CARACTERIZACIÓN PARCIAL, ESTUDIO BIOQUÍMICO Y MOLECULAR DEL GRÁNULO DE ALMIDÓN DE MAÍZ

1. RESUMEN Recientemente las variedades pigmentadas de maíz han cobrado mayor interés,

Debido a que éstas presentan un alto contenido de antioxidantes naturales; por lo

que la aplicación comercial de estos maíces tiene muchas posibilidades. Para

explotar adecuadamente estos granos hace falta investigar las características de

su principal constituyente que es el almidón. El almidón está organizado por

partículas discretas conocidas como gránulos, su tamaño forma, composición, va

a estar directamente relacionado con sus propiedades funcionales y por lo tanto

con sus posibles usos en la industria. En este trabajo se estudió a los gránulos de

maíz azul (MA), comparado con los gránulos de maíz blanco (MB). El almidón se

aisló del endospermo. Ambos almidones presentaron un alto contenido de

proteínas, por lo que se realizó una extracción para eliminar esas proteínas, lo

cual produjo una disminución de 8.3% a 1.8% en maíz azul (MA) y de 7.5% a 2.3%

en maíz blanco (MB), obteniéndose así un almidón purificado con un contenido de

almidón total de 92.96 y 93.8% para MA y MB, respectivamente. El almidón

dañado de las muestras fue de 12.6% para MA y 5.05% para MB. El almidón de

MA presentó una mayor temperatura de inició y de pico, así como entalpía de

gelatinización (70ºC, 74.7ºC y 10.5 J/g, respectivamente) que el almidón de MB

(65.2ºC, 70.7ºC y 8.9 J/g, respectivamente). Los gránulos de almidón de MA

fueron predominantemente redondos y presentaron poros; los de MB presentaron

la tendencia a ser elípticos. En la 2D-PAGE se observó la presencia de la enzima

GBSSI de 60 kDa con un pI entre 5-6. Otras enzimas de biosíntesis como la SSSI

(80 kDa), SSSII (120 kDa), SBEI (88 kDa) y SBEII (90kDa) se observaron en la

SDS-PAGE del proceso de extracción de proteínas, con un patrón electroforético

diferente entre las muestras. El contenido de amilosa aparente entre la población

de gránulos grandes y pequeños no presentó diferencia estadística (p>0.05).

2. INTRODUCCIÓN México es el cuarto productor mundial de maíz (Sea mays L.) y uno de los

principales importadores del mismo. En nuestro país, el maíz es la principal fuente

de calorías y proteínas para los habitantes de las zonas rurales que representan

los estratos más pobres de la sociedad. Además, este grano se emplea en forma

creciente en el sector pecuario (Paredes-López et al., 2006). El maíz es una

fuente de calorías para los humanos y los animales debido a que presenta un alto

contenido de almidón, que es el principal constituyente de su grano. Esta

característica ha promovido su uso a nivel industrial.

El almidón esta formado por moléculas de amilosa y amilopectina, las cuales son

polímeros de D-glucosa. En la amilosa las unidades de glucosa están unidas

mediante enlaces glicosídicos α 1-4 y forman largas cadenas lineales. La molécula

de amilopectina se caracteriza, además, por la presencia de ramificaciones

formadas por uniones α 1-6 entre unidades de glucosa. En las células vegetales el

almidón se dispone en forma de gránulos, los cuales poseen una proporción

variable de amilosa y amilopectina, dependiendo de la especie, su localización en

la planta y su etapa de desarrollo. Estas diferencias dependen de las enzimas que

catalizan los procesos de síntesis y degradación del almidón y de la compleja red

de mecanismos que regulan este proceso. En años recientes, el interés por

conocer más acerca de las enzimas implicadas en la biosíntesis del almidón ha

aumentado, debido a que éstas definen las características morfológicas, de

tamaño y de composición de sus gránulos. Estos factores determinan, a su vez las

propiedades físico-químicas del almidón y por lo tanto, sus características

nutricionales y funcionales (James, 2003).

En México se han descrito numerosas variedades de maíces pigmentados (Ortega

et al., 1991), cuyos colores negros, morados y rojos se deben a las antocianinas

presentes en diferentes partes del grano (Wellhausen et al., 1951; Salinas-

Moreno, 2000). Estas variedades han cobrado gran importancia debido a sus

propiedades nutraceuticas. Varios estudios se han enfocado a la extracción,

caracterización y utilización de sus colorantes para la industria de alimentos

(Fossen et al., 2001). Algunos estudios disponibles en la literatura científica

indican que los productos a base de estos maíces, como es el caso de la tortilla,

presentan mejores características de sabor y textura, que los elaborados a partir

de maíz blanco. Hemos planteado como hipótesis de este trabajo que las

diferencias en las características organolépticas de los alimentos preparados con

maíces pigmentados con respecto al blanco reflejan diferencias en el contenido y

composición de su almidón. En este estudio nos proponemos conocer la

composición química, distribución de tamaño y morfología del gránulo de almidón

del maíz azul y en una segunda etapa, aislar y estudiar algunas de las enzimas

participantes en su biosíntesis. La información generada en este proyecto

permitirá una mejor caracterización de esta variedad de maíz azul, en cuanto a su

morfología, distribución de tamaño y composición química de sus gránulos de

almidón y de las enzimas que lo sintetizan, lo cual facilitará la evaluación de sus

potencialidades nutricionales e industriales. Eventualmente, este proyecto puede

aportar información útil para entender mejor los mecanismos de síntesis y

crecimiento de los gránulos de almidón de maíz.

3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GENERAL Caracterizar química y morfológicamente a los gránulos de almidón de maíz y

realizar el estudio de algunas enzimas involucradas en su síntesis desde el punto

de vista bioquímico y molecular.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Realizar la caracterización química parcial del almidón de maíz.

Purificación del almidón en estudio. Caracterizar morfológicamente el almidón de dos variedades de maíz.

Conocer la distribución de tamaño de los gránulos de almidón.

Separación de éstos en base a su tamaño.

Determinación de sus propiedades térmicas. Realizar estudios bioquímicos y moleculares de algunas enzimas involucradas en la

biosíntesis de los gránulos. Nota: los objetivos marcados en negritas son los que se realizaron en el 2007 y con lo que se

concluye este proyecto.

4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1 MATERIALES Se utilizó maíz pigmentado y maíz blanco (H511) como control, donados por el

INIFAP Texcoco e Iguala, respectivamente.

4.2 MÉTODOS

4.2.1 Extracción de proteínas

Se realizó una extracción de proteínas para obtener un almidón con alta pureza. El

almidón se suspendió (1 g) en 5 mL de metabisulfito de sodio al 1% en baño maría

a 45ºC por 48 h. Posteriormente, se dejó en reposo a 4ºC por 2 h y se centrifugó a

6 000 g a 4ºC por 10 min. El residuo se suspendió en 10 mL de Cloruro de sodio

(NaCl) 0.5 M en agitación a 4ºC por 1 h y se centrifugó (6 000 x g, 4ºC, 10 min). Al

residuo se le adicionó 10 mL de etanol, se dejó en agitación por 20 min a

temperatura ambiente y se centrifugó (6 000 x g, 4ºC, 10 min). El sobrenadante se

descartó y al residuo se lavo con 20 mL de agua destilada y se centrifugó (6000 x

g, 4ºC, 10 min). Este lavado se repitió dos veces. Finalmente, el sobrenadante se

descartó y el almidón se secó a 40ºC por 3 h.

4.2.2 Microscopía electrónica de barrido (MEB) La microscopía electrónica de barrido (MEB) provee una mayor perspectiva de la

superficie del gránulo de almidón así como de su morfología. Se utilizó el método

reportado por Paredes-López y col. (1989). La muestra de almidón se espolvorea

sobre una cinta conductora de cobre de doble adhesión, la cual se fija previamente

en un soporte de aluminio del microscopio electrónico de barrido JEOL (Japan

Electronic Optical Limited,Modelo, JSEM 35CX, Japón). La muestra se cubrió con

una capa de carbón de 30 nm. Las muestras se colocaron en el ionizador de

metales JEOL y se recubrió con una capa de oro de 60 nm. Las muestras fueron

observadas al microscopio electrónico de barrido a un voltaje de 8 kV y se

tomaron las fotografías.

4.2.3 Propiedades térmicas Las propiedades térmicas de los almidones se estudiaron empleando CDB (TA

Instruments, modelo 2010, New Castle, E.U.A.). Los almidones tienen la

capacidad de sufrir un cambio o transición cuando son calentados en medio

acuoso. La calorimetría diferencial de barrido es una técnica termoanalítica que

sirve para monitorear éstos cambios, como función de la temperatura, por medio

de detección de cambios de calor asociados con el proceso. El principio de la

medición es la comparación de la razón de flujo de calor hacia la muestra y un

material inerte de referencia, los cuales son calentados a la misma velocidad.

4.2.4 Gelatinización La gelatinización de los almidones se evaluó por el método propuesto por

Paredes-López y col. (1994), el cual consistió en pesar 2 mg de muestra (en base

seca, mínimo tres réplicas) dentro de una charola de aluminio, se le adicionaron 7

µL de agua desionizada. Se selló la charola herméticamente y se dejó equilibrar a

temperatura ambiente durante 1 h antes de realizar el análisis. Como referencia se

utilizó una charola de aluminio vacía. Transcurrido el tiempo de equilibrio, la

muestra se sometió a un programa de calentamiento en un intervalo de

temperatura de 0 a 120 °C con una velocidad de calentamiento de 10 °C/min. La

temperatura de inicio (Ti), la temperatura de gelatinización o de pico (Tp), la

temperatura final (Tf) y la diferencia de entalpía (∆H) se obtuvieron directamente

del análisis realizado con el software TA Instruments 2010 versión 2.1.

4.2.5 Caracterización bioquímica

4.2.5.1 Extracción de proteínas Se tomó una muestra de 1 g de almidón a la cual se le realizaron cuatro lavados

con 10 mL de regulador de extracción (50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM EDTA; 1

mM de DTT) y dos veces con regulador de lavado (62.5mM Tris-HCl, pH 6.8;

10mM DTT; SDS al 2%), la muestra se agitó durante 15 min a 4 ºC;

posteriormente se centrifugó a 13,000 x g por 10 min a 4 ºC. Al residuo, se le

adicionaron 30 mL de regulador de lavado y se llevó a ebullición por 15 minutos

con agitación constante. Posteriormente se congeló (-20 °C) por 1 hora,

transcurrido este tiempo, la muestra se descongeló y se centrifugó a 13000 x g por

30 minutos a 4 ºC. El sobrenadante se recolectó y se le adicionó un volumen igual

de una solución de ácido tricloroacético: acetona (30:70 v/v) 30% (-20 °C) para

precipitar las proteínas y se dejó reposar por 2 h a -20 °C. La muestra se

centrifugó a 13000 x g por 10 minutos. Se descartó el sobrenadante y el residuo se

lavó dos veces con acetona, después de cada lavado se centrifugó a 13,000 x g

por 5 min a 4 ºC, el residuo se dejó secar (proteína concentrada) (Peng y col.,

2000). En cada etapa, de cada sobrenadante se recuperó 1 mL con el objetivo de

realizar una SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel

electrophoresis) para separar las proteínas de acuerdo a su peso molecular y

observar si se eliminaron proteínas de almacenamiento y de superficie de la

muestra. La proteína concentrada se rehidrató con 1 mL de regulador (8 mM urea,

2 % CHAPS, 0.002% azul de bromofenol). Se cuantificó el contenido de proteína

mediante el método de Bradford.

4.2.5.2 Separación de proteínas por primera dimensión (Punto Isoeléctrico) El isoelectroenfoque se realizó de acuerdo a Amersham Biosciences Uppsala,

Sweden (Barkelman and Stenstet, 2002). Se utilizaron tiras de imobilinas de 11

cm, con un gradiente de punto isoeléctrico (pI) de 4 a 7. Las tiras de immobilina

fueron equilibrados por 15 min en regulador de equilibrio (6M urea, 2 M tiourea, 50

mM tris pH 8.8, 30 % glicerol, 10 % SDS, 1 % DTT). Se dejaron en reposo por 16

h, antes de realizar el isoelctroenfoque. Para pruebas preeliminares se trabajó con

tiras de 7 cm y un gradiente de pI de 3-10.

4.2.5.3 Separación en segunda dimensión (Peso Molecular) Las proteínas separadas por pI en las tiras de immobilina se colocaron en

regulador de corrida por 15 min con agitación. Las tiras se cargaron en un gel para

electroforesis discontinua. Para esta electroforesis se preparon 2 geles, el gel de

corrida, donde se separan las proteínas, y el gel de apilamiento o gel concentrador

(“stacking”) que como su nombre lo indica, concentra la mezcla. El gel de corrida

se preparó con una concentración de acrilamida del 12%, mientras que el

concentrador fue de 4%. La electroforesis se corrió a 10 mA por gel durante 5 h,

aproximadamente. Los geles fueron teñidos con azul de Coomasie durante 1 h.

Los geles teñidos fueron digitalizados, y analizados con software para 2D

(PDQuest 7.2, BIO-RAD®). Las manchas fueron caracterizadas con respecto a su

peso molecular y punto isoeléctrico por interpolación bilineal entre características

del gel con respecto a los estándares.

4.2.5.4 Identificación de proteínas (MALDI-TOF) Las manchas de interés fueron cortadas manualmente de los geles de

electroforesis de dos dimensiones, se destiñeron y se colocaron en tubos

eppendorf con agua destilada. Se realizó una digestión tríptica y los péptidos

obtenidos se analizaron por espectrometría de masas MALDI-TOF. La información

que se obtuvo se analizó mediante el programa MASCOT, que utiliza una base de

datos para identificar proteínas.

4.2.6 Análisis estadístico Para determinar las diferencias estadísticas se aplicó un análisis t-student a un

nivel de significancia del 5% (p=0.05). Para determinar diferencias en la

caracterización fisicoquímica de los gránulos grandes y pequeños se realizó un

análisis de varianza de una vía, cuando se encontraron diferencias estadísticas se

utilizó el método de comparaciones múltiples mediante la prueba SNK (Student-

Newman- Keuls), al mismo nivel de significancia.

5. Resultados y discusión

5.1 Extracción de proteínas Debido a que las muestras presentaron un alto contenido de proteína y que éstas

forman una matriz proteica que recubren los gránulos de almidón, se realizó una

extracción de acuerdo a sus propiedades de solubilidad y por medio de la ruptura

de los puentes disulfuro de la matriz proteica. Después de la extracción el

contenido de proteínas disminuyó a 1.79% en el maíz azul y a 2.31% en el maíz

blanco (Cuadro 1). Este resultado puede indicar que las diferencias se deben al

tipo de proteínas presente en los maíces estudiados, lo cual está relacionado con

el tipo de endospermo, porque como se mencionó el maíz azul presenta

endospermo vítreo y harinoso mientras que el maíz blanco únicamente

endospermo vítreo. En general, el endospermo de maíz presenta cuatro tipos de

proteínas de reserva, albuminas (3%), globulinas (3%), prolaminas (60%) y

glutelinas (34 %). Las prolaminas (zeínas) son predominantes del endospermo y

presentan cuatro subunidades (α,β,δ,γ) las cuales tienen bajo contenido de lisina y

triptófano; las α-zeínas influyen de manera importante en el endospermo vítreo. El

endospermo harinoso tiene menos α-zeínas, más albuminas y glutelinas (Landry y

col., 2005), esto esta relacionado con el alto contenido de lisina y triptófano que

presentan maíces con endospermo harinoso (mutantes “floury” y “opaque”)

(Landry y col., 2005). Miguel y col. (2004) reportó que el maíz azul presenta un un

alto contenido de lisina (2.3 mg/g) (Miguel y col., 2004), lo cual indica que el tipo

de endospermo presente en este maíz influye sobre su patrón de proteínas de

almacenamiento.

Después de la extracción de proteínas, la pureza del almidón incrementó a

92.96% y 93.76 % para el maíz azul y blanco, respectivamente. Sin embargo, el

almidón dañado incrementó de manera importante en el maíz azul (12.62%), en

comparación con el ligero incremento que se presentó en el maíz blanco (5.06 %).

Este daño pudo deberse al tratamiento con diversos disolventes para la extracción

de proteínas. La gran susceptibilidad del almidón de maíz azul está relacionado

con su naturaleza, características estructurales de sus principales componentes

que están relacionados con su biosíntesis. Para todos los experimentos realizados

se utilizó este almidón purificado, con el objetivo de que los resultados obtenidos

se puedan atribuir a las características del almidón y no a la interacción almidón-

proteína.

Cuadro 1. Contenido de proteína, almidón total y almidón dañado después de la

extracción de proteínas del almidón de maíz Contenido (%) Maíz azul Maíz blanco

Proteina ¶ 1.79±0.21 a 2.31±0.01 b

Almidón Total 92.96±0.73 a 93.76±0.93 a

Almidón Dañado 12.62±0.28 a 5.06±0.22 b

Media de tres repeticiones± error estándar; base seca. Valores con letras diferentes en la misma fila son estadísticamente diferente (p≤0.05). ¶ N×5.85.

5.2 Microscopía electrónica de barrido (MEB) En los análisis de microscopía electrónica de barrido (Figura 1) se puede observar

que en ambas muestras se presentaron gránulos predominantemente redondos.

Como se mencionó la matriz proteica fue eliminada; sin embargo, se pueden

observar impurezas que podrían ser restos de proteínas. Debido a este

procedimiento, fue posible observar poros en los gránulos de almidón de maíz

azul. Desde 1970 se ha reportado la presencia de poros en gránulos de almidón

de maíz (Hall y Sayre, 1970); Fannon y col. (1992) presentaron evidencia de que

los poros son características estructurales de los gránulos de almidón, los cuales

conectan la cavidad central de los gránulos con el ambiente (Huber y BeMiller,

1997) y están presentes en las primeras etapas del desarrollo del gránulo (Huber y

BeMiller, 2000). Los poros y/o canales están constituidos por proteínas (Han y col.,

2005) y son utilizados por las enzimas durante la biosíntesis del almidón. Se ha

reportado que la proteína brittle 1 (bt1) esta localizada dentro de esos poros (Han

y col., 2005). Esta proteína es la encargada de transportar ADP-glucosa, que es el

precursor de síntesis de almidón, desde el citosol al plastidio (Smith, 2001).

Por otro lado, la presencia de poros y canales en los gránulos de almidón afectan

las propiedades fisicoquímicas, funcionales y de digestibilidad del almidón. El

almidón de maíz que presenta poros o canales es más susceptible a la digestion

enzimática (Leach y Schoch, 1961; Gallant y col., 1973; Fuwa y col., 1977;

Kanenaga y col., 1990), la cual inicia en el hilum (Leach y Schoch, 1961; Nikuni

1956; Hood y Liboff, 1983). Además, se ha reconocido que la enzimas pueden

entrar al interior del gránulo a través de estos poros y canales (Hall y Sayre, 1970;

Fannon y col., 1992).

Esto puede estar relacionado con las diferencias presentadas en los valores de

almidón dañado, debido a que el resultado obtenido puede no tener relación con

un mayor daño ocasionado durante la extracción de proteínas, sino a la

susceptibilidad del gránulo de almidón con poros al ataque enzimático. El almidón

de maíz blanco presentó una superficie lisa, lo que da como resultado un bajo

contenido de almidón dañado. Las características morfológicas de los almidones

de maíz analizados pueden relacionarse con las propiedades funcionales

(retrogradación) y digestibilidad de los productos elaborados a partir de ellos,

como es el caso de las tortillas (Hernández-Uribe y col., 2007)

Figura 1. Microfotografías de microscopía electrónica de barrido (MEB) del almidón de maíz azul (a) y blanco (b).

5.3 Parámetros térmicos Gelatinización El perfil térmico del proceso de gelatinización se presenta en el Cuadro 2. No se

presentaron diferencias estadísticas en la Ti, Tp y Tf entre las fracciones de

gránulos grandes y pequeños de ambas muestras. Las dos fracciones de gránulos

grandes y pequeños presentaron una temperatura de inicio, pico y final de 68ºC,

72ºC y 80ºC, respectivamente, mientras que para maíz blanco fueron de 62ºC,

68ºC y 76ºC, respectivamente. Tang y col. (2000), encontraron un comportamiento

similar en cebada, los parámetros de gelatinización no presentaron diferencias

entre las dos poblaciones de gránulos de almidón. Como se observó, estos

parámetros térmicos fueron mayores y significativamente diferentes en ambas

fracciones de gránulos de maíz azul en comparación con las fracciones de maíz

blanco, lo cual sugiere que tanto la población de gránulos grandes como los

pequeños de maíz azul tienen una mayor cristalinidad que su contraparte en maíz

azul.

No se presentaron diferencias en el intervalo de gelatinización entre las

poblaciones de gránulos pequeños y grandes de ambas muestras (Cuadro 2); sin

embargo, este parámetro fue mayor para las dos poblaciones de gránulos del

maíz blanco que para los del maíz azul. Se ha reportado un mayor intervalo de

gelatinización para las poblaciones de gránulos grandes en comparación con los

gránulos pequeños (Peng y col., 1999; Ao y Jane, 2007). Aunque, Tang y col.

(2002) reportó una mínima diferencia (1ºC) del intervalo de gelatinización entre la

población de gránulos grandes y medianos (12.1ºC y 13ºC, respectivamente), pero

no encontró diferencias entre la población de gránulos medianos y pequeños

(13ºC y 13.3ºC, respectivamente). Esto sugiere que el intervalo de gelatinización

no solo indica una mayor heterogeneidad del tamaño de gránulo de almidón, sino

que los gránulos grandes necesitan un mayor intervalo de temperatura para que

se lleve a cabo una completa gelatinización. Por lo tanto, un mayor intervalo de

gelatinización en ambas poblaciones de gránulos de almidón de maíz blanco

puede estar relacionado a que el tamaño de los gránulos es mayor tanto en la

fracción de gránulos pequeños (3-9 µm) como en la de gránulos grandes (10-21

µm) en comparación con las poblaciones del maíz azul (gránulos grandes: 1-9 µm;

gránulos pequeños: 10-18 µm).

Cuadro 2. Propiedades de gelatinización de gránulos grandes y pequeños de almidón de maíz medidos por calorimetría diferencial de barrido

Muestra Ti

(ºC) Tp (ºC) Tf (ºC) IG (Tf-Ti,

ºC) ∆H (J/g)

GG 68.40±0.32 a 72.36±0.04 a 80.61±0.33 a

12.21±0.04 a

10.07±0.01a Maíz Azul

GP 68.05±0.07 a 72.50±0.07 a 80.23±0.40 a

12.19±0.33 a

8.33±0.04b

GG 62.64±0.14b 68.27±0.05 b 76.84±0.23 b

14.20±0.31 b

9.12±0.09c Maíz Blanco

GP 61.88±0.14 b 67.99±0.34 b 76.93±0.38 b

15.05±0.53 c

8.86±0.06d

Media de tres repeticiones± error estándar; base seca. Valores con letras diferentes en la misma columna son estadísticamente diferentes (p≤0.05). Ti= Temperatura inicial; Tp= temperatura de pico; Tf= temperatura final; IG=Tf-Ti= Intervalo de gelatinización, ∆H= entalpía de gelatinización. GG=Población de gránulos grandes. GP=Población de gránulos pequeños. Se presentaron diferencias en la entalpía de gelatinización de los gránulos

grandes y pequeños de ambas muestras. Los gránulos pequeños presentaron una

entalpía menor (maíz azul, 8.33 J/g y maíz blanco 8.86 J/g) que los gránulos

grandes (maíz azul, 10.07 J/g y maíz blanco 9.12 J/g).

Una mayor entalpía de gelatinización esta relacionada con un nivel de cristalinidad

mayor (Jane y col., 1999; Patindol y col; 2002). Ao y Jane (2007) propusieron que

los gránulos grandes están constituidos por moléculas de amilopectina que tienen

mas cadenas B2 pero pocas cadenas cortas A y B1 en un arreglo paralelo dentro

del gránulo de almidón, lo cual provoca que esta población de gránulos presente

una mayor cristalinidad que los gránulos pequeños. Diversos autores han

reportado una mayor entalpía para los gránulos grandes en comparación con los

gránulos pequeños (Eliasson y Karlsson, 1983; Soukala y Morrison, 1985;

Vasanthan y Bhatty, 1996; Peng y col., 1999; Singh y col., 2003).

5.4 Extracción de proteínas asociadas a los gránulos de almidón Las proteínas del maíz se dividen en dos grupos, dependiendo de su grado de

asociación con el gránulo de almidón. El primer grupo lo conforman las proteínas

solubles en agua que no se asocian con los gránulos. El segundo grupo esta

formado por las proteínas que se asocian a los gránulos, que a su vez se

subdividen en: proteínas de superficie y en proteínas unidas al gránulo. Las

proteínas unidas al gránulo se encuentran en la superficie y/o en su interior. El

método de extracción utilizado permite eliminar proteínas no asociadas al gránulo

(albumina) y proteínas asociadas al gránulo (de superficie, también conocidas

como de almacenamiento: prolamina, glutelina y globulina) las cuales se adhieren

a la periferia de los gránulos de almidón durante su aislamiento (Baldwin, 2001).

En la Figura 2 se presenta una fotografía de la SDS-PAGE del almidón de maíz

azul y blanco. Se cargo una concentración de proteína de 9.8 µg/µL. El carril 1,

corresponde al marcador de pesos moleculares; los carriles del 2 al 4

corresponden a los sobrenadantes de la etapa de extracción. Los carriles 5 y 6

pertenecen a los sobrenadantes de la etapa de lavado y el carril 7 se presenta el

extracto concentrado. En los geles de ambas muestras se observaron que en los

carriles del 2 al 6 algunas enzimas de biosíntesis fueron eliminadas (SSSII, 90

kDa, AGPasa, 50 kDa), esto puede deberse a que como ya se había realizado

anteriormente una eliminación de proteínas que corresponden a las asociadas a la

superficie del gránulo, las proteínas que fueron removidas fueron las proteínas

internas asociadas al gránulo. Sin embargo, se obtuvo una proteína de 60 kDa en

mayor cantidad en el extracto concentrado (carril 7), la cual es identificada como la

GBSSI, esto debido a que esta enzima se localiza dentro del gránulo de almidón y

su extracción se lleva a cabo mediante la gelatinización del gránulo.

Figura 2. SDS-PAGE de la extracción de proteínas de los gránulos de almidón: maíz: a) azul y b) blanco. El carril 1 corresponde al estándar de peso molecular, del carril 2 al 4 corresponde al proceso de extracción, el carril de 5 a 6 corresponde a al proceso de lavado y el carril 7 al extracto concentrado.

En el gel del almidón de maíz azul se presentan proteínas de peso molecular de

33, 42, 50, 90, 120 kDa, aproximadamente, (en los carriles del 2 al 4) los cuales

corresponden posiblemente a los pesos moleculares de γzeina, bt1, glutelinas,

AGPasa, SBEII (Nakamura y col., 1996) y SSSII (Gao y Chibbar, 1998),

respectivamente. En el carril 5 y 6 se observa una proteína de 100 kDa (glutelina)

(Yau y col., 1999) y en el carril 7, se presenta una de 60 kDa (GBSSI) que es la

predominante. Se pueden observar en menos concentración proteínas de 80 kDa

(SSSI) (Shure, 1983) y 88 kDa (SBEI) (Peng y col., 1999), aproximadamente. En

el gel de maíz blanco no se observaron las proteínas de 120 (carril 2-4), 80 y 88

kDa (carril 7) mientras que las otras proteínas (33, 42, 50, 90, 100 kDa) tienen una

menor expresión.

El patrón electroforético de ambos almidones de maíces sugiere que su biosíntesis

es diferente, lo que se reflejará en sus características estructurales así como en

sus propiedades funcionales. La ausencia de algunas isoformas SSS (I y II), y

SBEI en el almidón de maíz blanco, sugiere que el almidón presenta una

distribución de longitud de cadenas y patrón de ramificación de amilopectina

diferente con respecto al maíz azul.

5.5 Electroforesis en dos dimensiones En la Figura 3 se observa la electroforesis en dos dimensiones (2D-PAGE) del

extracto crudo de las proteínas asociadas al gránulo de almidón. En ambas

muestras se tuvo la presencia de una proteína de 60 kDa con un intervalo de

punto isoeléctrico (pI) entre 5 y 6, de la cual se observan alrededor de 5 manchas,

que se identificó por espectrometría de masas (MALDI-TOF) como GBSSI (Figura

4). Esto sugiere que la GBSSI es un complejo multienzimático que depende del

número de isoformas de GBSSI presentes para que influyan en la biosíntesis de

amilosa (Shure y col., 1983; Miura y Sugawara, 1996). En almidón de maíz la

GBSSI ha sido reportada en un peso molecular entre 58 y 60 kDa y un pI entre 6 y

6.5 (Nakamura y col., 1993; Taira y col., 1995; Nakamura y col., 1995). Nakamura

y col. (1996) encontraron que la GBSSI se observa en una SDS-PAGE, como una

simple banda de 60 kDa, pero en 2D-PAGE se observaron de 3 a 5 manchas de

diferente pI. Esto indica que la GBSSI de las diferentes fuentes botánicas

estudiadas, presenta algunas isoformas que tienen igual peso molecular pero

diferente punto isoeléctrico. Una explicación para GBSSI la cual presenta varias

isoformas ha sido dada por Nakamura y col., (1995) quiénes atribuyeron las

diversas proteínas a genes situados en los cromosomas 7A, 4A y 7D (Chao y col.,

1989; Miura y Sugawara,1996). Sin embargo, la relevancia funcional de estas

isoformas tiene que ser elucidada. En este sentido, aún no es posible relacionar la

diferencia del contenido de amilosa y el nivel de expresión de las muestras,

porque en maíz, Tsai (1974) reportó que la actividad de GBSSI es directamente

proporcional al numero de alelos “waxy” presentes en el endospermo, por lo que el

contenido de amilosa no tiene una relación proporcional con la expresión de

GBSSI.

Por otro lado, la SSSI y SSSII no se observaron en la 2D-PAGE de maíz azul, esto

pudo deberse a que la concentración de estas proteínas es muy baja y no logran

resolverse en 2D-PAGE como en SDS-PAGE. Además, se ha reportado que la

GBSS en el endospermo de maíz es la proteína predominante asociada al gránulo

de almidón (Mu-Foster y col., 1996).

Figura 3. Separación por 2D-PAGE del extracto de proteínas unidas al gránulo de almidón de maíz azul (a) y blanco (b).

Granule-bound starch synthase 1, chloroplast precursor (EC 2.4.1.242) (Granule-bound starch synthase I) (GBSS-I) - Zea mays (Maize) Matched peptides shown in Bold Red

1 MAALATSQLV ATRAGLGVPD ASTFRRGAAQ GLRGARASAA ADTLSMRTSA 51 AAPRHQQQA RRGGRFPSLV PWS KTGGLGR VCASAGMNVV FVGAEMA DVLG 101 GLPPAMAANG HRVMVVSPRY DQYKDAWDTS VVSEIKMGDG YETVRFFHCY 151 KRGVDRVFVD HPLFLERVWG KTEEKIYGPV AGTDYRDNQL RFSLLCQAAL 201 EAPR YRD ILSLNN NPYFSGPYGE DVVFVCNDWH TGPLSCYLKS NYQSHGI251 AKTAFCIHNI SYQGRFAFSD YPELNLPERF KSSFDFIDGY EKPVEGRKIN 301 WMKAGILEAD RVLTVSPYYA EELISGIARG CELDNIMRLT GITGIVNGMD 351 EWDPSRDK YIAVKYDVST AVEAKALNKE ALQAEVGLPV DRNIPLVAFI VS401 GRLEEQKGPD VMAAAIPQLM EMVEDVQIVL LGTGKKKFER MLMSAEEKFP 451 GKVRAVVKFN AALAHHIMAG ADVLAVTSRF EPCGLIQLQG MRYGTPCACA 501 TII EGKTGFHMGR LSVDCNVVEP ADVKKVATTL QRAIKVVGTP STGGLVD551 AYEEMVRNCM IQDLSWKGPA KNWENVLLSL GVAGGEPGVE GEEIAPLAKE

601 NVAAP

Figura 4. Programa Mascot a partir de datos de espectrometría de masas de la mancha de 60 kDa de la figura 3. Las secuencias de los péptidos similares se

encuentran resaltadas en rojo.

6. CONCLUSIÓNES: La presencia de poros en los gránulos de almidón de maíz azul refleja un

mecanismo biosintético diferente con respecto al almidón de maíz blanco.

La entalpía de gelatinización de los gránulos grandes y pequeños sugiere

que la amilopectina tiene una conformación diferente, y que esta relacionada con

una diferente distribución de la longitud de las cadenas de la amilopectina.

El nivel de expresión y la presencia/ausencia de las enzimas involucradas

en la biosíntesis de la amilopectina, puede explicar las diferencias en las

características morfológicas y fisicoquímicas entre ambos almidones.

IMPACTO:

Los resultados de este trabajo ayudaran a conocer las potencialidades

nutricionales e industriales del almidón de maíz azul. Eventualmente, este

proyecto puede aportar información útil para entender mejor los mecanismos de

síntesis y crecimiento de los gránulos de almidón de maíz, este conocimiento es

básico, para en un futuro poder producir almidones modificados genéticamente.