완벽한 Cloning으로가는 완벽한 구성 In-Fusion HD Cloning...

완벽한 Cloning으로 가는 완벽한 구성

Ligation을 한번에 In-Fusion® Enzyme

정확도 높은 High Fidelity PCR 효소 CloneAmpTM HiFi PCR Premix

Cloning 효율을 높이는 방법 NucleoSpin ® / Cloning Enhancer

도입 효율이 높은 Competent Cells StellarTM Competent Cells

In-Fusion® HD Cloning Plus

Cloning=Clontech

directional cloning products

• Seamlessly clone what you want, want—with no added

restriction enzymes, ligase, phosphatase required

clone fragments kb

In-Fusion PCR Cloning Kits allow you to clone PCR-amplified inserts into any vector, linearized at any restriction site, in a simple 30 minute reaction (Figure 1;

in several different sizes and formats, so you can optimize PCR cloning reactions to

format provides ease-of-use and consistency between reactions, while the liquid format provides maximum versatility. Our new In-Fusion Advantage PCR Cloning Kits are available with or without NucleoSpin®

or Cloning Enhancer, so you can choose the best treatment for your PCR product prior to cloning. For further customization, Clontech provides a wide array of products to complement the In-Fusion Kits. For those researchers who do not already have a vector they would like to use, Clontech offers several In-Fusion Ready Prelinearized Vectors with options for fluorescent protein fusions, 6xHN tags for purification of recombinant proteins, and easy switching between expression systems (3, 4). Additionally, you can transform your In-Fusion reaction into our highly

Fusion-Blue™ Competent which are optimized for use with

In-Fusion™ AdvantageA system you can use with any vector and insert—the single solution for all your PCR cloning applications

Table I: In-Fusion PCR Cloning vs. Other Cloning Systems

Limitations of Other Cloning Systems The In-Fusion Advantage

• Vector choice is limited.

• Different kits require different vectors.

• Must use vector supplied with kit.

This versatile technology allows the cloning of ANY PCR product into ANY linearized vector, as long as they share 15 bp of homology at each end.

• Restriction digestion and ligation of inserts is necessary.

• Require unique, compatible restriction sites.

• Appropriate restriction sites are limited.

No restriction digestion or ligation of PCR products is required. Cloning is not hindered by restriction sites within the PCR products.

• Complex constructs require subcloning. No subcloning is required.

Figure 1. The In-Fusion Advantage Cloning Protocol. A thermostable, DNA polymerase and primers are used to generate a PCR product containing a gene of interest with 15 bp extensions homologous to the ends of vector. The PCR product is either treated with Cloning Enhancer or spin and combined with the vector in a 30 min In-Fusion Advantage cloning reaction. The cloning reaction is then used to transform E. coli.

Amplify your gene s

s

Anylinearized

vector

Recombinant vector

30 min single-tubereaction

The In-Fusion Enzyme creates

which are then fused dueto the 15

Add proprietary

to the PCR productOR

PCR product

A system you can use with any vector and insert—the single solution for all your PCR cloning applications

In-Fusion PCR Cloning vs. Other Cloning Systems

Other Cloning Systems The In-Fusion Advantage

limited.

require different vectors.

supplied with kit.

This versatile technology allows the cloning of ANY PCR product into ANY linearized vector, as long as they share 15 bp of homology at each end.

digestion and ligation of inserts

compatible restriction sites.

No restriction digestion or ligation of PCR products is required. Cloning is not hindered by restriction sites within the PCR products.

In-Fusion Advantage Cloning Protocol. A thermostable, DNA primers are used to generate a PCR product containing a

15 bp extensions homologous to the ends of vector. The PCR product Cloning Enhancer or spin and combined with the vector

Advantage cloning reaction. The cloning reaction is then used

Amplify your gene of interests

with 15 bp extensionshomologous to vector ends

Anylinearized

vector

Recombinant vector

30 min single-tubereaction

In-Fusion Enzyme createssingle-stranded regions at the ends

of the vector and PCR product,h are then fused due

bp homology

Add proprietaryCloning Enhancer

to the PCR productspin-column purify

PCR product

목적유전자 (insert)

PCR product 정제 : Cloning Enhancer나 NucleoSpin으로 권장

In-Fusion 효소가 vector와PCR product (insert) 말단을

single-strand으로 만든 후15 bp의 상동서열을 융합시킨다.

Vector의 양쪽 말단 15 bp 상동서열을 insert 증폭 primer 5’에 넣어 준다.

In-Fusion 반응(50 ℃, 15 min)

Vector 준비 : vector 선형화 (linearize)

• 제한효소 처리 : 2 종류의 제한효소로 처리하는 경우 더 효과적이다

• Inverse PCR : PCR로 vector를 증폭 증폭시 high-fildelity PCR 효소 사용을 권장한다.

Insert 준비 : In-Fusion primer로 PCR

In-Fusion primer는 gene specific primer( )에 vector

의 5＇말단과 상보적 서열(※：15 bp)을 부가한 primer이

다.

Cloning은 Clontech

In-Fusion Cloning의 특징

Any Vector, Any Insert • Vector 종류나 삽입 위치의 제한 없이 cloning 가능

• 특정 vector나 특정 cell 없이 In-Fusion 효소만 있으면 가능

짧고 간편한 반응 • 50℃, 15 분이면 In-Fusion 반응 완료

• 목적유전자(insert)에 A tailing이나 제한효소 처리 또는 vector의 phosphatase 처리 불필요

뛰어난 cloning 효율 • 방향성이 유지되는 directional cloning으로 clone 스크리닝 효율이 높음

다양한 실험에 적용 가능 • 복수 DNA도 동시에 cloning 가능하며 전용 vector나 cell이 불필요

• 긴 단편 DNA(~ 15 kb)의 cloning, mutagenesis이나 modular vector 제작에도 효과적

In-Fusion Cloning 개요

In-Fusion® HD Cloning Flow Chart

02

정확하고 간편하게 In-Fusion® Primer 디자인

2

Results

With PrimeSTAR GXL polymerase, products up to 30 kb could be amplified from human genomic DNA, and

products up to 40 kb were efficiently amplified from lambda DNA (Figure 2, left and middle panels). In addition,

fragments up to 13.5 kb were obtained from cDNA (Figure 2, right panel).

III. Amplification of GC-Rich Targets The performance of PrimeSTAR GXL polymerase was compared to several other commercially available high-fideli-

ty polymerases and polymerases marketed as being optimized for use with GC-rich templates.

Methods

Fragments with high GC-content were amplified from either 100 ng of human genomic DNA (lanes 1 and 2) or

10 ng of T. thermophilus HB8 genomic DNA (lanes 3 and 4). All reactions were performed according to the proto-

col recommended by each manufacturer.

Results

Under the conditions used, only PrimeSTAR GXL polymerase yielded highly specific amplification of all of the

GC-rich targets tested (Figure 3).

Conclusions

PrimeSTAR GXL polymerase outperforms other enzymes and provides highly

specific amplification in a variety of challenging PCR scenarios (i.e., long range

PCR and amplification of GC-rich sequences). With PrimeSTAR GXL polymerase,

excellent PCR results can be obtained without the need for special buffers or modifications

to the reaction conditions.

Figure 2. Amplification of long targets using PrimeSTAR GXL polymerase. Amplicons of vary-ing lengths were amplified by PCR from either human gDNA (left), lambda DNA (middle), or synthesized cDNA (right). The expected size of each product is listed beneath the gel image. In all cases, lane M contains a λ-Hind III digest molecular size marker.

M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 MM 1 2 3 4 M

PrimeSTAR GXL Company A Company B

Company B.2 (for GC-rich) Company C

Company D (for GC-rich)

Figure 3. Amplification of GC-rich targets using PrimeSTAR GXL polymerase or enzymes from other manufacturers (Companies A, B, C, or D). The Company B.2 and Company D enzymes mar-keted as optimized for GC-rich templates. Amplicons of vary-ing GC-content were amplified from either human gDNA (lane 1, APOE, 74% GC; lane 2, TBFß1, 69% GC) or T. thermophilus HB8 gDNA (lane 3, 2029 bp, 74% GC; lane 4 4988 bp, 74% GC). Lane M contains a pHY molecular size marker.

1. 0.5 kb2. 1 kb3. 2 kb4. 4 kb5. 8 kb6. 15 kb7. 20 kb8. 30 kb9. 40 kb

1. TP53 0.5 kb2. DCLRE1A 1 kb3. DCLRE1A 2 kb4. DCLRE1A 4 kb5. Beta-globin 8.5 kb6. Beta-globin 15 kb7. Beta-globin 20 kb8. Beta-globin 24 kb9. Beta-globin 27 kb10. Beta-globin 30 kb

1. Dystrophin 1 kb2. Dystrophin 2 kb3. CCND2 2.8 kb4. TFR 4 kb5. Dystrophin 6 kb6. Dystrophin 8 kb7. Dystrophin 12 kb8. Dystrophin 13.5 kb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 M

Human genomic DNA Lambda DNA cDNA

I n - F u s i o n ® H D C l o n i n g P l u s

2

Results






Methods




Results



Conclusions







M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 MM 1 2 3 4 M








M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 M



2

Results






Methods




Results



Conclusions







M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 MM 1 2 3 4 M








M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 M



정확함과 편리함의 조화 In-Fusion ® HD Cloning

Any vector, any insert • 제한효소 사이트 관계 없이 원하는 위치에 cloning 가능

• Subcloning 필요 없이 final vector로 cloning 가능

짧고 간편한 실험

• Insert의 A-tailing, 제한효소, alkaline phosphatase, ligase 처리가 불필요

In-Fusion 반응시간 → 단 50 ℃, 15 min <단, Drydown type은 37 ℃, 15 min, 50 ℃, 15 min>

• 한번의 실험으로 multi-fragment cloning이나 point mutation 제작 가능

뛰어난 cloning 효율 • 방향성이 유지되는 directional cloning이 가능하며, false positive의 확률이 낮음

단백질 발현용 cloning에 최적 • 추가 염기가 없어 frame shift* 걱정 없음

* DNA sequence 염기 추가로 아미노산 배열이 변화되어 mutation이 생기는 현상

タカラバイオ　クローニングハンドブック7

操作方法の要

↓③インサ〡トDNAをPCR 幅する。　（Advantage® HD Polymerase Mixを用いた場合）

１．ベクタ〡およびインサ〡トDNAの調製

①使用するベクターとクローニング部位を決定し、理または　インバ〡スPCR によりベクタ〡を化する。　　　　　　　　　　　　　　… 化ベクター溶液［A］ ↓②インサ〡トDNAのPCR 幅のためのIn-Fusion Primerを設計する。

5 × Advantage HD Bu er（Mg2+） dNTP Mixture（2.5 mM each） FW Primer/RV Primer 各0. 2～0.3Advantage® HD Polymerase（2.5 units/μl ） 0.2Template 20Sterile deionized H2O up to 2

In-Fusion酵素は、各DNA 片の末端15 基の相同配列を認識してこれを融合させます。このため目的インサートをPCR 幅する場合には、使用する化ベクターの末端配列に相同な15 基を、配列特異的プライマ〡の5'末端に付加することがポイントです。上のように線化

ベクターの末端形に合わせて、In-Fusion Primerを設計してください。なお、In-Fusion Cloning反は産物のA-overhangの有無による影響を受けないため、PCR 物のA-overhangを考慮する必要はありません。

（プロトコ〡ルの詳細については必ず書を確認してください。）

便利なオンラインサポ〡トツ〡ル、「 In-Fusionプライマ〡設（In-Fusion Primer Design Tool ）」をご利用ください。　　http://bioinfo.clontech.com/infusion /

！プライマ〡設計用ウェブツール

98℃ 10 sec.55℃ 5 sec. または15 sec. 　　30 cycles72℃ 1 min/kb

ベクター末端が5'突出の場合

Forward Primer5'-NNNNNNNNNNNNNNN

5'-… NNNNNNNNNNN3'-… NNNNNNNNNNNNNNN



5'-… NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3'-… NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

ベクター末端が平滑の場合


5'-… NNNNNNNNNNNNNNN3'-… NNNNNNNNNNNNNNN

… -3'NNNNNNNNNNNNNNN… -5'NNNNNNNNNNN

-5'NNNNNNNNNNNNNNNReverse Primer

… -3'NNNNNNNNNNNNNNN… -5'NNNNNNNNNNNNNNN


… -3'… -5'


上述の基を15 の相同配列としてえます。

インサートDNAを幅するための特異的な配列を追加

In-Fusion Primer 디자인

In-Fusion Primer 디자인 온라인 사이트 : http://bioinfo.clontech.com/infusion/

Advantage HD Polymerase Mix (Code 639241) 는 최고의 fidelity와 높은 증폭 효율로 cloning하고자 하는 목적 유전자의 증폭

은 물론 vector의 선형화에도 추천한다. 또한 긴 단편 증폭용 high fidelity PCR 효소인 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Code

R050A)를 이용하면 6kb 이상의 유전자를 효율적으로 증폭할 수 있다.

In-Fusion 반응은 목적 DNA(insert)를 PCR 증폭한 후 별도의 제한효소 처리 과정 없이 vector와 In-Fusion 효소를 첨가하여 50℃

에서 15분간 반응하면 insert와 vector의 15bp 상동서열이 융합된다(EcoDry type 반응 시간 : 37℃, 15분+50℃, 15분).

www.takara.co.kr I Tel. 02.2081.2510 I [email protected]

기존 Cloning 법 vs In-Fusion Cloning 법


操作方法の要




5 × Advantage HD Bu er（Mg2+） 5 μdNTP Mixture（2.5 mM each） 2 μFW Primer/RV Primer 各0. 2～0.3 μMAdvantage® HD Polymerase（2.5 units/μl ） 0.25 μlTemplate 200 ngSterile deionized H2O up to 25 μl




便利なオンラインサポ〡トツ〡ル、「 In-Fusionプライマ〡設計サ（In-Fusion Primer Design Tool ）」をご利用ください。　　http://bioinfo.clontech.com/infusion /
















… -3'… -5'




Insert DNA를 증폭하기 위한

목적유전자의 primer 서열

Vector 말단이

P


rimer 3’ 부분 디자인(Gene-Specific Sequence)

•18 – 25 bp

•GC함량 = 40 – 60%

•Tm = 58 - 65 ℃

* 세부 사항 매뉴얼 참조

5’ 돌출인 경우

Vector 말단이

평활인 경우


操作方法の要
























… -3'… -5'





操作方法の要




5 × Advantage HD Bu er（Mg2+） dNTP Mixture（2.5 mM each） FW Primer/RV Primer 各0. 2～0.3Advantage® HD Polymerase（2.5 units/μl ） 0.2Template 20Sterile deionized H2O up to




















… -3'… -5'





操作方法の要
























… -3'… -5'



























… -3'… -5'





　　　　　　　　　　　　　　… 化ベクター溶液［A］ ↓②インサ〡トDNAのPCR 幅のためのIn-Fusion Primerを設計する。




















… -3'… -5'




Vector 말단이



操作方法の要




5 × Advantage HD Bu er（Mg2+） 5 μ ldNTP Mixture（2.5 mM each） 2 μ lFW Primer/RV Primer 各0. 2～0.3 μMAdvantage® HD Polymerase（2.5 units/μl ） 0.25 μlTemplate 200 ngSterile deionized H2O up to 25 μl




便利なオンラインサポ〡トツ〡ル、「 In-Fusionプライマ〡設計サイ（In-Fusion Primer Design Tool ）」をご利用ください。　　http://bioinfo.clontech.com/infusion /
















… -3'… -5'




위의 염기를 15 개의 상동 염기서열로 계산합니다.

タカラバイオ　クローニングハンドブック 7

原理と特長

操作方法の要

↓③インサ〡トDNAをPCR幅する。　（Advantage

® HD Polymerase Mix


①使用するベクターとクローニング部位を決定し、理または　インバ〡スPCRによりベクタ〡を化する。　　　　　　　　　　　　　　…化ベクター溶液［A］ ↓②インサ〡トDNAのPCR幅のためのIn-Fusion Primerを設計する。

5 × Advantage HD Buer （MgdNTP Mixture（2.5 mM each）FW Primer/RV Primer Advantage

® HD Polymerase（2.

Template Sterile deionized H2O

●インサートの種類、クローニング部位、ベクターを選ばずディレクショナルにクローニング●短鎖から長鎖（50 bp～15 kb）までよくクローニング可能●１回の反で、DNA片の同時クローニングも可能●In-Fusionはわずか15分で完了

①In-Fusion酵素は、DNA片の末端1ため、ベクター上のクロ〡ニングしたい位相補的な配列を付加したプライマ〡で目

②制限酵素理またはインバースPCR①のPCR産物

※とIn-Fusion酵素を混

※非特異的な幅がある場合にはバンドの場合はCloning Enhancer

③50℃15分のIn-Fusion反によりシーが完了

In-Fusion酵素は、各DNA片の末端15基の相同配列を認識してこれを融合させます。このため目的インサートをPCR幅する場合には、使用する化ベクターの末端配列に相同な15基を、配列特異的プライマ〡の5'末端に付加することがポイントです。上のように線化

ベクターの末端形に合わせて、In-Fusion Primerを設計してください。なお、In-Fusion Cloning反は産物のA-overhangの有無による影響を受けないため、PCR物のA-overhangを考慮する必要はありません。


便利なオンラインサポ〡トツ〡ル、「In-（In-Fusion Primer Design Tool　　http://bioinfo.clontech.com

！プライマ〡設計用ウェ

5 × In-Fusion HD Enzyme & dH2O

①

②

③

PCR

線化ベクター

目的クロ〡ン

In-Fusionキットはクロンテック




5'-…NNNNNNNNNNN3'-…NNNNNNNNNNNNNNN



5'-…NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3'-…NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN



5'-…NNNNNNNNNNNNNNN3'-…NNNNNNNNNNNNNNN

…-3' NNNNNNNNNNNNNNN…-5' NNNNNNNNNNN

-5' NNNNNNNNNNNNNNNReverse Primer

…-3' NNNNNNNNNNNNNNN…-5' NNNNNNNNNNNNNNN


…-3'…-5'


上述の基を15の相同配列としてえます。



In-Fusion クローニング

原理と特長

操作方法の要






® HD Polymerase（2


相同配列を融合させることでクローニングのベクタ〡の末端配列を利用してクローニベクターが使用でき、余分な配列が一切クロ〡ニングを行うことができる優れた手法


①In-Fusion酵素は、DNA片の末端1ため、ベクター上のクロ〡ニングしたい相補的な配列を付加したプライマ〡で目








便利なオンラインサポ〡トツ〡ル、「（In-Fusion Primer Design Tool　　http://bioinfo.clontech.com

！プライマ〡設計用ウ


①

②

③

PCR

線化ベクター

目的クロ〡ン
















…-3'…-5'





原理と特長

操作方法の要








ClontechのIn-Fusion酵素を用いてDNA相同配列を融合させることでクローニングのベクタ〡の末端配列を利用してクローニベクターが使用でき、余分な配列が一切クロ〡ニングを行うことができる優れた手法













①

②

③

PCR

線化ベクター

目的クロ〡ン
















…-3'…-5'




1일

2일

In-Fusion Cloning 법

PCR 증폭

증폭 확인

In-Fusion 반응 : 15 분

Transformation

Insert 확인

기존 Cloning 법< 제한효소 처리 방법 >

1일

2일

3일

PCR 증폭

증폭 확인

증폭 산물 정제

제한효소처리 및 정제

Vector선형화 및 dephosphorylation

Ligation

Transformation

Insert 확인

시간과 노력 절감 !

0 5 10 15 20 25 30

~19h

~28h

In-Fusion 법

기존 Cloning법


操作方法の要
























… -3'… -5'




!

35

TA cloning에서 In-Fusion cloning까지

タカラバイオ　クローニング実験ハンドブック7 タカラバイオ　クローニング実験ハンドブック 8

In-Fusion クローニングIn-Fusion クローニング（続）

原理と特長

操作方法の概要 ↓③インサートDNAをPCR増幅する。　（Advantage® HD Polymerase Mixを用いた場合）

１．線状化ベクターおよびインサートDNAの調製①使用するベクターとクローニング部位を決定し、制限酵素処理または　インバースPCRによりベクターを線状化する。　　　　　　　　　　　　　　…線状化ベクター溶液［A］ ↓②インサートDNAのPCR増幅のためのIn-Fusion Primerを設計する。

↓②インサートDNA溶液［B］とする。

2.アガロースゲル電気泳動でPCR増幅産物を確認

3. In-Fusion Cloning反応

①電気泳動の結果に応じて、以下のようにインサートDNAを処理する。

5.インサートチェックPCR、培養、プラスミド精製　インサートチェックPCRは5ページを、プラスミド精製は10ページを参照

5 × Advantage HD Buffer（Mg2+） 5 μldNTP Mixture（2.5 mM each） 2 μlFW Primer/RV Primer 各0.2～0.3 μMAdvantage® HD Polymerase（2.5 units/μl） 0.25 μlTemplate 200 ngSterile deionized H2O up to 25 μl

5 × In-Fusion® HD Enzyme Premix 2 μl線状化ベクター［A］ x μl精製済／CE処理済みPCR断片［B］ y μldH2O up to 10 μl

●増幅産物に非特異的な増幅が認められた場合：　目的バンドのみを切り出し、NucleoSpin® Extract IIを用いて　スピンカラム精製を行う。　　　　●増幅産物がシングルバンドの場合はCloning Enhancer　処理を推奨：

PCR反応液 5 μlCloning Enhancer 2 μｌ

50℃、15分反応→氷上静置　

【関連製品リスト】製品名

In-Fusion® HD Cloning Kit w/Cloning Enhancer※

In-Fusion® HD Cloning Kit w/NucleoSpin®※

In-Fusion® HD Cloning Kit w/Competent Cells※

In-Fusion® HD Cloning System CE※

In-Fusion® HD Cloning System※

In-Fusion® HD Cloning Kit※

In-Fusion® HD EcoDry™ Cloning Kit※

容量

10回

10回

10回

10回

10回

10回

8回

製品コード

639633

639639

639642

639636

639645

639648

639689

価格（税別）

¥22,000

￥24,000

￥36,000

￥37,000

￥39,000

￥21,000

￥21,000

ClontechのIn-Fusion酵素を用いてDNA断片同士の末端15塩基の相同配列を融合させることでクローニングを行います。使用する任意のベクターの末端配列を利用してクローニングを行うため、あらゆるベクターが使用でき、余分な配列が一切付加されず、しかも定方向クローニングを行うことができる優れた手法です。

●インサートの種類、クローニング部位、ベクターを選ばずディレクショナルにクローニング●短鎖から長鎖（50 bp～15 kb）まで効率よくクローニング可能●１回の反応で、複数DNA断片の同時クローニングも可能●In-Fusion反応はわずか15分で完了

①In-Fusion酵素は、DNA断片の末端15塩基の相同配列を融合するため、ベクター上のクローニングしたい位置の両側15塩基とそれぞれ相補的な配列を付加したプライマーで目的遺伝子をPCR増幅する。

②制限酵素処理またはインバースPCRにより線状化ベクターを用意し、①のPCR産物※とIn-Fusion酵素を混合する。

※非特異的な増幅がある場合にはスピンカラム精製を、シングルバンドの場合はCloning Enhancer処理を行って使用してください。

③50℃15分のIn-Fusion反応によりシームレスかつ定方向にクローニングが完了

In-Fusion酵素は、各DNA断片の末端15塩基の相同配列を認識してこれを融合させます。このため目的インサートをPCR増幅する場合には、使用する線状化ベクターの末端配列に相同な15塩基を、配列特異的プライマーの5’末端に付加することがポイントです。上図のように線状化ベクターの末端形状に合わせて、In-Fusion Primerを設計してください。なお、In-Fusion Cloning反応は増幅産物のA-overhangの有無による影響を受けないため、PCR増幅産物のA-overhangを考慮する必要はありません。

（プロトコールの詳細については必ず取扱説明書を確認してください。）

便利なオンラインサポートツール、「In-Fusionプライマー設計サイト（In-Fusion Primer Design Tool）」をご利用ください。　　http://bioinfo.clontech.com/infusion/

PCR産物がシングルバンドの場合に増幅産物をそのままIn-Fusion反応に用いるための前処理試薬。この処理により、PCRに使用したプライマーや鋳型プラスミド、dNTPの影響を受けず、In-Fusion酵素が最大のパフォーマンスを示すことができる。

！プライマー設計用ウェブツール

In-Fusion Cloningならマルチクローニングも効率よく行うことができます。各1 kbのDNA断片をIn-Fusion® HD Cloning Kitを用いてクローニングし、コロニーPCRによりインサートを確認したところ、10クローン中7クローンで正しい挿入が確認できました。

！複数DNA断片のマルチクローニング37℃ 15分→80℃ 15分

4.大腸菌への形質転換Stellar™ Competent Cells（製品コード 636763）やE. coli HST08 Premium Competent Cells （製品コード 9128）など、形質転換効率が1×108 cfu/μgプラスミドDNA以上のコンピテントセルの使用を推奨します。

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※プレミックス済み液体タイプのIn-Fusion HDには、上記のほか、50回包装と100回包装があります。

In-Fusion® HD添付製品

Cloning Enhancer

※In-Fusion® HD EcoDryTM Cloning Kitは、凍結乾燥タイプ（室温、デシケーター内保存可能）のIn-Fusion® HDキットです。マイクロチューブに分注済みのため直ちに使用することができます。24回タイプ（8連チューブ×3本）、96回タイプ

（96ウェルプレート）もあります。

NucleoSpin® Extract II

高い形質転換能を持つコンピテントセル。長鎖プラスミドDNAの形質転換においても高い効率が得られ、同様の遺伝子型を持つ他のコンピテントセルと比較してコロニー形成速度が速い。pUC系プラスミドでの形質転換の際には、β-ガラクトシダーゼのα-相補性を利用し、X-Gal添加による組換え体の青／白選別を行うことができる。

Stellar™ Competent Cells

Cloning Enhancer

NucleoSpin® Extra

ct II

Stellar™ Competent Cell

添付製品


①

②

③

PCR線状化ベクター

目的クローン

形質転換コロニー数 415正しい形質転換体の割合 7/10

目的クローン

Fragment 1Fragment 2

線状化ベクター

Fragment 3

In-Fusionキットはクロンテック社の製品です。


ベクター末端が5’突出の場合

Forward Primer5’- NNNNNNNNNNNNNNN

5’-… NNNNNNNNNNN3’-… NNNNNNNNNNNNNNN



5’-… NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3’-… NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN



5’-… NNNNNNNNNNNNNNN3’-… NNNNNNNNNNNNNNN

…-3’NNNNNNNNNNNNNNN…-5’NNNNNNNNNNN

-5’NNNNNNNNNNNNNNNReverse Primer

…-3’NNNNNNNNNNNNNNN…-5’NNNNNNNNNNNNNNN


…-3’…-5’


上述の塩基を15塩基の相同配列として数えます。

インサートDNAを増幅するための特異的な配列を追加

PCR産物が複数バンドの場合にゲル精製を行うスピンカラム

Linearized

Vector

목적 Clone

In-Fusion Cloning

Clontech의 In-Fusion Cloning 기술은 In-Fusion 효소를 이용해 DNA 단편간의 말단 15 base의 상동서열을 fusion 시켜 cloning 하는 기술이다. 사용하는

vector의 말단 서열을 이용하여 cloning 하기 때문에 모든 vector를 사용할 수 있으며, 추가로 어떤 서열도 첨가되지 않는다. 양쪽말단의 서열을 인식하므로 방향

성 있는 cloning이 가능하다.

원리와 특징

•• Insert 종류, cloning 부위, vector에 구애받지 않는 directional cloning

•• 짧은 단편부터 긴 단편(50 bp~15 kb)까지 효율적으로 cloning 가능

•• 1회의 반응으로 여러 DNA 단편을 동시에 cloning 가능

•• In-Fusion 반응 시간은 불과 15 분

① In-Fusion 효소는 DNA 단편의 말단 15 base의 상동서열

을 이용하여 fusion 시키기 때문에 vector의 cloning할 위치

의 양측 15 base와 각각 상보적인 서열을 부가한 primer로

목적 유전자를 PCR 증폭한다.

② 제한효소 처리 또는 inverse PCR에 의해 linear vector를

준비하여, ①의 PCR 산물※과 In-Fusion 효소를 혼합한다. ※. 비특이적인 증폭이 있는 경우에는 spin column 정제를,

single band의 경우는 Cloning Enhancer로 처리해서 사

용한다.

③ In-Fusion 반응(50℃, 15 분): directional cloning 완료

[실험방법]

(상세한 프로토콜은 반드시 제품의 사용설명서를 확인해 주세요)

1. Linear Vector 와 Insert DNA의 조제

①. 사용하는 vector와 cloning 부위를 결정해 제한효소 처리 또는

inverse PCR로 vector를 선형화한다. : linear vector 용액 ［A］

② Insert DNA의 PCR 증폭을 위한 In-Fusion Primer를 설계한다

In-Fusion 효소는 각 DNA 단편 말단 15 base의 상동 서열을 인식해

fusion 시킨다. 그러므로 insert를 PCR로 증폭할 때 사용하는 primer의 5’

말단에 linear vector의 말단 서열과 상동의 15 base를 추가하는 것이 핵

심이다. 위의 그림과 같이 linear vector의 말단 서열에 맞춰서 In-Fusion

Primer를 설계해야 한다. 덧붙여 In-Fusion Cloning 반응은 TA Cloning

과 달리 증폭 산물의 A-overhang의 유무에 의한 영향을 받지 않기 때문

에 PCR 증폭 산물의 A-overhang을 고려하지 않아도 된다.

③ Insert DNA를 PCR 증폭한다.

CloneAmp HiFi PCR Premix를 이용했을 경우

CloneAmp HiFi PCR Premix 12.5 ㎕

FW Primer/RV Primer 각 0.2~0.3 μM

주형 < 100 ng

dH2O up to 25 ㎕

98℃ 10 sec.

55℃ 5 sec. (또는 15 sec.) 　　 30 ~ 35 cycles

72℃ 5 sec/kb

タカラバイオ　クローニング実験ハンドブック7 タカラバイオ　クローニング実験ハンドブック 8

In-Fusion クローニングIn-Fusion クローニング（続）

原理と特長

操作方法の概要 ↓③インサートDNAをPCR増幅する。　（Advantage® HD Polymerase Mixを用いた場合）

１．線状化ベクターおよびインサートDNAの調製①使用するベクターとクローニング部位を決定し、制限酵素処理または　インバースPCRによりベクターを線状化する。　　　　　　　　　　　　　　…線状化ベクター溶液［A］ ↓②インサートDNAのPCR増幅のためのIn-Fusion Primerを設計する。

↓②インサートDNA溶液［B］とする。

2.アガロースゲル電気泳動でPCR増幅産物を確認

3. In-Fusion Cloning反応

①電気泳動の結果に応じて、以下のようにインサートDNAを処理する。

5.インサートチェックPCR、培養、プラスミド精製　インサートチェックPCRは5ページを、プラスミド精製は10ページを参照

5 × Advantage HD Buffer（Mg2+） 5 μldNTP Mixture（2.5 mM each） 2 μlFW Primer/RV Primer 各0.2～0.3 μMAdvantage® HD Polymerase（2.5 units/μl） 0.25 μlTemplate 200 ngSterile deionized H2O up to 25 μl

5 × In-Fusion® HD Enzyme Premix 2 μl線状化ベクター［A］ x μl精製済／CE処理済みPCR断片［B］ y μldH2O up to 10 μl

●増幅産物に非特異的な増幅が認められた場合：　目的バンドのみを切り出し、NucleoSpin® Extract IIを用いて　スピンカラム精製を行う。　　　　●増幅産物がシングルバンドの場合はCloning Enhancer　処理を推奨：

PCR反応液 5 μlCloning Enhancer 2 μｌ

50℃、15分反応→氷上静置　

【関連製品リスト】製品名

In-Fusion® HD Cloning Kit w/Cloning Enhancer※

In-Fusion® HD Cloning Kit w/NucleoSpin®※

In-Fusion® HD Cloning Kit w/Competent Cells※

In-Fusion® HD Cloning System CE※

In-Fusion® HD Cloning System※

In-Fusion® HD Cloning Kit※

In-Fusion® HD EcoDry™ Cloning Kit※

容量

10回

10回

10回

10回

10回

10回

8回

製品コード

639633

639639

639642

639636

639645

639648

639689

価格（税別）

¥22,000

￥24,000

￥36,000

￥37,000

￥39,000

￥21,000

￥21,000

ClontechのIn-Fusion酵素を用いてDNA断片同士の末端15塩基の相同配列を融合させることでクローニングを行います。使用する任意のベクターの末端配列を利用してクローニングを行うため、あらゆるベクターが使用でき、余分な配列が一切付加されず、しかも定方向クローニングを行うことができる優れた手法です。

●インサートの種類、クローニング部位、ベクターを選ばずディレクショナルにクローニング●短鎖から長鎖（50 bp～15 kb）まで効率よくクローニング可能●１回の反応で、複数DNA断片の同時クローニングも可能●In-Fusion反応はわずか15分で完了

①In-Fusion酵素は、DNA断片の末端15塩基の相同配列を融合するため、ベクター上のクローニングしたい位置の両側15塩基とそれぞれ相補的な配列を付加したプライマーで目的遺伝子をPCR増幅する。

②制限酵素処理またはインバースPCRにより線状化ベクターを用意し、①のPCR産物※とIn-Fusion酵素を混合する。

※非特異的な増幅がある場合にはスピンカラム精製を、シングルバンドの場合はCloning Enhancer処理を行って使用してください。

③50℃15分のIn-Fusion反応によりシームレスかつ定方向にクローニングが完了

In-Fusion酵素は、各DNA断片の末端15塩基の相同配列を認識してこれを融合させます。このため目的インサートをPCR増幅する場合には、使用する線状化ベクターの末端配列に相同な15塩基を、配列特異的プライマーの5’末端に付加することがポイントです。上図のように線状化ベクターの末端形状に合わせて、In-Fusion Primerを設計してください。なお、In-Fusion Cloning反応は増幅産物のA-overhangの有無による影響を受けないため、PCR増幅産物のA-overhangを考慮する必要はありません。

（プロトコールの詳細については必ず取扱説明書を確認してください。）

便利なオンラインサポートツール、「In-Fusionプライマー設計サイト（In-Fusion Primer Design Tool）」をご利用ください。　　http://bioinfo.clontech.com/infusion/

PCR産物がシングルバンドの場合に増幅産物をそのままIn-Fusion反応に用いるための前処理試薬。この処理により、PCRに使用したプライマーや鋳型プラスミド、dNTPの影響を受けず、In-Fusion酵素が最大のパフォーマンスを示すことができる。

！プライマー設計用ウェブツール

In-Fusion Cloningならマルチクローニングも効率よく行うことができます。各1 kbのDNA断片をIn-Fusion® HD Cloning Kitを用いてクローニングし、コロニーPCRによりインサートを確認したところ、10クローン中7クローンで正しい挿入が確認できました。

！複数DNA断片のマルチクローニング37℃ 15分→80℃ 15分

4.大腸菌への形質転換Stellar™ Competent Cells（製品コード 636763）やE. coli HST08 Premium Competent Cells （製品コード 9128）など、形質転換効率が1×108 cfu/μgプラスミドDNA以上のコンピテントセルの使用を推奨します。

��

� ��

�

※プレミックス済み液体タイプのIn-Fusion HDには、上記のほか、50回包装と100回包装があります。

In-Fusion® HD添付製品

Cloning Enhancer

※In-Fusion® HD EcoDryTM Cloning Kitは、凍結乾燥タイプ（室温、デシケーター内保存可能）のIn-Fusion® HDキットです。マイクロチューブに分注済みのため直ちに使用することができます。24回タイプ（8連チューブ×3本）、96回タイプ

（96ウェルプレート）もあります。

NucleoSpin® Extract II

高い形質転換能を持つコンピテントセル。長鎖プラスミドDNAの形質転換においても高い効率が得られ、同様の遺伝子型を持つ他のコンピテントセルと比較してコロニー形成速度が速い。pUC系プラスミドでの形質転換の際には、β-ガラクトシダーゼのα-相補性を利用し、X-Gal添加による組換え体の青／白選別を行うことができる。

Stellar™ Competent Cells

Cloning Enhancer

NucleoSpin® Extra

ct II

Stellar™ Competent Cell

添付製品


①

②

③

PCR線状化ベクター

目的クローン

形質転換コロニー数 415正しい形質転換体の割合 7/10

目的クローン


線状化ベクター

Fragment 3

In-Fusionキットはクロンテック社の製品です。




5’-… NNNNNNNNNNN3’-… NNNNNNNNNNNNNNN



5’-… NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3’-… NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN



5’-… NNNNNNNNNNNNNNN3’-… NNNNNNNNNNNNNNN

…-3’NNNNNNNNNNNNNNN…-5’NNNNNNNNNNN


…-3’NNNNNNNNNNNNNNN…-5’NNNNNNNNNNNNNNN


…-3’…-5’


上述の塩基を15塩基の相同配列として数えます。

インサートDNAを増幅するための特異的な配列を追加

PCR産物が複数バンドの場合にゲル精製を行うスピンカラム

Insert DNA을 증폭하기 위해

목적유전자의 primer 서열추가

Vector 말단이


Vector 말단이

평활인 경우

Vector 말단이



!Primer 디자인 온라인 사이트

편리한 In-Fusion primer 디자인 사이트

(In-Fusion Primer Design Tool)를 이용하십시오.

다카라코리아 홈페이지 또는 Clontech 홈페이지 참조


操作方法の要
























… -3'… -5'














操作方法の要
























… -3'… -5'






Vector 말단이

P



•18 – 25 bp

•GC함량 = 40 – 60%

•Tm = 58 - 65 ℃



Vector 말단이

평활인 경우


操作方法の要
























… -3'… -5'





操作方法の要
























… -3'… -5'





操作方法の要
























… -3'… -5'



























… -3'… -5'

























… -3'… -5'




Vector 말단이



操作方法の要
























… -3'… -5'






原理と特長

操作方法の要




















①

②

③

PCR

線化ベクター

目的クロ〡ン
















…-3'…-5'






原理と特長

操作方法の要





















①

②

③

PCR

線化ベクター

目的クロ〡ン
















…-3'…-5'





原理と特長

操作方法の要





















①

②

③

PCR

線化ベクター

目的クロ〡ン
















…-3'…-5'




1일

2일


PCR 증폭

증폭 확인


Transformation

Insert 확인


1일

2일

3일

PCR 증폭

증폭 확인




Ligation

Transformation

Insert 확인


0 5 10 15 20 25 30

~19h

~28h

In-Fusion 법

기존 Cloning법


操作方法の要
























… -3'… -5'




!


操作方法の要
























… -3'… -5'














操作方法の要
























… -3'… -5'






Vector 말단이

P



•18 – 25 bp

•GC함량 = 40 – 60%

•Tm = 58 - 65 ℃



Vector 말단이

평활인 경우


操作方法の要
























… -3'… -5'





操作方法の要
























… -3'… -5'





操作方法の要
























… -3'… -5'



























… -3'… -5'

























… -3'… -5'




Vector 말단이



操作方法の要
























… -3'… -5'






原理と特長

操作方法の要




















①

②

③

PCR

線化ベクター

目的クロ〡ン
















…-3'…-5'






原理と特長

操作方法の要





















①

②

③

PCR

線化ベクター

目的クロ〡ン
















…-3'…-5'





原理と特長

操作方法の要





















①

②

③

PCR

線化ベクター

目的クロ〡ン
















…-3'…-5'




1일

2일


PCR 증폭

증폭 확인


Transformation

Insert 확인


1일

2일

3일

PCR 증폭

증폭 확인




Ligation

Transformation

Insert 확인


0 5 10 15 20 25 30

~19h

~28h

In-Fusion 법

기존 Cloning법


操作方法の要
























… -3'… -5'




!

* 다카라코리아 홈페이지에서 on-line tool을 이용하세요.

In-Fusion® HD Cloning Plus 구성품

02 03

Ligation을 한번에 In-Fusion® Enzyme• 기능 양 말단에 상동서열을 지닌 vector와 insert를 반응시켜 3’ 말단부터 염기를 제거하고, end-joining 특성을 이용하여 DNA 단편을 ligation 함

Cloning 효율을 높이는 방법 = 완벽한 정제

NucleoSpin® / Cloning Enhancer (별도 구매시 Code 639613)

• NucleoSpin® PCR product (multiple bands, single band)에 따라 gel extraction과 PCR clean-up 방법을 선택하여 사용 가능

• Cloning Enhancer Template DNA나 PCR 잔여물을 제거하며, single band 일 경우에만 사용 가능

(정제 과정이 없어 시료의 손실이 없으므로 적은 양의 PCR product에 추천)

★ NucleoSpin® 별도 구매 불가. TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (Code 9762A) 사용을 추천함.

도입 효율이 높은 Competent Cells = 실험 성공의 지름길

StellarTM Competent Cells (별도 구매시 Code 636763)

High-Quality Competent Cells for All Your Cloning Needs…continued

Figure 2. Comparison of transformation effi ciencies using ligation reaction mixtures.

2.0 x 107

>1.0 x 108 >1.0 x 108 >1.0 x 109

1.0 x 107

0Stellar DH5 DH10B

Co

lony

form

ing

un

its

(CFU

)

2 kb

20 kb

COA transformation efficiency (cfu/μg pUC19 DNA)

.oN .taC eziS tcudorP

Stellar Competent Cells 10 x 100 μl 636763

Stellar Competent Cells 50 x 100 μl 636766

Stellar Competent Cells 96-well plate 636767

Te ch n i c a l N o te

Experimental Example 3: A Comparison of Colony Growth Rate on Agar after Transformation

Plasmid DNAs of 2 kb and 10 kb were each used to transform Stellar and DH10B competent cells with similar genetic char-acteristics (including methylation requiring restriction), using the same method as in Experimental Example 1. Photographs of colonies on agar were taken after 15 hours of incubation.

ResultsAfter transforming a 2 kb plasmid into each strain, there was no

erence in the growth rate of transformant colonies between the two strains (Figure 3, Panel A). However, after trans-forming 10 kb plasmids, Stellar colonies clearly showed a faster

cation of transformed colonies after 15 hours (Figure 3, Panel B). It has frequently been observed that the transformation of a large frag-ment slows the growth of some E. coli e Stellar strain, nevertheless, is able to maintain a considerable growth rate,

rmation within the normal incubation time.

Figure 3. Comparison of colony growth rate on agar after transformation.

Transformation of a 2 kb Plasmid

Transformation of a 10 kb Plasmid

ralletSB01HD

StellarDH10B

A

B

Endnote ciencies are provided by vendors as a gauge

of competent cell performance; however, the transformation cacies in real-life experiments may be substantially lower than

those listed. Moreover, ligation reaction mixtures are generally er composition of the

reaction mixture, among other factors, may inhibit transforma- ciency to an inadequate level. It is thus

cult to make an appropriate determination regarding the performance of a competent cell strain based entirely on the

ciency listed in the catalog. As demonstrated in the experimental examples using Stellar Competent Cells, high

ed plasmids and ligation reaction mixtures, making Stellar an excel-lent choice for a variety of cloning projects.

ciency of Stellar Competent ciency of ordinary cloning, but

also increases the percentage of large DNA fragments in cDNA libraries and genomic libraries.

• 높은 형질전환 효율 ( > 5 x 108 cfu / ug)

• Routine cloning은 물론 large fragment cloning에도 최적

• cDNA나 gDNA library 제작에 추천Ligation 후 transformation 효율 비교 ➜

• 높은 정확도 Hot start 효소. 낮은 에러율 (12 mismatched bases per 542,580 total bases)

• 합성 속도 높은 priming 효율, 빠른 extension 시간 (5 sec / kb)

• 적용성 GC-rich templates 적용 가능. 최대 10 kb까지 합성 가능

• 편리함 2X premix type

★ 10 kb 이상 DNA 단편 증폭에는 PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase (Code R050A) 사용을 추천함.

정확도 높은 High Fidelity PCR 효소

CloneAmpTM HiFi PCR Premix(별도 구매시 Code 639298)

PCR 효소 정확도 비교 ➜

2

Results






Methods




Results



Conclusions







M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 MM 1 2 3 4 M








M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 M



2

Results






Methods




Results



Conclusions







M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 MM 1 2 3 4 M








M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 M



2

Results






Methods




Results



Conclusions







M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 MM 1 2 3 4 M








M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 M



Application

A Takara Bio Company

www.clontech.com

Clontech Laboratories, Inc.

C l o n i n g & C o m p e t e n t C e l l s

In-Fusion® Multiple Fragment CloningIn-Fusion Cloning Kits make multiple insert cloning just as easy as single insert cloning. Using In-Fusion you can successfully combine multiple frag-ments of DNA in a single reaction without subcloning (1–3). The highly efficient In-Fusion enzyme enables you to obtain hundreds of colonies even when cloning several or large fragments. You can use any vector and clone exactly what you want, where you want it, without adding extra sequence. No additional treatment of the PCR fragments is required (such as restriction digestion, ligation, phosphorylation, or blunt-end polishing). The ability to easily, rapidly and precisely clone many fragments will help revolutionize the way you perform research!

7.13 IN (633222)

United States/Canada: +1.800.662.2566 • Asia Pacific: +1.650.919.7300 • Europe: +33.(0)1.3904.6880 • Japan: +81.(0)77.543.724For Research Use Only. Not for use in diagnostic or therapeutic procedures. Not for resale. Clontech, the Clontech logo, CloneAmp, EcoDry, In-Fusion, and Stellar are trademarks of Clontech Laboratories, Inc. All other marks are the property of their respective owners. Certain trademarks may not be registered in all jurisdictions. ©2013 Clontech Laboratories, Inc.

Newconstruct


Linearizedvector

Fragment 3

1. Linearize your vector by restriction digestion or inverse PCR.

2. Design primers for each fragment that you are cloning into the vector. When designing primers, include 15 bp of overlapping sequence with the adjacent segment or linearized vector. Amplify your fragments for cloning using the appropriately designed primers.

3. Combine all fragments and the linearized vector with the In-Fusion enzyme and incubate. During incubation, the enzyme chews back ds cDNAs creating sticky ends. The In-Fusion enzyme facil-itates joining of complimentary overlapping sequences, thereby creating the desired construct.

4. Transform competent bacteria and screen for clones. Using In-Fusion, even multiple fragment cloning yields >70% correct clones.

A Takara Bio Company

www.clontech.com

Clontech Laboratories, Inc.

C l o n i n g & C o m p e t e n t C e l l s

In-Fusion® Multiple Fragment CloningIn-Fusion Cloning Kits make multiple insert cloning just as easy as single insert cloning. Using In-Fusion you can successfully combine multiple frag-ments of DNA in a single reaction without subcloning (1–3). The highly efficient In-Fusion enzyme enables you to obtain hundreds of colonies even when cloning several or large fragments. You can use any vector and clone exactly what you want, where you want it, without adding extra sequence. No additional treatment of the PCR fragments is required (such as restriction digestion, ligation, phosphorylation, or blunt-end polishing). The ability to easily, rapidly and precisely clone many fragments will help revolutionize the way you perform research!

7.13 IN (633222)

United States/Canada: +1.800.662.2566 • Asia Pacific: +1.650.919.7300 • Europe: +33.(0)1.3904.6880 • Japan: +81.(0)77.543.724For Research Use Only. Not for use in diagnostic or therapeutic procedures. Not for resale. Clontech, the Clontech logo, CloneAmp, EcoDry, In-Fusion, and Stellar are trademarks of Clontech Laboratories, Inc. All other marks are the property of their respective owners. Certain trademarks may not be registered in all jurisdictions. ©2013 Clontech Laboratories, Inc.

Newconstruct


Linearizedvector

Fragment 3

1. Linearize your vector by restriction digestion or inverse PCR.

2. Design primers for each fragment that you are cloning into the vector. When designing primers, include 15 bp of overlapping sequence with the adjacent segment or linearized vector. Amplify your fragments for cloning using the appropriately designed primers.

3. Combine all fragments and the linearized vector with the In-Fusion enzyme and incubate. During incubation, the enzyme chews back ds cDNAs creating sticky ends. The In-Fusion enzyme facil-itates joining of complimentary overlapping sequences, thereby creating the desired construct.

4. Transform competent bacteria and screen for clones. Using In-Fusion, even multiple fragment cloning yields >70% correct clones.

Multi-fragments cloning 복수의 DNA 단편을 1회 반응으로 원하는 clone을 획득 가능

Vector와 각 단편들이 그림과 같이 overlapping 되도록 primer를 디자인 한 후,

이를 증폭하여 insert 준비

복수의 단편과 linearized vector를 In-Fusion enzyme과 반응하여

cloning 완료

★ Screening이나 subcloning에 소요되는 시간을 크게 단축하여 기존보다 빠르게 구축 가능

2

Results






Methods




Results



Conclusions







M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 MM 1 2 3 4 M








M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 M



2

Results






Methods




Results



Conclusions







M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 MM 1 2 3 4 M








M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 M



042-828-6525 고 객 (제품문의) 02-2081-2510

지원센터 [email protected] (대전•충청지역 제품주문)

지역별 전문 대리점

그린비바이오 (주) (서울,인천,경기) 02-2633-7114

(주) 에스앤씨 (서울,인천,경기) 1644-5778

(주) 삼화교역 (전북) 063-227-3700

(주) 진성에스엠알 (광주, 전남) 062-672-7631

(주) 프라임텍 (강원) 033-244-6969

브니엘바이오 (대구, 경북) 053-381-3611

(주) 대한과학 (부산, 울산, 경남) 051-247-2875

이엔바이오 (진주) 055-761-1036

(주) 셀피스 (제주) 064-722-6707

대 전 지 사

In-Fusion® HD Cloning 제품 리스트

Type Code 제품명 용량 Kit PCR 정제 Cells

Liquid

638909 In-Fusion® HD Cloning Plus 10 회 O O NS O

638916 In-Fusion® HD Cloning Plus CE 10 회 O O CE O

639648 In-Fusion® HD Cloning Kit 10 회 O ㅡ ㅡ ㅡ

639642 In-Fusion® HD Cloning Kit w/Competent Cells 10 회 O ㅡ ㅡ O

Drydown*

638912 In-Fusion® HD EcoDry Cloning Plus 8 회 O O NS O

639689 In-Fusion® HD EcoDry Cloning Kit 8 회 O ㅡ ㅡ ㅡ

639678 In-Fusion® HD EcoDry Cloning Kit w/Competent Cells 8 회 O ㅡ ㅡ O

Kit In-Fusion® HD Enzyme과 control (vector, insert) 포함 PCR CloneAmpTM HiFi PCR Premix

NS NucleoSpin® CE Cloning Enhancer Cells StellarTM Competent Cells

Liquid type 용량은 10, 50, 100 회이며, drydown type은 8, 24, (48), 96회로 구성됨.

관련 제품

• 최소 2 ng의 total RNA로 고품질의 cDNA library 제작 가능

• SMARTer® cDNA 합성 기술을 이용하여 full length cDNA를 합성 가능

• Cloning을 위한 제한효소 처리, 말단의 평활 또는 adaptor ligation 등의 과정 불필요

• 어떤 vector에라도 library를 제작 가능

* In-Fusion® enzyme을 동결건조한 제품으로, 1회에 필요한 양만큼 분주되어 있어 대량 실험에 용이함 (실온 보관 가능)

제작이 어려운 cDNA Library도 In-Fusion과 SMARTer가 만나면 간편해진다.

In-Fusion® SMARTer® Directional cDNA Library Construction Kit (Code 634933)

완벽한 Cloning으로가는 완벽한 구성 In-Fusion HD Cloning...

Documents

Transcript of 완벽한 Cloning으로가는 완벽한 구성 In-Fusion HD Cloning...