ETAPAS EN LA FERMENTACIN Aspectos microbiolgicos Cultivo y propagacin Recirculacin de levadura Recirculacin de vinaza Nmero de fermentadores Factores que afectan

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ASPECTOS MICROBIOLGICOS MORFOLOGA DE LOS MICROORGANISMOS

MORFOLOGA DE LA LEVADURA QU PAPEL JUEGA LA LEVADURA? MICROORGANISMOS CONTAMINANTES PRODUCTOS INDESEADOS CONCEPTOS FUNDAMENTALES

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CLASIFICACIN DE LOS MICROORGANISMOS

MICROORGANISMOS

PROCARIOTOS

EUCARIOTOS

Bacterias

Hongos

Algas

Protozoos

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MORFOLOGA DE LOS MICROORGANISMOS

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PAPEL DE LA LEVADURAinvertasa

C12 H22 O11 + H2OSacarosa (342 g) Agua (18 g)levadura

C6H12 O6 + C6H12 O6Glucosa (180 g) Fructosa (180 g)

C6H12 O6glucosa (180)

2C2H5OH + 2CO2etanol (92) dixido de carbono (88)

Biocatalizador en el proceso de fermentacin Inversin de sacarosa a glucosa/fructosa Convertir glucosa y fructosa a etanol5

MORFOLOGA DE LA LEVADURA

Forma oval Hongo unicelular Clulas ms grandes que las bacterianas Tamao: 5 - 10 m pH adecuado de trabajo 3.5 - 4.8 Temperatura entre 15C - 35 C6

MORFOLOGA DE LA LEVADURA

Reproduccin asexual por divisin celular (gemacin) Posibles duplicaciones: 4 - 20 veces Microorganismo facultativo No posee flagelos ni rganos de locomocin Existen ms de 500 clases de levaduras (levaduras salvajes)

Saccharomyces cerevisiae

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MEDIOS DE CULTIVO

Medio de cultivo (sustrato) Fuente de Energa Carbono Fuente de Protenas Nitrgeno Micronutrientes

Elementos esenciales P,K,O,Na

Vitaminas, Mg,Zn,Ca,Fe

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PRESERVACIN DEL MEDIO DE CULTIVO Preservado en un slant Temperatura de 4 C Cada vez que se use refrigerarlo y evitar que se contamine Solo manipulacin por personal encargado Cada inoculo se debe tomar frente a un mechero y con un asa totalmente estril o en cmara de flujo laminar EQUIPOS - microscopio - cmara de flujo laminar - autoclave (esterilizacin) - vidrieria, shakers - camara de new_beauer9

PROCEDIMIENTOS EN EL LABORATORIO

Uso de recipientes totalmente estriles El agua para los medios de cultivos debe ser destilada Indumentaria adecuada (bata,zapatones,cofia y tapabocas) En el laboratorio limitar el flujo de personal El lugar de trabajo totalmente asptico (cmara de flujo laminar) Aplicar todas las BPL y asepsia en el laboratorio

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BACTERIAS ACIDO-LCTICAS

Son facultativas Compiten por los nutrientes de la levadura. Operan a bajo pH Producto final de fermentacin cido lctico Tolerantes a altas concentraciones de sales y azucares . Ejemplos : Lactobacillus lactis Streptococcus lactis

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BACTERIAS ACIDO-ACTICAS

Predominantes en la fermentacin Opera a bajo pH Convierte el alcohol en Acido Actico Raramente se observa en melazas. Ejemplos: Acetobacter spp

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CLOSTRIDIUM & BACILLUS SPP

Se encuentra en la flora normal del aire y del suelo Opera a altas concentraciones de azcar y de sales Propiedades de formacin de esporas Sobrevive a bajo pH Resistentes al calor - por esporas Sintetizan sus propias vitaminas Los clostridios producen cido butrico, acetona y butano

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PRODUCTOS INDESEADOS GlicerolFormado del Glicerol 3 fosfto en la ruta metablica del etanol

AcetaldehidoFormado a partir del Piruvato

Acido acticoViene de las mieles o se forma por oxidacin a partir del etanol por accin de bacterias o levaduras

Acetato de EtiloFormado por la reaccin entre el etanol y el cido actico

MetanolProducto del metabolismod de la levadura cuando consume azucares tipo pentosas

Fusel oils (Pentanol, Butanol, Propanol)Producto de la accin de la levadura al consumir aminoacidos

cidos Propinico y ButricoFormado por bacterias que consumen el azcar14

CONCEPTOS FUNDAMENTALES PoblacinNumero de clulas presentes (PRAJ recomienda como mnimo una poblacin de 300 x 106 cell/ml)

Viabilidad

Nmero de clulas con actividad metablica (es deseable una viabilidad superior al 90%)

Unidades Formadoras de Colonias(UFC)Miles de millones de clulas presentes visibles al ojo humano. Usualmente se realizan cultivos en una caja Petri para establecer la poblacin de bacterias

Velocidad especfica de crecimientoMasa levadura fresca/masa levadura inicial/hora

Productividad especfica

Volumen alcohol/masa levadura/hora Volumen alcohol/volumen reactor/hora

Productividad volumtrica

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CINTICA DE CRECIMIENTO

Estacionaria

Crecimiento

Adaptacin

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FASES EN EL FERMENTADOR ADAPTACIN (lag)Se caracteriza por la sntesis y degradacin de material celular y adaptacin al nuevo medio ambiente. Se detiene la actividad metabolica

CRECIMIENTOCaracterizada por la reproduccin y multiplicacin celular a mxima velocidad. Mxima actividad metablica

ESTACIONARIASe detiene el crecimiento celular. El sustrato est agotado y comienza para la clula un estado de inanicin y de degradacin

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CULTIVO DE TRABAJO

Prueba cualitativa Propagacin Levadura Activacin de GR - X la levadura

Incubacin condiciones controladas

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PROPAGACIN DE LA LEVADURA

Slant L1 L2 L3

T1

T2

Fermentador PF T4 T3

19

PROPAGACIN DE LA LEVADURA

20

LEVADURA FLOCULANTE

Ca++ Ca++ C6H12 O6 Ca++ CCa+12 O6 H+ 6 C6H12 O6Ca++ Ca++ Mg++ Mg++ Ca++ Ca++ Ca++ MG++21

C6H12 O6 Ca++ C6H12 O6Ca++ Mg++ Ca++ Mg++ Ca++

Ca++ Mg++

LEVADURA FLOCULANTE mostoVino a destilacin

DECANTADOR

TANQUE DE ACTIVACINCrema de levadura

Levadura a fermentacin

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LEVADURA FLOCULANTE

Ventajas no requiere separadores mecnicos de

alta velocidad ahorra electricidad ahorra requerimientos de mantenimiento se evita la compra de repuestos evita la recirculacin de lodos al fermentador

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RECIRCULACIN DE LEVADURA Alta densidad celular: alta concentracin de biocatalizador en el fermentador Reduce tiempo de residencia Incrementa la eficiencia de fermentacin Reduccin de costos

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RECIRCULACIN DE VINAZA Reduccin en el consumo de agua de proceso Reduccin en la generacion de efluentes Recirculacin de nutrientes Reduccin de costosLa cantidad de vinaza recirculada depende de:

Concentracin de slidos en mosto funcin de F/N (mx. 16-18 % p/p) Nivel de acidez voltil en mosto funcin de acidez voltil en la alimentacin (mx. 2500 ppm)

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TIEMPO DE RESIDENCIAAz u ca re s fe rm e n ta bl e s - 4 5 %w/w, Ac Vo l a ti l -9 6 5 2 ppm , Le v. Re ci rcu l a bl e 7 0 %

Tiempo de residencia (hr)

40 30 20 10 0 0 8 9 10 Alcohol e n vino (%v/v)26

VELOCIDAD DE CRECIMIENTO

kg levadura fresca P.S KG KG LEVADURA FRESCAp.s/ /kg LEVADURA INICIAL levadura inicial p.s/h

0.12 0.11 0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0

3

4

5

6

7

8

9

% ALCOHOL EN VINO

Al pasar de 44aa77% en el contenido de alcohol se pierde un % 62 de velocidad de Al pasar de % en el contenido de alcohol se pierde un % 62 de velocidad de generacin de clulas generacin de clulas27

PRODUCTIVIDAD ESPECFICA1.4 1.3 1.2 1.1 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

Lt alcohol/ ALCOHOL/KG LITROS kg levadura LEVADURA P.S p.s/h

3

4

5

6

7

8

9

% ALCOHOL EN VINO

Al pasar de 44aa77% en el contenido de alcohol se pierde un % 50 de productividad Al pasar de % en el contenido de alcohol se pierde un % 50 de productividad28

UTILIZANDO UN SOLO FERMENTADORAlcohol conc.(%v/v) Productividad Tiempo de retencin (h) Concentracin celular

0-5.5 1.07 11.4

0-6.5 0.84 22 4.5

0-7.5 0.73 32

0-8.0 0.49 35

FERMENTADORES EN SERIEAlcohol conc.(% v/v) Productividad Tiempo de residencia (h) Concentracin celular T RTotal(h) 5.5 1.07 11.4 4.5 6.5 0.84 2.6 4.5 17.9 7 0.73 1.5 4.5 7.5 0.49 2.3 4.5

Utilizando fermentadores en serie se disminuye el tiempo de residencia hasta en Utilizando fermentadores en serie se disminuye el tiempo de residencia hasta en un 50 % un 50 % 29

FERMENTADORES EN SERIE

Productividad levadura

F15.5- 6.0%

F26.0- 6.5%

F36.5-7%

F47-7.5%

Conc. Alcohol30

Tiempo de residencia

FACTORES QUE AFECTAN LA FERMENTACIN MATERIA PRIMA AZUCARES FERMENTABLES CONTENIDO TOTAL DE MATERIA ORGNICA CONTENIDO TOTAL DE MATERIA INORGNICA Y CENIZAS SLIDOS SEDIMENTABLES PH TEMPERATURA

ACIDEZ VOLTIL ORGNICA CONTENIDO DE CARAMELOS SODIO CONTENIDO DE BACTERIAS RELACIN C/N CONTENIDO CELULAR TIEMPO DE RESIDENCIA AGITACIN CONCENTRACIN DE ETANOL OTROS

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AZCARES FERMENTABLES Sacarosa, glucosa y fructosa Altas concentraciones reducen residuos Fermentacin continua se pueden tener entre 15% p/p y 19% p/p de azcares fermentables Fermentacin discontinua alrededor de 23% p/p. CONTENIDO TOTAL DE MATERIA ORGNICA Protenas, almidones, dextranas, cidos, azcares infermentables, xilosa, arabinosa, polmeros Depende de la variedad de la caa. Vara entre 0.7 y 2.7 %. Mientras ms bajo sea este valor, ms eficiente ser la fermentacin32

CONTENIDO TOTAL DE MATERIA INORGNICA Y CENIZAS Iones de calcio, potasio, slice, hierro, manganeso, xidos, nitratos, compuestos clorados Incrementa la presin osmtica del medio de cultivo y por ende de la levadura Las mieles con alta relacin azcares fermentables a azcares infermentables poseen bajo contenido de cenizas CONTENIDO DE SLIDO SEDIMENTABLES Sulfatos de calcio y magnesio, algunas protenas y clulas muertas. Destilacin y concentracin de Vinaza33

pH Los microorganismos tienen un pH ideal en el que incrementan su actividad metablica Se requiere un pH entre 4.0 y 4.7 para obtener adecuada de la levadura. Afecta: El crecimiento celular La velocidad de fermentacin La formacin de subproductos una actividad

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pH

120 100

Velocidad especfica de crecimiento o productividad especfica

80 60 40 20 0 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6

pHR elative Sp. Grow th R ate R elative Sp. Produc tivity

35

pH

E ff e c t o f p H o n B ac te rial A c tivity6 5 4 3 50 70 90 110

pH

% B ac te rial A c tivity

36

TEMPERATURA Todos los microorganismos tienen una temperatura ideal Vara dependiendo de la levadura entre 30C y 35C Afecta: Actividad enzimtica La velocidad de fermentacin Desarrollo de bacterias mesfilas

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TEMPERATURA

Velocidad especfica de crecimiento o productividad especfica, en porcentaje

120 100 80 60 40 20 0 25 30 35 40 Temperatura, CVelocidad esp. de crecimiento Productividad especfica

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TEMPERATURA

E f f e c t o f T e m p e r a t u r e o n B a c t e r ia l A c t iv it y41

Temperature, in degree Centigrade

36 31 26 30

50

70

90

110

% B a c t e r ia l A c t iv it y

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ACIDZ VOLTIL ORGNICA Presencia principalmente de: cido actico cido propinico cido valrico cido isovalrico cido butrico cido isobutrico Los cidos representan venenos para la levadura Causan baja velocidad de reproduccin de la levadura La acidez empieza desde el momento en que se corta la caa (se recomienda que el tiempo mximo desde el corte hasta la molienda no sea mayor a 18 horas)40

ACIDZ VOLTIL ORGNICA

Velocidad especfica de crecimiento Productividad Especfica %

120 100 80 60 40 20 0 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

Acidez Volatil ppmRelative Sp. Growth Rate Relative Sp. Productivity

Contenido mximo recomendado 2500 ppm Contenido mximo recomendado 2500 ppm

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EFECTOS DE LA CIDEZ VOLTILAcidez Volatil (ppm)

Melaza-B Mosto

Eficiencia fermentacin

Costo Variable Alcohol

Millones/ao prdida

4000 5000 6500

2590 2730 2940

89.5% 88.8 87.4

$667.8/litro $670.8/litro $676.7/litro

$0 $ 157.5 $ 467.2

Base : 150,000 litros/dia Alcohol Carburante 350 dias de operacin / ao Recirculacin de vinaza 15.3 % p/p Slidos en fermentacin 7 % v/v Etanol en fermentacin Melaza B , Jugo Clarificado , Meladura Costo variable Alcohol incluye 3 % gasolina

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CONTENIDO DE CARAMELOSEFECTO DEL CARAMELOProductividad (lit de Alcohol kg de levadura) 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Caramelo @375 Nm 0.01 %

Por exceso de temperatura se forma el furfural yyel hidroximetilfurfural Por exceso de temperatura se forma el furfural el hidroximetilfurfural

Contenido mximo recomendado 0.15 (productividad de 0.95) Contenido mximo recomendado 0.15 (productividad de 0.95)

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CONTENIDO DE SODIO Produce cambios en la morfologa de la levadura tornndola ms ovalada. Genera cambios genticos negativos

RELACIN DE CARBONO-NITRGENO Relacin Carbohidratos/ Protenas De acuerdo a las necesidades se ajustar la necesidad de nitrgeno en la planta con difosfto de amonio o urea Usualmente se requiere de una relacin mayor a 1.2 Cuando C/N es baja se asocia con una presin osmtica alta44

CONTENIDO CELULAR Sistema sin recirculacin es del orden de 80 - 100 x 106

cell/ml Sistemas con recirculacin del orden de 250 - 400 x 106 cell/ml. Disminuyendo el tiempo de fermentacin. CONTENIDO DE BACTERIAS Son aceptables valores entre 100 1000 UFC al inicio de la fermentacin Cuando la poblacin bacteriana es del orden de 100x106 UFC se recomienda iniciar un nuevo cultivo

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CONTENIDO DE BACTERIAS

PJ: Jugo primario SJ: Jugo secundario MJ: Jugo mezclado CIJ: Jugo Clarificado FItJ: Jugo filtrado

Sy: Meladura A-mol: Miel A B-mol: Miel B C-mol: miel C46

CONCENTRACIN DE ETANOLRELACION ENTRE CONC. ALCOHOL & V ELOCIDAD SP. DE CRECIMIENTO0.12 0.11 0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 3 4 5 6 7 8 9 VOLUME % ALCOHOL IN MASH

KG OF FRESH DRY YEAST / KG OF VITAL DRY YEAST

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AZCARES RESIDUALES

E f fe c t o f R e s id u a l F e r m e n ta b le S u g a r s o n B a c t120 100 80 60 40 20 0 1

% Bacterial Activity

1 .5

2

2 .5

3

3 .5

4

4 .5

5

P e r c e n t a g e R e s id u a l F e r m e n t a b le S u g a r s48

FACTORES DEL CAMPO Y LA COSECHA Herbicidas para control de malezas: Ametrina, Diuron, 2-4 D amina Fertilizantes: Nitrgeno, Potasio, Fosfro Madurantes: Etefon, Glifosto, Fusilad Composicin del Suelo Condiciones climticas Microorganismos como Colletotrichum Falcatum y/o Fusarium Tiempo de cosecha y permanencia

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FACTORES DE FBRICA Cal afecta el pH e inhibe el grado de inversin de la sacarosa Azufre acta como biocida Floculantes: polielectrolitos, siliconas, poliacrilamidas promueven la sedimentacin de la levadura en los fermentadores Blanqueadores atacan la pared celular de la levadura Biocidas: aminas cuaternarias, tiosulfato de amonio en exceso pueden disminuir drsticamente la poblacin Manejo y almacenamiento de mieles y jugos pueden aportar carga microbiolgica perjudicial Anti-incrustantes Fibras/Bagacillo en exceso aumentan la presin osmtica Caramelos disminuye le productividad de la levadura50

OTROS FACTORES

Parmetro C oncentracin Efecto F/N 0.85 a 1.45 en Alta relacin favorece la Fermentables/ no miel final fermentacin Fermentables 1.15 en A mayor valor, permite la meladuras recirculacin de no fermentables sin afectar el proceso y por lo tanto favorece la recirculacin de vinaza Slidos no M ximo 17% No se debe superar este valor fermentables w/w porque la eficiencia de la fermentacin disminuye N itrgeno 200-3000 ppm El N es requerido como fuente en mieles de protena de las levaduras en requerido entrela fermentacin 600 a 800 ppm51

OTROS FACTORESSlidos totales

Parmetro

Concentracin75-80% w/w 7-14% w/w 0.5-4% w/w 1.54% w/w 4.8-8 Prueba cualitativa 0.1-7.0

Cenizas inorgnicas totales Ca como sulfato Slidos orgnicos precipitables Capacidad buffer pH Caractersticas espumantes Caramelo

Afecta la viscosidad y por lo tanto las propiedades de flujo A mayores concentraciones pueden ocasionar toxicidad a las levaduras Causa incrustaciones. Valores alrededor de 2% se consideran normales Incrementa la presencia de infeccin bacterial,afectan la presin osmtica Si es muy alto, incrementa los requerimientos de cido para el proceso Si alto, se incrementa el uso de antiespumantes que pueden inhibir la actividad de la levadura Inhiben severamente las levaduras, afectan eficiencias y produccin de alcohol52

Efecto

OTROS FACTORESParmetro Bacterias y levaduras salvajes Concentracin 1x108 UFC Efecto Inhiben la levadura, competencia en la fermentacin, disminuyen eficiencia Retarda el crecimiento de la levadura, la productividad y reduce el rendimiento

cidos voltiles

4000 -15000 ppm debe mantenerse en 2000 ppm en el fermentador

Trazas de sustancias inhibidoras

Se requiere el uso de biocidas. El amonio cuaternario usado en los medios hasta concentraciones de 10 ppm no representa problemas Existen biocidas que no son biodegradables con la temperatura pero pueden llegar a las mieles o meladuras e impiden la fermentacin . Referencia notas de clase, PRAJ, MATRIX marzo 10 de 200553

OTROS FACTORESContenido de azcar La levadura puede llegar 38% w/v depende de la levadura

Acido Lctico > 0.8% w/v Muerte pH 3-4

Bacterias

Sulfitos (Depende de la variedad )

FACTORES DE STRESS QUE AFECTAN LA LEVADURA

Sodio (ion) >500 mg/L muerte

Temperatura 35C max.

Acido Actico > 2400 ppm inhibe

Slidos disueltos > 20 % w/w54