• Levadura: hongounicelular redondeado uovoide que se reproducesexual o asexualmente.

• La identificación de laslevaduras se puede llevara cabo atendiendo acuatro criterios diferentes:morfológicos,bioquímicos,inmunológicos ogenéticos.

• Las colonias de levadurasen agar glucosado deSaboraud (SDA) sonligeramente abombadas oplanas, de consistenciamantecosa, lisa o rugosa,con olor agradable,tornándose pastosas amedida que envejecen.

• Por lo general las coloniasde levaduras no desarrollanmicelio aéreo, aunque enocasiones pueden aparecerprolongacionesaracneiformes en laperiferia de las colonias. Sise observa un micelio aéreodefinido, debe considerarsela posibilidad de que setrate de un hongo dimórficoo de ciertas especies delevaduras que puedenformar micelio verdadero .

• El laboratorio de micología identifica levaduras quetienen significancia clínica. Para lo cual se dispone demúltiples sistemas bioquímicos rápidos; y también sedeben seguir realizando sencillas pruebas que sonútiles en la identificación tales como:

• Observar la micromorfología.

• Producción de pigmento.

• Asimilación de carbohidratos.

• Producción de ureasa.

• Susceptibilidad a la cicloheximida.

• Desarrollo de película.

• Desarrollo a 37 y 42 °C.

• Colonias

• Se caracterizan por

presentar colonias

cremosas de color

blanco amarillento,

lustrosas, poco

elevadas y de bordes

bien definidos.

Examen microscópico

• Se observan células

redondas u ovaladas

de tres a siete micras

de diámetro, que se

reproducen por

blastoconidias y

forman pseudomicelio

en la mayoría de las

especies.

Pruebas fisiológicas para

identificación• Tubo germinativo (filamentación precoz)

• Permite diferenciar las especies de Candidaalbicans de las no albicans.

• Desarrollo a 42 °C

• C. albicans y C. dubliniensis tienencomportamiento fisiológico y morfológicosimilar y la prueba que los va a diferenciar enel laboratorio de microbiología es eldesarrollo a 42 °C en agar papa dextrosa.

• Producción de clamidosporas, blastoconidias y artrosporas.

Se observa al microscopio en

busca de desarrollo del

tubo germinal y se reporta el

resultado.

Interpretación

• El tubo germinal es una extensiónfilamentosa de la levadura, sinestrechamiento en su origen, cuyo anchosuele ser la mitad de la célula progenitoray su longitud tres o cuatro veces mayorque la célula madre

• La prueba es positiva al visualizar unaestructura elongada que se origina a partirde la levadura.

• Realizar esta prueba empleando cepascontroles en paralelo a la cepa en estudio.

• Sólo C. albicans es capaz de producirverdaderos tubos germinales; sinembargo, otras especies como C.tropicalis pueden producir pseudohifasprecoces de aspecto similar a los tubosgerminales pero con una zona deconstricción característica.

• Si se utiliza un inóculo demasiadoabundante de levaduras, también puedenobtenerse falsos resultados negativos.

Sembrar la cepa aislada

en tubo o placa Petri que

contenga agarpapa dextrosa.

Incubar a 42 ºC por 48

horas

INTERPRETACIÓN

Positivo: C. albicans. con

desarrollo óptimo

Negativo: C. dubliniensis sin

desarrollo

• Ante la presencia de estructuras con aspecto de hifas, loprimero que hay que determinar es si se trata de pseudohifas(resultantes del proceso de formación de blastoconidias y, portanto, con puntos regulares de estrechamiento) o, por elcontrario, son verdaderas hifas que se fragmentan enartroconidias.

• Interpretación

• Si el desarrollo en medios especiales revela la presenciade pseudohifas y blastoconidias, la levadura a identificarpertenece a alguna especie del género Candida.

• Si por el contrario, revela verdaderas hifas yartroconidias, lo más probable es que se trate deespecies de Trichosporon, Geotrichum oBlastoschizomyces.

Producción de clamidosporas,

blastoconidias (Procedimiento)

Incubar a 37 °C por 24 a 48 h.

Artroconidias de

Geotrichum

• Microscópicamente las células de

Cryptococcus neoformans se caracterizan

por presentar una cápsula de polisacárido

visible al examen directo con tinta china.

• Morfología de lascolonias

• Son mucoides ybrillantes. Sobre el ASDdesarrollan un colorblanco amarillento, sonpoco elevadas y debordes continuos,mientras que sobre elagar niger seed (agarsemilla de girasol)desarrollan un colormarrón.

Desarrollo de Cryptococcus

neoformans sobre agar Sabouraud

dextrosa después de 72 horas de

crecimiento a 37 ºC.

• Levaduras redondas de 7 a15 μm de diámetro, emalgunos casos puedenproducir blastoconidias. Suprincipal características esla de presentar una cápsulaque la circunda, visible alexamen directo con la tintachina.

• Control positivo:Cryptococcusneoformans.

• Control negativo: Candidaalbicans.

Cápsula de polisacárido visible

al examen directo con tinta

china (objetivo de 100X).

• Morfología de lascolonias

• Son de crecimiento rápido,en el período de unasemana presentan un colorblanco – grisáceo, queposteriormente cambia a uncolor amarillento conaspecto ceroso, polvorientoa rugoso. La temperaturaóptima de crecimiento es 25°C, la mayoría de las cepasno desarrollan o lo hacendébilmente a 37 ºC.

• Examen microscópico• Se observa artroconidias

unicelulares, en cadena,

• hialinas que resultan de la fragmentación de hifas no

• diferenciadas por fisión a través de un doble septo,

• estas estructuras tienen forma rectangular y redondeada

• en los extremos, semejante a un barril. Carecen

• de blastoconidias, conidióforos y pseudohifas.

Artroconidias de

Geotrichum spp. (objetivo

de 100X).

• Morfología de lascolonias

• Son de rápidodesarrollo, liso,plegado,aterciopelado, ceroso,de color blanco –amarillento – crema.La textura plegada esmás prominente en eltiempo.

Desarrollo de Trichosporon

spp. sobre agar Sabouraud

dextrosa después de 72 horas

de crecimiento a 37 ºC.

• Examen microscópico

• Se visualiza artroconidiasy blastoconidias. Lasblastoconidias sonunicelulares y de formavariable y nacen enbrotes en los ángulos delas artroconidias. Laprincipal característica esla de presentarartroconidias usualmenteen forma cúbica o debarril.

Artroconidias de

Trichosporon sp. (objetivo de

100X).

• Las colonias de Rhodotorula rubra se

caracterizan por presentar pigmentos

carotenoides que confiere a la colonia un

color naranja o rojo anaranjado.

• Microscópicamente las células de

Rhodotorula rubra se encuentran dotadas

de una fina cápsula visible al examen

directo con tinta china.

• Morfología de las

colonias

• Se caracterizan por

ser de color rojo –

anaranjado o naranja,

de aspecto cremoso o

rugoso, brillante y de

superficie lisa.

Desarrollo de Rhodotorula rubra

sobre agar Sabouraud dextrosa

después de 72 horas de crecimiento a

temperatura ambiente.

• Examen microscópico

• Se observan levaduras

redondas, ovoides de 2

– 6,5 micras de

diámetro, en ocasiones

forman pseudomicelio

rudimentario, al examen

directo con tinta china

se visualiza una fina

cápsula. Fina cápsula de Rhodotorula

rubra visible al examen directo

con tinta china.

Los patrones de asimilación

de azúcares (glucosa,

lactosa, sacarosa, maltosa,

galactosa y rafinosa)

permiten identificar las

diferentes especies de

Candida spp, Rhodotorula

rubra, Trichosporon spp. y

Geotrichum spp.

Interpretación:

Positivo: viraje del color

del medio de cultivo hacia

el amarillo.

Negativo: no se produce

viraje de color,

permaneciendo el color

del medio de cultivo en

morado o púrpura.

• Se basa en la

capacidad de producir

la enzima ureasa, la

cual desdobla la urea

en dióxido de carbono

y amonio,

incrementando el pH

del medio produciendo

un cambio de color

rojo– púrpura en el

indicador rojo de fenol.

• Interpretación• La prueba se considera

positiva cuando sealcaliniza el medio lo queproduce un cambio decolor original (amarillo) arosa o rojo.

• Una reacción positiva a laprueba ureasa essugestiva de perteneceral género Cryptococcus,la cepa de C. neoformansson productoras deureasa.

• Algunas especies de

Candida, Geotrichum

y Trichosporon

producen una película

y gas sobre la

superficie del medio

de cultivo (caldo

Sabouraud).

• Interpretación• Se considerará como

prueba positiva si se

produce una película

sobre la superficie del

medio de cultivo.

• Permite distinguir

aquellas levaduras

que son resistentes o

sensibles a la

cicloheximida o

actidione.

• Interpretación

• Cepas que se

desarrollen sobre

el medio de cultivo

se considerarán

como resistentes.

El hisopo inoculado se presiona con firmeza contra el fondo de un tubo vacío para

que se desprendan los microorganismos contenidos

en la fibra de algodón.

Reintroducir el hisopo en el tubo para que absorba los

reactivos.

La capacidad que

tienen algunas

cepas de levaduras

de producir nitritos a

partir de nitratos

(presencia de

enzima

nitratoreductasa Sc.)

• Interpretación:

• El desarrollo de uncolor rojo brillante en elhisopo es positivo.

• Negativo sólo cuandoel hisopo retiene elcolor de la colonia.

• Positivo: Cryptococcus.albidus var albidus

• Negativo: C.neoformans

• Capacidad de C.neoformans de formar unpigmento marrón o negro,denominado melanina, apartir de compuestosdifenólicos. La producciónde este pigmento mediantela prueba de la L – dopa –citrato férrico, es realizadapor la enzima fenoloxidasa.

• La reacción positiva seevidencia con la producciónde un pigmento marrónoscuro o negro alrededorde la colonia de C.neoformans.

Incubar en cámara húmeda a 28 °C de 3 a 18 h.

• Interpretación

• Positivo:

Cryptococcus

neoformans.

• Negativo: Candida

albicans.

Prueba de la fenol-oxidasa (Medio de

TOC). Producción de pigmento

marrón oscuro por C. neoformans.

• Entre estas metodologías tenemos a los medios de cultivoque emplean sustratos cromogénicos que permiten elaislamiento e identificación de algunas especies del géneroCandida.

• El fundamento de los mismos se basa en la detección dedeterminadas actividades enzimáticas por parte de laslevaduras mediante la hidrólisis específica de un sustratocromogénico en presencia de un indicador de la enzima. Unade las principales ventajas de estos medios es permitirdiferenciar fácilmente los cultivos mixtos.

• Se describen sistemas enzimáticos que usan un sustratocromogénico para detectar las enzimas MUGAL y PRO por loque no requieren el uso de lámpara ultravioleta.

Ejemplos

• CHROMagar candida

• Cromogen albicans

• CandiSelect

• CandidaID

• Albicans ID2

• Fluoroplate Candida

• Agar SDCA-MUAG

Procedimiento e interpretación

• La siembra se realizaa partir de cepasmuestras biológicas y seincuban a temperaturasde 30 a 37 °C durante 48horas.

• C. albicans, son lisas y de color verde esmeralda.

• C. dubliniensis, de color verde oscuro.

• C. tropicalis colonia de color azul oscuro con un halo púrpuramarron en el medio de cultivo.

• C. krusei. colonias rugosa con el centro rosado y el borde blanco.

• C. glabrota, colonia de color violetamorado.

Desarrollo de Candida

albicans (a), Candida krusei

(b) y Candida tropicalis (c)

sobre CHROM agar

Candida.

• También hay sistemas enzimáticosdisponibles que permiten la identificaciónrápida de C. albicans a partir de una coloniadesarrollada sobre cualquier medio de cultivoconvencional, éstos sistemas detectan una odos enzimas β – galactosaminidasa y L –prolina aminopeptidasa, presentes sólo enC. albicans. Para detectar estas enzimas lossistemas comerciales pueden utilizarsustratos fluorogénicos y cromogénicos.

• Entre otrasmetodologías deidentificación seencuentran lossistemas enzimáticosque emplean sustratosfluorogénicos,requiriendo para ello eluso de una lámparaultravioleta de 365 nm,es el caso delBactiCard Candida.

• Se fundamenta en el empleo

de diversos nutrientes

hidrocarbonados o

nitrogenados sobre un medio

sintético base, para observar

el crecimiento selectivo de una

levadura alrededor de los

nutrientes necesarios para su

desarrollo.

• Los medios de cultivo se

comercializan deshidratados

como medio base de

levaduras, siendo los más

usados:

• Medio sin carbono

• Medio sin nitrógeno

• Como fuente de

carbono se pueden

emplear todos los

azúcares y alcoholes.

Como sustrato

nitrogenado se puede

usar peptona,

asparagina, úrea,

sulfato de amonio,

nitrato de potasio y

aminoácidos diversos.

• Para su realización pueden emplearse

soluciones acuosas esterilizadas por

filtración, cilindros de Oxford en pocillos

hechos en el agar o bien discos de papel

absorbente empapados con el nutriente.

• Sin embargo, las pruebas de asimilación

en medios líquidos no ofrecen ninguna

ventaja adicional sobre los medios sólidos,

resultando mucho más laboriosas y

costosas.

Auxonograma (procedimiento)

Cada cepa de levadura se suspende en solución salina

fisiológica estéril.

Se introduce en cada tubo un hisopo estéril y se siembra

masivamente cada levadura en su respectiva caja con púrpura

de bromocresol.

Se humedecen los discos de papel filtro estéril (marcar los

discos con lápiz), con cada una de las soluciones de

carbohidratos, se deja secar el exceso y se colocan todos los

discos en la caja petri ya sembrada.

Se incuba a 37° C por 24 a 48 h.Se reporta el crecimiento de cada levadura alrededor de

cada uno de los discos

Interpretación:

Un crecimiento indica que hubo asimilación de ese carbohidrato por parte del hongo, un halo de inhibición alrededor del disco

indica que no hubo asimilación de la azúcar por parte del disco

Auxonograma por la técnica de

Araujo

Es la

fermentación

de azúcares.

Se cultiva la

levadura en un

medio líquido

con un glúcido

y un indicador

coloreado.

• Interpretación

• Presencia de gas

• Fermentación de

carbohidratos por

viraje del medio

• Existen diferentes sistemas deidentificación semiautomatizadosbasados en paneles o galeríasque contienen los nutrientes,como por ejemplo: Auxacolor, Uni– Yeast Tek, API 20 C AUX,Galeria ID32C, Sistema Vitek.

• Entre los sistemas automáticostenemos: Sistema Vitek 2, BiologYT MicroPlate, Rapid YeastIdentification Panel MicroScan.

• También hay sistemas de identificación rápida de levaduras mediante pruebas bioquímicas y enzimáticas, como: Rapid Yeast Plus System, Fungiscreen 4H. Api 20 CAUX.

La lectura de estas reacciones se

hace por comparación con un

control de crecimiento y la

identificación se obtiene, a partir de

un código numérico, mediante un

catálogo analítico o un programa

informático.

Auxacolor

Uni-Yeast-Tek

RapID Yeast Plus System®

• El RapID Yeast Plus System (Remel) es un sistema compuesto por un panel de 18 pocillos; cada uno contiene un sustrato convencional o cromogénico que detecta la asimilación de carbohidratos, ácidos orgánicos aminoácidos, así como la hidrólisis de la urea y de ácidos grasos. Permite identificar hasta 43 especies de levaduras.

• Debido a su requerimiento de ácidos grasos, las levaduraslipófilas no pueden ser identificadas con los sistemas ymedios habituales para otras levaduras, por lo que suidentificación merece un comentario diferenciado.

• Las levaduras de Malassezia furfur por ser lipofílicas, sedesarrollan en medios de cultivo que contengan en sucomposición aceites naturales u otras sustancias grasas,siendo el método más común el cultivo en ASD que contienecicloheximide o actidione y aceite de oliva, sin embargoexisten medios de cultivo alternativos como el agar de Dixónque en su formulación incluye al glicerol mono – oleato queestimula el crecimiento in vitro de la levadura. Laidentificación se basa en comparar característicasmorfológicas y fisiológicas.