Diagnóstico Bioquímico de las Enfermedades lisosomales por...
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Diagnóstico Bioquímico de las Enfermedades Lisosomales por el Laboratorio Clínico Dr. Joaquín Bobillo Lobato Laboratorio de Enfermedades Lisosomales HHUU Virgen del Rocío de Sevilla
Sevilla, 16 de octubre de 2014
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2014
Diagnóstico Bioquímico de las
Enfermedades Lisosomales por el
Laboratorio Clínico
Las enfermedades lisosomales
Estrategias diagnósticas Actividad enzimática
Sustrato acumulado
Productos atípicos
Algunos ejemplos diagnósticos
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Las enfermedades lisosomales
Enfermedades metabólicas “citológicas” Lisosoma
Enzimas, proteínas, cofactores
Enfermedades de depósito Progresivas
≈ 50 enfermedades 1/7000-8000
Clasificación Naturaleza del compuesto acumulado
Lipidosis Mucopolisacaridosis Glucogenosis
Defecto molecular Hidrolasas lisosomales Def. postraduccionales Def. tráfico
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Glucoproteinosis Mucolipisosis Liposusinosis
Def. protección Proteínas no enzimáticas Proteínas transmembrana
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Enfermedades Lisosomales Fundamento
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Acción enzimática lisosomal
Deficiencia enzimática lisosomal
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Enfermedades Lisosomales Consecuencias fisiopatológicas
Déficit enzimático
Acúmulo de sustancias no degradadas
Deficiencia de productos
Aparición de productos
atípicos
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DIAGNÓSTICO
Diagnóstico
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DIAGNÓSTICO Déficit Enzimático
Poner de manifiesto la deficiencia de actividad enzimática
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SUSTRATO
Marcador
Marcador
Cuantificación equipo de
análisis
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Actividad enzimática
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DIAGNÓSTICO Déficit Enzimático
Poner de manifiesto la deficiencia de actividad enzimática
Sangre seca en papel
Células Tejidos
Muestras
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Sustratos Específico
de la enzima
Marcador
Marcadores
Productos Óxido-reducción
Fluoróforos 4-metil-umbeliferona
Derivat. de sustratos Productos z/m específicos
Nuevos marcadores “Nano-química”
Métodos de análisis
Espectrofotometría
Espectrofluorimetría
Espectrometría de masas
Nuevos sistemas de detección
Fabry Galactosa
Gaucher 4-MU-β-D-glucopiranosido
Análisis multiplex
Puntos cuánticos
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DIAGNÓSTICO Déficit Enzimático
Poner de manifiesto la deficiencia de actividad enzimática
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Isoenzimas
Control condiciones ensayo
Sustratos específicos
Inhibidores específicos
Efecto Lyon y/o Mosaicismos
Índices enzimas específicas
Estudio genético
Otras limitaciones
Soluciones particulares
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DIAGNÓSTICO ENZIMÁTICO Enfermedad de Pompe
Actividad α-Glucosidasa ácida (EC 3.2.1.20)
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MUESTRA SUSTRATO-4MU PRODUCTO
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Linfocitos
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DIAGNÓSTICO ENZIMÁTICO Enfermedad de Pompe
Actividad α-Glucosidasa ácida (EC 3.2.1.20)
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Actividad Ácida Total
AαG
Actividad Inhibida
AαGIA
Actividad Neutra Total
NαG
Blanco Ácido
Blanco Neutro
Buffer ácido Sustrato ácido Acarbosa Buffer neutro Sustrato neutro Buffer ácido Buffer neutro
AαG
• Actividad αG en el lisosoma
• Incluye maltasas ácidas
NαG
• Actividad glucosidasa total
• Similar entre Sanos y Pompe
• Calidad del proceso
AαGIA
• Actividad efectiva
• AαG componente principal
• Pompe: AαG AαGIA
NαG/AαGIM
(AαG-AαGIM)/ /AαGIM
• Diferente comportamiento de las distintas facciones de actividad αG permite diferenciar pacientes Pompe
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DIAGNÓSTICO Sustancias no degradadas
Poner de manifiesto el acúmulo de sustratos no degradados
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PRODUCTO
FINAL Enzima
Productos
Intermedios Enzima
SUSTRATO ESPECÍFICO
SUSTRATOS
Sangre Orina Tejidos
DETERMINACIÓN
Microscopía / Tinción Fotometría
Cromatografía Espectrometría…
Déficit de productos
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DIAGNÓSTICO Sustancias no degradadas
Poner de manifiesto el acúmulo de sustratos no degradados
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Ferraz et al. Biochim Biophys Acta. 2014;1841(5):811-25
Groener et al. Clin Chem. 2007;53(4):742-47
Chuang et al. Orphanet J Rare Dis. 2014; 9:135
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DIAGNÓSTICO SUSTANCIAS NO DEGRADADAS MPS
Poner de manifiesto el acúmulo de sustratos no degradados
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Diagnóstico de MPS
Test de Berry
GAG´s en orina
Cromatografia en capa fina
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DIAGNÓSTICO Productos atípicos
Poner de manifiesto la presencia/aumento de sustancias atípicas
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Ruta alternativa
Ruta alternativa
Ruta alternativa
Ruta alternativa
PRODUCTO
FINAL Enzima
Productos
Intermedios Enzima
SUSTRATO ESPECÍFICO
COMPENSACIÓN
HOMEOSTÁTICA
PRODUCTOS ATÍPICOS
DETERMINACIÓN
Fotometría Fluorometría
Cromatografía Espectrometría…
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DIAGNÓSTICO Productos atípicos
Poner de manifiesto la presencia/aumento de sustancias atípicas
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Cht
CCL18/PARC
Complejo HC IIT Glc4
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DIAGNÓSTICO PRODUCTOS ATÍPICOS Enfermedad de Fabry
Poner de manifiesto la presencia/aumento de sustancias atípicas
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Rombach et al. Biochim Biophys Acta. 2010;1802(9):741-8.
METODOLOGÍA HPLC
Extracción lipídica con solventes orgánicos
Fase de derivatización OPA
Columna de separación UNISON UK-C18
Fase móvil: Metanol/agua
Flujo de 1,0 ml/min
Tiempo recorrido cromatográfico 30 min.
Tiempo de retenión 9,5 min.
Detección fluorescente:
Excitación: 340 nm
Emisión: 435 nm
Estándar interno: D-eritro-dihidroesfingosina
Groener et al. Clin Chem. 2007;53(4):742-47
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Diagnóstico Bioquímico de las
Enfermedades Lisosomales
Estrategias diagnósticas
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PATOLOGÍA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA SUSTRATO
ACUMULADO PRODUCTOS
ATÍPICOS
ENFERMEDAD DE POMPE
α-glucosidasa ácida y fracciones
(DBS y Linfocitos) …
Glucosa tetrasacárido
(Orina)
ENFERMEDAD DE FABRY
α-galactosidasa (DBS y Plasma)
… Lyso-Gb3 (Plasma)
ENFERMEDAD DE GAUCHER
β-glucosidasa (DBS y Leucocitos)
… Quitotriosidasa
y CCL18/PAR (Plasma)
MPS TIPO I α-iduronidasa
(DBS y Leucocitos) GAG´s (orina)
…
OTRAS ENF. LISOSOMALES
β-galactosidasa β-glucuronidasa
… …
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Laboratorio de enfermedades lisosomales Sevilla
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Laboratorio de enfermedades lisosomales 3ª Planta, Ed. Laboratorios, HHUU Virgen del Rocío
Manuel Siurot s/n, 41013 Sevilla Dr. Luis Jiménez Jiménez ([email protected]) Hospital Universitario Virgen del Rocío
Dr. Joaquín Bobillo Lobato ([email protected])
Hospital Universitario Virgen de Valme
Pilar Durán Parejo (TEL) ([email protected]) Hospital Universitario Virgen del Rocío
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Diagnóstico bioquímico de enfermedades lisosomales en España
Hospital Clínico Universitario de Santiago
de Compostela
Dr. Cristóbal Colón Mejeras
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Inst. de Bioquímica Clínica Hospital Clínic
Dr. Wladimiro Jiménez Povedano Dra. Antònia Ribes Rubió
Fundación Jiménez Díaz
Dr. Jesús Egido de los Ríos
Hospital Universitario Virgen del Rocío
Dr. Luis M. Jiménez Jiménez
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MUCHAS GRACIAS
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