FISIOLOGÍA BACTERIANA

CRECIMIENTO BACTERIANO

La replicación de una bacteria es el resultado de una serie de procesos metabólicos ordenados y que conducen a la FISIÓN BINARIA.

Crecimiento bacteriano abarca tres grandes áreas de estudio:•El METABOLISMO BACTERIANO, genera el material celular a partir de nutrientes simples presentes en el medio.•La REGULACIÓN, coordina centenares de procesos metabólicos y permite la síntesis coordenada y eficiente de los componentes y estructuras de las bacterias.•La DIVISIÓN CELULAR, es la formación de dos células hijas independientes a partir de una única célula madre.

METABOLISMO Es la suma de todos los procesos químicos que ocurren en un organismo.- Catabolismo: conjunto de procesos químicos celulares que liberan energía.- Anabolismo: conjunto de procesos químicos celulares que utilizan energía.

-Una ruta metabólica es una secuencia de reacciones químicas intracelulares catalizadas por enzimas.-Las enzimas son codificadas por los genes.

METABOLISMO BACTERIANOTiene muchos procesos semejantes a los de las células

eucariotas.PARTICULARIDADES:•Metabolismo adaptado para el crecimiento veloz. Es entre 10 y 100 veces más rápido que en células humanas.•Tienen mayor versatilidad en cuanto al tipo de nutrientes que puede utilizar para producir energía.•Mayor versatilidad en la utilización de oxidantes y no están limitadas al solo uso del oxígeno.

•Gran diversidad de requerimientos nutricionales ya que no todas poseen todos los caminos biosintéticos. Ayuda para la identificación.•Sintetizan macromoléculas por mecanismos menos engorrosos. Síntesis de Mureína, LPS y Acidos teicoicos son procesos únicos de las bacterias.

Aerobicas.Anaerobicas facultativas.Anaerobicas estrictas.

COMPLEJIDAD DEL METABOLISMO BACTERIANOPor medio de 2000 reacciones metabólicas diferentes la bacteria puede sintetizarse a si misma y generar la energía que necesita para procesos como la Motilidad y Transporte Activo.

REACCIONES METABOLICAS DE LA BACTERIA:•Reacciones de abastecimiento.•Reacciones de biosíntesis.•Reacciones de polimerización. •Reacciones de ensamblado.

REACCIONES DE ABASTECIMIENTOProveen la energía y los 12 precursores que la bacteria necesita para las reacciones biosintéicas.

Precursores: Glucosa-6-P, Fructosa-6-P, Pentosa-5-P, Eritrosa-4-P, triosa-P, 3-Fosfoglicerato, Fosfoenol-piruvato, Piruvato, Acetil-CoA, alfa-Cetoglutarato, succinil-CoA y oxalacetato.

CO2 O2 Agua …. Son los únicos nutrientes que entran por difusión simple a las bacterias.

Los nutrientes utilizan Difusión facilitada y transporte activo para ingresar.

FERMENTACIÓN Y RESPIRACIÓN

Hidratos de Carbono y otras moléculas: Fuente de Carbono y Energía.

GLUCOLISIS

RESPIRACIÓN(no siempre es el oxigeno el aceptor de electrones.)

FERMENTACIÓN (poco eficiente)GLUCOSA

Acido Pirívico

ATP

NADH

C.C

Acetil CoA

ATP

CO2

NADH

Electrones-Cadena Respiratoria

ATP

O2

H2

O

Acido Pirúvico o derivado

FERMENTACIÓN

Productos finales de la fermentación:Ej. Acido láctico.

NADH

RESPIRACIÓNCARACTERISTICAS - fosforilación oxidativa ( ADP + P - ATP)- Requieren una cadena de transporte de electrones- Pueden ocurrir en presencia de oxígeno (respiración aeróbica) o en su ausencia (respiración anaeróbica).- Tiene como aceptor final de electrones un compuesto inorgánico

RESPIRACION AEROBICA:- El aceptor de electrones es el oxígeno.- Utiliza la cadena de transporte de electrones para generar un gradiente de protones imprescindible para que las ATPsintasas formen ATP.

RESPIRACION ANAEROBICA:Existen bacterias (por ej. Pseudomonas o bacillus ) que utilizan aceptores de electrones distintos al oxígeno.

Aceptor de electrones: NO3- (productos: NO2

- N2 N2O)

FERMENTACIÓN CARACTERÍSTICAS- fosforilación a nivel de sustrato (citoplasma)- no necesita cadena de transporte de electrones (CTE)- utiliza como aceptor final de electrones una molécula orgánica.- El ATP se forma por donación de ATP de un fosfato de alta energía a partir de un producto intermedio fosforilado.

REACCIONES DE BIOSÍNTESIS

A partir de 12 precursores se sintetizan Aminoácidos, nucleótidos, hidratos de carbono, aminoazúcares, ácidos grasos y otras moléculas que son unidades necesarias para la síntesis de macromoléculas.

Además de la fuente de Carbono, las bacterias necesitan para la biosíntesis: Grandes cantidades de NADPH, ATP, Nitrógeno amínico y una fuente de Azufre.

Las moléculas que no pueden ser sintetizadas por una bacteria, obligatoriamente la obtienen del medio. SULFONAMIDAS: Inhibe la síntesis de Acido fólico en las

bacterias por unirse (IC) a la enzima que sintetiza Ac fólico a partir de PABA (compuesto Esencial para las bacterias)

REACCIONES DE POLIMERIZACIÓN REPLICACIÓN: Comienza siempre en un mismo sitio oriC.Síntesis del ADN bidireccional. Adición de nucleótidos en dirección 5’-3’.TRANSCRIPCIÓN: La diferencia con eucariotas es que todas las formas de ARN (mensajero, transferencia, ribosomal) son sintetizados por la misma ARN polimeraza bacteriana. Además no hay transporte de ARNm porque no hay membrana nuclear.TRADUCCIÓN: Síntesis de proteínas. Diferencias con eucariotas: •Inicio de traducción requiere número menor de proteínas.•ARNm policistrónico: Cada ARNm transcribe más de un gen, por lo que sintetiza más de una proteína.•No requiere ni procesamiento ni transporte de ARNm.•Traducción transcurre simultánea y a igual velocidad que la transcripción. Alta eficacia del proceso.•OTRAS moléculas polimerizan (aunque se sintetizan en el citosol) en la membrana citoplasmática: Peptidoglicano (mureína), LPS, Fosfolípidos y polisacárido Capsular.

REACCIONES DE ENSAMBLADO

ESPONTÁNEO: Autoensamblado (Ej: flagelos y ribosomas)

ESPECIAL: Mediado por mecanismos específicos de ensamblado guiado (algunas moléculas se sintetizan en el lugar de ensamblado y otras en el citosol y luego se ensamblan en su lugar..

DIVISIÓN CELULARFISIÓN BINARIA: Al azar se forman dos células hijas de una célula madre.

Más de 30 genes están involucrados en este proceso.

Muchas bacterias tardan 20 min en replicar su genoma a 37ºC. Las células hijas heredan cromosomas que ya están parcialmente replicados.

Complejo sistema de regulación para que se termine un ciclo de replicación y las células hijas sean ambas viables.

DESARROLLO DE LAS BACTERIAS EN CULTIVO

INÓCULO: Introducción de células bacterianas viables en un medio de cultivo líquido o sobre la superficie de un medio sólido.CULTIVO: Se llama de esa manera a un conjunto o población de bacterias que crecen en un medio determinado. Si es homogénea hablamos de un cultivo puro (población de la misma cepa de la misma especie).COLONIAS: Pequeñas masas visibles que forman las bacterias diseminadas mecánicamente sobre la superficie de un medio sólido cuando se replican en un tiempo determinado.CLON: Cuando las bacterias de una colonia derivan de una única célula.UFC: Puede estar compuesta por una bacteria o un cúmulo de bacterias y al crecer sobre medio sólido son capaces de generar una colonia aislada.DENSIDAD: Cuando hacemos referencia al contenido de bacterias en un cultivo líquido.

CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO

La curva del crecimiento bacteriano resulta de la representación gráfica de la determinación periódica del número de células viables por mililitro que existen en un medio líquido inoculado con células microbianas provenientes de un cultivo que ha crecido previamente hasta la saturación.

Replicación bacteriana en medio líquido depende de:•La especie bacteriana.•La composición del medio de cultivo.•La temperatura.

TMG: 37ºC entre 30 y 60 min.

106 UFC/ml: Turbidéz

Psicrófilas: Bacterias que crecen a bajas tºTermófilas: Bacterias que crecen a altas tºMesófilas: Bacterias que crecen entre las tº de los otros dos grupos extremos (casi todos los patógenos del hombre).

FASE DE LATENCIA

FASE EXPONENCIAL

FASE ESTACIONARIA

FASE DE DECLINACIÓN

densidad

FASE DE LATENCIA:

Este primer período del cultivo consiste en la adaptación de las células microbianas a su nuevo ambiente. En esta fase, las células microbianas se encuentran empobrecidas en cuanto a enzimas y metabolitos vitales para un óptimo uso de los nutrientes del medio hasta que alcanzan las concentraciones necesarias de estos componentes para reiniciar el crecimiento.Este periodo se puede prolongar en el caso de que el medio de cultivo previo y las condiciones actuales resulten tan diferentes que las células sean genéticamente incapaces de sobrevivir, por lo que sólo unas cuantas mutantes podrán subsistir, y obviamente se requerirá más tiempo para que éstas se multipliquen lo suficiente y sea notorio el aumento de células.

FASE LOGARÍTMICA O EXPONENCIAL:

Una vez adaptadas, las bacterias crecen hasta que alcanzan rápidamente la máxima velocidad de replicación. La velocidad de replicación es constante y la proporción de bacterias que mueren es mínima.Se sintetiza nuevo material celular a una tasa constante, pero éste material es en sí catalítico y la masa aumenta de manera exponencial. Esto continua hasta que uno o más nutrientes se agoten, o hasta que se acumule tal cantidad de metabolitos tóxicos que se inhiba el crecimiento. El oxígeno suele ser el limitante para los organismos aerobios: cuando la densidad bacteriana es de aproximadamente 1 x 107/ml es necesario aumentar el ingreso de oxígeno mediante agitación o burbujeo ; pero cuando la concentración alcanza 4 o 5 x 109 bacterias/ml, la tasa de difusión de oxígeno no puede satisfacer las demandas aun en un medio aireado, por lo que el crecimiento disminuye progresivamente.

N=No*2rN: número total de bacterias después de “r” replicaciones y a partir de un inóculo inicial No

FASE ESTACIONARIA MÁXIMA.

Ante el agotamiento de nutrimentos en el medio, cambio de pH o la acumulación de metabolitos tóxicos, el ritmo de crecimiento disminuye y se alcanza una fase estacionaria de crecimiento.Las bacterias se adaptan a las nuevas condiciones del medio y el ritmo de crecimiento ahora equivale al de muerte bacteriana.Debemos considerar que, para una célula microbiana, muerte significa la pérdida irreversible de la capacidad para reproducirse (crecer y dividirse), lo cuál se comprueba cuando una célula es incapaz de producir una colonia en cualquier medio. Entonces, designar a una célula microbiana como muerta no implica su destrucción física.La duración de esta fase depende de la naturaleza del microorganismo y de las condiciones del medio.

FASE DE DECLINACIÓN:

Esta fase, también conocida como fase de muerte, representa el deterioro y disminución de la densidad de células vivas debido al aumento progresivo de la tasa de mortalidad, la que tarde o temprano alcanza un valor sostenido.Por lo general, una vez que la mayoría de las células ha muerto, la tasa de mortalidad disminuye bruscamente, por lo que un número pequeño de sobrevivientes pueden persistir en cultivo por meses o años. Dicha persistencia puede deberse a que las células consiguen crecer gracias a los nutrientes liberados por las células que mueren y se lisan, observándose recambio celular.

REGULACIÓN Y ADAPTACIÓNReacciones metabólicas: Forma coordinada.

Para adaptar su metabolismo a las condiciones del medio: Sistemas de Regulación•Control de la actividad enzimática (enzimas alostéricas).•Control de la expresión génica (modifican la cantidad de diferentes enzimas que contienen). Ocurre generalmente al comienzo de la transcripción. Existen represores (regulador proteico) que se une al operador del operón (unidad de transcripción) para inhibir la transcripción. En algunos casos existen correpresores (se unen al represor) que son ligandos de enzimas alostéricas y se comportan como inductores. Las proteínas que se necesitan para el inicio de la transcripción son Activadores.•En general esto sirve para soportar cambios ambientales y stress.Regulon: grupo de genes sujeto al regulador. (Sist. de represión catabólica: Para que usen Glucosa cuando está presente. Enzima regulatoria: CRP y AMPc como ligando inductor. AMPc bajo cuando se degrada Glucosa).ADAPTACIÓN: SOS, Esporulación y quimiotaxis.

GENÉTICA BACTERIANA

Genotipo: es en conjunto, la totalidad de información a nivel genómico que codifica para las características de un organismo.

Fenotipo: es el conjunto de características que realmente se expresan en un organismo. Es un reflejo del genotipo, aunque no siempre refleja la totalidad del mismo.

•Gen: segmento de ADN que contiene Gen: segmento de ADN que contiene toda la información necesaria para la toda la información necesaria para la expresión controlada de una proteína.expresión controlada de una proteína.

•Transcripción: es el proceso mediante Transcripción: es el proceso mediante el cual la información contenida en una el cual la información contenida en una secuencia de ADN se transmite a una secuencia de ADN se transmite a una molécula de ARN.molécula de ARN.

•Traducción: es el proceso por el cual Traducción: es el proceso por el cual a partir de una molécula de ARN se a partir de una molécula de ARN se sintetiza una proteína.sintetiza una proteína.

Mutación: es un cambio en la secuencia de nucleótidos, originado por errores en el proceso de replicación del ADN, o por agentes mutagénicos.En función de la magnitud del cambio se pueden clasificar en microlesiones o macrolesiones.MICROLESIONES

Por desfasaje: hay alteración del marco de lectura de la secuencia. Puede ser una deleción o una inserción de una base nitrogenada.

Por sustitución:

Transición: cambio de una base nitrogenada por otra del mismo tipo.

Transversión: cambio de una base púrica (adenina y guanina) por una pirimidínica (timidina, citosina y uracilo) y viceversa.

MACROLESIONES:

Deleción: Pérdida de un grupo de bases.Inserción: Se insertan o se intercalan trozos de ADN en el interior de una secuencia. Duplicación: Repeticiones en tandem.Inversión: Una porción de ADN se separa y vuelve a unirse pero en sentido inverso.Translocación: Una porción de ADN se desprende y se inserta en otra región del genoma.

Una mutación siempre produce un cambio en el genotipo, pero ese cambio no siempre se ve reflejado en el fenotipo.

Según el efecto producido, se puede clasificar en:

•mutación sin sentido: generación de un codón de terminación. Cadena polipeptídica incompleta.

•mutación con sentido erróneo: cambio de un aa por otro.

•mutación supresora: reversión al fenotipo/genotipo original en células que ya habían sufrido mutaciones anteriormente.

Agentes mutagénicos

Pueden ser físicos o químicos.Químicos:Modificadores de bases: normalmente generan transiciones de base. (ácido nitroso, ag. alquilantes).Modificadores de la estructura secundaria del ADN: agentes intercalantes, pueden generar inserciones y deleciones. (colorantes de acridina).Análogos de base: se incorporan en la síntesis de ADN ya que son sustancias análogas a las bases de ADN, y al replicarse nuevamente generan transiciones. (5-bromouracilo, 2-aminopurina)

MUTACIONES: espontáneas, motivadas por el sistema SOS o causadas por agentes mutagénicos.

Físicos:Luz UV/visible: producen dimerización de timidinas que al separarse producen alteraciones del código.Radiación ionizante: (X, gamma y cósmicos) producen radicales libres que originan rupturas en la cadena de ADN, y la reparación origina las mutaciones.

Sistemas de reparación o recuperación

Fotorreactivación: a través de la fosfoliasa, que rompe los dímeros de timidina. Requiere de luz visible para actuar.

Reactivación negra: no necesita luz, es un poco más complejo, son varias enzimas que cortan la región dañada (también dímeros de timidina) e insertan los nucleótidos complementarios correspondientes.

SOS: se activa post-replicación, frente a la aparición de regiones unicatenarias sintetizando las cadenas complementarias.

Recombinación genética

Es el proceso por el cual elementos genéticos contenidos en dos genomas separados llegan a estar juntos dentro de una misma unidad.

En procariotas es un fenómeno que ocurre en forma azarosa por tres mecanismos:

•Transformación: captación de ADN libre en el medio por células competentes (receptora).

•Transducción: transferencia de material genético bacteriano por medio de bacteriófagos (virus bacterianos).

•Conjugación: transferencia de ADN entre dos células en contacto (plásmido F y otros plásmidos).

Transformación (neumococo-experimento)

Se da naturalmente sólo en algunos géneros bacterianos (Streptococcus, Haemophilus), aunque se puede inducir competencia experimentalmente en diversos géneros.

El ADN libre debe ser bicatenario para ser reconocido y solo habrá recombinación si hay homología con alguna secuencia del receptor.

Transducción

Transducción generalizada: después de un ciclo lítico normal, se generan partículas víricas conteniendo ADN viral o bacteriano, que luego infectarán otras células descargando el material genético en su interior. El material bacteriano que se transmite es totalmente inespecífico.

Transducción restringida o especializada: vía virus con ciclos lisogénicos. El material transmitido corresponde a secuencias adyacentes al sitio de inserción del genoma viral en el cromosoma bacteriano, y por consiguiente son genes próximos a secuencias homólogas al virus.

Conjugación (La única que puede darse en bacterias de diferente género)

Depende de la presencia del plásmido F, que codifica para una estructura denominada pili sexual, que media la transferencia de material célula-célula.El plásmido F y otros plásmidos se replican de forma independiente al cromosoma bacteriano. Atraviesan el pili en forma unicatenaria.Se puede dar entre células de diferente género, siempre que una de ellas tenga plásmido F.

ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN

DECONTAMINACIÓN: Procedimiento o tratamiento que hace segura la manipulación y el uso de dispositivos, aparatos e instrumentos. Esterilización, desinfección o limpieza simple.ESTERILIZACIÓN: Completa eliminación o destrucción de toda forma vida microbiana, incluyendo las esporas.DESINFECCIÓN: Eliminar o reducir la densidad de los microorganismos patógenos que se encuentran sobre objetos inanimados, con excepción de las esporas bacterianas.ANTISEPSIA: Se emplea un agente químico sobre superficies animadas (piel o tejidos vivos) con el propósito de inhibir su crecimiento o destruir a los microorganismos.LIMPIEZA: Remoción de toda materia ajena al objeto (suciedad, materia orgánica, etc.). Generalmente se lleva a cabo con agua, detergentes y acción mecánica.La limpieza debe preceder a todo proceso de desinfección y esterilización.

Pérdida irreversible de la capacidad de reproducción.

Curva de muerte bacteriana:

Se grafican número de sobrevivientes (UFC/ml) en escala logarítmica y en función del tiempo de exposición al agente en escala aritmética. Se obtiene una recta. La ordenada al origen indica el log del número inicial de bacterias y la pendiente define la velocidad de muerte de la población durante la esterilización.

MUERTE BACTERIANA

MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

Métodos Físicos: Aplicación de calor: Húmedo a sobrepresión (Autoclave). Seco. Tindalización. Filtración: Uso de Membranas.Irradiación: Gamma. UV. Métodos Químicos:Exposición: Oxido de etileno. Glutaraldehido.

DESINFECCIÓN Y ANTISEPSIA

Físicos: Pasteurización.

Químicos: - Desinfectantes de alto nivel Glutaraldehídos, formaldehídos y peroxígenos.

- Desinfectantes de nivel intermedio Alcoholes, clorógenos, iodóforos y fenoles.

- Desinfectantes de bajo nivel Compuestos de amonio cuaternario, anfóteros, mercuriales y sales de plata.

MEDIOS DE CULTIVO BACTERIANO

MEDIOSSólidos.

Semisólidos.

Líquidos.

Gelatinas

Definición: Las sustancias nutritivas preparadas en el laboratorio para el crecimiento de microorganismos se conocen como medio de cultivo. Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras necesitan medios especiales y aún hay algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios inertes desarrollados hasta ahora. Los microbios que crecen y se multiplican dentro o sobre un medio de cultivo constituyen lo que se denomina cultivo microbiano. En éste los gérmenes desarrollan sus procesos bioquímicos vitales.

Todos los medios de cultivo deben reunir una serie de condiciones:

Deben contener agua : componente por exelencia de la célula bacteriana. Disolvente de las sustancias nutritivas y además es el solvente de los electrolitos que mantienen el equilibrio ácido-base y la presión osmótica bacteriana.

Deben contener sustancias nutritivas adecuadas : hidratos de carbono, proteínas, lípidos, sales minerales, y en algunos casos vitaminas o factores de crecimiento que son sustancias indispensables para acelerar el metabolismo bacteriano y actuar como coenzimas de procesos enzimáticos.

Debe tener un pH adecuado: pH neutro ligeramente alcalino (la mayoría de las bacterias se desarrollan a pH entre 6,5 (acidófilos) y 7,5 (neutrófilos)).

Debe mantenerse en condiciones estériles: para evitar que se desarrollen gérmenes no deseados dificultando identificar la bacteria que hemos sembrado.

Para gérmenes aeróbicos: el medio de cultivo debe disponer de oxígeno libre o combinado, según que las bacterias respiren por un mecanismo aerobio, anaerobio facultativo o microaerofílico. Aceptores y donadores de hidrógeno: todos los organismos requieren una fuente de energía en forma de donantes de hidrógenos (sustratos oxidables).También se requieren aceptores de hidrógeno en las reacciones de oxidorreducción que suministran energía.- Gérmenes aerobios: oxígeno libre- Gérmenes anaerobios estrictos: Sust. Inorgánicas (carbonatos, nitratos, sulfatos)- Gérmenes anaerobios facultativos: Sust. Orgánica (fermentadores).

Fuente de Carbono, Nitrógeno y minerales (Azufre, Fósforo, etc.) Debe ser mantenido a una temperatura óptima: ésta temperatura esta alrededor de los 37º C.Hay una gran variedad de medios disponibles para el cultivo de microorganismos. Comercialmente la mayoría de ellos tienen sus componentes previamente mezclados y sólo necesitan la adición de agua y esterilización.

En los medios líquidos las sustancias nutritivas se encuentran disueltas y los microorganismos quedan en suspensión. Por otro lado en fases liquidas el crecimiento suele ser mayor que en medios sólidos porque la disponibilidad de nutrientes también es mayor. No contienen ningún tipo de agente solidificante y son también denominados caldos.Los medios líquidos pueden ser: de origen animal, de origen vegetal y también de composición química definida.

* Origen animal: pueden ser naturales (la leche o el suero) o pueden ser elaborados (caldo de extracto de carne).* Origen vegetal: corresponde generalmente a infusiones: infusiones de papa y de zanahoria .

LIQUIDOS

Se utiliza un agente solidificante (el agar-agar) en una proporción por encima del 15% (12-15 g/L). En ellos las bacterias crecen con mayor dificultad, pues los nutrientes se agotan con rapidez en el punto donde se desarrollan no obstante nos permite el aislamiento, purificación y visualización de su crecimiento en colonias, así como su posible identificación a través de medios específicos y diferenciales de caracteres sólidos, elaboración de antibiogramas, etc.

SOLIDOS

AGAR TSA AGAR TCBS

AGAR CHOCOLATE AGAR SANGRE

SEMISOLIDOS

Presentan agar-agar en su composición en una proporción menor al 5% (2,5g/L). Se utiliza especialmente para el estudio de algunas propiedades bioquímicas (oxidación-fermentación) .

GELATINA: Agente solidificante que se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuefacción. Es proteica, de origen animal y tiene la facultad de absorber agua. Se elabora agregándole al caldo común gelatina extrafina en proporción del 12-15 % lo cuál permite solidificar el medio. Se filtra, se esteriliza y se coloca en tubos.Se utiliza para cultivos de menos de 22º C, ya que licua a esta temperatura. En Bacteriología la gelatina se emplea, sola o mezclada con otras sustancias, como medio de cultivo y también para la conservación de preparaciones microscópicas.

TIPOS DE MEDIO:

- General- Selectivo: aislamiento directo o de enriquecimiento- Diferencial- Químicamente definido- Complejos- Mínimo