a

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CELAYA

E

Estudio paramétrico para la producción de melanina en scherichia coli recombinante

S

T E S I

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: INGENIERO BIOQUIMICO

P R E S E N T A

Victor Hugo Lagunas Muñoz

Celaya, Guanajuato Enero 2004

b

El presente trabajo se realizó bajo la dirección del

Dr. Alfredo Martínez Jiménez en el Departamento

de Ingeniería Celular y Biocatálisis del Instituto de

Biotecnología de la Universidad Nacional

Autónoma de México.

Para la realización del mismo se contó con el

financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología (CONACyT) a través del proyecto NC-

230 y de la beca de tesis de licenciatura No. 4842.

i

ÍNDICE

ÍNDICE ............................................................................................................................. i

ÍNDICE DE FIGURAS .....................................................................................................iii

ÍNDICE DE TABLAS ....................................................................................................... v

NOMENCLATURA ......................................................................................................... vi

1. RESUMEN .................................................................................................................. 1

2. INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN ......................................................................... 3

3 ANTECEDENTES ........................................................................................................ 5

3.1 Melanina ............................................................................................................ 5

3.2 Tipos de melaninas............................................................................................ 5

3.3 Enzima tirosinasa .............................................................................................. 6

3.4 Biosíntesis de melanina ..................................................................................... 7

3.5 Propiedades de la melanina .............................................................................. 9

3.6 Funciones biológicas de la melanina ............................................................... 10

3.7 Usos de la melanina ........................................................................................ 10

3.8 Procesos de síntesis de melanina ................................................................... 11

3.9 Justificación del proyecto y preguntas relevantes en relación al mismo.......... 12

4. OBJETIVOS DEL PROYECTO ................................................................................. 13

4.1 General ............................................................................................................ 13

4.2 Particulares...................................................................................................... 13

5. MATERIAL Y MÉTODOS.......................................................................................... 14

5.1 Cepas bacterianas........................................................................................... 14

5.2 Preparación de bancos celulares y medios de cultivo ..................................... 14

5.3 Evaluación de cultivos ..................................................................................... 15

Monómero de Feomelanina ................................................................................... 16

5.4 Condiciones de los cultivos y parámetros estudiados ..................................... 16

5.5 Determinación de crecimiento bacteriano........................................................ 17

5.6 Recuperación y cuantificación de melanina..................................................... 18

5.7 Espectro de absorción de melanina................................................................. 18

5.8 Determinación de glucosa ............................................................................... 19

5.9 Determinación de L-tirosina ............................................................................. 19

ii

5.10 Ensayos de actividad enzimática específica.................................................. 20

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.................................................................................. 21

6.1 Preparación de un banco de células................................................................ 21

6.2 Proceso de recuperación y cuantificación de melanina. .................................. 22

6.3 Efecto del marcador de selección (ampicilina) y del cofactor (Cu). ................. 26

6.4 Efecto de la temperatura.................................................................................. 28

6.5 Efecto del pH ................................................................................................... 33

6.6 Efecto del IPTG ............................................................................................... 36

6.7 Efecto de la concentración de cobre................................................................ 39

6.8 Cultivo lote con adiciones de tirosina............................................................... 41

6.9 Cultivo lote con alta concentración de tirosina................................................. 43

6.10 Producción de melanina en medio Luria........................................................ 44

10.11 Producción de feomelanina ......................................................................... 46

7. RESUMEN DE RESULTADOS ................................................................................. 50

8. CONCLUSIONES...................................................................................................... 51

9. PERSPECTIVAS....................................................................................................... 53

10. REFERENCIAS....................................................................................................... 55

11. ANEXO: Estimacion de los paramétros cinéticos y estequeométricos. ................... 60

11.1 Velocidad específica de crecimiento .............................................................. 60

11.2 Rendimiento biomasa sustrato (YX/S) ............................................................. 61

11.3 Velocidad específica de consumo de glucosa (qS)......................................... 61

11.4 Modelos para la formación de productos ....................................................... 62

iii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 3.1 Dominios de estructura de tirosinasa de diferentes grupos....................... 7

Figura 3.2 Modelo propuesto del sitio activo y de unión a cobre de tirosinasa de

mamífero. ............................................................................................................. 8

Figura 3.3 Biosíntesis de eumelanina y feomelanina. ................................................ 9

Figura 5.1 Estructura y pesos moleculares de tirosina y de monómeros de eu y

feomelanina........................................................................................................ 16

Figura 5.2 Curva de calibración de absorbencia a 230 nm en función de la

concentración de tirosina para cuantificarla por HPLC. ..................................... 19

Figura 6.1. Proceso implementado para la recuperación de melanina..................... 23

Figura 6.2. Espectro de absorción de eumelanina Sigma (grado analítico) y

eumelanina obtenida en el presente trabajo a partir de tirosina en medio mineral-

glucosa............................................................................................................... 24

Figura 6.3 Curva de calibración de absorbencia a 400 nm en función de la

concentración de eumelanina. ........................................................................... 25

Figura 6.4 Efecto de niveles de ampicilina y Cu sobre las cinéticas de crecimiento y

de formación de melanina. ................................................................................. 27

Figura 6.5 Efecto de la temperatura sobre las cinéticas de crecimiento, consumo de

glucosa y producción de eumelanina. ............................................................... 30

Figura 6.6 Relación entre la temperatura y la velocidad específica de crecimiento. 31

Figura 6.7 Relación entre la velocidad específica de crecimiento y la velocidad

específica de consumo de glucosa. ................................................................... 31

Figura 6.8 Aplicación del modelo tipo Arrhenius para representar la dependencia de

la velocidad específica de crecimiento con el recíproco de la temperatura para E.

coli W3110/pTrcMutmelA. .................................................................................. 32

Figura 6.9 Velocidad específica de formación de eumelanina como función de la

temperatura........................................................................................................ 33

Figura 6.10 Rendimiento de conversión de tirosina en eumelanina en función de la

temperatura........................................................................................................ 33

iv

Figura 6.11 Efecto del pH sobre las cinéticas de crecimiento y de producción de

melanina............................................................................................................. 34

Figura 6.12 Efecto del pH en la velocidad específica de formación de eumelanina. 35

Figura 6.13 Efecto del pH sobre el rendimiento reconversión de tirosina en

eumelanina......................................................................................................... 36

Figura 6.14 Cinéticas de crecimiento, consumo de glucosa y producción de melanina

de cultivos lote a diferentes concentraciones de IPTG. ..................................... 38

Figura 6.15 Cinéticas de crecimiento, consumo de glucosa y producción de melanina

a diferentes concentraciones de CuSO4. ........................................................... 40

Figura 6.16 Cinética de crecimiento, consumo de tirosina y producción de melanina

en medio M9 suplementado con tirosina, con alimentaciones graduales de

tirosina en la fase estacionaria........................................................................... 42

Figura 6.17 Cinética de crecimiento, consumo de glucosa y producción de melanina

a altas concentraciones de tirosina .................................................................... 44

Figura 6.18 Cinética de crecimiento y de producción de melanina con medio Luria. 46

Figura 6.19. Cinética de crecimiento y producción de feomelanina.......................... 48

Figura 6.20 Curva de calibración de feomelanina producida a 400nm..................... 49

Figura 11.1 Cinéticas de crecimiento, de consumo de glucosa y diferentes modelos

para la formación de producto: a) Modelo asociado a crecimiento P (A); b)

Modelo parcialmente asociado a crecimiento P (PA); c) Modelo no asociado a

crecimiento P (NA). ............................................................................................ 61

v

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 5.1 Cepas de Escherichia coli utilizadas en el presente estudio. .................... 14

Tabla 6.1 Efecto de los niveles de ampicilina y Cu sobre parámetros cinéticos de

crecimiento y de formación de melanina. ........................................................... 27

Tabla 6.2. Resumen de resultados de cultivos con diferentes concentraciones de

IPTG................................................................................................................... 37

Tabla 6.3 Datos cinéticos a diferentes concentraciones de sulfato de cobre............ 39

vi

NOMENCLATURA

Símbolo Definición Unidades

Amp Ampicilina.

Cys Cisteína.

DCW Peso seco de células (por sus

siglas en inglés: Dry Cellular

Weight).

gDCW/l

DOnm Densidad óptica a determinada

longitud de onda.

E. coli Escherichia coli.

EuMel Eumelanina.

FeoMel Feomelanina.

Glc Glucosa.

IPTG Isopropil β-D-tiogalactopiranósido.

p Plásmido.

P Producto.

qGlc Velocidad específica de consumo de

glucosa.

gGlc/gDWC.h

QP Productividad volumétrica de

eumelanina.

gEuMel/ l.h

rpm Revoluciones por minuto. 1/min

Trc Promotor híbrido que contiene la

región regulatoria -35 de trp y la

región correspondiente a la caja -10

del promotor lac UV5 .

Tyr L-Tirosina.

UI Unidades internacionales. µmolesDOPACROMO/min

X Biomasa. gDCW/l

vii

YEuMel/TYR Rendimiento Eumelanina / tirosina. gEuMel/gTYR

YFeoMel/TYR-Cys Rendimiento Feomelanina/ Tyr-Cys. gEuMel/gTyr-Cys

YX/S ó YX/Glc Rendimiento biomasa / sustrato,

(glucosa).

gDWC/gGlc

β Velocidad especifica de formación

de producto en la fase estacionaria.

gEuMel/gDWC.h, ó

gFeoMel/gDWC.h

µ Velocidad específica de crecimiento. h-1

1

1. RESUMEN Las melaninas son heteropolímeros polifenólicos que presentan varios colores, por

ejemplo las feomelaninas (FeoMel) de amarillo a rojizo y las eumelaninas (EuMel) de

café a negro. Las melaninas absorben luz ultravioleta, actúan como intercambiadores

catiónicos, semiconductores amorfos, biopolímeros de unión a drogas, protectores de

rayos X y gama, además proporcionan actividad antioxidante y antiviral.

Se realizó un estudio paramétrico para caracterizar, a escala de fermentador de

laboratorio, cinéticamente el crecimiento y la producción de melanina a partir de

tirosina en una cepa de Escherichia coli recombinante: W3110/pTrcMutmelA.

W3110/pTrcMutmelA es derivada de E. coli K12 y está transformada con el plásmido

pTrcmelA, el cual tiene clonado, en el vector inducible pTrc99A, el gen melA que

codifica para la enzima tiosinasa de Rhizobium etli C3 modificada en el aminoácido

535 (ácido aspártico glicina). Esta enzima es una monofenol oxigenasa, que usa

como cofactor al cobre y cataliza la conversión de L-tirosina a dopacromo vía L-

DOPA, el cual se polimeriza a melanina mediante una serie de reacciones

espontáneas.

Para llevar a cabo este estudio, los cultivos se realizaron en medio mínimo (M9) con

2 g/l de glucosa y 0.4 g/l de L-tirosina en fermentadores con 750 ml de medio. La

aireación y la agitación se mantuvieron constantes a 0.5 vvm y 600 rpm,

respectivamente. Los parámetros y niveles que se estudiaron fueron: a)

concentración de cofactor (CuSO4: 20, 40, 80 y 400 µg/ml); b) concentración del

marcador de resistencia del plásmido (ampicilina: 100 y 200 µg/ml); c) concentración

del inductor (IPTG: 0-1 mM); d) temperatura de crecimiento y de producción de

melanina (25-35°C); y e) pH durante la etapa de producción de melanina (5.5-8.5).

Para caracterizar el espectro de absorción de la eumelanina (de color negro que se

obtiene a partir de tirosina), se implementó un proceso de purificación, con un

rendimiento del 85%. El espectro de absorción, en el intervalo de 200 a 800 nm, fue

similar al que se obtiene con eumelanina grado analítico, con coeficientes de

2

extinción de 14.8 y 13.8 cm-1 (g/l)-1 a 400 nm para la eumelanina obtenida en este

trabajo y la analítica, respectivamente.

No obstante que la tirosinasa se produce intracelularmente durante la fase de

crecimiento, en todas las condiciones evaluadas la melanina se produjo únicamente

durante la fase estacionaria. Los parámetros estudiados se compararon en función

de la velocidad específica de formación de producto (β) durante dicha fase. En las

concentraciones evaluadas de ampicilina (100 y 200 mg/ml), la concentración de 200

mg/ml favoreció la síntesis de melanina a una mayor β. En concentraciones de 20 y

40 µg/ml del cofactor Cu, β fue ligeramente mayor (10%) que a 80 µg/ml, a 400 µg/ml

las células se lisan. Con concentraciones del inductor por debajo de 0.1 mM se

obtuvieron decrementos drásticos en β, reduciéndose hasta un 98% para 0.01 mM.

La temperatura afecta drásticamente β, siendo la favorable entre 30 y 32.5°C,

lográndose la conversión total de L-tirosina en melanina. El cambio de pH en la fase

estacionaria afectó drásticamente β, incrementándose al doble (hasta 40

mgEuMel/gDCWh), a pHs de 7.5-8.0 respecto a pH 7. Además el tiempo de cultivo, para

obtener la máxima conversión de tirosina en melanina, se redujo de 70 h para pH 7.0

a 30 h para pH 7.5 u 8. Estos resultados permiten sugerir que la actividad de la

tirosinasa de R. etli C3 se ve favorecida a pH de 7.5-8.0 y a 30°C. Con las

condiciones que favorecen la producción de melanina se obtuvo un rendimiento de

conversión de L-tirosina en melanina del 100% respecto al teórico, alcanzando 0.45

gEuMel/l y una productividad volumétrica de 16.7 mgEuMel/l h.

Así mismo, con estas condiciones se diseñó un cultivo, alimentando con una

concentración inicial de glucosa de 8.5 g/l. La L-tirosina se alimentó en dos pulsos,

uno durante la fase de crecimiento y otro en la estacionaria, hasta una concentración

total de 5 g/l. El rendimiento de conversión también fue del 100%, obteniéndose 6 g/l

de eumelanina con una productividad volumétrica de 95 mgEuMel/l h. Finalmente, se

logró producir feomelanina a partir de la mezcla molar 1:1 de los aminoácidos

cisteína y tirosina, con un rendimiento de conversión de los aminoácidos del 93%

respecto al teórico máximo y una β de 23 mgFeoMEL/gDWCh.

3

2. INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN En el laboratorio de Ingeniería de Vías Metabólicas del Departamento de Ingeniería

Celular y Biocatálisis de la UNAM (Lab. IVM-DICB-UNAM), se está desarrollando un

proyecto enfocado a la producción de moléculas biológicas de interés comercial.

Dicho proyecto pretende la optimización y diversificación de las vías del metabolismo

central del carbono y una parte del mismo está centrado en la vía de biosíntesis de

compuestos aromáticos en la bacteria Escherichia coli. El objetivo es diversificar y

optimizar la biosíntesis de al menos tres metabolitos aromáticos de interés comercial:

fenilalanina, catecol y melanina. Particularmente, el interés por polímeros del tipo de

la melanina ha crecido mucho en años recientes, debido a que se han identificado

muchas propiedades fisicoquímicas y aplicaciones importantes. Las melaninas

pueden actuar como fotoprotectores, intercambiadores catiónicos, agentes quelantes

y semiconductores amorfos (della-Cioppa et al., 1990; Wang et al, 2000). Así mismo,

este tipo de polímeros poseen actividad antioxidante y antiviral (Wang et al, 2000).

En el Lab. IVM-DICB-UNAM (Cabrera y Gosset, comunicación personal), se ha

transformado la cepa de E. coli W3110 (cepa no patogénica procedente de K12) con

un plásmido derivado de pTrc99A, el cual es inducible por IPTG y contiene el gen

melA que codifica para la enzima tirosinasa proveniente de Rhizobium ethli C3

modificada en el aminoácido 535 (ácido aspártico glicina). Esta monofenol

oxigenasa es la responsable de la síntesis de melanina y utiliza como sustrato L-

tirosina. Con el propósito de caracterizar la producción de melanina a escala de

fermentador de laboratorio y comprender el comportamiento fisiológico de esta cepa,

E. coli W3110/pTrcMutmelA, se planteó llevar a cabo estudios de parámetros

ambientales que potencialmente pueden afectar la formación de melanina. Al iniciar

este proyecto no se conocía mucho a este respecto, por o cual se decidió llevar a

cabo un estudio de parámetros de manera individual, en lugar de un diseño

experimental con interrelación de factores. Los parámetros que se decidió evaluar

son: temperatura, pH y las concentraciones de inductor, marcador de resistencia y

cofactor. Se caracterizaron las velocidades de crecimiento, de consumo de glucosa y

4

en algunos casos de tirosina, y de formación de melanina, así como el rendimiento

de conversión de L-tirosina en eumelanina.

5

3 ANTECEDENTES 3.1 Melanina Las melaninas son una familia de pigmentos de colores claros a negros, los cuales

se encuentran distribuidos en animales, plantas y microorganismos (della-Cioppa,

1990), son un grupo de heteropolímeros de alto peso molecular formados

principalmente por unidades de tipo indólico. Además representan el principal

pigmento presente en varias estructuras que constituyen la superficie de los

vertebrados (Riley, 1997). Dentro de los microorganismos que pueden sintetizar

melanina se encuentran algunas bacterias y hongos microscópicos (Aurstad y Dahle,

1972; Sadasivan y Neyra, 1987; Hoti y Balaraman, 1993; Ikeda et al., 1996). La

producción de melaninas por microorganismos silvestres ha sido reportada en

diversas especies bacterianas del género Aeromonas, Mycobacterium, Micrococcus,

Bacillus, Legionella, Streptomyces, Vibrio, Proteus, Shewanella (Wang, et al., 2000),

incluyendo las rizobacterias del genero Rhizobium, Azospirillum y Azotobacter

(Castro-Sowinski et. al., 2002).

3.2 Tipos de melaninas Existen diversos tipos de melaninas, las cuales se originan a partir de diferentes

precursores químicos (Mason, 1948). Cada tipo de melanina tiene diferentes

propiedades físico-químicas. En mamíferos las melaninas se subdividen en 2 clases

químicas, las eumelaninas (EuMel) y feomelaninas (FeoMel; Della-Ciopa, 1998). En

organismos vertebrados, la eumelanina es el principal pigmento presente en la piel.

Este tipo de melanina, de color café a negro, se origina a partir de unidades

derivadas de productos de la oxidación de la L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). En la

piel de algunos vertebrados también es común encontrar feomelanina, la cual se

forma a partir de una mezcla de productos de oxidación de L-DOPA con glutatión ó

L-cisteína. Dependiendo de la proporción de las unidades monoméricas, la

feomelanina puede tener un color que va desde el amarillo hasta el rojo. En algunas

especies animales y microbianas, también se han identificado las alomelaninas, las

cuales se generan a partir de precursores fenólicos primariamente catecoles y 1,8

6

dihidroxinaftaleno (Della-Ciopa, 1998), así como las piomelaninas, que provienen del

ácido homogentísico (Riley, 1997).

3.3 Enzima tirosinasa La síntesis de melanina ocurre debido a reacciones de oxidación sobre ciertos

compuestos fenólicos de tipo indol. A este proceso se le llama melanogénesis y

depende de la acción de enzimas específicas que pertenecen a la familia de las

monofenol oxidasas (Lerner and Fitzpatrick, 1950). Un ejemplo de este tipo de

enzimas son las tirosinasas (EC 1.14.18.1), las cuales tienen como sustrato principal

al aminoácido L-tirosina. Una característica particular de este tipo de enzimas es la

de poseer dos tipos de actividades: monofenol oxidasa y catecolasa. La tirosinasa

puede hidroxilar monofenoles y convertirlos en o-difenoles (actividad de monofenol

oxidasa, EC 1.14.18.1). También puede oxidar o-difenoles convirtiéndolos en o-

quinonas (actividad de catecol oxidasa). Las tirosinasas son metaloenzimas que

contienen átomos de cobre formando parte de su sitio activo (Pialis et al., 1996). La

tirosinasa es sintetizada como una apoenzima que carece de cobre y el mecanismo

por el cual se lleva a cabo la unión del cobre a la enzima varía dependiendo de la

naturaleza de la enzima. Existen proteínas especializadas que transfieren átomos de

cobre a la apotirosinasa, para convertirla en tirosinasa activa. Estas proteínas

activadoras, llamadas también chaperonas de cobre, han sido identificadas en

mamíferos, plantas y microorganismos que sintetizan melaninas (García-Borrón y

Solano, 2002). En el caso de Streptomyces, se ha identificado a la proteína MelC1

como la chaperona de cobre que activa a la tirosinasa MelC2. Los genes que

codifican para estas dos proteínas forman un operón en el genoma de Streptomyces

(Liaw y Lee, 1995). En las plantas superiores y hongos la enzima tirosinasa se

encuentran en varias isoformas: inmaduras, madura latente y activa. Sin embargo la

descripción bioquímica con respecto a la caracterización cinética y su relación entre

esas isoformas aún no ha sido establecida (Seo et al., 2002).

La forma activa de las tirosinasas de Agaricus bisporus, Neurospora crasa,

Aspergillus orizae, al igual que las tirosinasas de plantas superiores se encuentran

7

organizadas en tetrámeros (Van Gelder et. al, 1997). Básicamente la tirosinasa tiene

tres dominios, de los cuales el dominio central contiene 2 sitios de unión a cobre,

llamados CuA y CuB. Varias secuencias conservadas están presentes en las

tirosinasas de diferentes fuentes, como se muestran en la Figura 3.1 (Van Gelder et

al, 1997).

Cu A CuB

Plantas

Hongos

Bacterias

Eucariotes superiores

Susceptibles a corteIn vivo e in vitro

Rico en Cys

Rico en Cys

Rico en His

170

170

400

50 300

370

220

390

30

470

430

530

600

270

600

400

Probable péptido señal

Péptido transitorio

Trans membranal

Cu A CuB

Plantas

Hongos

Bacterias

Eucariotes superiores

Susceptibles a corteIn vivo e in vitro

Rico en Cys

Rico en Cys

Rico en His

170

170

400

50 300

370

220

390

30

470

430

530

600

270

600

400

Probable péptido señal

Péptido transitorio

Trans membranal

Figura 3.1 Dominios de estructura de tirosinasa de diferentes grupos.

De hecho el único dominio parecido que se encuentra conservado en todas las

tirosinasas es el dominio central. Donde seis residuos de histidina se encuentran

conservados, los cuales unen a un par de iones cobre en el sitio activo de la enzima,

el cual interactúa con el oxígeno molecular y el sustrato fenólico (Figura 3.2; García-

Borrón y Solano, 2002).

3.4 Biosíntesis de melanina El primer paso en la formación de eumelanina es la ortohidroxilación de la monofenol

L-tirosina a o-difenol (actividad de creolasa o monofenolasa) por la enzima tirosinasa

para dar lugar a L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) usando oxígeno molecular (Figura

3.3). El segundo paso es la oxidación del o-difenol o difenol (actividad difenolasa o

8

catecolasa) a dopaquinona en presencia de oxígeno molecular (Sung-Yum et al.,

2003). La dopaquinona es un compuesto altamente reactivo que espontáneamente

sufre una ciclización intramolecular para formar leucodopacromo, el cual

posteriormente se convierte en dopacromo. Reacciones de oxidación espontáneas

subsecuentes dan lugar a los compuestos 5,6-dihidroxiindol (DHI) y ácido 5,6-

dihidroxiindol-2-carboxílico (DHICA). La polimerización, también espontánea, de

dopacromo, DHI, DHICA y sus correspondientes quinonas, causa la formación de la

eumelanina (Figura 3.3; della-Cioppa, 1998).

Figura 3.2 Modelo propuesto del sitio activo y de unión a cobre de tirosinasa de mamífero.

9

S

N CO2H

OH

R

S

N

OH

R

N

S

R

tricocromos

FEOMELANINA

OH

HO2C NH2tirosina

tirosinasa

OH

OH

HO2C NH2

tirosinasa

O

O

CO2H NH2

OH

cisteina

SR

CO2H NH2cisteindopas

OH

Dopaquinona

dopatirosinasa

dopaquinona

ciclodopa

HO

HO NH

CO2H

O

-O NH+ H

CO2H

dopacromo

dopaquinonadopa

tirosinasa

NH

HO

OH

+

NH

OH

OH

CO2HEUMELANINA

DHICADHI

OH

Figura 3.3 Biosíntesis de eumelanina y feomelanina.

La síntesis de feomelanina inicia también con la acción de la tirosinasa sobre la L-

tirosina (Fig. 3.3). Sin embargo, la presencia de L-cisteína en el medio de reacción da

lugar a la formación de derivados tioles, entre los cuales predomina la 5-S-

cisteinilDOPA (5-S-CD). La oxidación de los derivados tioles vía la formación de

intermediarios de benzotiazina, da lugar a la formación de feomelanina (Ozeki et al.,

1997; Wakamatsu e Ito, 2002). La síntesis de otros tipos de melaninas sigue una ruta

similar pero utilizando diferentes sustratos. La presencia de mezclas de sustratos

(aminoácidos, péptidos u otros) durante el proceso de melanogénesis da lugar a la

síntesis de melaninas con una composición química heterogénea (della-Cioppa,

1998).

3.5 Propiedades de la melanina Las melaninas presentan muchas propiedades interesantes, debido al alto grado de

conjugación de la molécula la que más resalta es su amplio espectro de absorción de

luz. La melanina presenta también propiedades de intercambiador en reacciones de

10

oxido-reducción, especialmente las eumelaninas, ya que éstas pueden tomar parte

en las reacciones redox de uno o dos electrones. Uno de los efectos de la absorción

de luz es la foto-oxidación del pigmento, por la cual aumenta el contenido de grupos

carboxilo, cambiando las propiedades de absorción de la melanina, la cual es

llamada reacción de oscurecimiento de la melanina (Riley, 1997), debido a que

presenta funciones aniónicas con los grupos carboxilo y grupos hidroxilo

desprotonados, la melanina también funciona como un poderoso quelante (Sarna et

al., 1976).

3.6 Funciones biológicas de la melanina

.7 Usos de la melanina ímicas de las melaninas las hacen atractivas para ser

Las melaninas cumplen diversas funciones biológicas (Riley, 1992). Aparentemente,

todas ellas están relacionadas a la protección contra agentes dañinos en el medio

ambiente. Una de ellas es de tipo estructural, cuando se entrecruza con proteínas las

protege de la degradación (Riley, 1997). La melanización de vainas de semillas en

plantas y cutículas de los insectos le confieren mayor rigidez (Riley, 1997). La

melanina también le confiere a diversas especies de hongos resistencia a la

desecación y a temperaturas extremas (Bell y Wheeler, 1986; Fogarty y Tobin, 1996).

En el caso de organismos superiores, la melanina cumple el papel de pigmento

protector contra la radiación ultravioleta (UV) que proviene del sol (Krol y Liebler,

1998; Ortonne, 2002). Por otro lado, durante la síntesis de melanina, se generan

ortoquinonas, estructuras de DHI y DHICA oxidadas (García-Borrón, 2002), las

cuales pueden tener un papel antibiótico (Riley, 1997). Finalmente, la melanina

puede jugar un papel quimioprotector al servir como agente absorbente de radicales

libres (Riley 1997).

3Las propiedades físico-qu

utilizadas en diferentes aplicaciones industriales. Las melaninas son utilizadas

actualmente en productos y tratamientos médicos y cosméticos. (Weiner, 1997;

Rozanowska et al., 1999; Hung et al., 2002; Sava et al., 2001; Nofsinger et al., 2002).

Son usadas comercialmente como componente fotoprotector en cremas (Riley,

11

1997). Así mismo, se utilizan experimentalmente para la eliminación de metales

como parte de procesos para el tratamiento de agua (Fomina y Gadd, 2002).

Considerando la gran diversidad química de las melaninas, es de esperarse que se

continúen desarrollando nuevas aplicaciones industriales para este polímero.

3.8 Procesos de síntesis de melanina nará, las melaninas pueden ser obtenidas a

no de los procesos más eficientes para la producción industrial de melanina se ha

Dependiendo del uso al que se les desti

partir de procesos químicos, material biológico ó procesos biotecnológicos. La

síntesis química ó bioquímica de las melaninas permite obtener material con un alto

grado de pureza. Estos procesos se basan en la utilización de precursores químicos

con una alta pureza, los cuales se polimerizan por la acción de tirosinasas o

condiciones químicas específicas (Bridelli et al., 1999). Normalmente el material

obtenido de esta manera es utilizado para estudios analíticos, ya que el costo de

producción es relativamente alto. La extracción a partir de materia vegetal tiene la

ventaja de que las melaninas pueden ser obtenidas a un costo relativamente bajo

(Sava et al., 2001). Sin embargo, el producto obtenido consiste en una mezcla de

melaninas cuya composición puede variar con cada lote procesado. Otra fuente de

melaninas son los cultivos con hongos microscópicos. Varias especies

pertenecientes a los géneros Cladosporium y Aureobasidium pueden producir

melaninas en cultivos sumergidos (Fomina y Gadd, 2002).

U

logrado en cultivos con Streptomyces lividans TK64/pIJ702. Con este proceso se ha

reportado una concentración máxima de melanina de 2 g/l (della-Cioppa et al., 1990).

Por otro lado, con la utilización de las técnicas de ADN recombinante se han

trasformado cepas de E. coli con plasmados que expresan el gen de la tirosinasa

melC1 y el gen melC2 que codifica para la proteína activadora chaperona de cobre,

provenientes de Streptomyces antibioticus IMRU 3720 (della et al., 1998). Con esta

cepa recombinante de E. coli se han logrado producir 3 g/l de melanina con cultivos

en fermentador.

12

3.9 Justificación del proyecto y preguntas relevantes en relación al mismo levar

de melanina en medio mineral-glucosa-

on las concentraciones del marcador de resistencia (ampicilina), cofactor

máximo que se puede obtener de conversión de tirosina en

n los parámetros ambientales, tales como el pH, temperatura y nivel de

cidad se sintetiza la melanina?

la cepa recombinante?

TrcMutmelA?

, 3

se decidió llevar a cabo el estudio

Al mismo tiempo de incorporarse el que suscribe al Lab. IVM-DICB-UNAM para l

a cabo el proyecto de tesis de licenciatura, se requería en el proyecto enfocado a la

producción de moléculas biológicas de interés comercial, particularmente para

producción de melanina, caracterizar la producción de ésta a escala de fermentador

de laboratorio, evaluar el comportamiento fisiológico de la cepa de E. coli

W3110/pTrcMutmelA y valorar la capacidad con este biocatalizador para obtener

concentraciones de melanina mayores a las ya reportadas para cultivos sumergidos.

Para este propósito, al iniciar esta tesis existían varias preguntas que requerían ser

contestadas para conducir otras investigaciones relacionadas con este proceso.

Entre las preguntas que se tenían están:

¿Es posible llevar a cabo la producción

tirosina?

¿Cuáles s

(cobre) e inductor (IPTG) que se requieren para obtener una producción de melanina

con altos rendimientos?

¿Cuál es el rendimiento

melanina?

¿Cuáles so

oxígeno disuelto, que favorecen un alto rendimiento de conversión de tirosina en

melanina?

¿A que velo

¿Cuál es el nivel de actividad enzimática en

¿Es posible obtener eumelanina y feomelanina con la cepa W3110/p

¿Se pueden obtener concentraciones mayores al máximo reportado en la literatura

g/l, de eumelanina con este biocatalizador?

Para contestar varias de estas preguntas

paramétrico aquí presentado, cuyos objetivos se describen continuación.

13

4. OBJETIVOS DEL PROYECTO 4.1 General

Evaluar, a escala de fermentador de un litro, el efecto del cofactor, inductor,

marcador de resistencia, temperatura y pH sobre la producción de melanina, en

medio mineral con glucosa y L-tirosina en Escherichia coli W3110/pTrcMutmelA.

4.2 Particulares 1. Estandarizar métodos para cuantificar y semi-purificar la melanina.

2. Evaluar el efecto de los siguientes parámetros, sobre las cinéticas de

crecimiento y producción de melanina: pH, temperatura, concentraciones del

cofactor (Cu), marcador de resistencia (ampicilina) e inductor (IPTG).

3. Determinar la actividad enzimática de tirosinasa en condiciones de cultivo

selectas.

4. Maximizar la productividad y rendimiento en E. coli W3110/pTrcMutmelA en

medio mineral-glucosa para la conversión de L-tirosina en eumelanina

5. Diseñar e implementar una estrategia, basándose en los parámetros

estudiados para lograr concentraciones mayores a 3 g/l de eumelanina.

6. Evaluar la potencialidad de E. coli W3110/pTrcMutmelA para producir

eumelanina y feomelanina.

14

5. MATERIAL Y MÉTODOS 5.1 Cepas bacterianas Las cepas utilizadas en este trabajo se presentan en la Tabla 5.1.

Tabla 5.1 Cepas de Escherichia coli utilizadas en el presente estudio.

Cepa Genotipo o fenotipo relevante

W3110

W3110/pTrc99A

W3110/pTrcMutmelA

F-, λ-, INV (rnnD-rnnE) 1, RecA+, Trp+,Lac+

W3110 conteniendo el vector pTrc99a sin insertos

W3110 conteniendo el plásmido pTrcMutmelA.

El vector pTrc99A (Pharmacia Biotech) es un derivado del vector pkk23-2, que tiene

el promotor fuerte trc (ubicado antes de un sitio de clonación múltiple) y el terminador

transcripcional rrnB. Todas las cepas pertenecen a la Colección del Laboratorio de

Ingeniería de Vías Metabólicas del Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis

del Instituto de Biotecnología de la UNAM.

5.2 Preparación de bancos celulares y medios de cultivo Para obtener cultivos homogéneos y reproducibles se generaron bancos de células

con la cepa W3110/pTrcMutmelA como se describe a continuación. Se creció la cepa

en medio sólido agar 1.5% (Luria) Luria-Bertani (Sambrook et al.,1989) y en el medio

mineral M9 agar 1.5% (Atlas, 1993) suplementados con 2 g/l de glucosa y 200 µg/ml

de ampicilina. Las cajas se incubaron a 37°C por aproximadamente 24 horas, hasta

que se formaron colonias de aproximadamente 1.5 mm de diámetro, posteriormente

se trasfirieron de 3 a 5 colonias a un tubo de ensaye estéril, conteniendo 1 ml del

medio líquido correspondiente, se resuspendieron y se trasfirieron a un matraz de

500 ml con 100 ml del medio de cultivo respectivo. Se incubaron a 37°C y 250 rpm

(incubadora C24KC, New Brunswick Scientific), aproximadamente por 12 h hasta que

alcanzaron una DO600nm ≈1.5. Se tomaron muestras de 1 ml de estos cultivos y se

transfirieron, bajo condiciones asépticas, a crioviales conteniendo 1 ml de glicerol al

80%, inmediatamente las suspensiones se mezclaron, con ayuda de un vortex, y se

15

congelaron sobre hielo seco. El banco así preparado, conteniendo aproximadamente

50 viales, se almacenó a -70°C.

La composición del medio Luria fue: 10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura y

5 g/l de NaCl (Sambrook et al., 1989). La composición del medio M9 (Atlas, 1993) por

litro fue: 6 g Na2HPO4 ; 3 g KH2PO4; 1 g NH4Cl; 0.5 g NaCl; 1 ml de solución MgSO4

7H2O 1M;1 ml de solución CaCl2 0.1M; 1 ml de solución tiamina 1mg/ml; y 10 ml de

solución de glucosa 20%, es decir a una concentración inicial de glucosa de 2 g/l (a

menos que se indique otra cosa). Una vez disueltas en agua destilada, las primeras 4

sales se esterilizaron en autoclave, a 121°C por 15 minutos. Las soluciones del resto

de las sales se esterilizaron por separado. La tiamina se esterilizó por filtración (0.22

µm).

5.3 Evaluación de cultivos La evaluación de los cultivos se realizó calculando los siguientes parámetros

cinéticos o estequiométricos; rendimiento biomasa/sustrato (YX/S), velocidad

específica de crecimiento (µ), velocidad específica de consumo de sustrato (qS),

velocidad específica de formación de melanina (β) y rendimiento teórico de

producción de melanina (Consultar el anexo para ver los detalles de cálculo de estos

parámetros).

Los monómeros que conforman la eumelanina son del tipo DHICA (Figura 5.1), cuyo

peso molecular aproximado es 208 g/mol (Sarna y Sealy, 1984), el de la tirosina es

181 g/mol y dado que cada molécula de tirosina da origen a una molécula de DHICA,

el rendimiento teórico máximo (YEuMel/TYR) es: (208/181) = 1.15 gEuMel/gTYR.

Para el caso de la feomelanina, se consideró que los monómeros que la conforman

son del tipo de benzotiazinas, cuyo peso molecular promedio aproximado es de 295

g/mol (Sarna y Sealy, 1984), y que para que se forme una molécula de éstas, se

necesita una molécula de cisteína (PM = 121.6 g/mol) y una de tirosina (PM = 181

16

g/mol). Entonces el rendimiento teórico máximo de formación de feomelanina es

YFeoMel/Tyr-Cys = [295/(121.6+181)] = 0.97 gFeoMel/TYR-Cys.

NH

OH

OHC

O

NH2 HO2 C

H

O2H

Tirosina PM = 181 g/mol Monómero de eumelanina

PM = 208 g/mol

NH 2

(HOOC)

N

S

(COOH)

NH 2NH 2

(HOOC)

N

S

(COOH) Monómero de Feomelanina PM = 295 g/mol

Figura 5.1 Estructura y pesos moleculares de tirosina y de monómeros de eu y feomelanina.

5.4 Condiciones de los cultivos y parámetros estudiados Los cultivos se realizaron en fermentadores Applikon de 1 litro con un volumen de

operación de 0.75 L, agitados por medio de una turbina Rushton de 6 paletas planas.

La velocidad de agitación fue constante a 600 rpm con un flujo de aire constante de

0.5 vvm (a menos que se indique otra cosa). Bajo estas condiciones el oxígeno

17

disuelto nunca fue menor al 50% (con respecto al valor de saturación de aire). En

algunas ocasiones, también se llevaron a cabo cultivos en matraz de 500 ml (100 ml

de medio).

Dependiendo del cultivo y de la etapa de crecimiento, el pH se controló en diversos

niveles (5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, y 8.5), mediante la adición automática de base

(NH4OH al 2.5%) y ácido fosfórico 0.5 M. La temperatura fue controlada en el

fermentador a diferentes valores mediante un sistema de control Proporcional-

Integral-Derivativo (PID), con las constantes PID de 10, 2700 y 0, respectivamente.

Cuando se estudió el efecto de la temperatura los valores estudiados fueron: 25,

27.5, 30, 32.5 y 35 C.

En el estudio de los parámetros cinéticos en medio M9 para la producción de

melanina, el medio fue suplementado con diferentes concentraciones de CuSO4 (20,

40 y 80 µg/ml), amplicilina (100 y 200 µg/ml), IPTG (0.01, 0.1 y 1mM), y L-tirosina

(0.4 g), a menos que se indique otra cosa. Para ello se prepararon soluciones patrón

de CuSO4, ampicilina e IPTG las cuales se esterilizaron por filtración (0.22 µm). La L-

tirosina se agregó en polvo sin esterilizar. Para el caso del estudio con Luria sin

glucosa se usó solo una condición de los suplementos antes mencionados.

5.5 Determinación de crecimiento bacteriano El crecimiento bacteriano se cuantificó en función de la turbidez, midiendo la

absorbencia de los cultivos a 600 nm en un espectrofotómetro (Beckman DU-70).

Durante la etapa de crecimiento y cuando la producción de eumelanina era menor a

0.4 g/l, se tomaron muestras de 1.5 ml del cultivo, en diferentes etapas del mismo, y

una vez medida la DO600nm del medio con células y producto, se centrifugaban a

6,000xg por 5 min., al sobrenadante se determinaba de nuevo la absorbancia a 400 y

600. En este caso el valor para estimar la masa celular fue obtenido de la sustracción

de ambos valores. Dicha absorbencia fue convertida a peso seco mediante la

siguiente relación 1 DO600nm corregida = 0.37 gDCW/l (DCW = peso seco de células;

Hernández-Montalvo et al., 2001). Cuando se obtuvieron concentraciones de

18

eumelanina mayores a 0.4 g/l, ésta precipita y al centrifugar se acumula una cantidad

indeterminada en el paquete celular, ocasionando que el método anterior no sea

confiable para cuantificar la biomasa. En estos casos la biomasa se tomó como

constante, asignándole el valor que se obtenía hasta concentraciones de eumelanina

menores o iguales a 0.4 g/l. Como se explica adelante, la DO400nm del sobrenadante

fue utilizada para cuantificar la melanina. En los casos requeridos, el sobrenadante

se almacenó a -20°C, para posteriormente analizar los productos del cultivo.

5.6 Recuperación y cuantificación de melanina Para la recuperación de melanina se procesaron algunos caldos de fermentación al

final de los cultivos. Se centrífugo a 6,000xg (Centrífuga de Banco Eppendorf,

Modelo 5403) por 5 min., el sobrenadante se recuperó y la melanina se precipitó

bajando el pH a 2 con ácido clorhídrico 6 N, de nuevo se centrifugó, en está ocasión

a 12,000xg durante 12 min., el sobrenadante se desechó y el precipitado se secó en

un horno a 100°C por 72h.

Del producto seco se tomó una muestra y se solubilizó en agua a pH 10 con NaOH 6

N. Posteriormente se reajustó el pH a 7 con ácido clorhídrico 6 N, quedando la

melanina a una concentración final de 0.05 g/l. Se midió la absorbencia de la

solución a 400 nm y a otras concentraciones menores a 0.05 g/l. Con ésto se obtuvo

la curva de absorbencia a 400 nm en un espectrofotómetro (Beckman DU-70,

Fullerton, CA), en función de la concentración de melanina y se determinó el

coeficiente de extinción de los productos obtenidos.

5.7 Espectro de absorción de melanina A diferentes soluciones de melanina con una concentración de 0.05 g/l, a pH 7, se

les midió la absorbencia en un barrido continuo de longitudes de onda cada 2 nm

desde 190 a 800 nm.

19

5.8 Determinación de glucosa La glucosa fue determinada con un analizador enzimático (EKTACHEEM DT60 II

Multiple Analyzer, Kodak), en la cual la oxidación de glucosa esta acoplada,

mediante la glucosa oxidasa, a la generación de H2O2 .

5.9 Determinación de L-tirosina

De muestras selectas de los cultivos almacenadas a –20 °C se descongelaron y se

diluyeron 1:1 con una solución filtrada (0.22 µm) de ácido trifluoroacético (TFA) 2% y

metanol al 40%. Estas muestras se analizaron por HPLC, con una columna de fase

reversa (Discovery C-18 Supelco) de 250x4.6mm, 5µm y 4.5 cm3. El método utilizado

fue isocrático y se usó como fase móvil una solución de TFA al 2% y metanol al 40%

en agua, con un flujo de 0.5 ml/min. Para detectar la tirosina se utilizó un detector de

arreglo de iodos a una longitud de onda de 230 nm (Waters 2996 PDA) y usando

como sistema procesador de datos el software Millenium versión 3.03 (Waters).

Para elaborar la curva patrón de tirosina se utilizaron diluciones 1:1 del medio M9 sin

glucosa con tirosina y la fase móvil antes mencionada, en las cuales las

concentraciones finales de la tirosina fueron 0, 0.01, 0.05, 0.08, 0.1, 0.2, 0.3 y 0.4 g/l

(Figura 5.2).

0.0 0.1 0.2 0.3 0.40.0×10-00

5.0×1006

1.0×1007

1.5×1007

L-Tirosina (g/l)

Áre

a

Área = 2.973x107x [L-Tirosina] + 0.067x107

r2 = 0.998

Figura 5.2 Curva de calibración de absorbencia a 230 nm en función de la concentración de tirosina para cuantificarla por HPLC.

20

5.10 Ensayos de actividad enzimática específica Para los ensayos enzimáticos se tomaron muestras a las 8 y 24h de cultivos

selectos, las células se centrifugaron a 6,000xg, durante 5 minutos y se

resuspendieron en amortiguador de fosfatos de Na 0.2 M pH 7.5. La DO600 se ajustó

a 8. Las células fueron divididas en 2 volúmenes de 10 ml y mantenidas en un baño

frío a 4 °C y a una de ellos se agregaron 100 µl de inhibidor de proteasas y la

suspensión fue lisada por presión a 900 psi y 4 °C (Prensa de French, Thermo

Espectronic).

Como mezcla de reacción se tomó un volumen de 200 µl de células lisadas y no

lisadas, las cuales se adicionaron a 800 µl de una solución de 0.4 g/l de tirosina

disueltas en el amortiguador de fosfatos antes mencionado. Como blanco se utilizó la

solución de tirosina en amortiguador de fosfatos, sin extracto celular. Se incubaron a

30°C y se tomaron las lecturas de absorbencia a 475 nm, contra la solución blanco,

cada minuto durante 15 min. La actividad se expresa como Unidades por ml de

células. Donde una Unidad es 1µmol de dopacromo formado por min. Se usó un

coeficiente de extinción de 3600 M-1 cm-1 para el dopacromo (Kong et al. 2000).

21

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 Preparación de un banco de células La aparición de variantes celulares con morfología diferente y con un nivel reducido

de expresión de proteínas heterólogas, o con inestabilidad segregacional y/o

estructural de plásmidos, es un fenómeno observado frecuentemente con

microorganismos recombinantes. Con el propósito de reducir éstas variaciones se

recurre a la obtención de cepas con información genética integrada en cromosoma

o, como en el presente trabajo, al uso de vectores que se diseñaron para reducir la

inestabilidad de los mismos. pTrc99A es un vector de mediano número de copias

(30), en el cual la expresión de los genes está controlada por el promotor artificial trc

(Amann et al., 1988). trc es un promotor fuerte e híbrido, ya que combina la región –

35 del promotor de trp y la región –10 del promotor de lacUV5, el cual es regulado

por el operador lacO. Además, pTrc99A contiene: un sitio de clonación múltiple

(secuencias de ADN que son reconocidas por varias enzimas de restricción, las

cuales permiten que se puedan insertar genes, mediante cortes y ligaciones de

genes con relativa facilidad); el gen que codifica para la proteína represora lacΙq (que

lo hace inducible por Lactosa o IPTG); el gen que le confiere resistencia a ampicilina

como marcador de selección; los terminadores de la trascripción rrnB T1 y T2; y el

origen de replicación de pbr322. En total el tamaño del plásmido ptrc99A es de 4,176

pares de bases.

Varios de los elementos citados hacen que pTrc99A sea un vector estructural y

segregacionalmente estable, no obstante con el objetivo de evitar fuentes de

variación genética en el presente trabajo se decidió preparar un banco de viales con

la cepa que se empleó para llevar el estudio paramétrico. De esta manera, a partir de

una cepa de E. coli W3110 (cepa no patogénica que se utiliza ampliamente en la

industria biotecnológica para la producción de proteínas recombinantes), recién

transformada por electroporación con el plásmido pTrc99A conteniendo el gen que

codifica para la tirosinasa de R. etli (pTrcMutmelA), se evaluó la producción de

melanina en cajas conteniendo medio Luria. De estas cajas se seleccionó una

colonia, designada W3110/pTrcMutmelA, cuyo fenotipo es característico de

22

producción de melanina: color negro intenso en presencia de sulfato de Cu y tirosina.

Esta colonia fue cultivada, por separado, en medio rico (Luria) y medio mineral-2 g/l

de glucosa (M9: ver composición en la sección de materiales y métodos), en

presencia de ampicilina (200 µg/ml), hasta alcanzar una DO600 de 5 y 1.5

respectivamente, las cuales corresponden a la fase de crecimiento exponencial de E.

coli en estos medios. 1 ml de estos cultivos se adicionaron a crioviales conteniendo

glicerol (crioprotector) al 80% (previamente esterilizado), se mezclaron perfectamente

y se congelaron inmediatamente sobre hielo seco y se almacenaron en un ultra

congelador a –70°. Estos viales fueron utilizados como semilla para desarrollar los

inóculos en matraz. Durante 10 meses de almacenamiento, tiempo durante el cual

este banco fue utilizado para los cultivos reportados en este trabajo, la cepa se

mantuvo estable en cuanto a la velocidad de crecimiento, fenotipo y su capacidad

para producir melanina a partir de tirosina.

6.2 Proceso de recuperación y cuantificación de melanina. Las melaninas pueden recuperarse mediante un proceso sencillo que consta de:

precipitación a pH ácido (≤2); lavado con agua; disolver a pH alcalino (≥10); precipitar

de nuevo con ácido; lavar con agua o dializar; centrifugar y secar. Este proceso de

recuperación también puede ser empleado para cuantificar la cantidad de melanina

producida. No obstante, para propósitos prácticos de cuantificación de melanina

producida durante cultivos de la cepa W3110/pTrcMutmelA, dicho procedimiento es

demasiado tedioso y consume mucho tiempo. Con el fin de llevar a cabo una

cuantificación sencilla de la eumelanina producida, mediante una simple lectura de

absorbencia, como primera parte de este trabajo se procedió a purificar y caracterizar

el producto obtenido de cultivos con medio mínimo-glucosa suplementados con

ampicilina, sulfato de Cu y L-tirosina, implementándose el proceso descrito en los

materiales y métodos, el cual se muestra a manera de resumen en la (Figura 6.1).

Este proceso se adaptó a partir de lo descrito en la Patente de los EUA No.

5,837,505 (della-Cioppa et al., 1998), obteniéndose un producto de color negro

intenso.

23

Posteriormente, la melanina fue caracterizada espectrofotométricamente utilizando

una concentración (pesada y aforada con la mayor precisión posible) de 0.01 g/l en

agua destilada y comparada con respecto a la melanina grado analítico, la cual es

obtenida mediante síntesis química, que distribuye la compañía Sigma. Las

eumelaninas se pesaron cuidadosamente en balanza analítica, su disolución se llevo

a cabo a pH alcalino (pH = 10), y una vez disuelta el pH se ajusto entre 7 y 7.5, para

finalmente aforarse con agua destilada a la concentración indicada.

Centrifugación

Masa celular(desecho)

Sobrenadante

Precipitado Sobrenadante(desecho)

Ajuste pH 2 (HCl 0.5 mM) por 1hCentrifugación (12000 x”g”

por 12 min a 25 ° C)

Lavado con agua destilada sobre filtro de0.45 micras en vac ío

Secado de la melanina (100 ° C por 72 h)

Melanina

Cultivo de E. coli/ptrcmelA

Centrifugación (6000 x”g” por 5 min a 25 °C)

Masa celular(desecho)

Sobrenadante

Precipitado Sobrenadante(desecho)

Ajuste pH 2 (HCl 0.5 mM) por 1hCentrifugació

por 12 min a 25 ° C)

Lavado con agua destilada sobre filtro de0.45 micras en vac ío

Secado de la melanina (100 ° C por 72 h)

Melanina

Cultivo de E. coli/ptrcmelACultivo de E. coli/ptrcmelA

Centrifugación

Masa celular(desecho)

Sobrenadante

Precipitado Sobrenadante(desecho)

Ajuste pH 2 (HCl 0.5 mM) por 1hCentrifugación (12000 x”g”

por 12 min a 25 ° C)

Lavado con agua destilada sobre filtro de0.45 micras en vac ío

Secado de la melanina (100 ° C por 72 h)

Melanina

Cultivo de E. coli/ptrcmelACultivo de E. coli/ptrcmelA

Centrifugación (6000 x”g” por 5 min a 25 °C)

Masa celular(desecho)

Sobrenadante

Precipitado Sobrenadante(desecho)

Ajuste pH 2 (HCl 0.5 mM) por 1hCentrifugació

por 12 min a 25 ° C)

Lavado con agua destilada sobre filtro de0.45 micras en vac ío

Secado de la melanina (100 ° C por 72 h)

Melanina

Cultivo de E. coli/ptrcmelACultivo de E. coli/ptrcmelACultivo de E. coli/ptrcmelACultivo de E. coli/ptrcmelA

Figura 6.1. Proceso implementado para la recuperación de melanina

En la figura 6.2 se muestra el espectro de absorción obtenido para ambas

eumelaninas en un intervalo de longitudes de onda de 190 a 800 nm. Como puede

observarse, el espectro de absorción de ambas es prácticamente idéntico, con

excepción de una menor absorción de la melanina obtenida en este trabajo en

longitudes de onda comprendidas entre los 205 y 320 nm. Esta diferencia puede

deberse a que los grupos carboxilo, que son los principales encargados de absorber

la energía de la región ultravioleta, se ven disminuidos, al reaccionar con el HCl

utilizado en el método de recuperación, liberando CO2 en presencia de calor (Ito,

24

1986). Además de que la melanina elaborada a partir de síntesis enzimática es

diferente a la producida por síntesis química, en cuanto al promedio de unidades

monoméricas presentes en la eumelanina (Chedekel, 1992). Para determinar estas

diferencias es necesario llevar estudios de caracterización adicionales de(l) (los)

producto(s) purificados, con técnicas analíticas tales como resonancia magnética

nuclear, difracción de rayos X y HPLC acoplada a espectrometría de masa.

200 300 400 500 600 700 8000.00.20.40.60.81.01.21.4

Eumelanina obtenida

Eumelanina Sigma

Longitud de onda (nm)

Abs

orbe

ncia

Figura 6.2. Espectro de absorción de eumelanina Sigma (grado analítico) y eumelanina obtenida en el presente trabajo a partir de tirosina en medio mineral-glucosa.

Como puede observarse el espectro de absorción para ambas eumelaninas es

idéntico en el intervalo de 320 a 420 nm. Particularmente, con la concentración de

eumelanina empleada (0.01 g/l), a 400 nm se obtiene un valor de absorbancia el cual

es confiable de leer en la mayoría de los espectrofotómetros (0.163). Por estas

razones se escogió 400 nm como la longitud de onda a la cual se podría desarrollar

una curva de calibración para cuantificar la melanina en los sobrenadantes de los

cultivos. Mediante una curva de calibración a diferentes concentraciones de melanina

(0.01 a 0.05 g/l) contra absorbencia a 400 nm, se determinó experimentalmente el

coeficiente de extinción. En la Figura 6.3 se muestran los resultados obtenidos

usando celdas con un paso de 1 cm, las pendientes, que corresponden a los valores

25

de los coeficientes de extinción, fueron de 13.8 y 14.8 cm-1 (g/l)-1 para las

eumelaninas de SIGMA y la producida en este trabajo, respectivamente, con

coeficientes de correlación (r2) mayores a 0.999 en ambos casos. Los valores

numéricos de coeficientes de extinción obtenidos concuerdan con valores reportados

en la literatura para eumelanina, p. ej. Sarna y Swartz (1988) reportan un valor de

14.7 a 400 nm.

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.060.00

0.25

0.50

0.75

1.00Eumelanina Sigma

Eumelanina obteniday= 13.8x+ 0.008

y= 14.8x+ 0.01

Melanina (g/l)

Abs

orbe

ncia

400

nm

Figura 6.3 Curva de calibración de absorbencia a 400 nm en función de la concentración de eumelanina.

De tal manera que para cuantificar la eumelanina, se midió la DO400, en el

sobrenadante de cultivos libres de células y fue convertida a peso seco utilizando la

siguiente relación 1 DO400 = 0.0676 g/l eumelanina. Este último valor es el inverso del

coeficiente de extinción de la eumelanina procesada. Como se observa en la Figura

6.3, el método es sensible a concentraciones tan bajas como 0.01 g/l y la curva es

lineal hasta una lectura de absorbencia de 0.8 y concentraciones de 0.05 gEuMel/l a

400 nm. De tal forma que a concentraciones mayores a 0.05 gEuMel/l se realizaban

diluciones con agua destilada, este procedimiento también ayudaba a resolver el

problema de precipitación cuando se alcanzaron concentraciones mayores a los 0.4

gEuMel/l.

26

6.3 Efecto del marcador de selección (ampicilina) y del cofactor (Cu). Se realizaron cultivos con la cepa W3110/pTrcMutmelA para 2 concentraciones

combinadas del marcador de selección ampicilina y cofactor sulfato de cobre. Las

cinéticas de crecimiento y de formación de eumelanina se muestran en la figura 6.4.

Para evaluar el efecto combinado de dos niveles del marcador de resistencia y del

cofactor se probaron dos niveles de ambos: a) 200 µg/ml de ampicilina con 40 µg/ml

CUSO4; y b) 100 µg/ml de ampicilina con 20 µg/ml CUSO4. La figura 6.4 muestra la

cinética de este cultivo y en la tabla 6.2 se presenta un resumen de los parámetros

cinéticos y de conversión de glucosa en biomasa. En las concentraciones probadas,

la comparación de resultados permite establecer que la velocidad de crecimiento (µ)

y el rendimiento biomasa/glucosa (YX/Glc) fue menor con las concentración elevadas

de ampicilina y de Cu, en un 19 y 11%, respectivamente. Esto de debió

probablemente a que el uso de concentraciones relativamente altas de estos

compuestos resultan ser tóxicos ó a que se canaliza una mayor cantidad de energía

para el mantenimiento de la célula. No obstante en términos específicos la velocidad

de consumo de glucosa (qGlc) prácticamente no varió, debido a que la µ y YX/Glc

disminuyeron en aproximadamente la misma proporción.

Como se observa en la figura 6.4, una vez que la glucosa se agota y que el

microorganismo entra a la fase estacionaria, inicia la formación de melanina, esto

indica que la producción de la misma no esta asociada a crecimiento. Dicho

comportamiento se presentó en todos los experimentos llevados a cabo en la

presente tesis y se discutirá a más detalle en otras secciones. No obstante, se sabe

que la trascripción de los insertos que están bajo el control de trc en el vector

pTrc99A se da durante la fase de crecimiento (Amann et al., 1988) y, como se

mostrará adelante, que la actividad de tirosinasa y por ende la formación de la misma

es durante la fase de crecimiento. En el caso de productos no asociados a

crecimiento la formación del mismo esta dada por la ecuación =dtdP β x (Ver anexo

11.4 y 11.5), donde la constante βEuMel representa la velocidad específica de

producción de eumelanina (mgEuMel/gDCWh). En la figura 6.4 se observa que la

27

cantidad de células permanece constante durante la fase estacionaria y en la cinética

de formación de eumelanina que su producción se da a dos velocidades diferentes.

0 10 20 30 40 50 600.01

0.1

1

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

Tiempo (h)

Bio

mas

a (g

DW

C/l)

Eumelanina x 4 (g/l)

Glucosa (g/l)

Figura 6.4 Efecto de niveles de ampicilina y Cu sobre las cinéticas de crecimiento y de formación de melanina. Condiciones del cultivo: pH 7.0, 30°C y 0.1mM IPTG. Símbolos vacíos: 200 µg/ml de ampicilina y 40 µg/ml CuSO4. Símbolos llenos: 100 µg/ml de ampicilina y 20 µg/ml CuSO4.

Tabla 6.1 Efecto de los niveles de ampicilina y Cu sobre parámetros cinéticos de crecimiento y de formación de melanina.

Amp:CuSO4 (mg/ml:µg/ml)

µ

(h-1)

YX/Glc

(gDCW/gGlc)

qGlc

(gGlc/gDWC h)β1

(mgEuMel/

gDWCh)

β2

(mgEuMel/

gDWCh)

YEuMel/TYR

(%)

200 : 40 0.21 0.24 0.91 23.5 11.1 81.6

100 : 20 0.26 0.27 0.96 18.5 6.0 61.5

Para los dos casos evaluados β disminuyó más del 50% a las 22 h del cultivo (β2 en

la tabla 6.2). Esta disminución puede deberse a que la estabilidad de la tirosinasa

disminuye después de las 22 h. Además, tanto β1 y β2 fueron mayores en el

experimento con la mayor concentración de ampicilina y Cu en un 27 y 85%,

28

respectivamente, lo cual provocó que el rendimiento de producción de melanina con

respecto a tirosina sea del 82 % del teórico máximo a las 50 h de cultivo, 25% mayor

que el obtenido con el nivel bajo de ampicilina y Cu. Estos datos sugieren que el nivel

alto de ampicilina (200 µg/ml) probablemente provoca una mayor estabilidad del

plásmido y en consecuencia que estas células tengan una mayor cantidad de

tirosinasa.

6.4 Efecto de la temperatura En las figuras 6.5 a 6.9 se presentan las cinéticas y el resumen de resultados de los

experimentos donde se estudió el efecto de la temperatura sobre el crecimiento y la

producción de melanina, incluyendo las condiciones experimentales en la figura 6.5.

Como se observa la producción de melanina ocurre únicamente durante las fases

estacionarias de los cultivos y los parámetros cinéticos cambian en función de la

temperatura. En la figura 6.6 se observa que, para el intervalo de temperaturas

estudiado, la velocidad específica de crecimiento presenta una dependencia lineal

con la temperatura. Así mismo, la velocidad específica de consumo de glucosa

también presenta una relación lineal con la velocidad específica de crecimiento

(Figura 6.7). Esta última relación es representada por el modelo de consumo global

de sustrato, considerando que no hay producto,

qS =sYx /

µ + m

en el cual la ordenada al origen es la energía de mantenimiento (m) y el recíproco de

la pendiente es el rendimiento verdadero (YX/S). Los valores obtenidos son m =

0.095gGlc/gDCWh y YX/S = 0.37 gDWC/gGlu para ambos parámetros, respectivamente. Da

Silva y Bailey (1986) estimaron, para E. coli recombinante, que los rendimientos

teóricos máximos eran de 0.42 gDWC/gGlu, mientras que para el mismo hospedero

utilizado en el presente trabajo con un plásmido diferente, Sandoval (2003) obtuvo

YX/S = 0.4 gDWC/gGlu, siendo únicamente 10 % y 5% mayores al valor encontrado para

W3110/pTrcmutmelA. Los valores de energía de mantenimiento para E. coli silvestre

son de 0.047 gGlc/gDWC h (Neijssel, et al. 1996) y de 0.054 gGlc/gDWC h (Blanch y ClarK

1997). Estos valores son aproximadamente el 50 % menores, que el obtenido para E.

29

coli W3110/pTrcMutmelA, debido a que esta es una cepa que contiene el plásmido

pTrcMutmelA el cual aumenta la carga metabólica en la célula.

Para expresar la dependencia de la velocidad específica de crecimiento con respecto

a la temperatura se utilizó la ecuación de Arrhenius

RTa

eΕ−

Α=µ,

donde Ea es la energía de activación (cal/mol) y representa la cantidad energía

necesaria para obtener crecimiento exponencial microbiano en cierto intervalo de

temperatura; A es una constante que representa un factor de frecuencia; R es la

constante de los gases ideales (en cal/mol.°K) y T la temperatura (en °K). Graficando

el log µ contra T-1, se obtiene una línea recta, cuya pendiente es – Ea/R (Figura 6.8).

Multiplicando el valor de la pendiente por la constante de la ley general de los gases

(1.9872 cal/mol oK), se obtiene el valor de energía de activación: 14,778.8 cal/mol y

el valor de la constante A de 1.146x1010 (h-1). El valor de energía de activación

encontrado en nuestro trabajo para E. coli W3110/pTrcMutmelA fue únicamente 10 %

mayor que el reportado para E. coli B/r en medio mínimo (Ingraham y Marr, 1996).

No obstante que la temperatura óptima para el crecimiento de E. coli es de 37°C

(Ingraham y Marr, 1996), la producción de eumelanina no se ve favorecida a

temperaturas cercanas a este óptimo (Figura 6.5).

En esta ocasión también la producción de melanina se dio a dos diferentes

velocidades con reducciones del 50 al 75% para las temperaturas de 25-30oC y 32.5-

35oC, respectivamente, después de las 25 h de cultivo (Figura 6.5 y 6.9). No obstante

que el cultivo que se desarrolló a 35°C, por crecer a una mayor velocidad, llegó más

rápido a la fase estacionaria, no produjo melanina antes que los otros cultivos.

Probablemente esto se debe a que la temperatura de 35°C se aleja de la

temperatura óptima de actividad de tirosinasa, ya que es bien sabido que a 37oC el

30

0 10 20 30 40 50 60 700.01

0.1

1

Tiempo (h)

Bio

mas

a (g

DW

C/l)

0 10 20 30 40 50 60 700.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

Tiempo (h)

Glu

cosa

(g/l)

0 10 20 30 40 50 60 700.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Tiempo (h)

Eum

elan

ina

(g/l)

Figura 6.5 Efecto de la temperatura sobre las cinéticas de crecimiento, consumo de glucosa y producción de eumelanina. Condiciones del cultivo pH 7.0, 0.1mM IPTG, 200 µg/ml de ampicilina y 40 µg/ml CuSO4. Temperaturas (oC): Cuadrado 25.0, Triángulo 27.5, Triángulo hacia abajo 30.0, Rombo 32.5 y Circulo 35.0.

31

25.0 27.5 30.0 32.5 35.00.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

Temperatura (oC)

µ (h

-1)

Figura 6.6 Relación entre la temperatura y la velocidad específica de crecimiento.

0.1 0.2 0.3 0.4

0.5

0.7

0.9

1.1

µ (h-1)

q Glc

(gG

lc/g

DC

Wh) y= 2.723x + 0.095

Figura 6.7 Relación entre la velocidad específica de crecimiento y la velocidad específica de consumo de glucosa.

vector pTrc99A favorece la transcripción de los insertos bajo el control de trc (Amann

et al., 1988). Los datos presentados en las Figura 6.5 y 6.9 sugieren que la

temperatura favorable para la actividad de la enzima está entre 30 y 32.5oC y que la

velocidad específica de formación de melanina se ve favorecida a 32.5 y 30°C.

32

Además, considerando que el rendimiento de producción de melanina fue de 80 a

95% para las temperaturas de 25, 27 y 32.5oC, que se ve drásticamente reducida a

35oC (28%) y que a 30oC se obtiene el 100% de conversión de tirosina en melanina

(Figura 6.10), y aunado a que la mayor velocidad de síntesis se obtiene a esta última

temperatura, se escogió la temperatura de 30oC para continuar los estudios. Estos

resultados concuerdan con el origen del gen que codifica para la tirosinasa, es decir

el gen melA fue clonado a partir de R. etli, y los organismos del mismo genero

pertenecientes a bacterias del suelo han visto favorecida la producción de melanina a

esa temperaturas de cultivo 30°C (Mercado-Blanco et al. 1993).

3.20 3.25 3.30 3.35 3.400.1

1

1/T x 1000 (oK-1)

µ (h

-1)

y= -7.437x+23.162128

Figura 6.8 Aplicación del modelo tipo Arrhenius para representar la dependencia de la velocidad específica de crecimiento con el recíproco de la temperatura para E. coli W3110/pTrcMutmelA.

33

25 27.5 30 32.5 350

5

10

15

20

25ßEuMel1ßEuMel2

Temperatura (°C)

ß EuM

el(m

g EuM

el/g

DC

Wh)

Figura 6.9 Velocidad específica de formación de eumelanina como función de la temperatura.

25 27.5 30 32.5 350

20

40

60

80

100

Temperatura (°C)

Y EuM

el/T

yr(%

)

Figura 6.10 Rendimiento de conversión de tirosina en eumelanina en función de la temperatura.

6.5 Efecto del pH Para determinar el efecto del pH sobre la producción de melanina, se llevó acabo un

cultivo con los parámetros antes seleccionados (ampicilina 200 µg/ml, sulfato de

cobre 40 µg/ml y 30°C), con 0.4 g/l de tirosina y 0.1 mM de IPTG. El caldo de

fermentación, al llegar a la fase estacionaria, fue dividió en porciones de 50 ml

(matraces de 250 ml con mamparas), se ajusto el pH a diferentes niveles

(reajustandolos al mismo valor cada vez que se muestrearon) y se incubaron a 30° C

y 250 rpm. De esta manera la concentración de células fue constante para todos los

34

0 12 24 36 48 60 720.01

0.1

1

Tiempo (h)

Bio

mas

a (g

DW

C/l)

0 12 24 36 48 60 720.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Tiempo (h)

Eum

elan

ina

(g/l)

Figura 6.11 Efecto del pH sobre las cinéticas de crecimiento y de producción de melanina. Condiciones del cultivo: 0.1mM IPTG, 200 µg/ml de ampicilina y 40 µg/ml CUSO4. Símbolos para pH: Cuadrado 5.5, Triángulo 6.0, Triángulo hacia abajo 6.5, Rombo 7.0, Circulo 7.5, Equis 8.0 y Cruz 8.5.

experimentos durante la etapa de producción de melanina (Figura 6.11). La cantidad

de melanina obtenida, así como la velocidad con que se produjo fue drásticamente

afectada por el valor de pH (Figuras 6.11 y 6.12). Los valores de pH que no

35

favorecieron la síntesis de melanina fueron 5.5 a 6.5 y 8.5, siendo 7.5 y 8.0 los que

provocaron la mayor velocidad de producción. Cabe resaltar que a estos últimos

valores se presento una sola velocidad, ocasionando que desapareciera la etapa de

producción a una velocidad baja (Figura 6.12). Además a los valores de 7.5 y 8.5 el

valor de β se incrementó en promedio al doble del obtenido con pH 7.0.

El rendimiento de conversión de tirosina en melanina fue del 100% para los pHs de

7.0, 7.5 y 8.0, y menor a 70% para los otros valores evaluados (Figura 6.13). En

virtud de que la velocidad de producción y el rendimiento se reducen drásticamente a

pH de 8.5, se decidió seleccionar como el pH 7.5 en lugar de 8.0, durante la etapa de

producción, como el valor para continuar el estudio y evitar correr el riesgo de errores

durante el control de los cultivos, que podrían afectar radicalmente la formación de

melanina. De nuevo, como en el caso del estudio de temperatura, estos datos

sugieren que el pH óptimo de actividad de la enzima está entre 7.5 y 8.0.

5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.50

10

20

30

40

50

β1β2

pH

β (m

g EuM

el/g

DC

Wh)

Figura 6.12 Efecto del pH en la velocidad específica de formación de eumelanina.

36

5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.50

20

40

60

80

100

pH

Y EuM

el/T

yr(%

)

Figura 6.13 Efecto del pH sobre el rendimiento reconversión de tirosina en eumelanina.

6.6 Efecto del IPTG Una vez establecidos los valores de marcador de resistencia, cofactor, temperatura y

pH que favorecen la mayor velocidad de síntesis y el mayor rendimiento de

conversión de tirosina en melanina, y no obstante que se conoce que

concentraciones de 0.1 mM de IPTG conllevan a una buena transcripción del vector

pTrc99A, decidimos revisar el efecto de la concentración de inductor del plásmido.

Particularmente, para la construcción empleada, E. coli pTrcMutmelA, la

concentración más alta que se evaluó (1 mM) ocasionó reducciones en la velocidad

específica de crecimiento y en la velocidad de consumo de glucosa, no obstante la

cantidad de células alcanzadas cuando se agotó la glucosa fue la misma para las

tres concentraciones probadas (Figura 6.14 y Tabla 6.2). Al parecer, también como

ya ha sido reportado (Miao y Kompala, 1992), el aumento en las concentraciones de

IPTG afecta de manera negativa el crecimiento de algunas cepas de E.coli en

condiciones aeróbicas. Los resultados de producción de melanina indican: a) que la

producción fue mínima cuando se utilizó 0.01 mM de IPTG, probablemente debido a

una baja inducción del plásmido; b) que la formación de melanina inició 12 horas

después de entrar a la fase estacionaria cuando se usó 1 mM de IPTG, ocasionado

posiblemente por un efecto de acumulación excesiva y conformación inadecuada de

la tirosinasa; y c) que el rendimiento de conversión de tirosina en melanina fue el

37

máximo a concentraciones de 0.1 y 1 mM de IPTG, siendo prácticamente nulo

cuando se usó 0.01 mM. Por los resultados presentados en esta sección se

recomienda utilizar una concentración de IPTG de 0.1 mM cuando se utiliza medio

mineral con 2 g/l de glucosa, aunque probablemente a concentraciones celulares

mayores sea necesario una concentración mayor del inductor.

Tabla 6.2. Resumen de resultados de cultivos con diferentes concentraciones de IPTG.

IPTG

(mM) µ

(h-1)

qS

(gGlc/gDCWh) β1

(mgEuMel/gDcWh)

YEuMel/Tyr

(%)

1 0.22 0.66 49.8 100

0.1 0.29 0.82 43.6 100

0.01 0.31 0.81 0.72 11.41

38

0 10 20 30 40 500.01

0.1

1

Tiempo (h)

Bio

mas

a (g

DW

C/l)

0 10 20 30 40 500.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Tiempo (h)

Glu

cosa

(g/l)

0 10 20 30 40 500.00

0.25

0.50

0.75

Tiempo (h)

Eum

elan

ina

(g/l)

Figura 6.14 Cinéticas de crecimiento, consumo de glucosa y producción de melanina de cultivos lote a diferentes concentraciones de IPTG. Condiciones de cultivo: 200 µg/ml de ampicilina, 40 µg/ml de sulfato de cobre, 0.4 g/l de tirosina, pH 7.0 durante la fase de crecimiento y 7.5 durante la etapa de producción de melanina. IPTG (mM): Cuadrado 0.01, Triángulo 0.1, Triángulo hacia abajo 1.

39

6.7 Efecto de la concentración de cobre Con los valores de los parámetros antes seleccionados y cambiando el pH de 7.0 a

8.0, al llegar a la fase estacionaria, se decidió evaluar de forma independiente el

efecto que tiene la concentración de sulfato de cobre. Las concentraciones

evaluadas fueron: 20, 40, 80, y 400 µg/ml. Las células se lisaron instantáneamente

cuando se inóculo el cultivo con 400 µg/ml de sulfato de cobre, debido a que a tal

concentración el cobre (6.3 mM) es sumamente tóxico para E. coli W3110, la

concentración mínima de cobre reportada que inhibe su crecimiento es 3.5 mM

(Grass y Rensing 2001). En comparación con las concentraciones de CuSO4 de 20 y

40 µg/ml , las velocidades específicas de crecimiento de consumo de glucosa y el

rendimiento disminuyeron cuando se utilizaron 80 µg/ml deCuSO4 (Figura 6.15 y

Tabla 6.3). Al parecer el efecto tóxico del cobre sobre el crecimiento se empieza a

manifestar a partir de 1.26 mM y el exceso de iones Cu+2 parece interferir con la

activación del sustrato en el sitio activo de la enzima. La velocidad específica de

formación de melanina fue similar para las concentraciones de 20 y 40 µg/ml de

sulfato de Cu, lo cual permite suponer que estas son concentraciones adecuadas

para donar los iones Cu+2 que conforman el sitio activo de la enzima sin que se

afecte su afinidad por el sustrato.

Tabla 6.3 Datos cinéticos a diferentes concentraciones de sulfato de cobre.

CuSO4

(µg/ml)

µ

(h-1)

qS

(gGlc/gDCWh)β

(mgEuMel/gDCWh)

YEuMel/Tyr

(%)

80 0.24 0.74 38.7 73

40 0.27 0.83 46.6 100

20 0.27 0.82 41.7 100

40

0 10 20 30 40 500.01

0.1

1

Tiempo (h)

Bio

mas

a (g

DW

C/l)

0 10 20 30 40 500.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tiempo (h)

Glu

cosa

(g/l)

0 10 20 30 40 500.00

0.25

0.50

0.75

Tiempo (h)

Eum

elan

ina

(g/l)

Figura 6.15 Cinéticas de crecimiento, consumo de glucosa y producción de melanina a diferentes concentraciones de CuSO4. Condiciones: 200 µg/ml de ampicilina, 0.4 g/l de tirosina, 0.1 mM de IPTG, 30°C, pH inicial de 7.0 y 8 al iniciar la fase estacionaria. Sulfato de cobre (µg/ml): Cuadrado 20, Triángulo 40 y Triángulo hacia abajo 80.

41

6.8 Cultivo lote con adiciones de tirosina Con el propósito de determinar: a) el consumo de tirosina durante la fase de

crecimiento y el inicio de la estacionaria; b) sí era factible incrementar la

concentración de melanina; y c) la actividad específica de tirosinasa durante las

fases de crecimiento y estacionaria, se llevó a cabo un cultivo con todos los

parámetros estudiados en sus valores seleccionados y con pulsos de tirosina durante

la fase estacionaria tal y como se muestra en la figura 6.16. Los valores de los

parámetros cinéticos y estequiométricos durante la fase de crecimiento (µ, qGlc y

YX/S), fueron prácticamente iguales a los obtenidos en la sección anterior con 40

µg/ml de sulfato de cobre. La tirosina no es consumida por las células durante la fase

de crecimiento exponencial, durante la fase previa a la entrada a estacionaria y

cuando la concentración celular es máxima (aprox. 0.8 gDCW/l) se consume

aproximadamente el 20% de la tirosina inicial, es decir tan sólo 0.08 g/l de los 0.4 g/l

iniciales de tirosina (Figura 6.16). Durante la fase estacionaria, de producción de

eumelanina, se consume el 80% de la tirosina inicial. En el microorganismo

estudiado (E. coli W3110/pTrcMutmelA) la enzima es producida intracelularmente y,

aunque contradictorio, se sabe que los sistemas de trasporte, específicamente las

permeasas de tirosina aroP y tyrP en la membrana de E. coli, se reducen

drásticamente en presencia de tirosina (Whipp y Pittard, 1977; Sarsero et. al., 1991).

Esto constituye una barrera física, en la cual la tirosinasa formada no tiene acceso a

la tirosina para convertirla en L-dopa. El consumo de tirosina durante la etapa

preestacionaria parece servir para que las células utilicen este aminoácido para

satisfacer requerimientos nutricionales o para formar los primeros precursores de la

melanina. Como es sabido durante la fase estacionaria ocurren muchos cambios en

la expresión de proteínas, en la activación de los sistemas de respuesta a estrés y en

la conformación de la membrana de E. coli (Hewitt et al., 1999). Durante dicha fase

es probable que la combinación de estos factores ocasione que la tirosina ingrese a

la célula, los precursores de la melanina sean formados intracelularmente, por acción

de la tirosinasa, excretados al medio y que la polimerización de la misma ocurra

extracelularmente, ya que el producto es obtenido en el sobrenadante.

42

La adición de cuatro pulsos de tirosina en polvo, para obtener adiciones de 0.4 g/l

cada una, aparte de la inicial, permitió producir un poco más de 1.3 g/l de melanina y

mostrar que la enzima se mantiene activa, convirtiendo tirosina en melanina, en las

condiciones de cultivo evaluadas, hasta por más de 60 h (Figura 6.16). Además, la

conversión de los 1.2 g/l de tirosina, agregados en la primera parte del cultivo, en

melanina fue del 100% hasta las 60 h del cultivo, y la conversión de los 0.8 g/l de

tirosina adicionados en la etapa final del cultivo fue marginal, probablemente debido

a la inactivación de la enzima.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000.01

0.1

1

0.0

0.5

1.0

1.5

Tiempo (h)

Bio

mas

a (g

DW

C/l) Eum

elanina (g/l) L-Tirosina (g/l)

Figura 6.16 Cinética de crecimiento, consumo de tirosina y producción de melanina en medio M9 suplementado con tirosina, con alimentaciones graduales de tirosina en la fase estacionaria. Las flechas indican el momento en el cual se alimentan 0,4 g/l de tirosina. Condiciones del cultivo: 40 µg/ml de CuSO4, 0.1 mM de IPTG, ampicilina 200 µg/ml, 30 °C, pH 7.0 durante la etapa de crecimiento exponencial y cambio a 7.5 a partir de que se terminó la glucosa.

La actividad de la enzima durante la fase de crecimiento fue de 1.55 UI/gDWC y de

1.43 UI/gDWC a las 13 h (Figura 6. 17) de haber iniciado la fase estacionaria. Los

valores específicos de actividad son similares y muestran claramente que la enzima

se forma durante la fase de crecimiento, se mantiene estable durante al menos las

primeras 12 h de la fase estacionaria, y que no es necesario agregar más cofactor

43

durante el ensayo de actividad, ya que al parecer la totalidad de la enzima es

funcional y no requiere de cantidades adicionales del mismo. Estos datos, en

conjunción con los resultados presentados antes en esta sección, confirman que la

melanina no se forma durante la fase exponencial por que la enzima no está en

contacto directo con el sustrato.

10 250.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tiempo (h)

Act

. Enz

imát

ica

(U/g

DW

C)

Figura. 6.17 Valores de actividad a distintos tiempos del cultivo.

6.9 Cultivo lote con alta concentración de tirosina Con el fin de evaluar si el microorganismo era capaz de producir mas de 3 g/l de

melanina (valor de producción máximo reportado a la fecha con microorganismos

recombinantes; della-Cioppa et al., 1998) se llevó a cabo un experimento en el cual

se incrementó la concentración inicial de glucosa para incrementar la cantidad de

células y tener una mayor cantidad de tirosinasa en el mismo volumen y poder

convertir 5 g/l de tirosina en melanina. Los resultados de este experimento se

muestran el la Figura 6.17. En resumen, los parámetros cinéticos de crecimiento

fueron similares a los obtenidos previamente (µ de 0.25 h-1, qGlc 0.83 gGlc/gDWCh),

alcanzando una biomasa máxima de1.54 gDWC/l, un poco más del doble de los

experimentos anteriores con 2 g/l de glucosa. La producción de melanina se llevó a

cabo desde el inicio de la fase estacionaria hasta las 80 h del cultivo, llegando a un

44

total de 5.7 g/l, que corresponde al 100% de conversión del máximo teórico de la

tirosina adicionada. La velocidad específica de formación de melanina fue de β= 70.3

(mgMEL/gDWC h), la cual es 50% mayor que en los experimentos anteriores y en

términos de productividad volumétrica se alcanzó una velocidad de 95 mgMEL/l h, 5

veces mayor que la encontrada anteriormente cuando E. coli W3110/pTrcmelA fue

crecida utilizando 2 g/l de glucosa.

0 10 20 30 40 50 60 70 800.01

0.1

1

012345678

4 (g/l) tyr

Tiempo (h)

Bio

mas

a (g

DW

C/l) Eum

elanina (g/l)G

lucosa (g/l)

Figura 6.17 Cinética de crecimiento, consumo de glucosa y producción de melanina a altas concentraciones de tirosina Para poder producir altas concentraciones de melanina se realizo un cultivo con 8.5 g/l de glucosa para alcanzar mayor concentración celular, en medio M9 suplementado con 1 g/l de tirosina inicial, CuSO4 40 µg/ml, 200 µg/ml de Ampicilina, 0.1 mM de IPTG, temperatura de 30° C, 1 vvm (para evitar las limitaciones de oxígeno a altas concentraciones de celulares), a pH 7 de crecimiento, cambio de pH a 7.5 en la fase estacionaria y alimentación de 4 g/l de tirosina a las 32 del cultivo.

6.10 Producción de melanina en medio Luria Para descartar que la producción de melanina, y por ende la entrada de tirosina no

está reprimida por la presencia de glucosa, sino por las condiciones de la membrana

durante la fase estacionaria de los cultivos, se analizó la cinética de crecimiento y de

producción de melanina de E. coli W3110/pTrcMutmelA en medio rico (medio Luria)

sin glucosa, con las condiciones mostradas en la Figura 6.18. Además se incluyó

45

como control negativo a la cepa progenitora (W3110). Como era esperado, las

velocidades específicas de crecimiento fueron mayores que con medio mineral (0.63

h-1. para ambas cepas), la velocidad específica de formación de melanina fue de

28.27 mgEuMel/gDCW h, y la máxima concentración de producto fue de 1.13 gEuMel/l, el

cual es mucho mayor al que se obtendría a partir de los 0.4 g/l de tirosina. Un

balance sobre los aminoácidos aromáticos (incluyendo la tirosina) presentes en el

medio Luria, permitió concluir que dicha cantidad de melanina se formó por la

copolimerización de las especies activas formadas de la tirosina por la tirosinasa con

otros aminoácidos presentes en el medio Luria.

Por cuestiones prácticas, para llevar a cabo la cuantificación de melanina se usó el

coeficiente de extinción correspondiente a la eumelanina, aunque esta consideración

no es del todo correcta ya que el medio Luria contiene otros aminoácidos, incluyendo

tirosina (Manual: Difco Laboratories, 1998), que pueden copolimerizar con las

especies reactivas que forma la tirosinasa a partir de la tirosina y por tanto producir

un heteropolímero diferente al que se produce en medios mínimos con tirosina como

único sustrato. Lo más correcto sería caracterizar la melanina producida a partir del

medio Luria, pero dicho estudio no se contempló como parte integral de esta tesis,

además de que para esta parte del presente estudio lo más importante no era

cuantificar de manera precisa la melanina, sino determinar si la glucosa tenía un

efecto represor en la formación de ésta, además de que la producción de melanina a

partir de medios complejos genera costos de producción mayores, una melanina

bastante heterogénea y más difícil de eliminar impurezas durante la purificación.

En la Figura10.18 se muestra claramente que la formación de melanina se llevó a

cabo únicamente durante la fase estacionaria del cultivo, lo cual demuestra que no

hay represión por glucosa en los cultivos anteriores en presencia de glucosa y que la

tirosina extracelular entre en contacto con la tirosinasa intracelular depende

exclusivamente de las condiciones de la membrana. Otros estudio llevados a cabo

recientemente, por otro tesista en el laboratorio de IVM-DICB-IBt-UNAM, han

mostrado que se puede producir melanina en presencia de glucosa si las células son

46

permeabilizadas por diferentes métodos durante la fase de crecimiento exponencial

(Zarate y Martínez; comunicación personal). No obstante se ha reportado que

algunas veces la presencia de monosacáridos en el medio pueden actuar como

represores de la producción de melanina, caso concreto el de Streptomyces lividans,

que al no adicionar glucosa al medio, el cual está elaborado con caseína peptona y/o

caseína hidrolizada, la producción de melanina es mejorada (della-Ciopa, et al.

1998).

0 10 20 30 40 500.01

0.1

1

10

W3110W3110/ptrcmutmelA

0.0

0.5

1.0

1.5

Tiempo (h)

Bio

mas

a (g

DW

C/l) M

elanina (g/l)

Figura 6.18 Cinética de crecimiento y de producción de melanina con medio Luria. Condiciones: 200 µg/ml de Ampicilina, 0.4 g/l de tirosina, 0.1 mM de IPTG para E. coli W3110/pTrcMutmelA y sin los suplementos antes mencionados para la cepa silvestre E.coli W3110. Temperatura 30°C, con un pH inicial de 7.0 y 7.5 cuando los cultivos llegaron a fase estacionaria.

10.11 Producción de feomelanina Se llevaron a cabo pruebas preliminares a nivel matraz para evaluar la producción de

otro tipo de melaninas, utilizando L- tirosina en mezclas con cada uno de los

siguientes sustratos: fenilalanina, acido ascórbico y cisteína. Está reportado que

estos compuestos pueden copolimerizar con las especies reactivas derivadas de la

tirosina (della- Cioppa et al., 1998). De estos experimentos se observó que no había

variaciones en cuanto a color, excepto para la mezcla tirosina-cisteína en soluciones

47

diluidas. Es por eso que se decidió realizar el estudio en fermentador únicamente

para esta mezcla.

Es sabido que otro tipo de melaninas, con diferente color pueden formarse si las

especies reactivas formadas a partir de la tirosina copolimerizan con otros

aminoácidos, en el caso específico de la cisteína se forma un polímero color rojizo-

café que da lugar a la feomelanina (Ozeki et al., 1997). Como parte final del presente

trabajo se decidió evaluar el potencial de W3110/pTrcMutmelA para producir

feomelanina. Cabe aclarar que la cisteína es altamente tóxica para las bacterias

entéricas como E. coli (Mcfall y Newman, 1996), por esta razón se llevó a cabo

preliminarmente una prueba de inhibición al crecimiento de W3110/pTrcMutmelA por

cisteína. Se realizó un barrido usando concentraciones de cisteína por debajo de

1.116x10-3 M. Se encontró que la concentración máxima de cisteína que no afecta el

crecimiento de E. coli W3110/pTrcMutmelA es de 2.85 x10-4 M. Por lo tanto la

evaluación se realizó con las condiciones indicadas en la figura 6.19, adicionando

desde el inicio del cultivo 2.85 x10-4 M de cisteína. Además, durante la fase

estacionaria se hicieron dos adiciones de cisterna de 5.7x10-4 y 2.85 x10-4 M, a las 12

y 24 h del cultivo, para completar de esta manera 0.335 g/l de la mezcla 1:1 molar de

tirosina y cisterna (Figura 6.19). Se decidió probar esta relación considerando que en

la síntesis de feomelanina se incorpora una molécula de cisteína por cada molécula

de tirosina reactiva.

48

0 10 20 30 40 500.01

0.1

1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

cisteína 5.7x10-4M

cisteína2.85x10-4 M

Tiempo (h)

Bio

mas

a (g

DW

C/l) Feom

elanina (g/l)

Figura 6.19. Cinética de crecimiento y producción de feomelanina. Condiciones: 2 g/l de glucosa, CuSO4 40 µg/ml, 200 µg/ml de Ampicilina, 0.1 mM de IPTG, con 0.335 g/l de la mezcla 1:1 Molar de tirosina y cisteína, temperatura de 30° C, pH 7 de crecimiento y cambio a 7:5 en la fase estacionaria.

Para cuantificar la feomelanina, ésta se recuperó y caracterizó de la misma manera

que se utilizó para la feomelanina (Ver sección 6.2). La curva de calibración del

producto se muestra en la Figura 6.20, encontrándose un coeficiente de extinción de

9.5 cm-1 (g/l)-1 (r2 = 0.989), o en términos de absorbencia: 1 DO400 = 0.1056 g/l

feomelanina.

El análisis de la Figura 6.19 permite concluir que la concentración inicial utilizada, no

afecto el crecimiento de W3110/pTrcmelA, ya que las velocidades específicas de

crecimiento y de consumo de glucosa fueron 0.24 h-1 y 0.84 gGlc/gDWCh,

respectivamente, los cuales son bastante parecidos a los obtenidos en condiciones

similares y en ausencia de cisteína. En este caso también la formación de

feomelanina se llevó a cabo en la fase estacionaria y la cantidad feomelanina

máxima producida, a partir de la mezcla cisteína-tirosina, fue de 0.29 g/l, que

corresponde aproximadamente al 93 % del rendimiento teórico máximo de la mezcla

1:1 M de tirosina-cisteína. El promedio de velocidad específica de formación de

melanina fue 23.4 mgFeoMEL/gDCWh, valor que corresponde a aproximadamente la

49

mitad de la velocidad de formación de eumelanina bajo condiciones de cultivo

similares.

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.060.00

0.25

0.50

0.75

Feomelanina (g/l)

DO

(400

nm

) y= 9.47x + 0.0045

Figura 6.20 Curva de calibración de feomelanina producida a 400nm.

50

7. RESUMEN DE RESULTADOS Las condiciones favorables para la producción de melanina en cultivos lote con

medio mineral (M9) – glucosa en E.coli W3110/pTrcmelA son:

Sulfato de cobre (CuSO4): 20-40 µg/ml; Ampicilina: 200 mg/ml; IPTG: 0.1 mM;

Temperatura: 30 °C; y pH 7durante el crecimiento exponencial y cambio a pH 7.5-8

en la fase estacionaria.

51

8. CONCLUSIONES

Como primera parte de este trabajo se concluye que si es posible obtener melanina,

con E. coli W3110/pTrcMutmelA, en medio mineral-glucosa-tirosina.

La melanina producida a partir de tirosina en E. coli W3110/pTrcMutmelA es una

eumelanina.

El método de extracción de melanina utilizado permite obtener el 85 % de la

melanina producida.

La producción de melanina en cultivos lote, en E. coli W3110/pTrcMutmelA no esta

asociada a crecimiento.

La conversión de L-tirosina a eumelanina es del 100 % respecto al teórico máximo.

La enzima tirosinasa se encuentra de manera intracelular en la fase de crecimiento

exponencial y con una actividad similar durante la fase estacionaria del cultivo.

La melanina producida a partir de la mezcla tirosina y cisteína en E. coli

W3110/pTrcMutmelA es una feomelanina.

No existe represión por glucosa en la actividad de tirosinasa, si no más bien parece

ser un problema de contacto entre el sustrato y la enzima, probablemente provocado

por la incapacidad de E. coli para introducir tirosina durante la fase de crecimiento

exponencial.

Bajo las condiciones seleccionadas en este trabajo, se logró obtener una

productividad volumétrica de 95 mgEuMel/l h, la cual es mayor a otros valores

reportados en la literatura.

52

Se obtuvieron concentraciones de eumelanina de 5.8 g/l, aproximadamente el doble

del máximo reportado en la literatura con microorganismos silvestres o

recombinantes.

En su conjunto, los resultados aquí mostrados permiten proponer como una

alternativa biotecnológica el uso de E. coli W3110/pTrcMutmelA para la posible

formación de melanina a escala de producción.

53

9. PERSPECTIVAS

Evaluar si E. coli W3110/pTrcMutmelA puede producir melanina en la fase de

crecimiento exponencial utilizando otras fuentes de carbono diferentes a la glucosa.

Caracterizar la afinidad por otros sustratos derivados de la tirosina, y mezcla de cada

uno de ellos con la tirosina, para producir diferentes tipos de biopolímeros

(melaninas).

Purificar la enzima tirosinasa para: caracterizar sus propiedades catalíticas; producir

melania in vitro; inmovilizarla y producir melanina u otros compuestos derivados en

procesos continuos.

Producir melanina a partir de glucosa alterando las rutas del metabolismo central y

de síntesis de compuestos aromáticos en E. coli.

Inmovilizar la enzima tirosinasa para producir L-DOPA, que es un producto de interés

medico para tratar el mal de Parkinson.

Diseñar cultivos de alta densidad celular, primero crecer las células a alta densidad

sin inducir, antes de entrar a fase estacionaría, inducir (adiciona IPTG) por al menos

2 o 3 duplicaciones, agregar tirosina y tratar de alcanzar concentraciones de

melanina mayores a 20 g/l de manera que el proceso pueda ser factible para llevarlo

a la escala industrial.

Construir cepas que no requieran de la adición de inductor, por ejemplo, bajo un

promotor que se exprese constitutivamente.

Construir cepas que excreten la tirosinasa para llevar a cabo la producción de

melanina desde el inicio de los cultivos y además para favorecer la purificación de la

misma. Para excretar colocar un péptido señal a la tirosinasa y secuencias de

54

aminoácidos que permitan su adherencia a ciertas matrices para facilitar su

purificación.

Elaborar una patente para la producción de melanina a nivel fermentador, ante el

Instituto Mexicano de Protección Industrial (IMPI).

55

10. REFERENCIAS

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54. Whipp, J.M, y Pittard, A.J. 1977.Regulation of aromatic amino acid transport

system in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 132: 453-461.

60

11. ANEXO: ESTIMACION DE LOS PARAMÉTROS CINÉTICOS Y ESTEQUEOMÉTRICOS. 11.1 Velocidad específica de crecimiento La Figura 11.1 muestra la cinética de crecimiento, de consumo de glucosa y de

formación de producto típica para procesos de fermentación en procesos por lote. En

este caso se asume que los microorganismos han sido previamente adaptados en un

proceso de desarrollo de inóculos, en condiciones similares a las empleadas en el

cultivo a nivel de fermentador de las mismas y que por consecuencia no se presente

la fase de crecimiento retardado o de adaptación. Cuando las células no están

limitadas por sustrato crecen de forma exponencial y se observa una línea recta

cuando la masa celular es graficada en escala logarítmica en función del tiempo del

cultivo (Quintero, 1981). De está manera se tiene que:

dtdx = x µ t (1)

donde:

X es la biomasa (gDCW/l); t es el tiempo (h); y µ es una constante de proporcionalidad

que representa la velocidad específica de crecimiento (h-1)

Arreglando la ec. (1) e integrándola se obtiene:

X = Xo e( µ t ) (2)

donde:

Xo es la biomasa al inicio de la fase de crecimiento exponencial (gDCW/l)

De esta manera la velocidad de crecimiento se calculó aplicando el modelo de la ec.

(2), utilizando el método de los mínimos cuadrados.

61

11.2 Rendimiento biomasa sustrato (YX/S) Este término representa la biomasa generada por unidad de sustrato consumido:

0 5 10 15 20 25 30 350.01

0.1

1

10

X

P (NA)

0

2

4

6

8

10

P (A)

P (PA)Glu

Tiempo (h)

Bio

mas

a

Producto

Figura 11.1 Cinéticas de crecimiento, de consumo de glucosa y diferentes modelos para la formación de producto: a) Modelo asociado a crecimiento P (A); b) Modelo parcialmente asociado a crecimiento P (PA); c) Modelo no asociado a crecimiento P (NA).

YX/S =( )( )21

12

SSXX

−− (gDCW/gGlc) (3)

Donde:

S2 y S1 son la concentración de glucosa en la parte inicial y final, respectivamente

(gGlc/l); y X1 y X2 son la biomasa en la parte final e inicial de la fase de crecimiento

exponencial, respectivamente (gDCW/l).

11.3 Velocidad específica de consumo de glucosa (qS) Este parámetro representa la velocidad de consumo de azúcar por unidad de masa

celular (Quintero, 1981) y se calculó, durante la fase de crecimiento exponencial, de

acuerdo a:

62

qS =sYx /

µ (gGlc/gDCW h) (4)

11.4 Modelos para la formación de productos Las cinéticas que representan cada uno de los modelos de formación de producto se

muestran en la Figura 11.1 (Quintero, 1981). Cuando un sustrato se convierte en

producto (P), la tasa de formación esta en relación con la velocidad de crecimiento.

dtdP = α

dtdx (5)

donde α= constante estequiométrica. Este es el modelo asociado con crecimiento

Para los casos en que la formación del producto es independiente de la velocidad de

crecimiento:

dtdP = βX (6)

Donde X es la concentración de células, promedio, en la fase estacionaria y β es una

constante de proporcionalidad que representa la velocidad de formación de producto

no asociada a crecimiento, que se calcula mediante la siguiente ecuación:

β (gProducto/gDCW h) = x1dtdP = β (8)

El modelo combinado, para metabolitos parcialmente asociados a crecimiento,

propone expresar la producción como la suma de ambas ecuaciones:

dtdP = α

dtdx + βx (7)