Fluorescencia de proteínas

• Fluorescencia intrínseca (emisión dominada por trp)

• Marcado con sondas fluorescentes (RET, anisotropía)

•GFP y derivados(visualización, RET)

Fluorescencia de proteínas

Herramienta útil para dar información de• Estructura• Dinámica

• Conocer estructura de la proteína nativa, relacionar estructura con su actividad, su función

• Detectar cambios de estructura, que pueden llevar a alterar su función

• Cambios de estructura al interaccionar con otras macromoléculas o con ligandos

Por ejemplo:• Plegamiento / desnaturalización• Asociación / disociación

Phe Abundancia: 3.5%

λex = 260 nm, λem= 282 nm (Q.ε ~ 5)

Insensible al entorno

Tyr Abundancia: 3.5%

λex = 275 nm, λem= 303 nm (Q.ε ~ 220)

Insensible al entorno, quencheable

Ionizable, tirosinato emite (<Q)

Trp Abundancia: 1.1%

λex = 295 nm, λem= 350 nm (Q.ε ~ 770)

Sensible al entorno, quencheable

Varias τ

Emisión de Tirosinato

Emisión normalizada

de Y a pH 7 y a pH 12

λex = 280 nm

pKa (Y) = 10.3

Emisión del tirosinato a > λ (350 nm)

pero bajo rendimiento

Emisión de Tirosinato excitado

Emisión de Y a pH 6 en buffer acetato

λex = 280 nm

pKa (Y) = 10.3

pKa (Y*) = 4 - 5

Emisión del tirosinato a > λ (340 nm) pero bajo rendimiento

Emisión de Tirosina / Tirosinato

Emisión de proteínas que no contienen triptofanos

Emisión del tirosinato a > λ (350 nm)

puede confundirse con emisión de W

Emisión del W es sensible al efecto del solvente

Emisión de indol en mezclas ciclohexano-etanol

λex = 280 nm

Ciclohexano - no enlace H

Etanol – solvente más polarEmisión del W es sensible a efecto general del solvente y efecto específico del solvente

Emisión del W es sensible al entorno localUbicación de W en la proteína

1- azurin

2- ribonucleasa

3-Staphylo nucleasa

4- glucagón

Blue W ------------------------ Red W

Emisión del W proteico es sensible al entorno local

• Es claro el corrimiento al rojo al pasar el W a un entorno más polar

• No existe clara correlación con la Intensidad en el máximo (Q, τ)

• la intensidad de emisión de los W de una proteína depende de la estructura particular de esa proteína

• en general, mayor F en entorno más hidrofóbico, o sea, > F para blue W

Centro de masa espectral: <λi> = ∑ Fi λi / ∑ Fi

Emisión del W es sensible al entorno localPlegamiento de proteína

Emisión del W es sensible a desactivación bimolecular

Desactivación por quenchers solubles indica mayor exposición del W al solvente

Emisión del W es sensible a desactivación bimolecular

1- glucagón (1 W bien expuesto)

21- apozurin (1 W interior)

RET en fluorescencia intrínseca

Solapamiento espectral

Distancias entre residuos ~ 24 Å

F Y W

RET entre Tyr y Trp

hIFNγ homodímero, cada subunidad tiene 4Y y 1W

RET entre Tyr y Trp

La Eficiencia de RET Y → W se calcula a partir de espectros de excitación

Qλ / Q295 λem = 350 nm

Si E = 100% → Q(W)independiente de λ exc, Q rel = 1

Si E = 0% → Q rel <1

Emisión de Triptofano

•Relajación por solvente exposición al solvente

interacción con entorno proteico

• Quenching dinámico quencher externo

quencher = grupos cercanos de la proteína(Lys, His, COOH, amida, cistina)

• RET F → Y → W

blue W → red W

W → aceptor

• Anisotropía (τ ~ 3 – 4 ns, φ cortos, flexibilidad de dominios proteicos)

Emisión de proteínas con varios W

• En proteínas que no contienen W, insertar W en determinada posición

• Insertar análogo de W con otra emisión

• Insertar aminoácidos no naturales fluorescentes

• Iss (Intensidad de F en estado estacionario)

Distinguir grupos de W (quenching, fracción accesible)

Mutantes con 1 solo W

• TRF (Fluorescencia resuelta en el tiempo) Ajuste multiexponencial, distintas vidas medias / distribución

GFP = Green Fluorrescent Protein

Formación espontánea del fluoróforo al plegarse

Fotoestables

Exc. y Em. en el visible

Proteínas de fusión con GFP para marcado intracelular

Fluoróforo se forma espontáneamente, no necesita agregados (a diferencia de proteínas fitofluorescentes de organismos fotosintéticos, apoproteina + pigmento)

Tyr - emisión desde una única transición electrónica (Lb)

Trp - emisión posible desde 2 transiciones electrónicas isoenergéticas con distinta orientación del momento dipolar (La no estructurado, r alto, Lb estructurado, r bajo)