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Juan Luis Castillo N., T.M. MsCLaboratorio de Citometría de Flujo

Hospital del Trabajador Concepción.Departamento de Especialidades Médicas

Facultad de MedicinaUniversidad de Concepción

Miércoles 06 de Septiembre de 2006

www.oncoinmun.co.cl

Inmunofenotipificación Celular:Leucemias y Linfomas por Citometría de Flujo

¿QUE ES LA QUE ES LA CITO / METRIACITO / METRIADE FLUJODE FLUJO??

La Citometría de Flujo es una tecnología que permite la

“medición simultánea de múltiples características físicas y químicas de

células en suspensión”

¿QUE INFORMACION ENTREGA UN CITOMETRO DE FLUJO SOBRE UNA CELULA?

1.- Su tamaño.2.- Su granularidad o complejidad

interna.3.- Evaluación de características químicas:

• Fluorocromos

• Anticuerpos conjugados con fluorocromos

FACS: Fluorescence activated cell sorter

Flow Cell

InjectorTip

FluorescenceFluorescencesignalssignals

FocusedFocusedlaserlaserbeambeam

Sheathfluid

FLUOROCROMOSFLUOROCROMOSFluoresceinFluorescein(FITC)(FITC)

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Relat

ive I

nten

sity

Wavelength

ProteinProtein

ExcitationExcitation EmissonEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

ExcitationExcitation EmissonEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

PhycoerytherinPhycoerytherin(PE)(PE)

Protein

PMT

PMT

PMT

PMT

DichroicFilters

BandpassFilters

FlowFlow Cytometry Cytometry OpticsOptics

Láser

1

2

3

4

Flow cell

FORMA DE PRESENTACION DE DATOS

• Histograma

• Gráfico de Puntos (Dot Plot)

• Gráfico de Contorno (Countour Plot)

• Gráfico Isométrico (3D)

• Gráfico de Densidad (Density Plot)

Citometría de flujo: mediciones

L

M

G

SCATTER FLUORESCENCIA IMAGEN

“GATE”

HISTOGRAMA(Un Parámetro)

0

coun

ts

FL1

Autofluorescenciay/o

control isotipo

M1

ESTADISTICA DE CUADRANTES(Dos Parámetros)

Autofluorescenciay/o

control isotipo

0

FL2

FL1

-,+

-,- +,-

+,+

0

FL2

FL1

1 2

3 4

ESTADISTICA DE CUADRANTES(Dos Parámetros)

Procedimiento St.:

• 100 µµµµL de sangre total

• 10 µµµµL del Ac. conjugado

• Incubar por 10-15 minutos RT

• Añade el lisador

• Leer en un citómetro de flujo

PREPARACION DE LA MUESTRAPREPARACION DE LA MUESTRA

PROCESO DE ANALISIS DE UNA MUESTRA

1. CALIBRACION

2. ADQUISICION

3. ANALISIS

CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes

• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidía de ADN y Ciclo Celular• HLA-DR en monocitos• Estudio de Función Neutrofílica• Inmunofenotipo de macrófagos intestinales• Cuantificación de moléculas• Estudio de HLA-B27• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares

INMUNOFENOTIPIFICACION DE LEUCEMIAS

“Los distintos tipos de leucemias son un grupo heterogéneo de patologías resultantes de una

proliferación descontrolada de una o más tipos celulares hematopoyeticos tanto en médula ósea

como sangre periférica”

Inmunofenotipo de Leucemias y Linfomas Hematopoiesis

PLURIPOTENTSTEM CELL

COMMITTEDPROGENITOR

CELL

RECOGNIZABLE BONE MARROW

PRECURSOR CELL

MATURE BLOOD CELL

myeloblastmonoblast

pronormoblast red cell

neutrophilmonocyte

basophil

platelet

CFU-Baso

CFU-Eos

CFU-GM

BFU-E/CFU-E

eosinophil

pre-T

pre-B

myeloidprogenitor

cell

lymphoidprogenitor

cell

lymphoblast

lymphoblast

T-cell

B-cell

& plasma cell

MIXED PROGENITOR

CELL

CFU-Meg megakaryocyte

pluripotentstem cell

RETENCION DE ANTIGENOS

Células malignas frecuentemente conservan

antígenos asociados con la célula normal a

partir de la cual fueron derivados

CD19 CD19

CELULA PRE-B NORMAL

CELULALEUCEMICA

Transformación

Maligna

CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA)

•LLA-B :-BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19.-BII Común : CD10.-BIII Pre B: clg.-BIV Madura : slg

•LLA-T :-TI-proT: CD7-TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8-TIII-Cortical: CD1a-IIV-Madura: CD1a y CD3mb

•LMA :-LMA-M6 : glicoforina A-LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b-LMA-M3 : HLA-DR(-)-LMA-M4 : HLA-DR(+)

CD34

HLA-DR

CD15

CD34

CD117

TdTCD10(CALLA)

CD1a

CD34

CD117

TdTCD10(CALLA)

Ig cit.

Ig sup.

Definir grado de madurez

CD13

CD33

MPO

CD3c

CD3m

CD7CD2

CD19

CD20

CD79ααααCD22

Definir linaje

LMALLA-TLLA-BPropósito

Leucemias Agudas: Definición de Linaje y Grado de Madurez.

Evaluación de linfocitosis de etiología no determinada.

Aplicaciones

INMUNOFENOTIPO DE LEUCEMIAS

Identificar desordenes linfoproliferativos crónicos de células T y B.

Diferenciar entre leucemia linfoblástica y leucemia mieloblástica.

Aplicaciones


Subtipificar inmunológicamente leucemias agudas.


Es fundamental para definir línea celular.

Cytometry (CCC)34:39-42 (1998)

Útil en monitorizar Leucemias Linfoblástica Aguda

(LLA) y Leucemia Mielobástica Aguda.


Subclasificación Inmunológica de LLA e Identificación de fenotipos Mieloides (valor pronóstico).


Valor pronóstico


Modalidad Diagnóstica Primaria en síndromes Linfoproliferativos crónicos (Subclasificación

clínica y Pronóstico).


Valor diagnóstico en Gammapatias monoclonales (Enf. Residual).

• Paciente sexo femenino• 45 años• Sangre periférica• Compromiso general severo• Falla hepática

• Inmunofenotipo normal• Paciente fallece Características normales

• Sexo Femenino• 18 años• Médula ósea

LLA-B (BIII: pre B)

• Paciente sexo masculino• 43 años• Dgto. Leucemia Aguda

CD10CD19CD34HLA-DR

CD5CD33CD13CD3CD16+56MPOCD14

CD20

Positivo Negativo Positivo Débil

Leucemia LinfoblásticaDe Línea B (B-II: Común)

• Paciente sexo masculino• 6 años 5 meses• Medula ósea

Leucemia Linfoblástica de tipo B-II (Común), con expresión mieloide aberrante.

CD10CD19CD34CD33CD13HLA-DRTdT

CD20CD5CD3CD8CD16+56MPOCD14


• Paciente sexo masculino• 5 años 8 meses• Medula ósea

LeucemiaAgudaLínea T (T-IV madura)

CD10CD5CD2CD3CD7CD8CD4

CD19CD20CD33CD13CD16+56MPOCD34HLA-DR


Leucemia Mieloide Aguda

CD13CD33CD34CD56MPOHLA-DR

CD19CD20CD16TDTCD5CD3CD4CD8CD10


Leucemia Mieloide Aguda

CD33CD34HLA-DR

CD19CD20CD13TDTCD5CD3CD4CD8CD10


MPO

• Paciente sexo femenino• 78 años• Sangre periférica • WBC:169.000.

Sugerente de una Leucemia PromielocíticaHipogranular M3 HLA-DR (-)

CD33CD13CD56MPO

CD10CD19CD20CD5CD3CD34

CD14HLA-DR


• Paciente sexo femenino• 80 años• Diagnóstico: Proceso

linfoproliferativo crónico

Leucemia Linfoblática de Línea B (B-III - pre B)

CD10CD19CD20CD34CD33HLA-DR

CD5CD13CD3CD16+56MPO

Positivo Negativo Positivo Débil• Paciente sexo masculino• 21 años• Sangre periférica

Leucemia Linfoblástica de Línea T (Pre T)

CD5CD4CD8CD2CD7CD3cTdT

CD3CD10CD19CD20CD34CD33CD13CD16+56HLA-DRMPOCD14

Positivo Negativo Positivo Débil• Paciente sexo masculino• 5 años 8 meses• Medula ósea

Leucemia Aguda Línea T (T-IV madura)

CD10CD5CD2CD3CD7CD8CD4

CD19CD20CD33CD13CD16+56MPOCD34HLA-DR


• 30/12/2004• Sangre Periférica• Sexo femenino• 40 años

36 % 37 %

10 %

37 %

42 %

34 %

36 %

78 %

LLA-B (BIII- pre B)

• Misma Paciente• 08/02/2006• Medula ósea• Sexo femenino• 40 años

Sin evidencia de población patológica

• Misma Paciente• 18/05/2006• Medula ósea• Sexo femenino• 41 años

En el contexto de una muestra de médula ósea hipocelular, la población celular analizada, presenta características inmunofenotípicas sugerentes de una Leucemia Linfática Aguda de línea B (B-III PreB).

Trastorno linfoproliferativo crónico de línea B, con expresión clonal de cadenas livianas de inmunoglobulinas del tipo kappa.

CD19CD20kappaHLA-DR

CD10CD3CD4CD7CD16+56CD34TdTCD13CD33CD14MPOlambda


• Sexo masculino• 57 años• Sangre periférica• 13 Febrero 2004

Trastorno linfoproliferativo crónico de línea B, con expresión clonal de cadenas livianas de inmunoglobulinas del tipo kappa.

Linfoma del Manto

Leucemizadoetapa IV-B

• Mismo paciente• 59 años• Sangre periférica• 08 de junio 2005

Dgto. y TTO

CD19CD20kappaHLA-DR

CD10CD3CD4CD7CD16+56CD34TdTCD13CD33CD14MPOlambda


Linfoma de células linfociticas pequeñas de bajo grado de malignidad (línea B con expresión clonal de cadenas livianas del tipo kappa)

• Sexo femenino• 42 años• Julio 2001• Medula ósea

37 % células

CD19CD20kappa

lambdaCD10CD3CD4CD7CD33CD34CD13CD14HLA-DR


Linfoma de células linfociticas pequeñas de bajo grado de malignidad (línea B con expresión clonal de cadenas livianas del tipo kappa)

CD19CD20kappa

lambdaCD10CD3CD4CD7CD33CD34CD13CD14HLA-DR


• Misma paciente• 44 años• Octubre 2002• Medula ósea

9.6 % células

• Misma paciente• 45 años• Agosto 2003• Medula ósea

Medula ósea normal

• Misma paciente• 46 años• Abril 2004• Medula ósea

Medula ósea normal

• 30/12/2004• Sangre Periférica

• 18/05/2006• Medula ósea

LLA-B (BIII- pre B)LLA-B (BIII- pre B)

Esta población de blastos, presenta características de expresión de CD45 y CD13, diferentes a las encontradas en el estudio realizado el 30 de diciembre de 2004, lo que podría indicar que NO se trata de

la misma población celular, detectada en esa ocasión.

• 19/05/2006• Medula ósea• Sexo Masculino• 56 años• Diagnóstico ?????

82 % 17 %

4 % 95 % 36 % 12 %

37 %

60 %

81 %56 %

84 %

82 %

85 %

36 %

11 %

CD19CD13, CD33CD34MPOHLA-DRCD14

CD10, TDTCD4, CD8CD3CD16+56CD20

Positivo Negativo

CD13, CD33CD34MPOHLA-DR

CD19, CD20CD10, TDTCD4, CD8CD3CD16+56CD14

Positivo Negativo

R1 15.53 %R2 6.31 %



Positivo Negativo



Positivo Negativo

R1 15.53 %R2 6.31 %

1. Leucemia MielomonocíticaAguda

2. Leucemia Mieloblástica Aguda3. Síndrome Mielodisplásico

Leucemizado



Positivo Negativo



Positivo Negativo

R1 15.53 %R2 6.31 %



Leucemizado

1. Blastos regenerativos de tipo mieloide, con poca granularidad

2. Blastos regenerativos del tipo basófilos

3. Leucemia Mieloblástica Aguda sin Maduración

4. Leucemia Mieloblástica Aguda con maduración

5. Leucemia Basófila Aguda



Positivo Negativo



Positivo Negativo

R1 15.53 %R2 6.31 %



Leucemizado

1. Blastos regenerativos de tipo mieloide, con poca granularidad

2. Blastos regenerativos del tipo basófilos

3. Leucemia Mieloblástica Aguda sin Maduración

4. Leucemia Mieloblástica Aguda con maduración

5. Leucemia Basófila Aguda

• En su conjunto la muestra analizada PODRÍAcorresponder a un trastorno mieloproliferativobifenotípico

• No se puede descartar la presencia de otro inmunofenotipo celular no identificado, ni de un sustrato de base del tipo mielodisplásico

• Citometría de flujo:

• Principios básicos.

• Presentación de datos.

• Inmunofenotipificación de leucemias y linfomas:

• Utilidad y clasificación.

• Inmunofenotipo normal.

• Casos clínicos reales.

Tópicos Revisados

Juan Luis Castillo N., T.M. MsCLaboratorio de Citometría de Flujo

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Inmunofenotipificación Celular:Leucemias y Linfomas por Citometría de Flujo

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