UNIVERSIDAD AUTNOMA DE NUEVO LENFACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

ESTIMACIN POBLACIONAL DEL OSO NEGRO AMERICANO (Ursus americanus eremicus) CON MICROSATLITES DE ADN A PARTIR DE MUESTRAS NO INVASIVAS EN LAMPAZOS, NUEVO LEN.

TESIS QUE EN OPCION AL TITULO DE MEDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA PRESENTA

JOS LUIS MIJANGOS ARAUJO

ESCOBEDO, N.L.

ABRIL DE 2009

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE NUEVO LENFACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

ESTIMACIN POBLACIONAL DEL OSO NEGRO AMERICANO (Ursus americanus eremicus) CON MICROSATLITES DE ADN A PARTIR DE MUESTRAS NO INVASIVAS EN LAMPAZOS, NUEVO LEN.

REVISADA POR: ___________________________ Dr. Ramiro valos Ramrez Director de tesis ___________________________ Dr. Alfonso Martnez Muoz Director externo de tesis

___________________________ Dr. Vctor M. Riojas Valds Co-Director de Tesis Escobedo, N.L.

__________________________ Dra. Lourdes Chvez Co-Director externo de tesis 24 de abril de 2009

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"Bernardo de Chartres sola decir que somos como enanos a hombros de gigantes, por eso podemos ver ms que ellos y cosas a mayor distancia, no por ninguna agudeza visual de nuestra parte u otra distincin fsica, sino por que somos alzados y levantados por su tamao gigante. " Juan de Salisbury, Metalogicon, 1159.

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DEDICATORIA

Dedico este trabajo primeramente a Dios, ya que a l debo cada instante vivido. A mis padres, Jos Luis y Mercedes, a quienes debo todo lo que soy y todo lo que tengo. Y por ltimo a Cinthya y a Luca a quienes les deber todo lo que ser.

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AGRADECIMIENTOS

Quiero en primer lugar agradecer sumamente a los asesores de esta tesis. Al Dr. Alfonso Martnez, por haber confiado en m, darme la oportunidad de realizar esta tesis y siempre haberme tenido paciencia. Al Dr. Ramiro valos, por siempre tener una solucin rpida y concisa. Al Dr. Vctor Riojas, por haberme dado siempre su tiempo para resolver mis dudas. Y a la Dra. Lourdes Chvez, por permitirme trabajar en su laboratorio y nunca haberme negado nada. Tambin expreso mi sincero agradecimiento a la Dra. Haydee Loaiza, amiga genuina y comprometida que siempre me apoyo en buenos y malos momentos. A la QFB Beln vila, que siempre tuvo tiempo para ayudarme sin condiciones. Igualmente agradezco a las personas que tanto me apoyaron del Parque La Pastora: MVZ Gustavo Seplveda, MVZ Judith Tallabs, MVZ Dalia y Manuel. A todas las muchachas del laboratorio de ADN. Y en la Facultad al Dr. Jaime Hernndez y a Moi.

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TABLA DE CONTENIDOCaptulo 1. INTRODUCCIN..... 1.1 Planteamiento del problema.. 1.2 Justificacin 1.3 Hiptesis 1.4 Objetivos 1.4.1 General..... 2. ANTECEDENTES 2.1 Oso negro americano.... 2.1.1Clasificacin taxonmica. 2.1.2 Poblacin.. 2.1.3 Distribucin y hbitat.. 2.1.4 Estado de conservacin.... 2.1.5 Biologa. 2.1.6 Comportamiento y reproduccin. 2.2 Estimacin poblacional con muestras no invasivas. 2.2.1 Trabajo de campo 2.2.1.1 Errores originados por violaciones de las suposiciones de una poblacin cerrada..... 2.2.1.1.1 Cambios demogrficos.... 2.2.1.1.2 Probabilidad de captura... 2.2.1.2 Generalidades........... 2.2.2 Trabajo de laboratorio. 2.2.2.1 Errores originados por la poca cantidad de ADN 2.2.2.1.1 Homocigoto falso. 2.2.2.1.3 Alelo nulo.. 2.2.3 Anlisis estadstico.... 10 10 11 11 13 14 15 15 Pgina 1 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 6 8 9 10

1.4.2. Especficos.... 3

2.2.2.1.2 Alelo falso.. 15

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2.2.3.1 Errores originados por la capacidad de microsatlites de formar genotipos nicos... 3. MATERIALES Y MTODOS.. 3.1 Trabajo de campo.... 3.2. Trabajo de laboratorio.... 3.2.1 Extraccin del ADN.......... 3.2.3 Amplificacin por PCR...... 3.2.4 Electroforesis.. 3.2.5 Replicaciones en forma sistematizada............ 3.2.6 Deteccin de alelos nulos................... 3.3 Anlisis estadstico.. 3.3.1 Estimacin de errores.... 3.3.2 Estimacin de parmetros genticos y tamao poblacional... 4. RESULTADOS Y DISCUSIN... 4.1 Trabajo de campo.... 4.3 Costos.. 5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.. 6. LITERATURA CITADA.... APNDICE A..

17 18 18 20 21 23 25 27 31 31 31 32 33 33 43 45 47 55

3.2.2 Amplificacin total del genoma.. 22

4.2. Trabajo de laboratorio y anlisis estadstico... 34

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INDICE DE TABLASTabla I II. Especificaciones de los loci utilizados.. Muestras obtenidas en el trabajo de campo.. Pgina 25 33 37 38 39 41

III. Resultados de microsatlites amplificados.. IV. Frecuencias allicas.. V. Resultados generales de cada muestra..

VI. Densidad poblacional de oso negro americano en distintas localidades de Norteamrica VII. Costos..

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INDICE DE FIGURASFigura 1. Distribucin histrica de Ursus americanus en Norteamrica. 2. rea de estudio .... 3. Principio de la amplificacin mltiple por desplazamiento. 4. Patrones tpicos de electroferogramas de un microsatlite dinucletido.. 5. Diagrama de flujo de replicaciones en forma sistematizada... 6. Electroferogramas amplificados con y sin GenomiPhiTM... 7. Mtodos adicionales utilizados durante la optimizacin de la PCR.... Pgina 7 20 23 26 30 35 36

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NOMENCLATURA

ADN - cido desoxirribonucleico CMR - captura-marca-recaptura e.g. - exemple gratia: por ejemplo. EPMNI estudio poblacional con muestras no invasivas. Et al. y otros He heterocigosidad i.e. - id est, ita est: esto es, en otras palabras. Msnm metros sobre el nivel del mar. Pb - pares de bases PCR Reaccin en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction). PI - probabilidad de identidad PIh probabilidad de identidad entre hermanos RFU - unidades relativas de fluorescencia (relative fluorescence units)

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RESUMENJos Luis Mijangos Araujo Fecha de obtencin del grado: 25 marzo, 2009.

Universidad Autnoma de Nuevo Len. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Titulo: ESTIMACIN POBLACIONAL DEL OSO NEGRO AMERICANO (Ursus americanus eremicus) CON MICROSATLITES DE ADN A PARTIR DE MUESTRAS NO INVASIVAS EN LAMPAZOS, NUEVO LEN. Nmero de pginas: 56 Candidato para el grado de: Mdico Veterinario Zootecnista

rea de estudio: Biologa Molecular y Estadstica Poblacional Propsito y Mtodo del Estudio: Muestras de pelo de oso (Ursus americanus eremicus) obtenidas mediante trampas fueron analizadas mediante anlisis de microsatlites para estimar el tamao poblacional de osos que habitan en una regin ubicada en el municipio de Lampazos de Naranjo, Nuevo Len. Para la atraccin de los ejemplares se probaron varios cebos. Los pelos recolectados fueron almacenados en refrigeracin hasta su uso en la extraccin del ADN. Se ajust la tcnica para extraer ADN a partir de dos pelos, mismos que fueron sujetos a amplificacin genmica in vitro mediante amplificacin mltiple por desplazamiento. Para la diferenciacin e identificacin del ADN se emple el anlisis de 7 microsatlites segn lo recomendado por Peacock (2004) y la amplificacin del gen de la amelogenina para la determinacin del sexo. Los datos se analizaron computacionalmente para estimar las frecuencias allicas, heterocigosidad, la probabilidad de identidad de individuos no relacionados y la estimacin poblacional. Contribuciones y Conclusiones: El anlisis de microsatlites a partir de muestras no invasivas en un opcin adecuada para estimar las poblaciones en animales silvestres y se muestra como un recurso de vital importancia para estudios de conservacin. La seleccin de los oligonucletidos y la optimizacin de la PCR son los dos factores ms importantes para el xito en la genotipificacin basada en el anlisis de microsatlites. El uso de la amplificacin mltiple por desplazamiento (GenomiPhiTM, GE) permiti obtener ADN suficiente a partir de dos pelos para ser utilizada en estudios subsecuentes. Se evidenci que en 3 microsatlites la heterocigosidad es mayor a 0.7 y una densidad de por lo menos 1 oso/Km, as como la genotipificacin correcta de muestras con 2 pelos. Esta forma de estimacin tiene la capacidad para ser utilizada como mtodo rutinario y puesto que es muy verstil, puede ser utilizado en estimaciones de otras especies animales. FIRMA DEL ASESOR: _________________________________

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1. INTRODUCCINEn los ltimos 40 aos la poblacin humana se ha duplicado (U.S. Census Bureau, 2008), ocasionando la disminucin de casi la mitad de los bosques del planeta (UNEP-WCMC, 2000) y en consecuencia la fragmentacin y prdida de ecosistemas, as como la disminucin y extincin de especies, como es el caso del oso negro americano (Ursus americanus eremicus) en Mxico, que se encuentra en peligro de extincin (NOM-059-ECOL-2001. SEMARNAT, 2001). Es por eso que ahora cada instante es vital y decisiones deben de ser tomadas. Estas decisiones debern ser acertadas y sern acertadas solo si estn precedidas de conocimiento basado en datos precisos y confiables. Cuando se habla de conservacin de fauna silvestre, un estudio poblacional es el recurso que proporciona este conocimiento necesario para la acertada toma de decisiones. Un estudio poblacional debe ser viable, para su debida aplicacin en campo. Debe tener un alto grado de confiabilidad y poco margen de error. Debe ser verstil, para adaptarse a las caractersticas particulares de la especie y rea de estudio. Tambin debe ser eficiente, para obtener la mayor cantidad de informacin en el menor tiempo posible. En la actualidad todas estas caractersticas pueden ser multiplicadas gracias al desarrollo cientfico y ms particularmente al del campo de estadstica poblacional y biologa molecular, haciendo que estudios poblacionales confiables y precisos puedan llevarse acabo con muestras no invasivas (i.e. pelo y heces). Entre las variantes de un estudio poblacional, la estimacin poblacional es de gran relevancia, pues por sus caractersticas puede ser utilizado como cimiento en la toma de decisiones y posteriores estudios. Actualmente el mejor recurso para llevar acabo esta estimacin poblacional es el modelo de captura-marca-recaptura, grosso modo, se hace una relacin entre la cantidad de individuos capturados y etiquetados de una primera sesin, con la cantidad de individuos capturados, etiquetados o no, de una segunda sesin.

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Este modelo puede ser extrapolado y ser utilizado con muestras no invasivas, como si cada una de estas fuera una captura. Esto se logra a travs de marcadores moleculares llamados microsatlites (secuencias de pares de bases nucleotdicas presentes en el ADN que se encuentran en patrones repetitivos de 1 a 6 pares de bases). La ventaja de estos marcadores es que son polimrficos, ya que estas unidades repetitivas pueden variar entre los individuos. Al utilizar varios microsatlites en conjunto es posible formar una etiqueta gentica (genotipo) nica para cada individuo. Si bien, el utilizar esta etiqueta gentica proporciona muchos beneficios y posee varias ventajas sobre el tradicional mtodo de utilizar una etiqueta fsica, tambin implica la probabilidad de que errores interfieran en los resultados, debido principalmente a la poca cantidad de ADN que se encuentra en las muestras y a la capacidad de los microsatlites de formar un genotipo nico. En el presente trabajo se aplic la estimacin poblacional con microsatlites de ADN a partir de muestras no invasivas en la especie de oso negro americano, siendo esta la segunda fase del estudio iniciado por M. Sc. Dipl. Forest Christian Roschack. Al final de este escrito encontrarn respuesta preguntas como: Es verdaderamente viable para utilizarlo en campo?; Qu ventajas y desventajas tiene?; Es confiable y preciso?; Cules son sus alcances y sus limitaciones?; Cules son sus aplicaciones y repercusiones?; Cul es el futuro de este tipo de estudios? 1.1 Planteamiento del Problema La comunidad encargada de la conservacin de fauna silvestre enfrenta la necesidad urgente de recursos para obtener informacin, sin embargo frecuentemente se carece de alternativas viables para alcanzar este fin (Paetkau, 2003). Por el momento en Mxico no existen datos precisos acerca de muchas de las poblaciones de oso negro (SEMARNAP, 1999). La estimacin poblacional con muestras no invasivas es un recurso idneo para resolver estas necesidades, sin embargo los errores propios de este mtodo aunque no han impedido su utilizacin como un mtodo de rutina, si han despertado algunas dudas en el mbito cientfico.

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1.2 Justificacin La sobrepoblacin ha ocasionado la prdida de la biodiversidad, haciendo de vital importancia que esfuerzos en conservacin sean cada vez ms imprescindibles. Para tal fin es indispensable el empleo de recursos viables y confiables para recabar informacin, como lo es una estimacin poblacional con muestras no invasivas, ya que es una fuente de informacin invaluable que puede fungir como cimiento para estudios posteriores, permitir direccionar esfuerzos y tomar decisiones correctas. 1.3 Hiptesis La estimacin poblacional a partir de muestras no invasivas es un mtodo viable, eficiente y capaz de ser estructurado de tal manera que sea factible la minimizacin de errores, haciendo posible su utilizacin de forma rutinaria y poder as obtener informacin trascendental, confiable y precisa de algunas especies de la fauna silvestre mexicana. 1.4 Objetivos 1.4.1 General Estandarizar, aplicar y minimizar los errores propios de un mtodo para la estimacin del tamao poblacional de fauna silvestre con muestras no invasivas y demostrar que es viable y confiable para su utilizacin rutinaria en Mxico. 1.4.2 Especficos Estimar el tamao poblacional de oso negro en el Rancho Santa Mara ubicado en Lampazos de Naranjo, N. L. Estandarizar y optimizar la tcnica mediante microsatlites para la identificacin de individuos de oso negro.

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2. ANTECEDENTES2.1 Oso negro americano 2.1.1 Clasificacin taxonmica (Hall, 1981) Philum: Chordata Clase: Mammalia Orden: Carnvora Suborden: Fissipedia Familia: Ursidae Subfamilia: Ursinae Genero: Ursus Especie: Ursus americanus (Pallas, 1780) Subespecies en Mxico: U. a. amblyceps (Baird, 1859) U. a. eremicus (Merriam, 1904) U. a. machetes (Elliot, 1903)

2.1.2 Poblacin Durante los ltimos 20 aos la poblacin de oso negro americano ha ido en aumento (Williamson, 2002), segn las ultimas estimaciones, existen entre 850,000 y 950,000 osos negros a todo lo largo de su rango de hbitat (Bear Specialist Group 1996, 2007). Esto seria ms del doble si juntramos la poblacin de todas las dems especies de osos presentes en el mundo. Dentro de la especie existen 16 subespecies de las cuales, 3 se encuentran en Mxico. 2.1.3 Distribucin y hbitat Los osos negros viven desde el nivel del mar hasta los 3,500 msnm y desde Alaska hasta el norte de Mxico (ver figura 1).

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La distribucin histrica en Mxico comprenda los bosques templados de pino-encino de los estados de Coahuila, Chihuahua, Durango, Jalisco, Nayarit, Nuevo Len, Sinaloa, San Luis Potos, Sonora, Tamaulipas y Zacatecas (Moctezuma, 1997). Sin embargo la cacera furtiva y la disminucin de su hbitat redujeron su rea original de distribucin en un 80%, por lo que ahora solo pudiera comprender los estados de Sonora, Nuevo Len, Coahuila, Chihuahua y es posible que tambin abarque las serranas de Durango (SEMARNAP, 1999). 2.1.4 Estado de conservacin El oso negro se encuentra incluido en el Apndice II de la Convencin sobre el Comercio Internacional de Especies de Flora y Fauna Silvestres (CITES) como una especie en riesgo. La norma mexicana de proteccin de especies nativas (NOM-059-ECOL-2001. SEMARNAT, 2001) considera solamente a la subespecie U. a. eremicus en peligro de extincin. En la Unin Internacional para la Conservacin de la Naturaleza (UICN) se encuentra en el nivel de bajo riesgo (Bear Specialist Group 1996, 2007). En Canad y EUA de 40,000 a 50,000 osos negros son cazados anualmente (Bear Specialist Group 1996, 2007), en Mxico no existe la cacera desde 1985. 2.1.5 Biologa El oso negro es de cuerpo robusto, cola corta, y orejas pequeas y redondas. Es uno de los carnvoros de mayor tamao que pueden encontrarse en Mxico, pudiendo medir de largo desde 1.3 a 2 m y de alto desde 61 a 92 cm. El peso corporal oscila entre 90 y 216 Kg. Siendo las hembras, aproximadamente 20% ms pequeas que los machos (Ford, 1981; Herrero, 1985; Leopold, 1977; Novak, 1991). Lo usual es que no vivan ms de 20 aos. (SEMARNAP, 1999). Aunque lo indique su nombre el color de su pelaje no siempre es negro, en el occidente del continente el color puede variar desde el caf negruzco hasta el caf, canela y beige, incluso en los costas de Columbia Britnica en Canad existen osos con una variacin de color blanco (U. a. kermodei). 15

El oso negro es un animal omnvoro cuya dieta est constituida en un 75% de materia vegetal como son bayas, flores, hierbas, tubrculos y races, as como frutos secos. El 25% restante lo constituye materia de origen animal de su propia caza o de carroa como peces, insectos, miel y pequeos mamferos (SEMARNAP, 1999). 2.1.6 Comportamiento y reproduccin En Mxico solo en las ms altas montaas hibernan durante diciembre, enero y febrero; sin embargo, los osos que habitan en las partes ms bajas de las sierras hibernan por periodos ms cortos (Leopold, 1977). En un estudio realizado en las Serranas del Burro en Coahuila, Doan-Crider (1995), report que todos los machos y 60% de las hembras con oseznos de un ao de edad, se mantuvieron activos durante los meses de invierno, permaneciendo fuera de sus madrigueras y usndolas slo cuando las condiciones climticas eran severas; no obstante, se observ que todas las hembras preadas hibernaron. El tamao del territorio de hbitat depende de la abundancia de comida segn sea la temporada y el rea (Powell et al., 1997). En Mxico los machos subadultos de la poblacin de las Serranas del Burro presentan un territorio de hbitat que abarca entre 73.8 y 119.6 Km y las hembras adultas entre 12 y 27.2 Km (Doan-Crider, 1995). Los osos negros son polgamos y alcanzan la madurez sexual entre los tres y cinco aos de edad (Erickson y Nellor, 1964; Ford, 1981; Leopold, 1977; Poelker y Hartwell, 1973). Los cachorros nacen tpicamente en enero y febrero, aunque la cpula ocurre de mayo a julio, la implantacin se detiene y la gestacin activa es de solo 2 meses. El promedio de camada es de 2 a 2.5 cachorros (Alt, 1989). El periodo entre camadas puede variar de 1 a 4 aos (Eiler et al., 1989; Kasworm y Thies, 1994). El destete es a los 4 meses, sin embargo los cachorros permanecen con su madre aproximadamente 16 meses (Lindzey y Meslow, 1977b). El oso americano tiene 37 pares de cromosomas.

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Figura 1. Distribucin histrica de Ursus americanus en Norte Amrica*Modificado de Hall (1981) y Kolenosky y Strathearn (1987). (Lariviere, 2001).

1. 2. 3. 4.

U. a. altifrontalis; U. a. amblyceps; U. a. americanus;

5. 6. 7.

U. a. carlottae; U. a. emmonsii; U. a. eremicus;

9.

U. a. floridanus;

13. U. a. machetes; 14. U. a. perniger; 15. U. a. pugnax; 16. U. a. vancouveri.

U. a. cinnamomum;10. U. a. hamiltoni; 11. U. a. kermodei; 12. U. a. luteolus;

8. U. a. californiensis;

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2.2 Estimacin poblacional con muestras no invasivas (EPMNI) Gracias a que el ADN se encuentra en todas la clulas, puede ser obtenido a travs de varios mtodos. Uno de ellos es por medio de muestras no invasivas. Se consideran muestras no invasivas aquellas que son recolectadas sin tener que atrapar o molestar al animal (Taberlet et al., 1999). Fue en 1992 que surgieron los primeros trabajos que utilizaron muestras no invasivas como objeto de estudio (Hoss et al., 1992, Taberlet y Bouvet, 1992). Desde entonces estas muestras han sido utilizadas en varias aplicaciones en especies de fauna silvestre: Estimacin poblacional (Bellemain et al., 2005) Monitorear hibridacin entre especies (Adams et al., 2003) Paternidad y estructura social (Oka y Takenaka, 2001) Estimacin del territorio de hbitat (Taberlet et al., 1997) Identificacin del sexo (Yamamoto et al., 2002) Identificacin de la especie (Woods et al., 1999) Variacin gentica (Paetkau y Strobeck, 1994) Patrones de dispersin (Proctor et al., 2004) xito de reproduccin y estrategias de apareamiento (Craighead et al., 1995) Fragmentacin demogrfica (Proctor et al., 2002) Conexin entre poblaciones y flujo gentico (Dixon et al., 2006) Contenido de la dieta, patgenos y hormonas en heces (Kohn y Wayne, 1997) Identificacin de animales cazados ilegalmente (Wasser et al., 2004) Estimar distancias genticas entre poblaciones e individuos (Ponsuksili et al., 1999)

Dentro de las diferentes aplicaciones de las muestras no invasivas, la estimacin poblacional es de especial importancia debido a que puede ser utilizado como base para posteriores estudios y en toma de decisiones. Han transcurrido 12 aos desde la primera vez en la que muestras no invasivas fueron utilizadas para estudios de estimacin poblacional (Taberlet et al., 1997 y Pallsboll et al., 1997).

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Un EPMNI esta conformado por: 1. Trabajo de campo.- debe de tener un buen diseo para ser vlido, en l se recolectan las muestras. 2. Trabajo de laboratorio.- identificacin gentica de individuos a partir de las muestras tomadas en el trabajo de campo. 3. Anlisis estadstico.- estrechamente relacionado con el trabajo de campo, es el elemento matemtico que sirve de enlace e interpretacin entre los resultados del trabajo de campo y los resultados del trabajo de laboratorio. 2.2.1 Trabajo de campo El modelo de captura-marca-recaptura (CMR) es el apropiado para estimar la poblacin de oso negro, ya que es una especie que tiene un territorio de hbitat amplio, sus individuos estn dispersos, es difcil su observacin y no tiene cambios demogrficos en periodos relativamente cortos. Un modelo CMR consiste en capturar al individuo, marcarlo con alguna etiqueta y liberarlo. Esto se hace como mnimo en dos sesiones. Entre ms sesiones, ms precisa la estimacin. En el caso de un EPMNI la etiqueta es gentica, ya que cada individuo cuenta con esta etiqueta desde su nacimiento. Cada muestra colectada es considerada una captura. En el caso de muestras de pelo, estas son recolectadas por medio de trampas de pelo. Estas trampas se colocan cercando un cebo con alambre de pas, el animal al entrar a la trampa e investigar el cebo deja la muestra en el alambre de pas. Un modelo CMR esta basado en una poblacin cerrada en la que se asume que no existen cambios demogrficos (ni nacimientos y/o muertes, ni emigracin y/o inmigracin) durante el periodo del trabajo de campo, todos los individuos tienen una probabilidad igual de captura, su etiqueta ser identificada sin errores y ninguno la perder.

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2.2.1.1 Errores originados por violaciones de las suposiciones de una poblacin cerrada El principal objetivo en el trabajo de campo es asegurar que todas las suposiciones de una poblacin cerrada sean cumplidas con el fin de que no existan sesgos estadsticos. Sin embargo este objetivo puede ser difcil de alcanzar, debido a que la naturaleza sigue un proceso estocstico (al azar) en todas sus variables. De tal manera que no podrn eliminarse por completo todos los sesgos, sino solo minimizarse. Algunas maneras para conseguir este objetivo es reducir el tiempo de muestreo lo ms posible y utilizar modelos estadsticos que sean robustos a los sesgos en algunas suposiciones (Otis et al., 1978). Los sesgos estadsticos tienen 2 fuentes principales: cambios demogrficos y probabilidad de captura. 2.2.1.1.1 Cambios demogrficos. Para evitar en lo posible que existan sesgos se debe tomar en cuenta las caractersticas de reproduccin y realizar el muestreo en la poca en la cual no existan nacimientos. Si es posible se utilizan reportes de muertes accidentales. El rea de muestreo deber ser tan grande como para poder asumir que ningn individuo saldr o entrara del rea, al menos durante el periodo de muestreo. El rea puede estar delimitada por accidentes geogrficos, asentamientos humanos, cercas, rangos de hbitat o cualquier otra situacin particular. 2.2.1.1.2 Probabilidad de captura. Es de especial importancia conocer si patrones de movimiento, edad, sexo, dominancia social o comportamiento, influirn en la probabilidad de captura (Mowat y Strobeck, 2000). Es importante que los animales no sean felices o tmidos de entrar a la trampa de pelo (Otis et al., 1978), es por eso que los cebos no deben ser alcanzados por los animales o que contengan caloras. Las trampas se deben cambiar por lo menos 1 Km. entre sesiones para que los animales no se acostumbren a la trampa (Mowat 2000). En general y especialmente en poblaciones pequeas es necesario que exista una probabilidad de captura alta para obtener estimaciones confiables (Otis et al., 1978). 20

Para aumentar la probabilidad de captura el muestreo puede realizarse en pocas del ao donde haya poca cantidad de comida. 2.2.1.2 Generalidades Mowat y Strobeck (2000) recomiendan: la frecuencia de revisin de las trampas depende de las condiciones climticas. Las trampas se deben colocar 200 m lejos de caminos y a 2 Km. de lugares para acampar. Se deben poner signos de precaucin alrededor de la trampa. Si es posible las trampas se deben situar en lugares protegidos del viento y evitar pocas de lluvias. Se deben realizar de 4 a 5 sesiones. El rea se debe subdividir en celdas basadas en el promedio del territorio de hbitat de la especie. Se deben utilizar por lo menos 4 trampas por celda (Otis, 1978). 2.2.2 Trabajo de laboratorio En el trabajo de laboratorio la materia prima es el cido desoxirribonucleico o ADN. En grandes rasgos el ADN esta constituido por dos cadenas de secuencias de bases nucleotdicas unidas entre s. Los componentes de las bases nucleotdicas son principalmente 4 tipos de nucletidos: adenina, guanina, citosina y timina. Cada base nucleotdica se complementa o une, solo con otra base especifica, as es que la timina solo se complementa con la adenina y la guanina solo con la citosina. Cabe destacar la simplicidad del hecho de que tan solo el orden que siguen estas 4 bases nucleotdicas dentro de la secuencia del ADN, es la informacin necesaria para codificar la sntesis de aminocidos, que a su vez forman protenas, las unidades bsicas de estructura y funcionamiento en todos los seres vivos. Dentro de esta secuencia del ADN se encuentran los microsatlites, patrones de bases nucleotdicas, de 1 a 6 bases, que se repiten uno detrs de otro. Ya que los microsatlites se encuentran en lugares especficos del ADN (locus) que no son codificantes, poseen una alta tasa de mutacin, provocando que tengan diferente nmero de patrones repetitivos entre

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individuos, es decir son muy polimrficos. Los microsatlites tambin son codominantes1 y heredables, por lo tanto cada padre aportara un alelo2. As es que gracias a estas caractersticas los microsatlites se pueden utilizar como marcadores genticos y usarlos para identificar y diferenciar individuos. Para que sea posible identificar los microsatlites que se encuentran en cada individuo es necesario extraer el ADN de cualquier muestra que lo contenga y posteriormente amplificar solo la secuencia del ADN en el que se encuentra el microsatlite. Esto se logra a travs de una tcnica molecular llamada reaccin en cadena de la polimerasa o PCR. Descrita por primera vez por Kary Mullis en 1983, que se basa en 3 pasos: Desnaturalizacin: las dos cadenas por las que esta formado el ADN se separan a una temperatura de 95C. Alineamiento: la temperatura se disminuye de 50 a 65 C. Temperatura necesaria para que los primers3 se unan a su secuencia complementaria en cada cadena del ADN. La secuencia de los primers esta diseada para que se una al ADN en los lados en el que se encuentra la secuencia diana. Extensin: la temperatura aumenta a 72 C que es la ideal para que la enzima Taq polimerasa, tome al primer como soporte e inicie a unir las bases nucleotdicas, que se encuentran libres, a la secuencia complementaria de la cadena de ADN. Estos pasos se repiten por varios ciclos aumentando exponencialmente el nmero de la secuencia diana. Una vez que el microsatlite ha sido amplificado por la PCR, el siguiente paso es determinar el nmero de repeticiones que tiene, midiendo su longitud; si depositamos el producto de PCR en una sustancia tal en la que pueda ser suspendida y aplicamos un campo elctrico, las molculas de ADN emigraran al polo positivo, ya que poseen una carga negativa. Este proceso es llamado electroforesis. En base a que las molculas ms grandes emigraran ms lento que las pequeas, se compara la distancia recorrida con patrones estndar para determinar la longitud del microsatlite.1

Codominante.- situacin en la cual ninguno de los dos alelos heredados por los padres domina sobre el otro y los dos alelos son expresados. 2 Alelo.- las diferentes formas en las que se presenta un locus. 3 Primers.- secuencias de bases nucleotdicas sintticas.

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Tambin es posible identificar si en ese microsatlite sus alelos son iguales (homocigoto) o diferentes (heterocigoto). A todo este proceso se le llama genotipificacin. 2.2.2.1 Errores originados por la poca cantidad de ADN Si bien es cierto que la gran sensibilidad de la PCR permite amplificar secuencias a partir de una sola molcula de ADN (Zhang et al., 1992), no est exenta de errores, los cuales se maximizan cuando utilizamos poco ADN, como es el caso de las muestras no invasivas. Muchos de estos errores pueden llegar a ser tan considerables que el protocolo usual de utilizar una sola reaccin de PCR por cada muestra, sea insuficiente para obtener resultados fiables. Estos errores ocasionarn que el genotipo sea incorrectamente ledo y se sobrestime la poblacin. Existen diferencias significativas en la cantidad de ADN presente en el pelo entre especies y edades (Piggott y Taylor, 2003). Pero existe aun ms diferencia en la cantidad y calidad del ADN, entre un pelo recin arrancado y un pelo desprendido, que adems puede estar degradado por el tiempo y la exposicin a condiciones climticas. En un pelo recin arrancado se encuentran en promedio 65.2 ng (humano), en un pelo desprendido 0.88 ng. (chimpanc) (Morin et al., 2001). Goosens et al. (1998) en su investigacin relacionaron el porcentaje de error con el ADN extrado de diferente nmero de pelos (marmota), encontraron que existe un 14% de error de genotipificacin en extracciones de un pelo, 4.86% de 3 pelos y 0.29% de 10 pelos. Por su parte Taberlet et al. (1996) determinaron que para obtener un genotipo correcto con un 99% de confidencia se requieren de 8 clulas. Sin embargo para obtener una reaccin de PCR positiva el 99% de las veces solo es necesario 2.4 clulas. Es por eso que si se utilizan entre 2.4 y 8 clulas existe un rango muy amplio en el que puede haber errores a pesar de tener resultados positivos en la PCR. En base a esto desarrollaron un mtodo matemtico llamado de multitubos, en el cual es necesario (en casos especficos) realizar hasta 7 reacciones de PCR por locus para obtener un genotipo correcto con un 99% de confidencia.

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Waits y Leberg (2000) encontraron que un error por locus del 5% puede causar una sobrestimacin de la poblacin en un 200%. Goosens et al. (1998) y Gagneux et al. (1997) observaron un error por locus tan alto como 14% y 35% respectivamente. Existen tres principales errores que ocasionan la incorrecta determinacin de alelos: homocigoto falso, alelo falso y alelo nulo. 2.2.2.1.1 Homocigoto falso o alelo ausente (allelic drop out). Existe la posibilidad que al amplificar en la PCR un locus heterocigoto, tomemos solo uno o muy poco de los dos alelos presentes en la extraccin, dando como resultado que solo uno amplifique y se identifique errneamente como homocigoto. Si se toma en cuenta que son necesarias ~152 clulas diploides para obtener 1 ng. de ADN y que dentro del ncleo de cada clula existen 2 copias de cada cromosoma, se cuenta con un total de ~303 copias de cada locus, pero solo 152 copias de cada alelo si fuera un locus heterocigoto (Butler, 2005). En un caso terico en el que se extrae el ADN de una muestra de dos pelos desprendidos (0.88ng/pelo) se obtendran 1.76 ng. o 533 alelos en loci homocigotos y 266 alelos en loci heterocigotos. Se amplifican 8 loci (7 microsatlites y un locus para la identificacin del sexo), se utiliza el mtodo de multitubos con 7 reacciones por locus (56 reacciones en total), en cada reaccin se utilizaran aproximadamente 32 pg. o 10 alelos en loci homocigotos y 5 alelos en loci heterocigotos. En el caso de un locus heterocigoto la probabilidad de tomar un solo alelo de los 5 presentes por reaccin es del 20%. Frantz et al. (2003) en su estudio, determinaron que errores debido a falso homocigoto pueden llegar, en algunos casos, ser hasta del 47.7%. En contraste, Broquel et al. (2007) concluyeron que en el 65.2% de los casos de su investigacin se obtuvo una genotipificacin sin falso homocigoto al primer intento.

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2.2.2.1.2 Alelo falso. Existen 3 razones por las cuales un alelo observable puede ser falso: Contaminacin.- debido a la gran sensibilidad de la PCR las muestras no invasivas tienen predisposicin a ser contaminadas incluso con pequeas cantidades de ADN exgeno, pudiendo amplificar un alelo que no corresponde al del ADN diana. Bandas de sombra o tartamudas (shadow o stutter bands).- Se forman cuando en ocasiones durante la PCR en la cadena de ADN se forman bucles y conforme la Taq polimerasa sintetiza la cadena complementaria y pasa por el bucle no puede leer la secuencia que se encuentra dentro de l, dando como resultado productos ms cortos que el alelo original, esto es debido a que la Taq polimerasa sintetiza solo en direccin de 5 a 3 (Walsh et al., 1996). Pero si esto ocurre en los primeros ciclos y en presencia de poca cantidad de ADN estos productos amplificarn en la misma cantidad que el ADN diana formando un alelo falso (Taberlet et al., 1996). Adenilizacin.- la PCR tiene la tendencia de aadir un nucletido de ms, usualmente una adenina, en el extremo 3 de la cadena recin sintetizada (Pompanon et al., 2005), dando como resultado un alelo falso con una base de ms que el alelo real. 2.2.2.1.3 Alelo nulo. Se presenta cuando existe una mutacin en la secuencia de nucletidos que estn a los lados de los microsatlites, impidiendo que los primers se unan a la secuencia diana (Chapuis y Estoup, 2006). A diferencia del alelo ausente la ocurrencia del alelo nulo no es al azar, si no que no amplificar consistentemente. 2.2.3 Anlisis estadstico Cada microsatlite tiene un diferente nmero de alelos, ya que cada uno tiene un ndice de mutacin distinto. Entonces, un microsatlite se presentara en mayor o en menor cantidad a travs de una poblacin. Algunos individuos compartirn el mismo alelo y otros no. 25

As es que, existe la posibilidad de que dos individuos tengan el mismo alelo en todos los microsatlites analizados. Para saber que tan posible es que ocurra este fenmeno debemos analizar el poder de probabilidad de identificacin (PI) de los microsatlites. Waits et al. (2001) defini la PI como la probabilidad de que dos individuos escogidos al azar en una poblacin tengan el mismo genotipo. Para la estimacin del tamao poblacional existen diferentes modelos, algunos son robustos a sesgos en algunas suposiciones de una poblacin cerrada y algunos facilitan el determinar si existen violaciones a las suposiciones geogrficas (Boulanger y McLellan, 2001). Por lo general estos modelos son complejos, pero programas computacionales permiten hacer clculos confiables sin tener un conocimiento profundo en estadstica. Entre estos se ha demostrado que el programa MARK (White y Burnham, 1999) es el que da mejores resultados (Bellemain et al., 2005). Dentro de estos modelos se consideran tres variables en cuanto a la probabilidad de captura (Otis et al., 1978): Tiempo: permite que la probabilidad de captura vari a travs del tiempo o entre cada sesin. Se utiliza cuando en cada sesin se usan diferentes mtodos de captura. Comportamiento: permite que la probabilidad de captura vari por una respuesta en el comportamiento a la captura. Se utiliza cuando los animales son felices o tmidos al entrar a la trampa. Heterogeneidad: permite que la probabilidad de captura vari entre cada animal debido a sexo, dominancia social u otras variables. Estas tres variantes pueden ser utilizadas individualmente o combinadas. As que el reto no es alcanzar una probabilidad de captura igual, si no elegir el modelo apropiado (Mowat y Strobeck, 2000). Dentro de MARK existe una opcin que facilita la eleccin del modelo ms indicado. Desafortunadamente MARK no proporciona buenos resultados cuando el nmero de muestras y de recapturas son demasiados pequeos (Bellemain et al., 2007).

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2.2.3.1 Errores originados por la capacidad de los microsatlites de formar genotipos nicos Cuando los microsatlites tienen una PI alta existe el riesgo de que en la identificacin de individuos 2 o ms tengan el mismo genotipo y se subestime la poblacin, esto es llamado efecto de sombra (Mills et al., 2000). Este problema se acrecienta en poblaciones pequeas y emparentadas, que por consiguiente tendr una mayor cantidad de individuos compartiendo los mismos alelos. Para disminuir errores asociados con el efecto de sombra se utiliza como limite superior la probabilidad de identificacin que existe entre hermanos (PIh) para aceptar los genotipos (Waits et al., 2001). El clculo de la PI asume que la poblacin se encuentra en equilibrio de HardyWeinberg, cuando existe independencia entre los alelos dentro de un locus y entre diferentes loci. Esta suposicin puede ser violada en poblaciones naturales, cuando no hay cruzamientos al azar u ocurre una fuerte seleccin natural, mutaciones, inmigraciones, deriva gentica o subestructura en la poblacin, ya sea por aislamiento o por comportamiento social. Entonces generalmente la PI observada ser ms alta que la PI terica (Taberlet y Luikart, 1999). La PI esta muy relacionada con la heterocigicidad, fraccin de individuos de una poblacin que son heterocigotos en un locus en particular (Wikipedia, 2008), entre ms alta la heterocigosidad, ms baja la PI. El microsatlite ideal debe exhibir una heterocigosidad entre 0.6-0.8 (Taberlet y Luikart, 1999). Asimismo la heterocigosidad es un indicador general de variabilidad gentica.

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3. MATERIALES Y MTODOS3.1 Trabajo de campo El trabajo de campo fue completamente realizado por M. Sc. Dipl. Forest Christian Roschack en su investigacin cientfica del 23 de septiembre al 15 de diciembre del 2001. El rea de estudio fue el Rancho Santa Mara (50 Km) que se encuentra en el municipio de Lampazos de Naranjo en Nuevo Len, Mxico (entre 27 01 y 27 08 latitud norte y 100 42 y 100 57 longitud oeste). El rancho esta situado mayormente en una planicie a 350 msnm. Limitado al oeste por la Sierra Pjaros Azules (1,750 msnm) que se extiende de sur a norte. Hacia el sur limita con las montaas Mesa extendindose de oeste a este. El promedio anual de temperatura es de 23.8 C, siendo los meses ms calientes de junio a agosto con una temperatura promedio de 30.4 a 30.7 C. La precipitacin anual promedio es de 445.9 mm, siendo los meses con ms precipitacin mayo (53.3 mm), agosto (55.5 mm) y septiembre (110.8 mm). El clima es tpicamente caluroso-seco (Estrada et al., 2001). El rea del rancho Santa Mara se dividi en dos cuadrantes de 5X5 Km. (25 Km, rea promedio calculado que ocupa una hembra en su hbitat natural), cada cuadrante se dividi en 25 subcuadrantes de 1 Km. De cada cuadrante se seleccionaron al azar 5 subcuadrantes para colocar las trampas de pelo (N=10) en cada sesin (figura 2). En total se realizaron 4 sesiones, cada una con una duracin de 12 das. En cada sesin las trampas fueron cambiadas de lugar. Las trampas fueron puestas lo ms separadas posible en cada sesin. Los osos fueron atrados por el cebo a la trampa, en la mayora de los casos solo una vez, en pocos casos regresaron una segunda vez, pero solo muy poco en una 3 o 4 vez. Las trampas fueron hechas en forma de cuadrado. Por medio de estacas se tension el alambre y se llenaron las irregularidades del terreno. En un principio el largo de cada lado fue de 10X10 m posteriormente de 8X8 m y 7X7 m. En medio de cada trampa un tubo de metal de 3 m anclado a las 4 estacas fue puesto para poner el cebo a 2.5 m de altura. Hasta que todas las trampas estuvieran listas se puso el cebo.

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Durante este estudio se probaron diferentes tipos de trampas con diferente cebo y con diferente alambre de pas: Primera sesin: un solo alambre de pas con 12 cm. de separacin entre pas a 50 cm. de altura. Cebo: sardinas enlatadas en salsa de tomate de 300 g, abiertas por la mitad arriba y por la mitad abajo en unas y pescado marinado en ajo hasta que empezara la fertilizacin en otras. Segunda sesin: un solo alambre de pas con 12 cm. de separacin entre pas a 60 cm. de altura. Cebo: liebres y conejos secados al sol por 10 das junto con liebres y conejos congelados. Tercera y cuarta sesin: dos alambres de pas con 7 cm. de separacin entre pas a 45 y 65 cm. Cebo: sardinas enlatadas en salsa de tomate de 300 g. en unas y 3 Kg. de carne fresca de jabal en otras. Para la toma de muestra se utiliz una hoja mitad blanca y mitad negra para poder observar bien las muestras. Se utiliz un soplete para esterilizar el alambre de pas despus de revisar cada trampa. Se detectaron las especies no-diana que podran ser atradas por el cebo: puma (Felis concolor), lince (Lynx rufus), pecar de collar (Tayassu tajacu) y coyote (Canis latrans). Se compararon muestras de pelo de estas especies. Al principio las muestras se recolectaron de las trampas diariamente, posteriormente cada dos das. Las muestras fueron tomadas con forceps estriles. Se esterilizaron en 2 ml de polipropileno conteniendo 0.8 ml de cloroformo. Esta solucin fue usada una sola vez por muestra. Las muestras se pusieron en bolsas Ziploc de polietileno. Se uso desecante de silicona para secar las muestras. Cada muestra se examin con microscopio y solo se utilizaron las muestras cuando se observaron por lo menos dos pelos con raz. Durante todo el estudio se trat de observar las trampas noche y da. Se colocaron asientos altos movibles en la cercana de las trampas. En algunos casos existan asientos altos permanentes.

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Figura 2. rea de Estudio. Ubicacin geogrfica del Rancho Santa Mara en el municipio de Lampazos de Naranjo en Nuevo Len, Mxico (entre 27 01 y 27 08 latitud norte y 100 42 y 100 57 longitud oeste) y localizacin de las trampas. (los nmeros del 1-4 se refieren a las sesiones; en los subcuadrantes marcados con una X no se coloc ninguna trampa durante las 4 sesiones). 3.2 Trabajo de laboratorio La investigacin se llevo a cabo en el Laboratorio de Gentica de la Procuradura de Justicia del Estado de Nuevo Len. La escasa cantidad de ADN contenida en las muestras no invasivas es el principal inconveniente para llevar a cabo un EPMNI exitoso, ya que originar errores en la genotipificacin. Es por eso que es necesario que las tcnicas de laboratorio estn completamente optimizadas, especialmente la extraccin del ADN y las condiciones de PCR. 30

As como la utilizacin de recursos distintos a los empleados en genotipificaciones habituales, como son: amplificacin total del genoma y el uso de replicaciones en forma sistematizada. Es de vital importancia utilizar durante todo el proceso del trabajo de laboratorio controles negativos y positivos. Para el control positivo se anestesi un espcimen macho de oso negro americano y se extrajo sangre y pelo. Tambin se utilizo pelo y tejido de msculo e hgado igualmente de un espcimen macho obtenidos en una necropsia. Ambas muestras amablemente facilitadas por el Zoolgico La Pastora en Monterrey, Nuevo Len. Para la extraccin del ADN de los tejidos y de sangre se utilizaron 3 procesos diferentes: sistema Maxwell 16 de Promega, sistema BloodPrep de Applied Biosystems y con fenol cloroformo muy parecido al utilizado para pelo, en cada uno de ellos el ADN se diluyo en 100 l. En cada PCR se utilizo 1 l de las extracciones. 3.2.1 Extraccin del ADN Gran parte del xito en la genotipificacin reside en la capacidad de extraccin del mtodo utilizado y cobra aun ms relevancia cuando se analizan muestras no invasivas, donde el ADN se encuentra en pequeas cantidades y en la mayora de los casos degradado. Estudios revelan que del 20 al 30% de las muestras no contienen suficiente ADN para su posterior amplificacin con la PCR (Solberg et al., 2006). En protocolos habituales para la extraccin de ADN de muestras de pelo se utiliza un buffer de lisis que contiene un detergente, proteinasa K y un agente reductor. Sin embargo McNevin et al. (2005) demostraron que en comparacin con una digestin en una solucin acuosa, la cantidad de ADN liberada es mayor, puesto que cualquier ADN nuclear recuperable esta localizado en la cutcula externa del pelo. As es que el hecho de que los pelos se disuelvan o no en el buffer de lisis, no tiene ningn efecto en la cantidad de ADN nuclear extrada y por consiguiente procedimientos de limpieza comnmente utilizados anteriores a la extraccin estaran de hecho reduciendo la cutcula. El procedimiento completo de extraccin se encuentra descrito en el apndice A (pg. 55). 31

3.2.2 Amplificacin Total del Genoma (ATG) La ATG es una tcnica que solo recientemente ha dado buenos resultados. Existen diferentes mtodos de amplificacin, el que mejores resultados obtiene es la amplificacin mltiple por desplazamiento (AMD) (Uda et al., 2007). Esta se basa en la capacidad que tiene la ADN polimerasa Phi29 de tener un mtodo a prueba de error (actividad de exonucleasa de 3 a 5) y la utilizacin de hexmeros al azar como primers (ver figura 3). Dentro de las diferentes empresas que comercializan este tipo de amplificacin se eligi GenomiPhi V2 de General Electric Healthcare, debido a que es el kit en el cual es necesario la menor cantidad de ADN y es el que amplifica con mayor fidelidad (Bergen et al., 2005a). Las especificaciones afirman que es posible obtener de 4 a 7 ug. de ADN a partir de 1 a 10 ng en 1.5 horas, sin errores en la amplificacin. Sin embargo algunos estudios confirman que solo se obtienen resultados satisfactorios cuando se amplifican ms de 3 ng. de ADN (Lovmar 2003). Algunas investigaciones recientes han podido optimizar la amplificacin. Ballantyne et al. (2007a) confirmaron que omitiendo el paso de desnaturalizacin aumenta el xito de amplificacin. Tambin Ballantyne et al. (2007b) notaron que cuando se satura la reaccin de amplificacin con un polmero largo llamado polietilen glicol 400 (PEG 400) al 5% el xito de amplificacin aumenta. Todo el ADN extrado de las muestras de pelo se concentr vaporizndolo totalmente en una aspiradora-centrifuga para ADN. Posteriormente al pellet de ADN se le aadi 1 l de PEG 400 al 99% [5%] y 9 l de bfer de muestra. Se elabor un master mix con 9 l de bfer de reaccin y 1 l de enzima y este se aadi al pellet. Todo el proceso se realiz en hielo. Se omiti el paso de desnaturalizacin, se incubo a 30 C por 90 minutos y se inactivo a 65 C por 10 minutos. Finalmente al producto final de la amplificacin se le agrego 20 l de TE1X.

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Figura 3. Principio de la amplificacin mltiple por desplazamiento (AMD). Como primers se utilizan hexmeros al azar, estos se alinean a la cadena de ADN (A). Mientras la ADN polimerasa extiende la cadena a partir del primer, las cadenas que se extienden por delante son desplazadas (B). As las cadenas desplazadas sirven como plantillas para que otros primers se alienen a ellas y la ADN polimerasa extienda la cadena hacia el lado contrario (C). La reaccin continua y nuevas cadenas de ADN son desplazadas para producir nuevas plantillas y formar una estructura con muchas ramas (D), generando en abundancia copias de la cadena original de ADN. (Lovmar y Syvanen, 2006).3.2.3 Amplificacin por PCR

La eleccin de los microsatlites es sumamente importante. Entre ms grande es un microsatlite ms alto ser el ndice de error (Hoffman y Amos, 2005). Se puede esperar de un 12 a un 15% de disminucin por cada incremento de 100 bases (Buchan et al., 2005).

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Se deber utilizar una mayor cantidad de microsatlites para disminuir la PI en poblaciones que sean demasiado grandes o en poblaciones demasiado pequeas, en donde los individuos estn muy relacionados entre s. Se debe tomar en cuenta que al utilizar ms microsatlites aumenta la probabilidad de errores en la genotipificacin y se utiliza mayor cantidad de ADN, as que lo recomendable es utilizar menos microsatlites pero muy polimrficos (Waits & Leberg, 2003). Entre 5 y 7 microsatlites darn precisin necesaria en la mayora de los estudios (Paetkau, 2004). Para la diferenciacin e identificacin de las muestras se utilizaron 7 microsatlites descritos en Peacock (2004), marcados con fluorescencia en su secuencia delantera (ver tabla I). Para la determinacin del sexo, se utilizaron los primers SE47 y SE48 (Ennis y Gallagher, 1994) que se encuentran dentro de la secuencia del gen de amelogenina, enzima sintetizadora del esmalte de los dientes, el cual en osos es homocigoto (245 pb) en hembras y heterocigoto (191 y 245 pb) en machos (Yamamoto et al., 2002), esta caracterstica provee de un control positivo. No se utiliz fluorescencia en este primer para reducir costos, en este caso los productos de PCR se corrieron en gel de agarosa al 2%. Los 7 microsatlites y el gen de amelogenina fueron amplificados cada uno por separado en un volumen total en cada reaccin de 10 L, con las siguientes especificaciones: 5,000 ng. de suero de albmina bovino (BSA), 1.25 M de cada primer (12.5 pmoles), 1 L de ADN, 1 L de HO y 5 L de AmpliTaq Gold PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, California) que contiene: 0.05 U/L AmpliTaq Gold DNA Polymerase, 30 mM Tris/HCl, pH 8.05, 100 mM KCl, 400 M dNTP de cada base, MgCl2, 5 mM. Se utilizaron las siguientes temperaturas: incubacin inicial, 95 C por 10 minutos; 35 ciclos con una desnaturalizacin de 95 C por 30 segundos, una alineacin (temperatura especifica de cada primer) por 30 segundos, una extensin de 72 C por 1 minuto y por ultimo una extensin final de 72 C por 30 minutos.

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3.2.4 Electroforesis Para este proceso se utiliz el analizador gentico ABI PRISM 310 (Applied Biosystems, Foster City, California). La electroforesis se lleva acabo cuando por la accin de un campo elctrico, los productos de PCR viajan a travs de un polmero a lo largo de un capilar y son separados por tamaos. Despus de recorrer el capilar los productos de PCR etiquetados con fluorescencia son excitados por un lser de iones de argn para ser captados por un censor. Esta informacin es interpretada por un software y forma un electroferograma, en la que los alelos son representados en forma de picos y cuya unidad de medicin es la unidad de fluorescencia relativa o RFU (relative fluorescence units). Posteriormente los electroferogramas fueron analizados con el software Genemapper ID 3.1. Para la genotipificacin se realizaron 2 combinaciones de los productos de PCR de los microsatlites, aadindose 1 l de cada producto de PCR, en la primera se combinaron los microsatlites A, B, C y D y en la segunda E, F y G.

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A continuacin se elaboro un master mix conteniendo 0.3 l de Liz 500 como tamao estndar y 12 l de formamida HiDi, en cada tubo de muestra se agrego 12 l del master mix y 1 l de cada combinacin de microsatlites. El tiempo de corrida para todos los microsatlites fue de 23 minutos, se utiliz solo hasta el segmento de 350 pb del tamao estndar Liz 500 y el tiempo de inyeccin fue de 7 segundos. Para la interpretacin de los alelos es necesario el conocimiento de las diferentes variables que se pueden presentar en los electroferogramas. Bandas de sombra.- Estas bandas son ms notorias en microsatlites de dos nucletidos que en microsatlites con ms nucletidos (Walsh et al., 1996) y en alelos ms largos que en cortos (Wattier et al., 1998). En un individuo heterocigoto, en el cual sus dos alelos solo se diferencian en una o dos repeticiones, las bandas de sombra del alelo mayor se adicionarn al del alelo menor. En alelos que se diferencian en ms de dos repeticiones el alelo menor tiende a amplificar ms fuertemente que el mayor. Homocigoto con falsos alelos de 116, 114 y 112 pb que representan las tpicas bandas de sombra de -2, -4 y -6 pb del alelo verdadero de 118 pb.

Heterocigoto en el que los alelos difieren en 4 pb. Cuando la diferencia entre alelos es menor de 4 pb las bandas de sombra del alelo mayor se adicionan al alelo menor.

Figura 4. Patrones tpicos de electroferogramas de un microsatlite dinucletido

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Heterocigoto en el que los alelos difieren en 2 pb. La seal fluorescente de la banda de sombra de -2 pb del alelo de 94 pb se aade a la seal del alelo de 92 pb.

Heterocigoto en el que los alelos difieren en 8 pb. La banda de sombra de -2 pb es siempre de menor intensidad que el alelo verdadero. El alelo ms grande de 98 pb es de menor intensidad que el de 90 pb. debido a la preferencia de la Taq de amplificar ms eficientemente a los alelos ms pequeos.

Orgenes de los picos de un homocigoto: 1.-Producto de adenilizacin; 2.-alelo verdadero; 3.-banda de sombra de -2 pb del producto de adenilizacin; 4.-banda de sombra de -2 pb del alelo verdadero; 5.-banda de sombra de -4 pb del producto de adenilizacin.

Heterocigoto con productos de adenilizacin con una base de ms.

*pb- pares de bases Figura 4. Continuacin...

3.2.5 Replicaciones en forma sistematizada Taberlet et al. (1996) desarrollo un mtodo llamado de multitubos, el cual utiliza varias repeticiones de reacciones de PCR por cada locus y por cada muestra, para obtener resultados 99% confiables. 37

Este mtodo utiliza dos reglas, la primera es aceptar un alelo solo cuando es observado por lo menos 2 veces; basado en sus estimaciones la probabilidad de obtener un falso alelo no es ms del 5%, as que la probabilidad de obtener el mismo alelo en 2 reacciones de PCR independientes es de menos del 1%. La segunda regla es aceptar un homocigoto solo si 7 reacciones independientes de PCR detectaron el mismo alelo. Efectuar 7 repeticiones tal como lo describen Taberlet et al. eleva el costo y el tiempo del estudio, as que con el fin de hacer ms eficiente este proceso se dise una forma sistematizada de replicaciones en base a los estudios de Frantz et al. (2003) y Paetkau (2003). En un primer paso se amplifican todos los loci y se eligen los microsatlites con una heterocigosidad mayor a 0.7. En un segundo paso nuevamente se amplifican todos los loci y se acepta como definitivo un locus heterocigoto cuando en las 2 reacciones se obtiene el mismo resultado. Pero un locus homocigoto es aceptado solo provisionalmente. En el caso que el resultado fuera diferente en las dos reacciones se realiza una tercera, si entre estas 3 reacciones existen 2 resultados heterocigotos se acepta como definitivo y si fuera homocigoto se hace una cuarta reaccin, del mismo modo si existen dos heterocigotos se acepta como definitivo y si es homocigoto se acepta provisionalmente. En el tercer paso todos los genotipos provisionales que fueran 100% idnticos se clasificaron como si se originaran del mismo individuo. Genotipos incompletos fueron considerados solo si se obtuvo resultados en al menos uno de los dos microsatlites ms informativos. Posteriormente se agrupan en tres grupos de acuerdo al nmero de loci en los que se diferencian. En el primer grupo aquellos genotipos que se diferencian en solo un locus, un segundo en el que los genotipos se diferencian en dos loci y un tercero en el que los genotipos se diferencian en ms de tres loci. El proceso de agrupacin se llevo acabo en el programa Gimlet (Valiere, 2002).

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Se agrupan de esta manera debido a dos suposiciones: los errores nunca se presentan en ms de dos microsatlites en la misma muestra y la probabilidad que se presente el mismo error en mltiples microsatlites en mltiples muestras del mismo individuo es insignificante. Es por eso que los genotipos con 0 diferencias y aquellos con 3 o ms diferencias no son tomados en cuenta para replicarlos, pues para que genotipos con 1 y 2 diferencias se tomaran errneamente como genotipos con 0 diferencias los errores tendran que afectar los microsatlites en los cuales difieren y no en otros microsatlites y estos errores tendran que especficamente convertir el genotipo de un individuo al del otro individuo y no a uno de las docenas de posibles genotipos que tpicamente existen. En cuanto a los genotipos con 3 o ms diferencias, la heterocigosidad de los microsatlites hace que sea tambin improbable que existan errores en la genotipificacin. As que la nica probabilidad real de error es que aquellos genotipos del grupo 1 sean equivocadamente aceptados como si fueran del grupo 2 y viceversa. Una vez agrupados los genotipos, se comparan en pares los grupos con 1 y 2 diferencias, si el o los loci que hacen la diferencia son heterocigotos, el genotipo se acepta como definitivo, en caso contrario se realiza una reaccin ms. Si en esta ltima reaccin el resultado es un locus heterocigoto se realizan dos reacciones ms y posteriormente se clasifica como genotipo definitivo. La ltima condicin para aceptar los genotipos definitivos es que tengan una PI menor a 0.01, probabilidad suficiente para estimaciones poblacionales usando modelos de CMR (Mills et al., 2000). El proceso completo se esquematiza en la figura 5. Este protocolo no est diseado para detectar errores cuando solo existe una muestra de un individuo. Esto no es una preocupacin en el contexto de una estimacin poblacional, porque una muestra solo necesita tener un genotipo nico y no un genotipo correcto para hacer un clculo correcto.

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Figura 5. Diagrama de flujo de replicaciones en forma sistematizada 40

3.2.6 Deteccin de alelos nulos Pruebas de equilibrio de Hardy-Weinberg son usadas comnmente para revisar la calidad de los datos bajo la suposicin de que ndices altos de error generan un desequilibrio (Pompanon et al., 2005). Para la deteccin de alelos nulos se utiliz el programa MICRO-CHECKER (Van Oosterhout et al., 2004) y Cervus (Kalinowski et al., 2007) que proveen estimaciones de frecuencias de alelos nulos con un algoritmo basado en las diferencias entre frecuencias de homocigosis. (Bayard et al., 2005). 3.3 Anlisis estadstico 3.3.1 Estimacin de errores Para una correcta estimacin de errores se debe calcular el nmero de errores detectados dividido entre el nmero total de casos en los que puede ser detectado. Es por eso que para calcular el ndice de falso homocigoto solo deben tomarse en cuenta los genotipos heterocigotos (Broquet y Petit, 2004). Las ecuaciones para el clculo de falso homocigoto para cada locus y para todos los loci son las siguientes: fj= probabilidad de ocurrencia de falso alelo por locus. Fj= nmero de amplificaciones con falso alelo. Aj= nmero de amplificaciones positivas, ya sea homocigoto o heterocigoto, por locus.

Se calcula la media ponderada (fw) para encontrar f para todos los loci. Para el clculo de falso alelo se toman en cuenta genotipos homocigotos y heterocigotos. Pj= ndice de falso homocigoto por locus. Dj= nmero de falsos homocigotos por locus. Ahetj= nmero de amplificaciones positivas de heterocigotos por locus.

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Se calcula la media ponderada (pw) para encontrar p para todos los loci.

Se utiliz tambin un ndice de calidad publicado por Miquel et al. (2006). Al terminar de obtener los genotipos definitivos se cuantifican los errores. Todas las reacciones de PCR se califican en cada locus con un 1 si es igual al genotipo definitivo y con un 0 en su defecto. Las calificaciones de cada locus se suman y se dividen entre el nmero de repeticiones. Posteriormente se hace un promedio por muestra y un promedio global. De este modo un ndice de calidad bajo para genotipos nicos podra indicar la presencia de errores. Si se considera el ndice de calidad por muestra y se compara con el nmero de repeticiones que se necesitaron para llegar a un genotipo definitivo, se puede poner un lmite de ndice de calidad para estimar el nmero de muestras requeridas para un estudio futuro. Utilizar este ndice nos permite hacer comparaciones confiables entre muestras, loci, estudios y entre trabajos de campo y laboratorio. 3.3.2 Estimacin de parmetros genticos y tamao poblacional Para la estimacin de frecuencias allicas, heterocigosidad y probabilidad de identidad para individuos no relacionados (PI) y para hermanos (PIh) se utiliz el programa Gimlet (Valiere, 2002). Para la estimacin poblacional se utilizo el programa MARK (White y Burnham, 1999). Si un mismo individuo se capturo ms de una vez en la misma sesin, solo se tomo en cuenta una captura. Para la identificacin de alelos nulos, falsos homocigotos y de errores debido a bandas de sombra se utiliz el programa MICRO-CHECKER (Van Oosterhout et al., 2004).

42

4. RESULTADOS Y DISCUSIN4.1 Trabajo de campo Un total de 424 muestras fueron recolectadas y examinadas. Solo el 35% (59 muestras) tenan ms de dos races. El nmero de muestras como el nmero de pelo por muestra fue aumentando durante el proceso de mejoramiento de las trampas (Tabla II). Tabla II. Muestras obtenidas en el trabajo de campo.

Sesin 1 2 3 4 Total

No. de muestras 7 29 112 228 376

Muestras por trampa 1-2 1-7 1-13 1-36

No. de muestras de especies no diana 10 12 24 2 48

En la primera sesin los osos trataron de entrar a la trampa principalmente por arriba del alambre. En la segunda por debajo, especialmente las hembras, incluso machos grandes fueron capaces de pasar por debajo sin dejar muestra. En cada sesin los osos mostraron una increble adaptabilidad para pasar por el alambre. En la cuarta sesin los osos no fueron capaces de pasar por el alambre sin dejar muestra de pelo y fue cuando empezaron a destruir la trampa. El mejor mtodo es no bloquear el paso de los osos, si no tomar inadvertidamente la muestra mientras ellos entran. Despus de las 4 sesiones se concluy que la carne podrida es el mejor mtodo para atraer osos. Y fue mejor conejo que pecar. El hecho de que el largo de cada lado de la trampa fue cambiando en cada sesin no pareci afectar el xito de las trampas. El uso de asientos no afecto la entrada de los osos a la trampa, pues fue posible tomar muestras una hora despus de poner el cebo.

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4.2 Trabajo de laboratorio y anlisis estadstico De las 59 muestras obtenidas en el trabajo de campo 56 se lograron amplificar (95%), un mayor porcentaje que del 70 al 80% que estima Solberg et al. (2006) que ocurre en estudios similares. Del mismo modo se obtuvo una mejor amplificacin en los productos de PCR en los que se utiliz el estuche GenomiPhiTM que en aquellos en los que no se utiliz. Del electroferograma B, en la figura 6, se observa la existencia de un alelo falso el cual no se presenta en el genotipo verdadero (A). Asimismo en el electroferograma D se observa un falso homocigoto, siendo que este es realmente heterocigoto (C). Adems, en los electroferogramas de los productos de PCR en los que se utiliz el kit GenomiPhiTM, presentan una importante disminucin en la adenilizacin y una mayor cantidad de RFU.

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Con GenomiPhi

Sin GenomiPhi

A)

B)

C)al- alelo, sz- tamao, ht- altura (cantidad de RFU)

D)

Figura 6. Electroferogramas amplificados con y sin GenomiPhiTM Durante el proceso de optimizacin de la PCR post GenomiPhiTM, se experiment con 2 mtodos adicionales (ver figura 7). Una tcnica de touchdown PCR (A) y un proceso de pre-amplificacin (B), descritas en Sloane et al. (2000) y Piggott et al. (2004) respectivamente. En ambos casos los resultados fueron mejores con el mtodo utilizado (C) con menos adenilizacin y mayor cantidad de RFU.

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Durante el trabajo de laboratorio despus de amplificar una sola vez los microsatlites A, B, C y E en cada una de las muestras, ocurri desafortunadamente un accidente en el que se perdieron todas las muestras. Por esa razn no fue posible calcular los ndices de error, ni de calidad. Sin embargo gracias a que tres de los cuatro microsatlites que se lograron amplificar resultaron altamente polimrficos, fue posible alcanzar una PI en cada una de las muestras menor a 0.01, una probabilidad suficientemente baja para afirmar que no existen individuos que compartan el mismo genotipo.

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A)

B)

C)

al- alelo, sz- tamao, ht- altura (cantidad de RFU)

Figura 7. Mtodos adicionales utilizados durante la optimizacin de la PCR. Tabla III. Resultados de microsatlites amplificados Locus A B C E Promedio No. alelos 21 3 7 11 Rango de alelos 105-191 70-74 145-171 126-159 Heterocigosidad 0.92 0.35 0.82 0.79 0.72

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De estos 4 microsatlites el A, C y E muestran una heterocigosidad (porcentaje de individuos heterocigotos dentro de la poblacin) igual o mayor de 0.6-0.8 que Taberlet y Luikart (1999) consideran como la ideal en un microsatlite, lo cual significa que el nmero de alelos y la variedad de ellos son suficientes para poder diferenciar acertadamente cada individuo. En cuanto al rango de alelos de los loci se puede destacar que son menores de 200 pares de bases, lo cual hace que exista una menor probabilidad de error en la genotipificacin (Tabla III). La heterocigosidad que muestran estos loci se encuentran dentro del promedio de distintas poblaciones de osos en Norte Amrica, como se aprecia en el artculo de Paetkau (2003) sobre un inventario de estudios poblacionales. Es de notarse que el locus A es uno de los loci con ms nmero de alelos publicados.

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Tabla IV. Frecuencias allicas.Locus A Alelo 105 107 109 111 113 115 117 119 121 127 129 131 135 158 160 171 173 177 187 189 191 Frecuencias allicas 0.009 =1/112 0.036 =4/112 0.071 =8/112 0.089 =10/112 0.036 =4/112 0.143 =16/112 0.125 =14/112 0.089 =10/112 0.054 =6/112 0.054 =6/112 0.036 =4/112 0.009 =1/112 0.009 =1/112 0.018 =2/112 0.027 =3/112 0.009 =1/112 0.009 =1/112 0.125 =14/112 0.009 =1/112 0.027 =3/112 0.018 =2/112 E C Locus B Alelo 70 72 74 145 155 161 165 167 169 171 126 130 132 134 136 148 160 152 155 157 159 Frecuencias allicas 0.214 =24/112 0.777 =87/112 0.009 =1/112 0.143 =2/14 0.071 =1/14 0.071 =1/14 0.071 =1/14 0.286 =4/14 0.143 =2/14 0.214 =3/14 0.011 =1/94 0.106 =10/94 0.383 =36/94 0.074 =7/94 0.17 =16/94 0.021 =2/94 0.064 =6/94 0.011 =1/94 0.032 =3/94 0.064 =6/94 0.064 =6/94

Las frecuencias allicas aqu reportadas demuestran una alta heterocigosidad, caracterstica primordial de un microsatlite (Tabla IV). De las 56 muestras que se lograron amplificar se encontraron 51 genotipos diferentes, por lo tanto durante las 4 sesiones sucedieron 5 recapturas de las cuales 2 fueron en la misma sesin, es por eso que solo se tomaron en cuenta 3 recapturas. 49

Tabla V. Resultados generales de cada muestra Microsatlites Muestra1a sesin 1 2 3 4 5 6 7 2a sesin 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 3a sesin 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 2 2 4 2 4 2 2 10 3 8 3 5 109 107 127 117 117 115 109 109 189 117 187 129 113 173 177 119 127 119 111 115 191 177 189 129 72 72 72 72 72 72 72 72 70 72 72 70 72 72 72 72 72 72 72 72 70 72 72 72 --------------------------------------------------132 132 --132 130 130 130 134 132 132 ----132 134 --159 130 157 132 150 136 136 --2 25 26 27 28 3 29 30 1 31 32 33 3.08E-03 5.64E-05 4.61E-04 1.35E-02 3.95E-04 1.74E-04 1.05E-04 1.00E-03 4.18E-07 2.46E-03 3.76E-05 4.25E-04 2.19E-01 9.86E-02 8.90E-02 2.44E-01 8.79E-02 7.59E-02 6.85E-02 9.57E-02 2.76E-02 1.06E-01 8.61E-02 1.56E-01 6 3 3 3 4 2 6 5 2 2 3 2 5 5 11 3 107 109 --117 109 111 119 113 127 111 111 117 115 119 115 111 127 171 --177 113 177 129 117 177 119 117 121 127 177 115 115 72 70 --72 72 70 70 72 72 70 70 70 70 70 70 70 74 72 --72 72 72 72 72 72 72 72 72 72 72 72 72 --------165 --155 ------171 ----145 169 ----------167 --167 ------171 ----145 171 --132 ----130 132 132 132 136 159 ----126 136 132 148 132 136 ----136 134 157 157 159 159 ----150 136 136 150 157 11 12 --13 2 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 6.92E-06 4.25E-04 --6.83E-04 7.17E-06 3.63E-04 4.24E-06 1.17E-04 3.29E-05 5.31E-03 3.41E-04 6.06E-06 1.48E-04 1.98E-05 1.13E-06 4.15E-04 5.17E-02 1.57E-01 --8.30E-02 2.90E-02 6.72E-02 2.15E-02 7.25E-02 6.65E-02 1.74E-01 6.62E-02 4.66E-02 6.03E-02 2.47E-02 1.83E-02 6.83E-02 3 3 3 3 3 3 2 105 189 109 121 111 115 --119 191 115 121 115 119 --72 70 70 72 70 72 --72 70 72 72 72 72 ----161 ----167 ------169 ----167 ------134 132 132 132 130 ----150 150 157 132 130 --51 1 7 8 9 10 --9.62E-04 8.52E-09 3.32E-04 8.47E-05 1.02E-04 1.74E-04 --2.17E-01 8.53E-03 6.71E-02 8.19E-02 3.61E-02 7.59E-02 ---

No. Pelos

A

B

C

E

No. oso

PI

PIh

50

Tabla V. ContinuacinMicrosatlites Muestra36 37

No. Pelos7 4

A177 115 177 115

B70 70 72 72

C---------

E136 132 150 132

No. oso34 4

PI1.13E-04 9.97E-04

PIh5.77E-02 9.07E-02

4 sesin 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 3 3 3 2 5 3 8 3 2 11 6 7 6 6 2 2 5 8 4 2 4 10 115 117 121 107 115 158 109 117 107 160 131 111 111 177 117 111 --111 119 117 109 113 117 177 121 119 115 158 177 117 117 160 135 177 177 177 160 115 --115 121 129 119 127 72 70 72 72 70 70 72 72 72 72 72 72 72 72 72 72 --72 72 70 70 72 72 72 72 72 72 72 72 72 72 72 72 72 72 72 72 72 --72 72 72 72 72 ----------------------------------------------------------------------------------------132 130 132 132 132 132 132 148 --136 136 132 132 132 132 130 --130 132 --132 132 155 132 136 157 132 132 132 152 --136 159 136 136 136 134 134 --134 155 --155 159 35 36 37 38 4 39 40 41 42 43 44 5 5 45 46 6 --6 47 48 49 50 5.27E-04 8.48E-04 2.26E-04 1.88E-04 9.97E-04 1.56E-05 1.58E-03 4.27E-06 5.39E-03 1.25E-05 2.09E-06 1.76E-03 1.76E-03 1.23E-03 2.30E-04 2.44E-04 --2.44E-04 1.41E-04 2.97E-03 1.04E-04 1.13E-04 9.26E-02 7.31E-02 9.22E-02 8.35E-02 9.07E-02 7.20E-02 1.15E-01 6.45E-02 2.31E-01 7.12E-02 6.31E-02 1.03E-01 1.03E-01 1.05E-01 8.65E-02 7.42E-02 --7.42E-02 8.18E-02 1.70E-01 6.13E-02 8.06E-02

Estos resultados denotan que es posible realizar una genotipificacin correcta con tan solo 2 pelos. Cada uno de los genotipos encontrados tienen una PI (probabilidad de identificacin, probabilidad de que dos individuos escogidos al azar en una poblacin tengan el mismo genotipo) menor a 0.01 lo que asegura que estos genotipos no son compartidos por 2 o ms individuos (Tabla V).

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Posteriormente estos datos se ingresaron en el programa MARK, dando como resultado una densidad poblacional de 121 osos con una confiabilidad del 95% y un intervalo de confidencia de 100 a 152 osos o 2.42 osos/Km. Estos resultados indicaran que al menos 51 osos habitan en el rea de estudio de 50 Km o alrededor de 1 oso/Km. Entre otros resultados publicados (ver tabla VI), DoanCrider (1995) report en las Serranas de Burro en Coahuila, una densidad poblacional de 0.72 osos/Km, una de las ms altas reportadas, adems de ser la nica reportada hasta el momento en Mxico. En base al resultado obtenido del programa MARK, esta estimacin supera por mucho cualquier otra, lo cual podra interpretarse como dudosa. Tabla VI. Densidad poblacional del oso negro americano en distintas localidades de Norteamrica.

Martnez Muoz, Alfonso. Capacidad de carga para el oso negro (Ursus americanus eremicus) de los ecosistemas de las serranas del Carmen Coahuila. Informe final del Proyecto Q006. Universidad Autnoma de Nuevo Len. Facultad de Ciencias Forestales. (2001).

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Existen varias posibles explicaciones para estos resultados. En primer lugar el que el kit de GenomiPhi V2 haya ocasionado la creacin de alelos que no existan en realidad en la poblacin. Esto es poco probable debido a que se utiliz, durante todo el proceso de experimentacin, controles positivos de genotipos conocidos y en ningn momento se manifest este fenmeno. Adems si esto hubiera ocurrido, hubiera afectado de igual manera a todos los microsatlites y en todos existiera aproximadamente el mismo nmero de alelos. Por ltimo, por medio de comunicacin personal se describi la situacin a Kaye N. Ballantyne y Melissa R. Gunn ambos expertos e involucrados en procesos con GenomiPhi muy parecidos al utilizado en este trabajo, en el que consideran que esto es muy improbable. En segundo lugar es el hecho de que existen pocas recapturas, una de las caractersticas de los modelos CMR para hacer una estimacin correcta, lo cual indicara que existi un sesgo en el que los osos despus de la 1 captura hayan sido negativamente influidos y no regresaran a la trampa en las sesiones posteriores. En tercer lugar existe la posibilidad de que el rea de estudio no haya sido completamente cerrada e individuos fuera de sta hayan entrado. A pesar de que las muestras se perdieron y nicamente fue posible amplificar 4 microsatlites una sola vez, los picos observados en los electroferogramas en la gran mayora tenan ms de 150 RFU, lmite que Wallin et al. (1998) sita como mnimo para aceptar un alelo con certeza. Adicionalmente los resultados obtenidos por el programa MICRO-CHECKER (Van Oosterhout et al., 2004) no evidenciaron la presencia de alelos nulos, ni de falsos homocigotos o de errores causados por bandas de sombra. Todo esto hace suponer que si bien los resultados no fueron confirmados por medio de repeticiones, no distan mucho de los genotipos correctos, por lo tanto si el protocolo de replicaciones sistematizadas hubiera sido utilizado se cree que el nmero de replicaciones no fuera mayor a 3 por muestra y que no diferiran de los aqu presentados.

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4.3 Costos La viabilidad econmica es una de las principales caractersticas que cualquier estudio debe de tener. En el caso de estimaciones poblacionales basados en un modelo CMR, el costo de un mtodo tradicional es mucho mayor en comparacin al mtodo gentico, como lo describe Woods et al. (1999) en el que concluye que el costo de capturar fsicamente a un oso es de US$4,800 por ejemplar, a diferencia del costo por cada muestra no invasiva que vara de US$48 a US$96. En otros estudios, Hager Brown (2004) estim el costo en diferentes mtodos de estimacin poblacional: EPMNI-US$1,650, fotografa remota-US$9,500 y radio telemetraUS$13,000. En otra investigacin Vigilant (2002) calcul el costo de genotipificar una sola muestra con 8 microsatlites en alrededor de US$100, tomando en cuenta solo el costo de los reactivos. Por su parte Solberg et al. (2006) compar los costos de una estimacin poblacional con muestras no invasivas con los de una estimacin basada en helicptero. Concluyendo que el costo por muestra, incluyendo costos de laboratorio y salarios, es de US$140 o 4.5 veces menor que la estimacin por helicptero. A pesar de que un EPMNI es el mtodo con ms viabilidad econmica para realizar una estimacin en especies de fauna silvestre, sus costos aun son altos. Si bien es cierto que los reactivos son costosos, no es el principal motivo de su alto costo, sino las mltiples replicaciones de cada muestra cuando los resultados no son concluyentes. Los resultados de las reacciones de PCR de este estudio, aunque no fueron confirmados por replicaciones, hay razones para afirmar que estos resultados no hubieran excedido ms de tres replicaciones por muestra, utilizando el mtodo de replicaciones sistematizadas, aqu descrito, para obtener un genotipo consenso. Tomando como base el procedimiento que se realiz en esta tesis y recurriendo a reactivos mas econmicos utilizados por el Instituto Nacional de Normas y Tecnologa (NIST, National Institute of Standards) de Estados Unidos se calculo en teora el costo de genotipificar 100 muestras con 7 microsatlites y un locus ms para la identificacin del sexo, con 3 replicaciones por cada muestra. Por lo tanto el costo total del trabajo de laboratorio seria de USD$2,517.90 o aproximadamente USD$25 por muestra, la mitad del costo ms econmico publicado (Tabla VII). 54

Tabla VII. CostosDescripcin Extraccin Filtros de centrifugacin Microcon 100 Fenol:cloroformo:alcohol isoamilico (25:24:1) Proteinasa K Amplificacin Genomiphi V2 Suero de albmina bovino (BSA) AmpliTaq Gold PCR Master Mix Primer marcado Primer sin marcar Anlisis Formamida Hi-Di Tamao estndar LIZ 500 Polimero POP-6 ABI PRISM 3700 Bufer analizador gentico 10X Capilar, 47 cm Tapas p/tubos de muestra 0.5 ml Tubos de muestra 0.5 ml Generales Tubos de 0.2 ml Tubos de 1.5 ml Guantes Puntillas con barrera TOTAL SA SA SA SA 1 000 uni 500 uni 100 uni 1 000 uni $40.60 $15.90 $12.10 $101.50 1 500 uni 500 uni 200 uni 3 000 uni $60.90 $15.90 $24.00 $304.50 $2,517.90 AB AB AB GC GC GC GC 25 ml 400 ul 200 ml 25 ml 5 uni 500 uni 500 uni $30.00 $265.00 $669.00 $55.00 $160.00 $115.00 $36.00 8 ml 180 ul 10 ml 12.5 ml 3 uni 600 uni 600 uni $9.60 $119.25 $33.45 $27.50 $96.00 $138.00 $43.20 GE GE AB AB AB 100 rxs 25 mg 250 uni 1 uni 1 uni $390.00 $55.00 $250.00 $75.00 $25.00 100 rxs 6 mg 375 uni 5 uni 7 uni $390.00 $13.20 $375.00 $375.00 $175.00 Compaia Present. Precio uni. $278.00 Cantidad p/100 muestras 100 uni TOTAL

M

100 uni

$278.00

GE GE

400 ml 100 mg

$128.00 $94.00

35 ml 30 mg

$11.20 $28.20

Los precios son en dlares y sin I.V.A. M- Millipore; GE- General Electric; AB, Applied Biosystems; GC, Gel Company; SA, Sigma Aldrich.

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5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONESActualmente el desarrollo de proyectos de conservacin debe adquirir un carcter prioritario en las decisiones de quienes respecta la administracin de los recursos naturales no renovables, como lo es la fauna silvestre. Esto es especialmente necesario en Mxico, en primer trmino por que se carece de informacin, muchas veces elemental, de varias de las especies silvestres que habitan en el pas. Para llevar a cabo un proyecto exitosamente, es imprescindible que el primer objetivo sea la obtencin de informacin sobre la situacin en la que se encuentra una poblacin animal Como se ha mencionado una estimacin poblacional es el cimiento para posteriores esfuerzos en cuanto a conservacin. Una estimacin poblacional con muestras no invasivas posee muchas ms ventajas que desventajas con respecto a otros mtodos de estimacin. Entre estas ventajas podemos mencionar, primeramente, que el costo es menor, se obtiene una cantidad mayor de informacin, se aumenta el nmero de capturas y as la precisin de las estimaciones, se elimina el estrs y la mortalidad, se acorta el periodo de muestreo para garantizar aun ms el termino de una poblacin cerrada, se reducen los sesgos en la probabilidad de captura causados por la respuesta a las trampas, adems de que estas trampas se colocan ms fcilmente y se pueden revisar con menor frecuencia. Una de las principales cualidades de este sistema, es que posee la capacidad de aportar informacin sobre el contenido gentico, lo cual permite conocer el sexo, la relacin existente entre individuos y poblaciones y particularmente la variabilidad gentica, pues de ella depende la capacidad de responder a variaciones ambientales, constituyendo la base para el progreso gentico (Rochambeau et al., 2000). A estas ventajas se suma que al emplear el mtodo aqu descrito, la cantidad de ADN amplificada con el kit GenomiPhi es suficiente para ser utilizada en estudios subsecuentes, el costo del trabajo de laboratorio se disminuye considerablemente y que errores en la genotipificacin (principal desventaja de este tipo de estudio), aunque no se demostr por completo en este estudio, pueden ser minimizados al grado de ser ignorados.

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La seleccin de los primers y la optimizacin de la PCR son tal vez los dos factores ms importantes para el xito en la genotipificacin, como lo consideran Fernando et al. (2003), en esta investigacin estos dos procesos se encuentran ya depurados y listos para su aplicacin. Dentro de los microsatlites analizados dentro de esta tesis, 3 de ellos tienen una alta heterocigosidad, hacindolos idneos para su utilizacin en este tipo de estudios. Tambin se encontr una densidad poblacional de al menos 1 oso/Km, una de las ms altas publicadas. El porcentaje de genotipificacin positiva fue del 95% tambin una de las ms altas publicadas hasta el momento, fue posible genotipificar correctamente muestras con 2 pelos y se logr reducir el costo por muestra a la mitad del costo ms econmico publicado. Dado que se presentan tantas variantes y existen tantos posibles errores dentro de este estudio, es recomendable llevar acabo un estudio piloto antes de hacerlo a gran escala y decidir si es factible o no su realizacin. La principal meta de un estudio piloto es identificar las dificultades tcnicas, determinar el ndice de error en la genotipificacin y el clculo de la PI. Waits y Paetkau (2005) recomiendan genotipificar a 30 individuos con 10 a 15 microsatlites y si la variabilidad gentica fuera muy pequea, como es en poblaciones pequeas o aisladas, podra no ser viable utilizar este estudio. Esta forma de estimacin, dadas sus caractersticas, tiene la capacidad para ser utilizada como mtodo rutinario y puesto que es muy verstil, con algunas variaciones, puede ser utilizado en estimaciones de cualquier otro carnvoro. Se concluye finalmente que la estimacin poblacional con muestras no invasivas, es un recurso indispensable para lograr afrontar con xito el desafo que representa una poblacin humana en constante crecimiento y poder impedir el agotamiento de los recursos naturales no renovables.

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6. LITERATURA CITADAAdams, J.R., Kelly, B.T., Waits, L.P. Using faecal DNA sampling and GIS to monitor hybridization between red wolves (Canis rufus) and coyotes (Canis latrans). Mol Ecol 12:21752186. (2003). Alt, G. L. Reproductive biology of female black bears and early growth and development of cubs in northeastern Pennsylvania. Disertacin de tesis de Ph.D., West Virginia University, Morgantown, WV, EUA (1989). Baird, S. F. Mammals of the boundary. United States and Mexican Boundary Survey 2:1 62. (1859). Ballantyne, K. N., Roland, A. H., Van Oorschot, R. John Mitchell. Increasing amplification success of forensic DNA samples using multiple displacement amplification. Forensic Sci. Med. Pathol. 3:182187. (2007b). Ballantyne, K. N., Van Oorschot, R. A., Muharam, I., van Daal, A., Mitchell, R. J. Decreasing amplification bias associated with multiple displacement amplification and short tandem repeat genotyping. Anal Biochem. Sep 15; 368 (2):222-9. (2007a). Barber, A. L., y Foran, D. R. The Utility of Whole Genome Amplification for Typing Compromised Forensic Samples. J. Forensic Sci., November Vol. 51, No. 6. (2006). Bayard de Volo, S., Reynolds, R. T., Topinka, J. R., Michael, B. M. y Antolin, F. Population genetics and genotyping for mark recapture studies of northern goshawks (accipiter gentilis) on the Kaibab Plateau, Arizona. J. Raptor Res. 39(3):286295. (2005). Bear Specialist Group 1996. Ursus americanus. En: IUCN 2007. 2007 IUCN Red List of Threatened Species. . Consultado el 26 de febrero del 2008. (2007). Bellemain, E., Nawazb, M. A., Valentinia, A., Swenson, J. E., y Taberlet, P. Genetic tracking of the brown bear in northern Pakistan and implications for conservation. Biological Conservation 134 537-547. (2007). Bellemain, E., Swenson, J. E., Tallmon, D., Brunberg, S. y Taberlet, P. Estimating population size of elusive animals with DNA from hunter-collected feces: four methods for brown bears. Conservation Biology, 19, 150161. (2005). Bellemain, E., y Taberlet, P. Improved noninvasive genotyping method: application to brown bear (Ursus arctos) faeces. Molecular Ecology Notes 4, 519522. (2004). Boersen, M. R., Clark, J. D. y King, T. L. Estimating black bear population density and genetic diversity at Tensas River, Louisiana using microsatellite DNA markers. Wildlife Society Bulletin 31:197207. (2003). Bonin, A., Bellemain, E., Eidesen, P. B., Pompanon, F., Brochmann, C., y Taberlet, P. How to track and assess genotyping errors in population genetic studies. Molecular Ecology 13, 32613273. (2004).

58

Boulanger, J., Stenhouse, G., MacHutchon, G., Proctor, M., Himmer, S., Paetkau, D. y Cranston, J. Grizzly Bear Population and Density Estimates for the 2005 Alberta (Proposed) Unit 4 Management Area Inventory Report Prepared for Alberta Sustainable Resource Develpment, Fish and Wildlife Division, December. (2005). Broquet, T, Menard N, Petit E. Non invasive population genetics: a review of sample source, diet, fragment length and microsatellite motif effects on amplification success and genotyping error rates. Conserv Genet 8:249260. (2007). Buchan, J. C., Archie, E. A., Van Horn, R. C., Moss, C. J. y Alberts, S. C. Locus effects and sources of error in noninvasive genotyping. Mol. Ecol. Notes 5(3): 680683. (2005). Butler, J.M. Forensic DNA Typing, 2nd Edition (Elsevier Academic Press), p. 56. (2005). Chaves P. B., Paes, M. F., Mendes, S. L., Strier, K. B., Louro, I. D. y Fagundes, V. Noninvasive genetic sampling of endangered muriqui (Primates, Atelidae): Efficiency of fecal DNA extraction. Genetics and Molecular Biology, 29, 4, 750-754. (2006). Craighead, L., Paetkau, D., Reynolds, H. V., Vyse, E. R. y Strobeck, C. Microsatellite analysis of paternity and reproduction in Arctic grizzly bears. Journal of Heredity, 86, 255261. (1995). Creel S, Spong G, Sands JL, Rotella J, Zeigle J, Joe L, Murphy KM y Smith D. Population size estimation in Yellowstone wolves with error-prone noninvasive microsatellite genotypes. Molecular Ecology, 12, 20032009. (2003) Dixon, J. D., Oli, M. K., Wooten, M. C., Eason, T. H., Mccown, J. W. y Paetkau, D. Effectiveness of a regional corridor in connecting two Florida black bear populations. Conservation Biology 20:155162. (2006). Doan-Crider, D. L. Population characteristics and home range dynamics of the black bear in Northern Coahuila, Mexico. M. S. Thesis, Texas A&M University-Kingsville. 117pp. (1995). Eiler, J. H., Wathen, W. G. y Pelton, M. R. Reproduction in black bears in the southern Appalachian Mountains. The Journal of Wildlife Management 53:353360. (1989). Elliot, D. G. Descriptions of apparently new species of mammals of the genera Heteromys and Ursus from Mexico and Washington. Field Columbian Museum Publications, Zoology Series 3, 80:233237. (1903). Ennis S, Gallagher TF. A PCR-based sex-determination assay in cattle based on the bovine amelogenin locus. Anim Genet. Dec; 25(6):425-7. (1994). Erickson, A. W. y J. Nellor. Breeding biology of the black bear. Pp. 4-45 en: The black bear in Michigan. Mich. Agric. Exp. St. Res. Bull. 4. (1964). Ernest, H. B., Penedo, M. C. T., May, B. P., Syvanen, M. y Boyce, W. M. Molecular tracking of mountain lions in the Yosemite Valley region in California: genetic analysis using microsatellites and faecal DNA. Molecular Ecology 9, 433441. (2000). Fernando, P., Vidya TNC, Rajapakse C, Dangolla A, Melnick DJ Reliable noninvasive genotyping: fantasy or reality? J. Hered. 94:115123. (2003). 59

Ford, B. Black bear. The spirit of the wilderness. Houghton Mifflin Company. Boston. Massachusetts. 182 pp. (1981). Frantz, A. C., Pope, L. C., Carpenter, P. J., Roper, T. J., Wilson, G. J., Delahay, R. J. y Burke, T. Reliable microsatellite genotyping of the Eurasian badger (Meles meles) using faecal DNA. Molecular Ecology, 12, 16491661. (2003). Frantz, A. C., Schaul, M., Pope, L. C., Fack, F., Schley, L., Muller, C. P. y Roper, T. J. Estimating population size by genotyping remotely plucked hair: the Eurasian badger. Journal of Applied Ecology 41:985995. (2004). Gagneux, P., Boesch, C. y Woodruff, D. S. Microsatellite scoring errors associated with noninvasive genotyping based on nuclear DNA amplified from shed hair. Molecular Ecology, 6, 861868. (1997). Garshelis, D. L. Markrecapture density estimation for animals with large home ranges. Pages 10981111 in D.R. McCullough and R.H. Barrett, editors. Wildlife 2001: populations. Elsevier Applied Science, London, UK. (1992). Gill, P, Whitaker, J., Flaxman, C., Brown, N. y Buckleton, J. An investigation of the rigor of interpretation rules for STRs derived from less than 100 pg of DNA. Forensic Sci. Int. 24; 112(1): 17-40. (2000). Goosens, B., Waits, L. P., y Taberlet, P. Plucked hair samples as a source of DNA: reliability of dinucleotide microsatellite genotyping. Mol. Ecol. 7:12371241. (1998). Gunn, M. R., Hartnup, K., Boutin, S., Slate, J., y Coltman, D. W. A test of the efficacy of whole-genome amplification on DNA obtained from low-yield samples. Molecular Ecology Notes 7, 393399. (2007). Hall, E. R. The mammals of North America. Second ed. John Wiley & Sons, New York 2:6011181 1 90. (1981). Herrero, S. Bear attacks: their causes and avoidance. Winchester Press, Piscataway, New Jersey. (1985). Hoffman, J. I., y Amos, W. Microsatellite genotyping errors: detection approaches, common sources and consequences for paternal exclusion. Mol. Ecol. 14:599612. (2005). Hoss, M., Kohn, M., Paabo, S., Knauer, F. y Schroeder, W. Excrement analysis by PCR. Nature 359:199. (1992). International Union for Conservation of Nature and Natural Resources (IUCN). Status survey and conservation action plan. Bears. Servheen, C., Herrero, S. y Peyton, B. Comps. IUCN, Gland, Switzerland and Cambridge, UK. 309 pp. (1999). Kalinowski, ST, Taper, ML & Marshall, TC Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment. Molecular Ecology 16: 1099-1006. (2007) Kasworm, W. F., y Thier T. J. Adult black bear reproduction, survival, and mortality sources in northwest Montana. International Conference on Bear Research and Management 9:223230. (1994). 60

Kohn, M. H. y Wayne, R. K. Facts from feces revisited. Trends Ecol. Evol. 12, 223-227. (1997). Lariviere, S. Ursus americanus. Mammalian species 647:1-11. (2001). Leopold, A. S. Fauna Silvestre de Mxico. Pax Mxico. Segunda edicin. Mxico. (1977). Leopold, A.