio tipo Endo que contiene lactosa a

inoculación de 35 ± 0,5°C - 24 hrs.

GRUPO COLIFORMEGRUPO COLIFORME

GÉNEROSGÉNEROS FUENTEFUENTE

EscherichiaEscherichia HECES (HECES (humanos y animaleshumanos y animales))

KlebsiellaKlebsiella HECES, AMBIENTEHECES, AMBIENTE

EnterobacterEnterobacter HECES, AMBIENTE HECES, AMBIENTE

CitrobacterCitrobacter AMBIENTEAMBIENTE

SerratiaSerratia AMBIENTEAMBIENTE

ORGANISMOS PATÓGENOS EN EL AGUAORGANISMOS PATÓGENOS EN EL AGUA

MÉTODOS PARA COLIFORMESMÉTODOS PARA COLIFORMESTOTALESTOTALES

Método de filtración por membrana (FM)Método de filtración por membrana (FM)

Un total de 100 ml de muestra en uno o más filtros; por ejemplo,1 filtro con 100 ml ó 4 filtros con 25 ml cada uno.

Preparación de diluciones decimales

Muestra de agua

cruda

Dilución

10-1

Dilución

10-3

Dilución

10-2

10 ml

Agua de dilución

amortiguada

10 ml 10 ml

90 ± 2 ml 90 ± 2 ml90 ± 2 ml

10 ml 10 ml 10 ml

1 ml 0,1 ml 0.01 ml

100 ml 25 ml50 ml

100 ml 50 ml 10 ml

Volumen filtrado

Placas con AGAR m-FC ó ALMOHADILLAEMBEBIDA ENCALDO m-FC

VOLUMEN DE MUESTRA

ORIGINAL FILTRADA

COLIFORMES TOTALES - VERIFICACIÓN DEL FMMuestra

Agar mEndo 35° ± 0.5°C, 24 h

Crecimiento+, Gas+

Caldo lactosado verde brillantebilis 35 ± 0.5° C, 24 - 48 h

Coliformes totales verificados

Crecimiento+, Gas+

a) Seleccionar ≤≤ 5 colonias con brillo metálico, ob) Trasladar las colonias con un hisopo del filtro a

Caldo lauril triptosa 35° ± 0.5°C, 24 - 48 h

DEFINICIÓN

Bacterias que forman parte del grupo Coliforme, bacilos gram – negativos, no esporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a 44.5 ± 0,2 °Cdentro de las 24 ± 2 hrs.

La mayor especie en el grupo de coliformes termotolerantes es la E. Coli.

COLIFORMES TERMOTOLERANTES(fecales)

MÉTODO PARA COLIFORMES TERMOTOLERANTES

Se realiza a partir de coloniaspositivas de coliformes totales enplacas con medio m – Endo, lascuales son transferidas en tubosconteniendo medio EC, durante 24hrs.

CONFIRMACIÓN DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES

MUESTRA

AGAR m-ENDO ó m-ENDO LES

35°C ± 0,5 °C / 24 HRS

SELECCINAR 5 COLONIAS VERDE DORADO Y CONBRILLO METÁLICO

COLIFORMES TERMOTOLERANTES ( fecales)

CALDO EC 44,5 °C ± 0,2 °C / GAS (+) 24 HRS

PRUEBA PARA COLIFORMESTERMOTOLERANTES POR MF SOLO CON

AGUA DE LA FUENTE

MUESTRA

COLIFORMES TERMOTOLERANTES( fecales )

Medio m - FC

44,5 °C ± 0,2 °C / 24 hrs.

COLONIAS AZULES

DEFINICIÓN

Escherichia coli

Bacteria Coliforme que posee la enzima ββ- dGlucoronidasa y es capaz de romper el sustrato4-metil umbeliferil glucorónido ( MUG) con la producción de fluorescencia cuando crece enlos medios EC – MUG a 44.5 ± 0,2 °C en 24 ± 0,2 horas en Agar nutritivo con MUG a 35°C ± 0,5 en4 horas

E. coli MÉTODO DE FILTRACIÓN DE MEMBRANA

MUESTRA

AGAR m-ENDO ó m-ENDO LES 35°C ± 0,5 °C / 24HRS

FLUORESCENCIA LUZ UV 366 nm

CALDO EC + MUG 44,5 °C ± 0,2 °C/ gas (+) 24 hrs

SELECCINAR 5 COLONIAS VERDE DORADO YCON BRILLO METÁLICO

E. coli

E. coliFILTRACIÓN DE MEMBRANA – MEMBRANA FILTRANTE

( MÉTODO DE MATES SHAFFER)

MUESTRA

AGAR m-ENDO ó m-ENDO LES 35°C, 24 Hrs

E. coli

AGAR NUTRITIVO + MUG 35,5 °C ± 0,2 °C / 4 hrs

a) Seleccionar ≤≤ 5 colonias con brillo metálico.b) Trasladar el filtro al

FLUORESCENCIA LUZ UV 366 nm

VENTAJAS DEL MÉTODO DE

FILTRACIÓN POR MEMBRANA

• Proporciona recuentos directos.

• Es más preciso ( se obtienenresultados más reproducibles) quela prueba de FTM o NMP.

• Rápido y fácil de realizar.

• Analiza mayores volúmenes demuestras con bajas concentracionesde organismo.

Calculo de la densidad de coliformes porel método de filtración de membrana

Colonias de coliformes/100 ml = Colonias de coliformes contados x 100

ml de muestra filtrada

Se expresa en UFC / 100 µµl

DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE

FILTRACIÓN POR MEMBRANA

• Intervienen los altos niveles deturbiedad.

• Los coliformes debilitados puedensobrevivir mejor en la prueba de FTMo NMP.

• Las altas concentraciones de nocoliformes interfieren en el recuento.

• Efecto del tipo de filtro de membrana.

VERIFICACIÓN• VERIFICAR TODAS LAS COLONIAS DE

COLIFORMES TOTALES SI HAYIGUALDAD O MENOR A 5 COLONIAS ENEL FILTRO.

• VERIFICAR 5 COLONIAS ELEGIDASALEATORIAMENTE DEL FILTRO CONMÁS DE 5 COLONIAS EN EL FILTRO.

TASA DE VERIFICACIÓNTASA DE VERIFICACIÓNmétodo de filtración por membranamétodo de filtración por membrana

1. Porcentaje de verificación =

(Número total de tubos positivos)

(Número total de tubos inoculados)

X 100

2. Recuento de coliformes totales verificados =

Fracción % de verificación x (Coliformes/100 ml)*

* Recuento en membrana

RECOMENDACIONES

Analizar 100 ml de muestra, independientedel método elegido.

*

La muestra debe analizarse dentro de las 30 horasde recolección.

*

Usar etanol al 95% en medio m-Endo (alcohol nodesnaturalizado)

*

RECOMENDACIONES(CONTINUACIÓN)

Realizar el control apropiado de esterilidad: agar, caldo, amortiguador de fosfato y filtros.

*

Probar los nuevos lotes de filtros para la recuperacióny efectos en la morfología de las colonias.

*

No guardar el agar por más de 2 semanas; desecharlas almohadillas humedecidas con el medio de cultivodespués de 96 horas.

*