Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI
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“Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann”FACULTAD DE CIENCIAS- ESBI
PRÁCTICA DE LABORATORIO:
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES, TERMOTOLERANTES: Técnica del número más probable (NMP) y aislamiento de E.coli
INTEGRANTES:-Tania Arias Ch. -Germán Mamani
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COLIFORMES
Son bacilos Gram negativos no
esporulados, forma bacilar.
Aerobias o anaerobias facultativas.
Fermentan la lactosa con producción de Ácido y gas a 30-37ºC en 48 horas
Capacidad para crecer en presencia
de sales biliares.
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Se encuentra en:
Intestino del hombre, animales, y en
otros ambientes como:
Suelo, plantas, cáscaras de huevo,
etc.
COLIFORMES
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Los principales microorganismos indicadores en alimentos son:
Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de proceso: Mesófilos aerobios (o cuenta total) , cuenta de
hongos y levaduras y cuenta de coliformes totales.
Indicadores de contaminación fecha o bacterias entéricas: Coliformes fecales, E. coli y enterococos.
COLIFORMES
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La selección de indicadores en un alimento depende fundamentalmente de:
Los riesgos implicados
Lo que se requiera saber para: liberar, controlar o mejorar el alimento,
manteniendo el enfoque preventivo.
COLIFORMES
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E. coli, es un microorganismo indicador pues:
Ser detectables y estar presentes. Su crecimiento y número debe ser
correlativamente negativa a la calidad. Contados y diferenciados de otros
microorganismos. Contables en poco tiempo. Su crecimiento no debe ser alterado por
otro componente de la flora.
COLIFORMES
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Se consideran excelentes indicadores de la eficiencia de los procesos de sanitización y desinfección, así como de calidad sanitaria en agua, vegetales y diversos productos procesados.
Su determinación se basa generalmente en la capacidad de fermentar lactosa
COLIFORMES
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Los coliformes fecales o Termotolerantes,
fermentan la lactosa entre 43,.5 – 45,5ºC, y la
facultad de producir Indol en agua peptonada
(Pascual,1922).
COLIFORMES
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Los coliformes totales, fermentan la lactosa a 35 +-1ºC generalmente:
Escherichia Enterobacter
Citrobacter Klebsiella.
COLIFORMES
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Existen 3 fases o etapas:
Prueba presuntiva.
Prueba confirmatoria.
Prueba concluyente.
Análisis de Coliformes en Agua y Alimentos
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Fuente: Youself, E. Ahmed; Carlstrom, Carolyn; “Microbiología de los alimentos – Manual de laboratorio”;2003; Ed. Acribia.
TABLA 1: Métodos de análisis de coliformes
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Pruebas presuntivas, confirmativas y concluyentes en el análisis de coliformes de alimentos
Fuente: Youself, E. Ahmed; Carlstrom, Carolyn; “Microbiología de los alimentos – Manual de laboratorio”;2003; Ed. Acribia.
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Procedimiento según la FDA:MUESTRA + Tampón fosfato Butterfield
Homogenizar la muestra con
solución diluyente
10 -1 10 -2 10 -3
INCUBAR
1. Prueba presuntiva de
coliformes
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Consultar tabla NMP para 3 diluciones
2. Prueba confirmativa de coliformes totales
4. Prueba completa para
E.coli
3. Prueba confirmativa de
coliformes tolerantes
FUENTE: FDA
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MÉTODO NORTEAMERICANO MÉTODO BRITÁNICO MÉTODO CALDO LACTOSA 2% DE BILIS VERDE
BRILLANTE, Y CONFIRMACIÓN EN MEDIO SÓLIDO
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES
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MÉTODO NORTEAMERICANO
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES (ICMSF)
1ml 1ml10 -1
10 -210 -3
C/U con 9ml de
AP
C/U con 10ml de
LST
INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.
25 gr MUESTRA + 225ml AP
Verificar gas y turbidez
Prueba presuntiva:
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Prueba presuntiva:
+ + + ++ +---
Prueba confirmativa:
Verificar gas y turbidez
Verificar gas y turbidez
10 ml Caldo Brilla
INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 –
48 h.
+ + - - - -
2 0 0
caldo LST
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Fuente: ICMS. Segunda Edición. Editorial Acribia.
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MÉTODO BRITÁNICO
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES (ICMSF)
1ml 1ml10 -
1 10 -2
10 -3
C/U con 9ml de
AP
C/U con 10 mL
Caldo Mac Conkey
(Púrpura de Bromocresol) INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.
25 gr MUESTRA +
225ml AP
Verificar gas y turbidez
Prueba presuntiva:
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Prueba confirmativa:
Verificar gas y turbidez
Caldo Mac Conkey
(Púrpura de Bromocresol)
+ + + ++ +---
3 12
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MÉTODO CALDO LACTOSA 2% DE BILIS VERDE BRILLANTE, Y CONFIRMACIÓN EN MEDIO SÓLIDO
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES (ICMSF)
1ml 1ml10 -
1 10 -2
10 -3
C/U con 9ml de
AP
C/U con 10ml de
Brilla
INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.
25 gr MUESTRA
+ 225ml AP
Verificar gas y turbidez
Prueba presuntiva:
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Prueba presuntiva:
+ - - -+ +---
Prueba confirmativa:
Verificar gas y turbidez
Verificar gas y turbidez
caldo brilla
INCUBAR:Con VRBA (Agar bilis lactosa rojo neutro cristal violeta): 24 horas/ 35 – 37ºC
Con Agar ENDO: 48 horas/ 35 – 37ºC
Siembra en superficie de tubos positivos
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MÉTODO NORTEAMERICANO MÉTODO BRITÁNICO MÉTODO CALDO LACTOSA 2% DE BILIS VERDE
BRILLANTE, Y CONFIRMACIÓN EN MEDIO SÓLIDO
RECUENTO DE COLIFORMES
TERMOTOLERANTES
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MÉTODO NORTEAMERICANO
RECUENTO DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES (ICMSF)
1ml 1ml10 -
1 10 -2
10 -3
C/U con 9ml de
AP
C/U con 10ml de
LST
INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.
25 gr MUESTRA
+ 225ml AP
Verificar gas y turbidez
Prueba presuntiva:
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Prueba presuntiva:
+ + + ++ +---
Prueba confirmativa:
Verificar gas y turbidez
Verificar gas y turbidez
10 ml Caldo Brilla
INCUBAR: 44,5 +- 0,2 °C por 24 – 48 h.
+ + - - - -
2 0 0
caldo LST
Tomar asadas
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MÉTODO BRITÁNICO
RECUENTO DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES (ICMSF)
1ml 1ml10 -
1 10 -2
10 -3
C/U con 9ml de
AP
C/U con 10 mL
Caldo Mac Conkey
(Púrpura de Bromocresol) INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.
25 gr MUESTRA
+ 225ml AP
Verificar gas y turbidez
Prueba presuntiva:
+ + + ++ +---
![Page 27: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/27.jpg)
+ + + ++ +---
Verificar gas y turbidez
Verificar gas y turbidez
10 ml Caldo Brilla
INCUBAR: 44°C +- 0,1 °C por 24 – 48 h.
+ + + + + +
23 1
caldo LST
Tomar asadas de los tubos
positivos
Tomar asadas de los tubos positivos
Prueba Indol44 ºC
Producción de gas e Indol positivo+ + + + + +
Coliformes termotolerantes
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PRUEBAS IMViC PARA
IDENTIFICACION DE COLIFORMES
Fuente: ICMS. Segunda Edición. Editorial Acribia.
![Page 29: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/29.jpg)
Pruebas de identificación de organismos coliformes: IMViC
Gas en caldo lactosado
biliado a 44-45.5° C
Prueba de indol
Prueba rojo de metilo
Prueba de Vogues
Proskauer
Crecimiento en citrato
E. ColiTipo ITipo II
+-
+-
++
--
--
IntermediosTipo ITipo II
--
-+
++
-b-b
++
Enterobacter aerogenes
Tipo ITipo II
--
-+
--
++
++
Enterobacter cloacae
- - - + +
IrregularesTipo ITipo IITipo IV
-++
+--
++-
--+
--+
Fuente: ICMS
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NMP PARA AGUA POTABLE25 gr
MUESTRA +
225ml AP
INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.
10 ml
1 ml 0,1 ml
Serie de diluciones con 9ml de diluyente
10 -2
10 -3
10 -4
![Page 31: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/31.jpg)
NMP PARA AGUA DE MAR25 gr
MUESTRA +
225ml AP
Pre incubación: 35 -37 ºC por 3 horasIncubación a Baño María: 44,5°C x 21 a 23 horas
10 ml
1 ml 0,1 ml
Serie de diluciones con 9ml de diluyente
10 -2
10 -3
10 -4
CALDO: AL
FUENTE: MINISTERIO DE SALUD
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Pruebas de identificación de organismos coliformes: IMViC
Indol (+)Rojo de
metilo (+)
Voges Proskauer
(-)
Citrato (-)
![Page 33: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/33.jpg)
![Page 34: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/34.jpg)
![Page 35: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/35.jpg)
![Page 36: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/36.jpg)
INVESTIGACIÓN DE E. coli
FUENTE: NORMA ISO
![Page 37: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/37.jpg)
Uso de las Petrifilm:
Estas placas contienen un medio selectivo para E.coli coloreándose las colonias de azul violeta si esta esta presente, sin necesidad de realizas pruebas de identificación.
VENTAJAS: Evita errores humanos Ayudan a los procesadores de alimentos a muestrear
fácilmente, una detección rápida del microorganismo
MÉTODOS ALTERNATIVOS:
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PETRIFILM
![Page 39: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/39.jpg)
E.coli en MUG en presencia de luz UV
![Page 40: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/40.jpg)
EN NUESTRO
LABORATORIO…
UTILIZAREMOS EL MÉTODO CALDO LACTOSA 2% DE BILIS VERDE BRILLANTE, Y CONFIRMACIÓN EN MEDIO SÓLIDO
![Page 41: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/41.jpg)
MATERIALES
MUESTR
A
•Refresco presuntamente contaminado
DILUYENTE
•Agua peptonada
MEDIO
•Caldo lactosa 2% bilis verde brillante (brilla)
![Page 42: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/42.jpg)
PROCEDIMIENTO (ICMSF)
1ml 1ml10 -1
10 -2 10
-3 C/U con 9ml de
AP
C/U con 10ml de
Brilla
INCUBAR: 35 -37 ºC por 24 – 48 h.
VACIAR LA MUESTRA AL
BEAKER
25 ml
AP
Agregar 1ml a cada tubo
![Page 43: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/43.jpg)
1ra Lectura
VERIFICAR SI HUBIERA GAS Y TURBIDEZ
caldo brilla
+ + - -+ ----
INCUBAR:Con Agar ENDO: 48 horas a 35 – 37ºC
Sembrar en superficie tubos
positivos
Inocular con un asa los tubos positivos
INCUBAR:24 horas a 44ºC a baño maría
Realizar las pruebas de identificación: IMViC
![Page 44: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/44.jpg)
Luego de analizar la muestra de refresco, se obtuvo una cepa sospechosa para E. coli, y luego de las pruebas bioquímicas IMViC:
RESULTADOS
![Page 45: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/45.jpg)
Resultados
Prueba del INDOL
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol.Al añadir dos gotas del reactivo. Esperar 10 minutos para observar el color del halo formado.
Halo rojo: reacción +
![Page 46: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/46.jpg)
ResultadosPrueba del ROJO
DE METILO
Esta prueba se fundamenta en el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan de la fermentación de la glucosaLa fermentación n ácido-mixta
Reactivo prueba de RM: solución indicadora Rojo de Metilo
Halo rojo: reacción (+)
![Page 47: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/47.jpg)
ResultadosPrueba de VOGUES
PROSKAUER
Voges-Proskauer buscavía de fermentación del butanodiolGlucosa acetil-metil-carbinol butanodiolReactivo prueba de VP: Solución de naftol e K(OH)
Color marrón: reacción (–)
![Page 48: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/48.jpg)
ResultadosPrueba del
CITRATO SODICO
Determinación sobre la capacidad de un organismo de utilizar citrato como única fuente de carbono y energía. Únicamente las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y, al hacerlo, liberarán iones amonio lo cual basificará el medio. Sin crecimiento y color verde: reacción –
![Page 49: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/49.jpg)
- Tener todo listo antes de iniciar la práctica - No demorar al momento de realizar las
diluciones - Homogenizar bien las diluciones - Marcar las pipetas que se usan para cada
dilución
Sugerencias:
![Page 50: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/50.jpg)
I.C.M.S.F. 2000. Los Microorganismos de los Alimentos. Vol. I: Su significado y métodos de enumeración. 2a edición. Editorial Acribia, S.A. - Zaragoza (España).
Food and Drug Administration. 2001. Bacteriological Analytical Manual. 8th Edition. USA.
Youself, E. Ahmed; Carlstrom, Carolyn; “Microbiología de los alimentos Manual de laboratorio”;2003; Ed. Acribia.
Bibliografía:
![Page 51: Recuento de Coliformes Totales y Termotolerantes E COLI](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022052204/557203084979599169a4727c/html5/thumbnails/51.jpg)
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