Bol San. Veg. Plagas, 16: 743-754, 1990

Factores ecofisiológicos relacionados con la susceptibilidad ainsecticidas y la resistencia a malatión en Sitophilus oryzae (L.)(Coleoptera: Curculionidae).

STADLER,T., PICOLLO, M. I. Y ZERBA, E. N.

Se determinaron los principales factores ecofísiológicos que afectan directa eindirectamente los resultados de los estudios toxicológicos y el factor de resistencia almalatión con Sitophilus oryzae. Fue analizada la influencia de la dieta, temperatura deensayo, sexo, estadio y la edad sobre la susceptibilidad a malatión y diferentescompuestos insecticidas de dos cepas de referencia de S. oryzae, una resistente y otrasusceptible al malatión. Las variaciones cuantitativas de los resultados de los ensayostoxicológicos son moderadas a partir del 5o día de edad de las imágenes. No seobservaron diferencias significativas en cuanto a la susceptibilidad a fosforados entreambos sexos; para el lindane en cambio, los machos muestran una susceptibilidad100% superior a la registrada para las hembras. La susceptibilidad al malatión serelaciona en forma inversa con el valor nutritivo de la dieta. EL factor de resistencia almalatión también fue dependiente de la dieta. En insectos criados sobre trigo resultómayor que en insectos criados sobre dieta artificial.

Todos los factores analizados se relacionan estrechamente con variaciones de lasusceptibilidad a xenobióticos a nivel poblacional dentro de la especie; la obtención deresultados comparables y reproducibles depende de la normalización de los citadosfactores antes y durante el bioensayo.

Stadler,T.,' Conicet e Instituto Nacional de Investigación de las Ciencias Naturales"B. Rivadavia". Av. A. Gallardo 470, (1405) Buenos Aires;

Picollo, M. I. y Zerba, E. N. Conicet y Centro de Investigaciones de Plagas eInsecticidas (CIPEIN). Zufriategui 4380, (1603) Buenos Aires, Argentina.

Palabras Clave: Sitophilus oryzae, ecofisiología, susceptibilidad a insecticidas.

INTRODUCCIÓN

El desarrollo de resistencia por parte deciertas poblaciones de especies plaga coe-voluciona cualitativamente con el desarrolloindustrial de compuestos fitosanitarios ycuantitativamente con su posterior aplica-ción. Es así como de año en año se incre-menta el número de especies con represen-tantes resistentes, transformando la prácticafitosanitaria en una empresa cada vez máscompleja y costosa.

La resistencia a insecticidas es un fenó-meno conocido desde principios de siglo,

aunque este hecho adquiere real trascenden-cia a partir de la finalización de la segundaguerra mundial. Así también las prácticasde control de S. oryzae tienen sus comien-zos en 1945 con el uso del DDT, continuan-do con el lindane. Actualmente se utilizanfosforados como el malatión, fumigantescomo son la fosfina y el bromuro de metiloy piretroides como por ejemplo la deltame-trina, aplicándose preferentemente aquelloscompuestos con buena acción residual.

El fenómeno de la resistencia a insectici-das en una determinada cepa en estudio,debe ser definido primeramente desde el

punto de vista bioquímico. Por otra parte,no es menos importante determinar las cau-sas ecofisiológicas que afectan directamentela magnitud y la velocidad de la evolucióndel fenómeno de resistencia que puedenprovocar, promover o retardar su desa-rrollo (STADLER, 1988). El primer paso en labúsqueda de cepas resistentes de S. oryzaees el "monitoréo de la resistencia" enpoblaciones que habitan en el grano alma-cenado, y la finalidad práctica de estosensayos es:

a- detectar resistencia.b- calcular de modo confiable el factor de

resistencia (FR).c- discriminar los compuestos más acti-

vos entre diferentes productos insecticidas.La premisa fundamental para que se

cumplan estos objetivos es que: los ensayosdeben ser comparables, en otras palabras,reproducibles. Es el objetivo del presentetrabajo, determinar la influencia de las prin-cipales variables ecofisiológicas en el ensa-yo toxicológico con S. oryzae, sobre la basede investigaciones previas (STADLER, 1988).

En los últimos años, diversos autores sehan ocupado de la influencia de las varia-bles exógenas o ecológicas y ambientales, ylas endógenas o fisiológicas y poblaciona-les, sobre la susceptibilidad y el desarrollode resistencia a insecticidas (CICHY, 1971;GEORGHIOU & TAYLOR, 1977; GOMEZ et al.,1983; STADLER, 1988).

La variabilidad de los datos de suscepti-bilidad de S. oryzae a diferentes compuestosse debe principalmente -considerando sola-mente los factores exógenos- a la tempera-tura, humedad y dieta imperantes durante eldesarrollo (cría) de la población estudiada,además de las condiciones imperantesdurante el ensayo toxicológico. Un resumi-do análisis de cada una de las más impor-tantes variables muestra que:

Temperatura: La temperatura es proba-blemente el factor extrínseco más importan-te entre todos aquellos que afectan la res-puesta de S. oryzae a un xenobiótico a cortoy largo plazo. La velocidad del desarrollode resistencia en S. oryzae a DDT y a fosfo-rados también es función de la temperatura,

como lo demuestran las experiencias deCICHY (1971), donde para alcanzar un FR =40, se requieren 20 generaciones a 25°C ysolamente 10 generaciones si la incubaciónse realiza a 30°C.

Humedad relativa: El desarrollo deresistencia a DDT y fosforados en 5. oryzaese correlaciona en forma negativa con lahumedad relativa, incubando a 30°C, con55% y 75% de HR respectivamente (CICHY,1971). En la generación 15, el factor deresistencia (para fosforados) alcanzado enlas poblaciones criadas con 55% HR, es21,14, mientras que con 75% HR el factorde resistencia alcanzado es 6,78. A pesar deque estos fenómenos fueron frecuentementecitados en la literatura, hasta el momento,no se habían explicado las causas que deter-minan la estrecha relación entre la HR y losaspectos cuantitativos del fenómeno de laresistencia en S. oryzae.

Dieta: El tipo y la cantidad de alimentodisponible en el medio influye sobre eltamaño del insecto (STADLER, 1988), y segu-ramente sobre su estado general, supervi-vencia y su tolerancia a los plaguicidas. Larespuesta de una población a un insecticidao a algún otro factor adverso está influencia-da por el alimento incorporado durante eldesarrollo, así como también por la ingestamás reciente (CHAMP & DYTE, 1976).

Para poblaciones de S. oryzae criadassobre centeno y presionadas con DDT, seobtienen valores de resistencia a DDT 15veces superiores a aquellos que se obtienensobre cebada. Para fosforados, en las pobla-ciones criadas sobre trigo, el desarrollo dela resistencia es 37 veces superior que enaquellas criadas sobre cebada (CICHY,1971). Por otra parte, modificando la dietadurante la cría (en una generación), el desa-rrollo de la resistencia muestra característi-cas diferentes y distintas dietas tienen unefecto particular en función del insecticidautilizado. En términos generales puededecirse que: la dieta juega un rol importan-te, afectando a corto plazo la susceptibilidadde una población a determinado insecticida,y a largo plazo la velocidad del desarrollode la resistencia.

A través de la normalización del métodode cría de 5. oryzae se obtienen sucesivasgeneraciones con características similares.Las poblaciones presentan un bajo coefi-ciente de variación en el tamaño de los indi-viduos y estado general de los mismos. Porotra parte, la estabilidad de estos dos facto-es actúa como coadyuvante de la verosimi-litud de las experiencias toxicológicas.

Estadio: Es importante la fase o estadiodel desarrollo seleccionado para realizar losensayos toxicológicos - especialmente paralos estudios de acción residual-, ya quedebe llegarse a una solución de compromisoentre : los aspectos prácticos y operaciona-les del ensayo y monitoreo, el ciclo de vidadel insecto y las posibles diferencias en latolerancia de huevos, larvas, pupas e ima-gos al insecticida.

El monitoreo directo de resistencia en S.oryzae, sólo es realizable con imagos, mien-tras que en ensayos posteriores (sobre laFl), es posible comparar la tolerancia dehuevos, larvas, pupas e imagos utilizando laalimentación artificial (STADLER, 1988), y elmétodo de topicación.

Edad: La edad del material biológico esotra de las importantes variables que influ-yen sobre los resultados de los ensayos toxi-cológicos. Para una cepa malatión resistentede T. castaneum, la tolerancia de los imagosse encuentra incrementada tres veces duran-te los primeros 4 - 5 días de vida. En la cepasusceptible en cambio, las variaciones de lasusceptibilidad a Malatión, son menos evi-dentes durante el mismo período, y la tole-rancia sufre un paulatino incremento con laedad (CHAMP & CHAMPBELL-BROWN, 1970).

Sexo: En insectos plaga del grano alma-cenado, la susceptibilidad a insecticidas esgeneralmente distinta para ambos sexos,

Insecticidas utilizados:

aunque esta diferencia, en general, no essignificativa. Las distintas respuestas nosiempre se deben a diferencias morfométri-cas entre los individuos de ambos sexos,sino también a diferencias en la tasa de asi-milación y metabólica (BUSVINE, 1971). Envarias especies plaga así como en el presen-te caso, la relación de sexos en la poblaciónes 1:1, de modo que este factor no represen-ta una fuente de variación significativa enlos monitoreos toxicológicos rutinarios. Sinembargo, es fundamental tenerlo en cuentaya que se trata de uno de los más importan-tes factores modificadores de la resistenciaen S. oryzae, especialmente cuando la resis-tencia está ligada al sexo. Este es un fenó-meno conocido para el caso de los piretroi-des (HEATHER, 1986) y para DDT (CHAMP,1967).

MATERIAL Y MÉTODOS

Material biológico: Las cepas de 5. ory-zae utilizadas en los ensayos toxicológicosson las Cipein-s y Cipein-rm (CIPEIN-CITE-FA, Buenos Aires, Argentina). La metodolo-gía de incubación, alimentación (dieta arti-ficial) y cría utilizadas responden exacta-mente a las técnicas de STADLER (1988). La"dieta natural" utilizada fue Triticum aesti-vum - Germoplasma Mexicano (Victoria-Inta) y la "dieta imcompleta", pellets deharina de trigo.

De los cultivos Cipein-S y Cipein-rm(cepa susceptible normal y resistente amalatión) se seleccionaron individuos de 5 -10 días de edad, que fueron anestesiados ysexados. Los insectos no fueron sometidos aayuno previo a los ensayos toxicológios.

Preparación de las soluciones: Como

COMPUESTO

MALATIÓN

DELTAMETRINA

LINDANE

ORIGEN

Cyanamid Argentina

Roussel Uclaf

Sintyal

GRADO DE PUREZA

purif.por cristaliz.>98%

97%

95%

solvente se utilizó una mezcla de tres partesde éter de petróleo y una de acetona (v/v).Luego de un screening, que permitió ajustarlas correspondientes concentraciones paracada insecticida, se prepararon las series dediluciones a partir de soluciones madre de10mg/ml de cada compuesto.

Aplicación del tóxico: Se utilizó elmétodo del tópico, aplicándose 0,2 ul sobrela superficie ventral del abdomen de cadainsecto. Para ello se utilizó una jeringaHamilton N 701-N de 10 (J.1 provista de un"repeating dispenser" Hamilton N° PB-600-1 adaptado. La topicación se realizó conestereomicroscopio y anestesia con C02.

Para cada concentración del xenobióticose topicaron seis grupos de 30 individuos decada sexo, que fueron posteriormente colo-cados en recipientes separados (frascos devidrio de 20ml con ventilación en el extre-mo superior), en estufa de cultivo a 28 ±1°C y 77% ± 2%HR y en ausencia de ali-mento durante 24 horas. Por cada serie dediluciones y bajo las mismas condiciones sepreparó un control, topicando con 0,2 |il desolvente por individuo.

Evaluación de los ensayos: Transcurri-das 24 horas a partir de la topicación se

anotaron los datos de mortalidad. El criteriopara evaluar la respuesta fue la caída delinsecto ("knockdown"), definida como laincapacidad pra sostenerse y caminar. Elcálculo de la dosis letal para 50% de lapoblación (Dl50) se realizó mediante unprograma de computación de probabilidadestadística, basado en el método de LITCH-GIELD & WlLCOXON (en PlCOLLO DE VlLLARet al, 1985); el factor de resistencia secalculó como sigue: FR = DL50 Cipein-RM/ DL50 Cipein-S.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Valores de DL50 de distintos insecticidas:

Los valores de dosis letal media (DL50)para tres diferentes insecticidas obtenidaspor el método del tópico se resumen en elCuadro 1. Para la cepa CIPEIN-S se observael siguiente orden de susceptibilidad enambos sexos para los insecticidas ensaya-dos: deltametrina > malatión > lindane.

Influencia de distintas variables sobrela susceptibilidad a insecticidas:

Cuadro 1. Valores de dosis letal media (DL50) para diferentes insecticidas, determinados para ambos sexos dela cepa Cipein-S y Cipein-RM. En condiciones estándar de ensayo (* = Intervalo confidencial; ug/I = ug/insecto).

seX0

MACHOS

HEMBRAS

comp.

MALATIÓN

DELTAMET.

LINDANE

MALATIÓN

DELTAMET.

LINDANE

De acuerdo con las anteriores considera-ciones, la respuesta a un xenobiótico escaracterística para cada especie e insectici-da; pero también difiere entre poblacionesde una misma especie o entre fases, esta-dios, intervalos de edad en un estadio o sim-plemente entre individuos con diferenteestado fisiológico. Para S. oryzae, el análisisindividual de cada una de estas variablesmuestra que:

Edad: Durante los primeros cinco días devida del imago, se observa menor suscepti-bilidad a malatión así como mayor desvia-ción en la respuesta toxicológica. En la Fig1., puede observarse un incremento gradualde la susceptibilidad a malatión durante losprimeros tres días de vida del imago; estefenómeno se revierte gradualmente a partirdel 5o día y permanece estable hasta el 15día, a partir del cuál sufre un leve incremen-

Fig.l.: Variaciones de la tolerancia a malatión en función de la edad de los individuos (imágenes), en la cepaCipein-S a 28 +1°C y 77% +2%HR.

to. La variabilidad observada en la suscepti-bilidad durante los primeros cinco días devida del imago se debe probablemente a unaserie de eventos fisiológicos que modificanla penetración y el metabolismo del xeno-biótico. Estos fenómenos se relacionanposiblemente con el curtido de la cutícula,la maduración sexual y con los importantescambios en el metabolismo de los lípidos ehidratos de carbono que se producen alcomenzar la fase adulta (SINGH & SINHA,1977).

Tomando estos ensayos como referencia,puede decirse que el intervalo de edad reco-mendado para el material biológico destina-do a experiencias toxicológicas es entre 5 y10 días.

Sexo: A pesar de que el promedio delpeso corporal de las hembras es aproxima-damente un 15% superior al de los machos(HEMBRAS, X = l,52mg, S=o,314; MACHOS,x = l,27mg, S=o,277), la respuesta toxico-lógica es similar en ambos para el malatióny la deltametrina. Para el lindane en cam-bio, la susceptibilidad del macho es un100% mayor que la de la hembra en cepassusceptible y resistente (Cuadro 1).

Temperatura: La temperatura es cierta-mente el factor extrínseco que más signifi-cativamente afecta la respuesta de estosinsectos a un xenobiótico. Este factor actúaen varios niveles:

a.- la temperatura a la cual evolucionó lacepa. Esto es especialmente importante paracepas resistentes.

b.- la temperatura de incubación durante

la cría.c - la temperatura a la que los insectos

fueron mantenidos antes, durante y despuésdel ensayo toxicológico.

Este último punto es particularmenteimportante debido a la estrecha interrela-ción de la temperatura con la actividad delos insectos, en relación con los fenómenosde intoxicación y detoxificación, concentra-ción del xenobiótico en el sitio de acción yeventual recuperación de la intoxicación.

CHAMP & CHAMPBELL-BROWN (1970),demostraron que un cambio de la tempera-tura, de 25°C a 30°C, provoca un incremen-to de aproximadamente x 1,5 en la toxicidadde malatión, diazinon y fenitrotión en S.oryzae. Por otra parte, THAUNG & COLLINS(1986) comprobaron que la toxicidad delfenitrotión para S, oryzae se ve incrementa-da con la temperatura, en contraste con lacipermetrina que posee un efecto negativo.

Los ensayos toxicológicos a 15, 26 y30°C muestran que la susceptibilidad para elmalatión se correlaciona positivamente conla temperatura (Fig. 2, Cuadro. 2), mientrasque para el caso de la deltametrina, estacorrelación es negativa (Fig. 3, Cuadro. 2).

De acuerdo con las anteriores considera-ciones, se estableció que 28+l°C es un valoraceptable desde el punto de vista fisiológicoasí como del operacional para los ensayostoxicológicos.

Humedad Relativa: La economía delagua en las plagas de los granos almacena-dos tiene características muy particularesdebido a que éstas se encuentran adaptadas

Cuadro 2. Valores de DL50 para malatión y deltametrina a diferentes temperaturas y 77%HR para la cepaCipein-S de S. oryzae criada sobre dieta artificial.

Insecticida

Malatión

Deltametrina

a vivir en ausencia de agua libre, enambientes donde la actividad del vapor deagua (av) es particularmente baja. Paracompensar las pérdidas, estos insectos repo-nen el agua con el alimento, la absorben de

la atmósfera o la ganan a partir de la oxida-ción de carbohidratos primarios y grasas(agua del metabolismo).

En S. oryzae, la mayor parte del aguaperdida por transpiración es reemplazada

Fig.2.: Toxicidad del Malatión a diferentes temperaturas y 77% H. Cepa Cipein-s, criada sobre alimento artificial.

por agua absorbida del ambiente en formapasiva y activa. La transpiración es reguladaa su vez por la concentración interna deagua (av interna), que es constante e inde-pendiente de la concentración externa (av

externa). Una importante adapatación deesta y de otras especies que se desarrollanen habitats tan extremos es la capacidad deregular la incorporación de agua modifican-do el consumo de alimento en función de su

Fig.3.: Toxicidad de la deltametrina a diferentes temperaturas y 77% HR, Cepa Cipein-s, criada sobre alimento artificial.

propio balance interno (ARLIAN, 1979). Lapérdida neta de agua por transpiración solopuede ser compensada completamente porla via digestiva en atmosferas con una av =0,85-0,65. Por arriba o debajos de estoslímites (o,65 « a v » 0,85), S. oryzaereduce significativamente el consumo dealimento. El balance general de agua en S.oryzae puede resumirse de la siguientemanera:

1.- Con actividades de vapor de 0,225, lapérdida de agua por transpiración excede ala ganancia por el metabolismo, absorción eincorporación con el alimento. La tasametabólica no se modifica para compensarel déficit.

2.- Con actividades de vapor entre 0,65 -0,85, el agua incorporada con el alimento,absorción y metabolismo, compensa laspérdidas por transpiración y metabolismo.

3.- Con actividades de vapor de 0,99, elagua incorporada con el alimento se reduce aldisminuir el consumo de alimento y la absor-ción compensa ampliamente las pérdidas.

Puede concluirse que: en las cepas que sedesarrollan sobre grano tratado con insec-ticidas y en ambientes con baja HR, elrápido incremento de la resistencia es con-secuencia exclusiva del aumento de la dosisde pesticida incorporado a causa del incre-mento en el consumo de alimento.

Para mantener a S. oryzae fuera de condi-ciones de stress por desecación o exceso dehumedad, es recomendable fijar en 77% +2% la humedad relativa; tanto para la cría delinsecto como para el ensayo toxicológico.

Dieta: Define el tamaño y estado fisioló-

gico general del material biológico. Laspoblaciones alimentadas sobre sustratos demenor valor nutritivo (dieta incompleta)muestran mayor susceptibilidad a malatiónen los ensayos toxicológicos (Fig. 4, Cua-dro 3). Este fenómeno puede deberse enparte, a la distribución homogénea de todoslos componentes dentro del comprimido dealimento artificial, los que en la semilla detrigo se encuentran compartimentalizados -formando un sistema heterogéneo- y nosiempre al alcance de la larva, especialmen-te durante los primeros estadios de su desa-rrollo. También es apreciable la diferencia

Cuadro 3. Datos toxicológicos comparativos paramalatión de poblaciones de Cipein-S, criadas sobretres tipos de dieta diferentes en condicionesestándar de ensayo.

en la susceptibilidad entre las poblacionesalimentadas a base de trigo y a base de ali-mento artificial.

A pesar de la buena perfomance del ali-mento artificial, es innegable el valor nutri-tivo de la semilla de trigo; sin embargo, enel primero se descarta totalmente la influen-

Cuadro 4. Caracterización toxicológica para malatión, de las cepas Cipein-s y Cipein-rm criadas sobre trigo ysobre dieta artificial en condiciones estándar de ensayo.

cia de variables tales como: textura, caracte-rísticas fisico-químicas del pericarpo ytamaño del grano, que dependen de la hibri-dización (GOMEZ et al, 1983) y del almace-

namiento (PENG et al, 1983).Determinación del factor de resistenciaLos valores de FR obtenidos por el méto-

do del tópico para poblaciones criadas sobre

Fig. 4. Susceptibilidad a malatión en tres poblaciones de 5. oryzae criadas sobre diferentes dietas en condiciones

estandard de ensayo.

trigo y alimento artificial, difieren en formasignificativa (Cuadro 4). El intervalo confi-dencial para el FR calculado para las pobla-ciones criadas sobre alimento artificial esalgo más estrecho que el calculado parapoblaciones criadas sobre trigo.

CONCLUSIONES

1.- Las principaels variables que afectanlos resultados de los ensayos toxicológicoscon 5. oryzae, así como la formación de laresistencia a insecticidas en poblaciones deesta especie son: temperatura, humedad rela-tiva, dieta, estadio del desarrollo, edad y sexo.

2.- Queda claramente demostrada lainfluencia de la dieta sobre la susceptibili-dad de una cepa a determinado insecticida ysobre el factor de resistencia medido parauna cepa resistente a malatión. Es recomen-dable utilizar individuos criados sobre elmismo tipo de dieta (preferentemente artifi-

cial) para los ensayos toxicológicos.3.- El sexado es un paso indispensable

dentro del esquema de los ensayos toxicoló-gicos a nivel de laboratorio, ya que en algu-nos casos la diferencia de la respuesta deambos sexos, a determinado xenobiotico, esaltamente significativa (ver lindane).

4.- La temeperatura y humedad relativarecomendada para el ensayo toxicológicocon S. oryzae es 28 ± 1°C y 77% ± 2% HR.Bajo estas condiciones, los individuos man-tienen su normal actividad y se encuentranfuera de los límites de las condiciones destress provocado por alteraciones en subalance hídrico.

5.- Para el ensayo toxicológico, el inter-valo de edad ideal de las imágenes es entrelos 5 y 10 días. Dentro de este intervalo deedad se observa la menor desviación en larespuesta toxicológica.

6.- De entre los insecticidas ensayados,las cepas CIPEIN de S. oryzae muestran unaalta susceptibilidad a piretroides.

ABSTRACT

STADLER,T., PICOLLO, M. I. Y ZERBA, E. N.(1990): Factores ecofisiológicosrelacionados con la susceptibilidad a insecticidas y la resistencia a malatión en Sitophilusoryzae (L.) (Coleoptera:Curculionidae). Bol. San. Veg. Plagas, 16 (4): 743 - 754

Main factors affecting the results of toxicological studies and the resistance factorto malathion in Sitophilus oryzae are identified. The influence of diet, temperature,sex, stage of development and age over the susceptibility to several insecticides wasstudied in two strains of 5. oryzae. Susceptibility of 0 - 5 days-old imagines isvariable. There are no significant differences in the susceptibility toorganophosphorous insecticides between sexes; however, males show 100% highersusceptibility to lindane than females. There is an inverse relationship berweensusceptibility and dietary nutritive value. The resistence factor to malathion showed tobe dependent to the diet. It was higher in insects reared on wheat than on artificial diet.

All these factors are closely related to susceptibility to xenobiotics within weevilpopulations. Therefore, comparable and reproducible results depend on thestandardization of conditions prior to and during bioassays.

REFERENCIAS

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(Aceptado para su publicación: 17 Julio 1990)