Expresión recombinante de Expresión recombinante de lisozima de camarón marino en lisozima de camarón marino en

Escherichia coliEscherichia coli..

LisozimaLisozima

• Es una proteína presente en los hemocitos de camarón.

• Componente de la respuesta antibacteriana de la defensa innata de crustáceos.

Panaeus vannamei

Objetivo:Objetivo:

• Sobreexpresar Lisozima para el estudio de su función y propiedades biquímicas.

Sistema de expresión bacteriano

En invertebrados, la expresión de la lisozima está regulada y responde al estímulo bacteriano.

Las bacterias sintetizan proteínas en el citosol

no hay formación de puentes disulfuro ni glicosilación.

Las proteínas recombinantes (Lyz) que no se pliegan forman CUERPOS DE INCLUSIÓN

Alto rendimiento de proteínas desnaturalizadas que se pliegan sintéticamente

Clonado del cDNA de Lisozima Clonado del cDNA de Lisozima

Templado: librería cDNA fágica de hemocitos de camarón

Región codificante de lisozima

amplificación por PCR

Primers con sitios de restricción NdeI y BamHI

Secuencia nucleotídica de cDNA de Lyz de camarón.

Primers de expresión:• PV-Lyz-NdeI• PV-Lyz-BamHI

Amplicones analizados por electroforesis

Vector/inserto digeridos secuencialmente por BamHI y NdeI

Ligación

Ligación : DNA Lys + vector pET5a

E. coli DH5α (LB, Ampicilina)

*Identificación de recombinantes por colony PCR

*Plásmidos de posibles transformantes: aislados por lisis alcalina

Clones positivos secuenciados con primers T7 y

PV-Lyz-BamHI

• 5 clones recombinantes de Lyz

• La identidad de la banda de 500 pb se confirmó por secuenciación del DNA

Inserto de Lyz

Expresión de la proteína recombinanteExpresión de la proteína recombinante

pET5a-Lyz

BL21 Rosetta Gami -LacZ E. coli

* caldo Lb, Amp, Kan, Tetr, Cloramf

* agitación a 37°C hasta OD de 0.6 a 600 nm.

Identificación de presencia de pET5a-Lyz

Cepas transformadas

Screening por colony PCR usando primers:

• PV-Lyz-BamHI (de Lyz)• T7 (del vector)

Sistema de expresión bacteriano en Sistema de expresión bacteriano en E. coli E. coli

• Expresión controlada del gen de interés por T7 RNA polimerasa.

Operón lac

La proteína expresada bajo el control del operón Lac se sintetizará en presencia de lactosa o un inductor análogo artificial, llamado IPTG

T7 RNA polimerasa

Expresión de lisozima.Expresión de lisozima.

• Inducción con IPTG a una concentración final de 0.4mM.

HEL: Lisozima de clara de huevo

~ 17 KDa

Aumento de la intensidad de la banda

Protocolo para cuerpos de inclusión y re-plegamiento

Se determinó por SDS-PAGE que Lyz se expresa como cuerpos de inclusión.

Aislamiento de cuerpos de inclusión

Re-plegamiento

Purificación

Testeo con 16 buffers

Se utilizo DTT para reducir cualquier enlace disulfuro durante la desnaturalización de la proteína.

Búsqueda de condiciones deBúsqueda de condiciones de re-plegamiento.re-plegamiento.

• El re-plegamiento de proteínas que contenían puentes disulfuro no es trivial.

• Testeo de 16 buffers por dilución de la solución de los cuerpos de inclusión, el re-plegamiento fue identificado por actividad enzimática en la solución.

• Buffer N° 13 fue utilizado para el re-plegamiento a gran escala de Lyz desnaturalizada, el cual permitió el re-plegamiento activo de Lyz con un mayor rendimiento

Separación de moléculas según su tamaño.

Diálisis.

Re-plegamiento de Lyz.Re-plegamiento de Lyz.

Diálisis

Centrifugación 20.000 rpm

Sobrenadante (contiene Lyz)

Ultrafiltración (aislamiento)

Concentró la muestra

Re-plegamiento de Lyz.Re-plegamiento de Lyz.

• La proteína fue reoxidada por una combinación de Glutation reducido /oxidado Formación de puentes disulfuros

Detección de la actividad enzimática

• Banda de ~ 17 KDa es el componente principal de los cuerpos de inclusión.

Lyz: Proteína replegada luego de la ultrafiltracion y concentrada.

IB: Cuerpos de inclusión antes de la extracción.

~ 17 Kda

• La concentración de la proteína fue monitoreada, se obtuvo rendimiento total de 10.4% para un total 6.75mg/lt de medio.

Actividad de Lisozima.Actividad de Lisozima.

•Formación del halo donde la enzima lisó las bacterias.

•La preparación era activa contra Micrococcus luteus.

Lyz: replegada y purificada.

RB: Buffer Nº13.

Control

ConclusiónConclusión

Obtención de cantidades suficientes de lisozima recombinante. Rendimiento total de 10.4%,para un total 6.75mg de Lyz/l de medio.

La expresión recombinante debería utilizarse en conjunto con una purificación cromatográfica de proteínas, teniendo el cDNA disponible o haciendo uso de las secuencias disponibles en Genbank.

Re-plegamiento es un paso crítico.

Producción de proteínas recombinantes Producción de proteínas recombinantes en sistemas bacterianos.en sistemas bacterianos.

Bajo costo comparado a distintos sistemas eucariotas superiores.

Tiempo de replicación muy bajo (20 min) de E.coli.

Fácil utilización.

Alcanza alta densidad en cultivo utilizando sustratos baratos.

Son sistemas genéticamente bien caracterizados (se conocen secuencias de represores y promotores)

Hay una amplia disponibilidad de vectores y cepas mutantes para una gran variedad de usos.

VentajasVentajas

Algunas proteínas producidas en bacterias se tornan inestables o carecen de actividad biológica (no hay modificaciones post-traduccionales).

Generación de endotoxinas dañinas para la salud.

Ineficiente secreción de la proteína al medio de cultivo.

Formación de cuerpos de inclusión

DesventajasDesventajas

Producción de proteínas recombinantes Producción de proteínas recombinantes en sistemas bacterianos.en sistemas bacterianos.

Paula Gonzalez – Flavia Piccioni