ELABORACIELABORACIÓÓN DE MEZCLA N DE MEZCLA PARA PCRPARA PCR

Raquel Asunción Lima Cordón

PCR

Polymerase Chain reaction (reacción en cadena de la polimerasa)Sintetizar muchas veces un fragmento de ADNPCR: simulación de lo que sucede en la célula cuando se sintetiza el ADN

PCR

Ingredientes necesarios:PolimerasaADNOligonucleotidos dNTPs (dinucleotidos)

PCR: ingredientes

Oligonucleótidos:

Uno debe tener la misma secuencia del ADN Segundo debe ser complementario a esa secuencia. Forward y reverse

De no ser así, no podría amplificarse el fragmento deseado.

PCR: aplicaciones

Genética de poblaciones

Evolución molecular

Genómica

Medicina forense

PCR: ¿Cómo funciona?

Después de haber preparado la mezcla maestraSe coloca en un termociclador

Calienta o enfría los tubos a tres temperaturas distintas (ciclos de reacción)

95° (desnaturalización)40° - 60° (alineamiento)72° (extensión)

PCR: desnaturalización

Dobles cadenas de ADN se abren.

Se forman y se rompen constantemente los puentes de H entre los oligonucleótidos y el ADN

Uniones más estables durarán mas tiempoPolimerasa se une al fragmento de ADN de doble

cadena : 5´→ 3´

PCR: alineamiento

PCR: extensión

Polimerasa alcanza su máxima actividadContinúa la sintesis de los fragmentos de ADN

TIPOS DE TECNICAS

RAPDs, AFLPs, RFLPsTener claro el tipo de información que necesitamos Las técnicas se pueden dividir en dos categorías

PCRs para la amplificación de un solo sitio conocido del genomaPCRs en los que no es necesario conocer la región que se está amplificando.

•

PCRs para la amplificación de un solo sitio conocido del genomaRequieren conocer la secuencia que se trabajaCon este tipo es posible hacer filogeniasLos datos pueden obtenerse de:

Geles que detectan cambios hasta de una sola base SSCPUtilizando enzimas de restricción

•

PCRs en los que no es necesario conocer la región que se está

amplificando.

Se desconoce el tamaño del fragmento (s)Se utilizan para determinar polimorfismo genómicoUtiliza un solo oligonucleotido con 2 características

Pequeño a mediano (6 -18 pb)Secuencia esté presente muchas veces en el ADN

¿Qué

se necesita para hacer un PCR?

Polimerasa comercial (acompañada de un buffer o amortiguador)MgCl2 (cloruro de magnesio) Oligonucleótidos Agua (debe tener pocas sales, bidestilada)Tubos (0.2 – 0.5 ml) y puntas (libres de ARNasas y ADNasas)Termociclador

HACIENDO PCR

ANTES DE EMPEZARPreparar todos los reactivos en alícuotas congeladas (-20° C)

CONDICIONES DEL PCREmpezar con las mismas condiciones que se hayan reportado para el oligonucleótido que se estáutilizando.Realizar pruebas con pocas muestras antes de utilizar todas las muestras de estudio.

Concentración inicial

Concentración final en la reacción

Cantidad para un tubo

Cantidad para 10 tubos

dNTPs 10 mM 200μM varía de acuerdo al magnesio

1 μl 10 μl

Magnesio 25mM 1.5mM puede probarse de 1 a 4 mM

3 μl 30 μl

Oligo forward

10 μM 1μM puede probarse de 0.1 a 1 μM

5 μl 50 μl

Oligo reverse

10 μM 1μM puede probarse de 0.1 a 1 μM

5 μl 50 μl

Enzima 5U/μl 1U 0.2 μl 2 μl

Buffer 10X 1X 5 μl 50 μl

Agua - - 29.8 μl 298 μl

ADN 0.1mg/ml 0.1 mg genómico 11 μl -

TEMPERATURAS Y CICLOS

Buscar artículos que hayan trabajado con el organismo de interés. Si no hay o bien no funciona se puede probar lo siguiente

Desnaturalización inicial: 95°C por 5 – 10 mins30 ciclos con desnaturalización a 95 °C (30 s), alineamiento a 50 °C (30 s) y extensión a 72 °C por tiempo variable. Extension final 72 °C 10 mins4 °C

LA TEMPERATURA DE ALINEAMIENTOPuede modificarse si el PCR aun no funciona. Se puede calcular la Tm (melting temperature) de cada oligo

Varia de la cantidad de dobles o triples enlaces de H

http://insilico.ehu.es/tm.php

¿Qué

hacer cuando todo empieza a fallar?

¿Cuál es la calidad del ADN que tenemos?

ADN contaminado con proteínas que inhiben la reacción de PCRADN esté degradado: correr una pequeña muestra de ADN en un gel.

En la extracción ocurre lo siguiente

Rompe tejido: detergente (SDS o CTAB), si quedan restos de SDS la reacción se inhibe. Puede neutralizarse utilizando 0.5% de Tween 20 o 40

Después es necesario deshacerse de todos los componenetes celulares: se usan sales que precipitan proteínas pero no el ADN.

Hacer curvas de cloruro de magnesioRevisar la concentración y el manejo de los dNTPs. Revisar el buffer

Algunos ya incluyen el MgCl2 e inhiben la reacción

Revisar los oligonucleótidosPodrían estar degradados, defectuosos, mal diseñados.

Contaminación Trabajar con control negativo

GELES DE AGAROSAMétodos para visualizar el PCR

Principios básicos de la electroforesis

Geles de agarosa o acrilamida (permiten separar fragmentos de acuerdo al tamaño de cada uno)Especie de red con agujeros de tamaños diferentesEl ADN es “corrido” por corriente eléctrica hacia el polo positivo (ADN negativo)

Fragmentos de un mismo tamaño se agruparan todos juntos formando bandas en el gel

¿Agarosa o acrilamida?

AcrilamidaRedes con tamaños de poros uniformesPequeñosÚtil si los tamaños de los fragmentos son pequeñosSeparación fina Una sola base de diferencia

Son muy laboriosasLa tinción con plata

AgarosaNo forma redes tan uniformesPermite separar moléculas de ADN en un intervalo muy grandeSencillo

METODOS PARA GELES DE AGAROSA

EQUIPOCámara de electroforesisFuente de poderTransiluminador de luz UVEquipo de fotografía

Para empezar:

Preparar buffer de corrida Con pH requeridoTBE (Tris Boratos EDTA): estable y reusable.TAE (Tris Acetatos EDTA): menos estable pero permite obtener mejor separación de bandas

La concentración de agarosa dependerá de los tamaños de fragmentos

Si se desconoce el tamaño, se puede iniciar con agarosa al 1%

Rango efectivo de separacion (Kb) Agarosa (%)

30 -

1 0.5

12 -

0.8 0.7

10 –

0.5 1.0

7 –

0.4 1.2

3 –

0.2 1.5

La agarosa se disuelve en el mismo buffer que se utiliza para la corridaSe calienta hasta ebullición (evitar derramar)Dejar enfriar aprox. 60°CAñadir bromuro de etidio

Se intercala en las bases del ADNBrilla con luz UVEs mutágeno y altamente tóxico

Verter en el contenedor de gelesColocar peines para formar pozosDejar enfríar y solidificarAgregar el buffer necesario hasta cubrir el gel

CARGANDO EL GEL

Colorante de corrida: llevan sustancia espesa (glicerol o sacarosa) que permite que la muestra caiga hacia el fondo del pozoColorantes: nos dan una idea de cómo van migrando los fragmentos

Cuando el gel esté listo, se conectan los cablesCable rojo: polo positivo.Cable negro: polo negativo.

El ADN migrará hacia el polo +Se recomienda utilizar 5 volts por cada cm que exista entre los dos electrodos (fragmentos grandes)Fragmentos pequeños se recomienda 90-100 V.

Una cámara de 30 cm se correrá a 150 V

GRACIAS POR SU ATENCIÓN