Gisella Orjeda Mayo 2006 Introducción a la Genómica Gisella Orjeda.

Gisella Orjeda Mayo 2006

Introducción a la Genómica

Gisella Orjeda


Que es la Genómica?

• La genética estudia la herencia de los genes, uno a la vez. La Genómica trata de mirar todos los genes como un sistema dinámico, a través del tiempo, para determinar como interactúan e influencian las vías, redes biológicas, y la fisiología. Es mucho mas global. Es un proceso dinámico


Que es el secuenciamiento del ADN?

• El secuenciamiento del ADN es el proceso que determina el orden exacto de las bases que conforman un genoma.


Para que sirve?• Numero de genes que controlan un carácter, localización y función • Regulación génica• Organización de la secuencia de ADN• Tipos de DNA no codante, cantidad, distribución, contenido de información y funciones• Coordinación de la expresión génica síntesis de proteínas, y eventos post-translacionales. • Interacción de las proteínas en las maquinaria molecular compleja• Comparación entre la función génica predicha y la determinada experimentalmente • Conservación evolutiva entre organismos • Conservación de proteínas (estructura y función) • Estudio del Proteoma (contenido total de proteínas y función) en organismos • Correlación de SNPs (variaciones de una base entre individuos) con salud y enfermedad • Susceptibilidad a una enfermedad basados en la variación de la secuencia• Genes involucrados en caracteres complejos y enfermedades multigenicas


3,000’000,000 bp

La posibilidad de un esfuerzo coordinado para secuenciar el genoma humano se toco por primera vez en un meeting en la universidad de California en Santa Cruz en 1985.


Como se secuencia?

• http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/project/info.shtml#how


Avances técnicos que hicieron posible el secuenciamiento del

genoma humano• La polymerase chain reaction (PCR) que

permitió producir muchas copias de ADN rápida y precisamente

• Un método de secuenciamiento automatizado elaborado en base a la técnica de la PCR y el proceso de secuenciamiento desarrollado por Frederick Sanger en 1977


http://www.csun.edu/%7Ehcbio027/biotechnology/lec3/sanger.html


Añadir ddGTP, ddATP,ddCTP,ddTT, a cada uno de los tubos conteniendo el ADN de interés, luego de la reacción separarlos en un gel

Para secuenciar leer el orden de las bases desde la mas corta hasta la mas grande


Cartografiar el genoma o (mapear) involucra:

1. Cortar los cromosomas en fragmentos pequeños que puedan ser mantenidos, propagados y caracterizados.

2. Ordenarlos en sus posiciones correspondientes en los cromosomas.

Una vez que el mapeo se completa, el siguiente paso es determinar las bases de cada uno de los fragmentos que ha sido ordenado


Enzimas de restricción (Restricción incompleta)


Vectores

Vectores Caracteristicas Talla inserto

Plasmido E.coli- Introducidos por transfornacion 1-5 kb (electroporacion or heat shock)

Fago E.coli- Virus que infecta bacterias 10-15 kbIntroducido por transfeccion

Cosmido E.coli- Plasmido con “cos” sites para 30-45 kb el packaging en fagos lambda. Introducidos por infeccion en E. coli

Molécula de DNA que se origina de un virus, un plásmido o la célula de un organismo superior en la que otro fragmento de DNA de un tamaño apropiado puede ser integrado sin que el vector pierda su capacidad de auto-replicación

Los vectores introducen DNA en células hospederas, donde el DNA puede ser reproducido en grandes cantidades.


Cromosomas Artificiales : para el map-based cloning

Vector Caracteristicas Talla-inserto

BACs: E.coli- Basado en el F factor ocurre natural 100-300 kb mente. Estable, 1-2 copias por celula

TACs Contain T-DNA (w vir genes) so can be 100-300 kb

BiBACs: transformed into plants via Agrobacterium

PACs: E.coli- Basado en el genoma del fago-bacteria 100-300 kb P1 (un virus)

YACs: Cel. levadura (50-100 veces mas volumen < 1,000 kb que E. Coli). Usualmente inestablestienen re-arreglos (1

Mb)


Vector requirements

• Marcador de selección – Resistencia a ampicilina, kanamicina, hygromicina,

herbicidas, etc.– Permite que solo los clones recombinantes

sobrevivan

• Sitios de clonamiento múltiple (mcs)– muchos (únicos) sitios de restricción

• Los vectores que amplifican en E. coli:– Origen de replicación (Ori): requerido por el

plasmido para replicarse en la bacteria– Control of copy number (F factor plasmid):

reduce el numero de copias del plásmido en una célula dada para evitar problemas de re-arreglos (quimeras)


Tamaño del clon => tamaño de la genoteca

• Cálculo del numero de clones necesario para tener la probabilidad (P) de obtener una secuencia dada:

N = ln (1-P) / ln (1-f)

Donde f es la proporción del genoma en un clon y N es el numero de clones necesarios.

• Ejemplo– Cuantos clones BAC (con un inserto promedio de 150 kb) se

necesitan para tener una prob de 99% de contener todos los fragmentos génomicos posibles del tomate (talla del genoma 950,000 kb)?

– Con p < 0.01, N = 30,701 Con p < 0.05, N = 19,933

– Del Arroz (talla del genoma 430,000 kb)?

– Con p < 0.01, N = 13,199 Con p < 0.05, N = ??


Construcción de mapas físicos

• Los mapas físicos de construyen con arreglos continuos de clones con insertos grandes (YAC, BAC, PAC, etc) y alineándolos a un mapa de ligamiento genético

• Se hace el fingerprint (i.e.digestion con HindIII) de las genotecas grandes (10-20X) y los extremos de cada BAC se secuencian

• El patrón de restricción de los clones se aparea usando un programa que se llama FPC (fingerprint contig) que permite que los clones sean ensamblados en contigs

• Los Contigs se alinean a los mapas genéticos hibridándolos a marcadores o alineando informaticamente la secuencia de los marcadores a la secuencia de los BAC-end o YAC, PACS ETC.


Fig. 2: Chen et al. (2002) The Plant Cell 14:537-545

Esto es un contig


Fig. 1: Chen et al. (2002) The Plant Cell 14:537-545

Physical:Genetic map. Anchored BACs are shown in red, gaps in black, centromere in green.

Use of a relatively small number of genetically mapped markers is sufficient to anchor the BAC contigs to the genetic map. The gaps that remain usually consist of repetitive DNA that is either hard to clone or hard to sequence.

Strategy and status

November 2004

Sequencing Oryza sativachromosome 12

Chromosome 12 public data

• Genetic map 198 M– 6 non spécifiques

– 141 acc 5`

– 86 acc 3`

• Seq Bac-Ends Clemson

– 2 libraries (10.9X) :

HindIII

EcoRI

• FPC: rice.fpc Clemson fingerprinted Bacs

• Seq 11 Bacs (CNS)– markers

– Assigned to Contigs Clemson

• 322 EST mapped to K12

www.sanger.ac.uk/Software/Image

IMAGE

Duplication chr11-chr12 : 2.5 Mb

OSJNBa0009F13

OSJNBa0052H10

OSJNBA0039D03

BAC L

BAC F

BAC B

BAC A

BAC G

BAC I

BAC KBAC H

541 3 2

339 12 1 10

688 1 1 338 337 (7 clones séquencés affectés potentiellement au chr1) 336 1 1

335 14 3 (dont le H) 13

333 1 1 559 1 1 (K) 2

332 7 4 331 2 2

330 1 = 1 (I) 1

329 1 1

na 3 2

907 6 4

32 (ex 328) 3 1 (G) 2

489 5 1 4

326 6 1 (A) 3

343 4 3

679 2 2

14 1 (B) 1

325/978 8 2 (F et L) 8

298 chr11? (ex 299) 3 1 (E) 2

321/322 10 2 (C et D) 7 + 2

Contig de Clemson BACs Monsanto BACs Clemson BACs en MTP

19 94 15 (dont 11 CNS) 78

Strategy to determine the minimal tiling path

20Kb

Strategy to determine the minimal tiling path

OUR STRATEGY COMBINES

-Fingerprint Contig positioning by Blasts-Monsanto Bac positioning by Blasts- STC approach- Bac fingerprinting- Gap filling by Hybridisation

Minimum tiling path

RepeatMask Blasts ID > 95%

Blasts, Hybridationet Fingerprint

f r

BacEnds Clemson

markers

BACs Monsanto

BACs Genoscope

BAC participating at MTP

Fingerprint contig limitUnknown sequenceBac Clemson

Anchoring BACs and determining the minimal tiling path

Chromosome 12 Contig identification

Positioning Monsanto BACs on contigs

Sequencing strategy K12 rice

Hybridation

• Trois séries de filtres de haute densité (82944 clones)– 72 plaques 384 banque Clemson HindIII – 72+62 plaques 384 banque Clemson EcoRI +

10 plaques banque Monsanto

• 35mer Primer3

• [32P]dCTP

www.genome.clemson.edu/fpc/index.html

FPC takes as input a set of clones and their restriction fragments (called Bands) and assembles the clones into contigs.

SPOTTING de las dos genotecas e hibridación con los marcadores asignados al cromosoma 12

En una membrana de nylon de 20 cm x 20 cm se puede hacer el spotting de 72 placas de 384-pocillos cada una en duplicado

Por lo tanto 90% de los clones BAC pueden ser spotted

en tres membranas.

EL OBJETIVO ES ASIGNAR CLONES A LOS MARCADORESBASADOS EN LA HOMOLOGIA DE SECUENCIA

7

A

P

1 24

G

I II

III IV

V VI

2 6 12 2 3

1 10 4 11 12

9 6 10

7 8 11 3 5

1 5 9 4 8

A

P

1 24I II

III IV

V VI

G

2 6 12 2 3

1 10 4 11 12

9 6 7 10

7 8 11 3 5

1 5 9 4 8

Status physical mapping

• Number of markers used: 126• Number of anchored contigs: 37• 6 gaps closed with BacEnds from contig

extremities • Number of gaps 3 centromere and 2

telomeres

249/223 : 249/224250

S257

2

251

C15

56S

E603

77

252

R33

75G

1225

S105

20

405

G13

91

253 255a 107 257

E612

29

E300

09S

R61

7

S109

04

E603

77B

C61

563S

S107

04

C53

024S

S140

25

258 260 324 262 210 293 269

S131

26S

S100

43S

S143

6

E441

8S

C50

732S

E338

S

S116

79

C44

9S2

545

E324

6

E209

945

C20

8

C10

69

S861

L405

G14

06

R16

84

C90

1

Tel

263 264 265 266S1

0074

G40

2

C44

3

109K5K5

154

409

E605

56E6

0556

254

74

S132

87A

S132

87A

S620

5S6

205

259

S137

52

Updated 24/10/02

295

Chr 11- chr 12 DUPLICATION

C10

656S

C60

227S

R30

23R

3023

8.6

9.78.4 E508

28S

27.126.7 38.1

C11

324

C11

324

39.4 39.7

S473

6S4

736

40.6

42.741.2

C52

894

C52

894

E421

1E4

211

51.5

Y68

54R

51.851.8

C11

372

55.1 55.9 55.9 57.8

C11

831S

58.9 61.6

R10

818

R10

818

64.4

E404

7E4

047

E601

42E6

0142

E431

9E4

319

C53

919

C53

919

C53

903

C53

903

C01

85C

0185

E511

66E5

1166

S518

4S5

184

88.6

R17

09

91.4

C46

0

94.6

C87

95.1

R10

289S

R10

289S

S155

68S1

5568

E223

4E2

234

C52

936

R01

25R

0125

R40

38R

4038

97.397 99.7

C51

368

100.9 103.1100.9 109.5

Y28

24R

348

109.2

R17

59

107.4

S135

61

108.2

S110

76

108.7

:EST hyb.:EST hyb. :marker hyb.:marker hyb. :centromere:centromere:chr11:chr11:chr12:chr12

R22

19R

1869

E505

93S

E311

51SA

E288

9SC

S205

42S

R88

7

47 47 47.6 48.2 48.2 48.248.2 48.248.2 49.3

S215

11S

50.4

256C

6021

7C

6021

7

S647

7S6

477

S189

3S1

893

E100

37E1

0037

S162

19S1

6219

C52

663

C52

663

C30

362

C30

362

S144

274

S144

274

S104

11S1

0411

TelK8K8

325

339

375 281 b0070A21b0070A21 a0021D06a0021D06 b0074J13b0074J13

a0085J02a0085J02 Syd 393

49.3

434 255b

51.5

CENTROMERECENTROMERE

311 b0016C24b0016C24

a0017A21a0017A21 a0056I16a0056I16b0119N22b0119N22

71.2

Syd

a0028L05a0028L05

a0028L05a0028L05

40.3

PCRPCR

PCR

Syd

PCR

Syd : Syngenta data

GeneticGenetic mapmap

RiceRiceFPCFPCcontigscontigs

67.2 71.2 72.2 73 73 75.8 78.9

106.6

PCR

How we have eliminated gaps between contigs?

• Hybridisation with probes developed from BAC ends positioned at contig extremities

CHROMOSOME 12 SEQUENCING PROGRESS CHROMOSOME LENGHT 28.8 MbTILE LENGHT 27 MbTILE BACs 266 BACsSUBMITTED in PLN EMBL 214 BACsFINISHING 52 BACsGAPS 3 (centromere and 2 telomeres)

Nathalie CHOISNE, Gisella ORJEDA, Eric PELLETIER, Marcel SALANOUBAT, Jean WEISSENBACH and Francis QUETIERTech: Nadia DEMANGE, Agnes VIOLLET

GENOSCOPE and UMR 8030 GENOSCOPE/CNRS/Université d ’Evry, 2 Rue Gaston Crémieux CP 5706, 91057 EVRY Cedex, France

http://www.genoscope.cns.fr

The Team


Tamaño comparativo (Bases)

(levadura cromosoma 3) 350 K

Escherichia coli (bacteria) 4.1 Millones

El mas grande cromosoma de levadura 5.8 Millones

Levadura entera 15 Millones

El cromosoma humano mas pequeño (Y) 50 Millones

El cromosoma humano mas grande(1) 250 Millones

El genoma humano entero 3 k Millones

Tallas de los genomas


• E.coli 4.1 Mb• Levadura 15 Mb• Arabidopsis 125 Mb• Drosophila 137 Mb• Arroz 420 Mb• Fugu 365 Mb• Soya 1,100 Mb• Pollo 1,200 Mb• Maiz 2,500 Mb• Raton 2,700 Mb• Humano 3,200 Mb• Cebada 4,800 Mb• Trigo 16,000 Mb• Pino 20,000+ Mb


C-value paradox

• La talla del genoma no esta correlacionada con el numero • de genes o la complejidad biológica.

Species Physical size Genetic size Phys:Genetic Gene No. Arabidopsis 125 Mb 1200 cM 104 kb/cM 25,498 Rice 430 Mb 1800 cM 238 kb/cM ~50,000 Sorghum 760 Mb 1500 cM 500 kb/cM ~50,000 Tomato 950 Mb 1400 cM 680 kb/cM ?? Maize 2,500 Mb 1500 cM 1,660 kb/cM ~50-

100,000 Barley 5,300 Mb 1760 cM 3,000 kb/cM ~50,000

• Talla física de los genomas varia enormemente• Talla genética es mas o menos equivalente• Los grandes genomas tienen tasas talla-fisica: talla-genetica grandes• el numero estimado de genes varia y no es aun estable

18


Primero, mapas de organismos modelo


Que es un genoma modelo?Que es un genoma modelo?

• Interpretación de las agencias de financiamiento:

• Tiempo intergeneracional rápido, genoma pequeño, fácil de hibridizar (endo y cross) tamaño físico pequeño, en relación a especies importantes, fácilmente transformable, mapas genéticos y físicos de alta densidad.

11


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/


Info en genomas secuenciadoshttp://www.genomesonline.org/


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/


http://www.ensembl.org/


Anotación


Que hemos aprendido del genoma humano

• Tenemos 3164.7 million de bases nucleotídicas (A, C, T, and G). • El gen promedio tiene mas o menos 3000 bases, pero el tamaño

varian enormemente, el mas grande es el de distrofina con 2.4 million de bases.

• Se estima que el numero total de genes es de 30,000 —mucho menos que previos estimados de 80,000 a 140,000 que fueron basados en extrapolaciones de areas ricas en genessin contar las areas pobres.

• Casi todas (99.9%) las bases nucleotidicas son exactas en toda la gente.

• No conocemos las funciones del 50% de los genes descubiertos.


Separar la paja del grano

• Menos del 2% de genoma codifica proteinas. • Las secuencias repetidas que no codifican por

proteinas ("junk DNA") forma por lo menos 50% del genoma humano.

• Se piensa que la secuencias repetidas no tienen una funcion directa pero ellas nos enseñan sobre la estructura y la dinamica cromosomica. En el tiempo los “repeats” re-modelan el genoma re-arreglandolo, creando nuevos genes y modificando y barajando los existentes.


Como esta dispuesto

• El genoma tiene sectores geno-densos "urban centers" que estan compuestos predominantemente de G y C.

• En contraste los sectores geno-pobres so ricos en A y T. Estas regiones GC y AT pueden verse como bandas claras y oscuras en un cariotipo

• Los genes parecen estar concentrados en áreas al azar a lo largo del genoma con espacios vastos de DNA no codante entre ellos.

• Existen segmentos de hasta 30,000 C y G que se repiten una y otra vez en general alrededor de areas ricas en genes y que forman una barrera entre los gnees y el "junk DNA." Se piensa que estas islas CpG ayudan a regular la actividad génica.

• El cromosoma 1 es el que tiene mas genes (2968), y el Y, el que tiene menos (231).


• El próximo paso: Functional Genomics


• Investigando la relacion entre genotipo y fenotipo

• Organizacion del Genoma• Prediccion genica• Genomica comparative• Regulacion genica


Aquí en Cayetano

• Positional cloning of 4HL stripe rust resistance quantitative trait loci in barley

• Genómica Funcional de las Variaciones Naturales en dos genes importantes para la calidad del fruto de la Chirimoya (Annona cherimolia)

• Identificación de genes y Eco-tilling para la resistencia durable a enfermedades de la cebada en Latinoamérica

• Differential Display (DD) para el descubrimiento de genes candidatos que participan en la tolerancia a sal y sequia.

• Hacia la Pesca y Analisis de Genes de Tolerancia a Sales, Sequia y Heladas en Granos Andinos por "Differential Display" y Real Time PCR

• Seleccion de Cepas de Acidiothiobacillus Ferrooxidans Productoras de Biofertilizantes por Ecotilling

Gisella Orjeda Mayo 2006 Introducción a la Genómica Gisella Orjeda.

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