NIVEL DE SUSCEPTIBILIDAD DEL HAPLOTIPO REGIONAL DE VARROA DESTRUCTOR A LOS ACARICIDAS DE SINTESIS DE USO COMUN EN APICULTURA.

INFORMA FINAL 26 de Agosto de 2010

Objetivo general del proyecto

Caracterizar molecularmente el haplotipo de V. destructor presente en los apiarios de APICOLA

MALKA SRL. y evaluar los niveles de susceptibilidad del ácaro frente a los acaricidas de uso común

en apicultura.

Objetivos particulares

Amplificar y secuenciar fragmentos de ADN pertenecientes a poblaciones de V. destructor

presentes en los apiarios de APICOLA MALKA SRL.

Poner a punto las técnicas para evaluar CL50 de Varroa destructor y A mellifera frente a

cumafos, amitraz, fluvalinato y flumetrina.

Comparar los valores de CL50 obtenidos con los niveles de base correspondientes a otras

zonas.

Caracterización molecular del haplotipo de Varroa destructor presente en los apiarios

destinados a la producción de material vivo de la empresa Apícola Malka SRL.

Materiales y Métodos Recolección y almacenamiento de los especímenes para el análisis molecular: Se usaron ácaros recolectados en etanol 96% y conservados a -20ºC hasta su uso según lo

propuesto por Anderson y Trueman (2000).

Extracción de DNA:

Se utilizaron 20 individuos pertenecientes a la misma población, que compartían las mismas

características morfológicas, para obtener suficiente cantidad de DNA para la amplificación y

posterior secuenciación. Para la extracción de DNA se utilizará un método no destructivo adaptado

por Anderson y Fucks (1998) quienes utilizaron el kit de Qiagen DNeasy Tissue Kit para realizar

una extracción de DNA no-destructiva en ácaros aumentando la duración de la etapa de lisis. El

DNA extraído se conservó a -20ºC hasta su uso.

Amplificación de DNA:

Las muestras de DNA crudo obtenidas del pool de ácaros fueron usadas para amplificar la región

del DNA mitocondrial correspondiente al gen CO-I , usando el set de primers COXF y COXRa

desarrollados por Anderson y Fuchs (1998) y siguiendo la metodología descripta por ellos. El

producto de la reacción de PCR fue corrido en geles de agarosa al 2% usando un marcador de

peso molecular para identificar las bandas.

Lo primers COX F y COX Ra amplificaron un fragmento de 458 bp (± 10 bp), por lo tanto fueron

purificados y posteriormente secuenciados.

Secuenciación de los fragmentos:

Parte del material amplificado obtenido fue enviado al Laboratorio de Secuenciación Pro-Papa EEA

INTA Balcarce para la confirmación de los resultados y detección de variaciones en la secuencia

nucleotídica.

Métodos de análisis de las secuencias:

Para confirmar la identidad y la relación filogenético de dichas secuencia, se realizaron búsquedas

combinadas en GeneBank, EMBL y DDBJ usando el formato FASTA. Las secuencias de las

especies fueron alineadas usando el programa ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw/) de manera de

poder identificar a qué haplotipo pertenecía nuestra muestra (los sitios variables se nombrarán

usando el código IUB). Se alineó la secuencia obtenida para nuestra muestra con las publicadas

por Anderson y Trueman (2000) en el Genbank para los haplotipos coreano (AF106899) y japonés

(AF106897). De acuerdo a los resultados aportados por este estudio los haplotipos son

concordantes en un 98% con la secuencia reportada para el haplotipo coreano (Gene Bank

NCBI) (presentado en informe parcial).

Análisis filogenéticos:

Una vez obtenido el alineamiento múltiple, fue editado manualmente usando el programa Bio Edit

(Hall, 1999). Los análisis de relaciones entre taxones fue realizado usando BioNJ para neighbour

joinning (Gascuel, 1997; Felsenstein, 1989; Elias y col., 2007) y Phyml para máximum likelihood

(Guindon y col., 2003; Anisimova, 2006) disponibles en el paquete Phylogeny.fr (Dereeper y col.,

2008). El árbol filogenético fue construido con el programa Treeview (Page, R., 2001).

Determinación de haplotipos de Varroa por High Resolution Melting (HRM) Real Time PCR

Para realizar la PCR se utilizaron los primers COXI (Anderson y Trueman 2000). Cada muestra de

ADN extraída (incluyendo las que habían sido secuenciadas) fue cuantificada y calculada la

relación 260/280 para determinar el estado y calidad de la muestra. Una vez realizado esto se

seleccionaron los templados que figuran resaltados en la siguiente Tabla y se les realizó la PCR en

Tiempo Real.

Muestra Abs 260 Abs 280 Relación 260/280 ng/µl dilución ng/µl final

Río turbio 0,02 0,012 1,666666667 1,428571429 142,857143

Santa Fe 0 0,021 0 0 0

Santiago del Estero 0,01 0,005 2 0,714285714 71,4285714

Tucumán 0,03 0,014 2,142857143 2,142857143 214,285714

Misiones 0,01 0,017 0,588235294 0,714285714 71,4285714

Santa Cruz 0,03 0,015 2 2,142857143 214,285714

Neuquén 0,04 0,018 2,222222222 2,857142857 285,714286

Jujuy 0,04 0,01 4 2,857142857 285,714286

San Luis 0,025 0,016 1,5625 1,785714286 178,571429

Master Mix

1X 12X

EVaGreen Mix 12,5 150

Primer fw 1,75 21

Primer rv 1,75 21

Se colocaron 16 µl de master mix por tubo

En la tabla siguiente se observa el resultado del primer PCR, puesta a punto con muestras ya caracterizadas por secuenciación y confección de la curva de calibración para calcular coeficiente de variación usando la muestra Neuquén como templado estándar.

Rótulo Muestra µl templado necesarios para

1,3ug µl agua

R Río turbio 9 0

SE Santiago del Estero 9 (para 0,65 ug) 0

T Tucumán 6 3

SC Santa Cruz 6 3

N Neuquén 4,5 4,5

SL San Luis 7,3 1,7

N1/10 Neuquén 4,5 4,5

N1/100 Neuquén 4,5 4,5

N1/1000 Neuquén 4,5 4,5

Una vez puesta a punto se corrió el resto de las muestras seleccionadas. La segunda PCR se realizó utilizando los templados que figuran a continuación:

muestra Rotulado

Braunstein1 B1

Salta.. S

Braunstein 2… B2

Bs As..... BA

E. Ríos… ER

España… ER

Río negro. RN

Francia.... F

Neuquén N

NTC (Non template control) NTC

1X 11X

EvaGreen Mix 12,5 137,5

Primer fw 1,75 19,25

Primer rv 1,75 19,25

Se colocaron 16 µl de master mix por tubo. Para todos los templados se colocó 9 µl de templado con excepción de Neuquén en el que se colocaron 4,5 µl de templado y 4,5 µl de agua en la reacción.

Condiciones de PCR en Tiempo Real

Cycle Cycle Point

Hold @ 95°c, 5 min 0 secs

Cycling (50 repeats) Step 1 @ 95°c, hold 58 secs

Step 2 @ 52°c, hold 60 secs

Step 3 @ 72°c, hold 60 secs, acquiring to Cycling A([Green][1][1])

Melt (72-95°c) , hold secs on the 1st step, hold 5 secs on next steps, Melt A([Green][1][1])

Al final del ciclado se hizo una curva de melting standard y luego HRM de 75 a 85 °C. Resultados La alineación de las secuencias obtenidas (Fig. 1) permitió diferenciar 5 variantes del haplotipo

coreano con inserciones (1), transiciones (2) y transversiones (4). Las distintas variantes del

haplotipo obtenidas en Argentina fueron publicadas en el Genebank (BankIt1384076,

384077,1384078, 1384079,1379390). También se secuenciaron Neuquén y San Luis pero como las

secuencias eran iguales a alguna de las variantes publicadas no se incluyeron en el alineamiento.

Los fragmentos obtenidos coinciden con los correspondientes al gen COX I de V. destructor y son

98-99% similiar a los publicados en el Genebank para variantes del haplotipo coreano.

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

5 15 25 35 45 55

Australia TTTGGAAATT TAGGGATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

Corea de S TTTGGAAATT TAGGGATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

Japon TTAGGAATTT TAAGTTTGCA TTTAGCTGGA ATCTCCTCTA TTATAAGATC TATTAATTTT

Java TTAGGAATTT TAAGTTTACA TTTAGCTGGA ATTTCTTCTA TTATAAGATC TATTAATTTT

Indonesia TTTGGTAATT TAGGGATAAT TTATGCTATA ATA------A CTATTGGTAT TTTAGGTTTT

Buenos Air TTT---AATT TCGGAATATT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

Entre Ríos ---------- ---------- ---------- ---------- --------AT TTTAGGTTTT

Nagrota1 TTTGGAAATT TAGGGATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

Amristar1 TTTGGAAATT TAGGGATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

China TTAGGAATTT TAAGTTTGCA TTTAGCTGGA ATCTCCTCTA TTATAAGATC TATTAATTTT

Hisar1 TTTGGAAATT TAGGGATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

España TTTGGAAATT TAGGGATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

Jammu TTTGGAAATT TAGGGATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

Nagrota TTTGGAAATT TAGGGATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

Rahastan TTTGGAAATT TAGGGATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATC~GGTA TTTTAGGTTT

Rampuraful TTTGGAAATT TAGGGATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

Rapal TTTGGAAATT TAGGGATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

Ropar2 TTTGGAAATT TAGGGATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

Vietnam TTAGGAATTT TAAGTTTGCA TTTAGCTGGA ATCTCCTCTA TTATAAGATC TATTAATTTT

Neuquen TTTGGAAATT TAGGGATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

Río Negro TTTGGAAATT TCGGAATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

Río Turbio TTTGGAAATT TAGGGATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

Santa Cruz TTTGGAAATT TAGGGATAAT TTACGCTATA ATA------A CTATCGGTAT TTTAGGTTTT

Limulus po TTGACAATCT TTTCTCTCCA CTTAGCAGGA GTATCATCAA TTTTAGGTGC AATTAATTTC

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

65 75 85 95 105 115

Australia ATTGTATGAG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

Corea de S ATTGTATGGG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

Japon ATTGCTACTA TTTTAAATAT ACGTGTAAAG GGGATAAATC TTGAAATAAT GCCTTTATTT

Java ATTGCTACAA TTTTAAATAT ACGTGTTAAG GGGATAAATC TTGAGATAAT ACCTTTATTT

Indonesia ATTGTATGAG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGGATAGATA TTGA------ ---------T

Buenos Air ATTGTATGGG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

Entre Ríos ATTGTATGGG CTTATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

Nagrota1 ATTGTATGGG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

Amristar1 ATTGTATGGG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

China ATTGCTACTA TTTTAAATAT ACGTGTAAAG GGGATAAATC TTGAAATAAT GCCTTTATTT

Hisar1 ATTGTATGGG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

España ATTGTATGGG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

Jammu ATTGTATGGG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

Nagrota ATTGTATGGG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

Rahastan TATTGTATGG GCTCATCATA TATTTACAGT AGGAATAGAT ATTGA----- ----------

Rampuraful ATTGTATGGG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

Rapal ATTGTATGGG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

Ropar2 ATTGTATGGG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

Vietnam ATTGCTACTA TTTTAAATAT ACGTGTAAAG GGGATAAATC TTGAAATAAT GCCTTTATTT

Neuquen ATTGTATGGG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

Río Negro ATTGTATGGG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

Río Turbio ATTGTATGGG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

Santa Cruz ATTGTATGGG CTCATCATAT ATTTACAGTA GGAATAGATA TTGA------ ---------T

Limulus po ATTACCACAA TTATTAATAT ACGAACATCC GGAATAGTAC TTGAACGAAT ACCATTATTC

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

125 135 145 155 165 175

Australia ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCTACTGG TATTAA----

Corea de S ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCTACTGG TATTAA----

Japon GTATGGTCTG TTTTTATTAC TACTATT-TT ATTATTATTA TCTTTGCCTG TTTTAGCTGG

Java GTATGGTCAG TTTTTATTAC TACTATT-TT ATTATTATTA TCATTACCTG TTTTAGCAGG

Indonesia ACTCGGGCTT ATTTTACTGC GGCTACAATG ATTATTGCGG TTCCCACTGG TATTAA----

Buenos Air ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCTACTGG TATTAA----

Entre Ríos ACTCGAGCAT GTTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCCACTGG TATTAA----

Nagrota1 ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCTACTGG TATTAA----

Amristar1 ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCTACTGG TATTAA----

China GTATGGTCTG TTTTTATTAC TACTATT-TT ATTATTATTA TCTTTGCCTG TTTTAGCTGG

Hisar1 ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCTACTGG TATTAA---G

Rampuraful ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCTACTGG TATTAA----

Rapal ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCTACTGG TATTAA ----

España ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCTACTGG TATTAA----

Jammu ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCTACTGG TATTAA----

Nagrota ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCTACTGG TATTAA----

Rahastan TACTCGAGCA TATTTTACTG CAGCTACAAT AATTATTGCG GTTCCTACTG TATTAA---

Ropar2 ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCTACTGG TATTAA----

Vietnam GTATGGTCTG TTTTTATTAC TACTATT-TT ATTATTATTA TCTTTGCCTG TTTTAGCTGG

Neuquen ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCTACTGG TATTAA----

Río Negro ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCTACTGG TATTAA----

Río Turbio ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCCACTGG TATTAA----

Santa Cruz ACTCGAGCAT ATTTTACTGC AGCTACAATA ATTATTGCGG TTCCCACTGG TATTAA----

Limulus po GTTTGATCAG TTAAAATTAC TGCAATCCTT CTTCTT-CTA TCTCTCCCTG TTCTTGCTGG

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

185 195 205 215 225 235

Australia AATTTTTTCT TGATTAGCAA CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCCC--GATA

Corea de S AATTTTTTCT TGATTAGCAA CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCCC--GATA

Japon GGCTATTACA ATATTGTTAA CAGATCGAAA TTTTAATACT ACATTTTTTG ATCCTAGAGG

Java AGCTATTACA ATATTATTAA CAGATCGAAA TTTTAATACT ACTTTTTTTG ATCCTAGAGG

Indonesia AATTTTTTCT TGATTAGCGA CAATTCATGG TTCTATAGTA AAATTAGATG TTCC--AATA

Buenos Air AATTTTTTCT TGATTAGCAG CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATCAGATG TCCC--GATA

Entre Ríos AATTTTTTCT TGATTAGCAG CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCC---GATA

Nagrota1 AATTTTTTCT TGATTAGCAA CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCCC--GATA

Amristar1 AATTTTTTCT TGATTAGCAA CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCCC--GATA

China GGCTATTACA ATATTGTTAA CAGATCGAAA TTTTAATACT ACATTTTTTG ATCCTAGAGG

Hisar1 AATTTTTTCT TGATTAGCAA CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCCC--GATA

España AATTTTTTCT TGATTAGCAA CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCCC--GATA

Jammu AATTTTTTCT TGATTAGCAA CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCCC--GATA

Nagrota AATTTTTTCT TGATTAGCAA CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCCC--GATA

Rahastan -AATTTTTTC TTGATTAGCA ACAATTCATG GTTCTATAGT TAAATTAGAT GTCCC--GAT

Rampuraful AATTTTTTCT TGATTAGCAA CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCCC--GATA

Rapal AATTTTTTCT TGATTAGCAA CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCCC--GATA

Ropar2 AATTTTTTCT TGATTAGCAA CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCCC--GATA

Vietnam AGCTATTACA ATATTGTTAA CAGATCGAAA TTTTAATACT ACATTTTTTG ATCCTAGAGG

Neuquen AATTTTTTCT TGATTAGCAA CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCCC--GATA

Río Negro AATTTTTTCT TGATTAGCAG CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCCC--GATA

Río Turbio AATTTTTTCT TGATTAGCAA CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCCC--GATA

Santa Cruz AATTTTTTCT TGATTAGCAA CAATTCATGG TTCTATAGTT AAATTAGATG TCCC--GATA

Limulus po AGCTATTACA ATACTCCTAA CAGATCGAAA CTTCAATACA TCATTTTTTG ACCCTGCAGG

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

245 255 265 275 285 295

Australia ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

Corea de S ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

Japon AGGTGGTGAT CCTATTTTAT ATCAACATTT ATTTTGATTT TTTGGACACC CAGAAGTTTA

Java GGGAGGGGAC CCTATTTTAT ATCAACATTT ATTTTGATTT TTTGGGCATC CAGAAGTTTA

Indonesia ATTTGATCCT TGGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTGGG-- ---GGGAATT -ACTGGTGTG

Buenos Air ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

Entre Ríos ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

Nagrota1 ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

Amristar1 ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

China AGGTGGTGAT CCTATTTTAT ATCAACATTT ATTTTGATTT TTTGGACACC CAGAAGTTTA

Hisar1 ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

España ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

Jammu ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

Nagrota ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

Rahastan AATTTGATCT TTAGGTTTTA TTTTTTTATT TACTTTAGG- ----GGGTAT T-ACTGGTGT

Rampuraful ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

Rapal ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

Ropar2 ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

Vietnam TGGTGGTGAT CCTATTTTAT ATCAACATTT ATTTTGATTT TTTGGACACC CAGAAGTTTA

Neuquen ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

Río Negro ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

Río Turbio ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

Santa Cruz ATTTGATCTT TAGGTTTTAT TTTTTTATTT ACTTTAGG-- ---GGGTATT -ACTGGTGTA

Limulus po AGGGGGTGAC CCAGTCCTAT ACCAACATTT ATTTTGATTT TTTGGGCACC CTGAAGTCTA

....|....| ....|....| ....|....

305 315 325

Australia -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATATT-

Corea de S -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATATT-

Japon TATTTTAATT TTGCCTGGTT TTGGTATT-

Java TATTTTAATT TTACCTGGAT TCGGAATT-

Indonesia -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATATT-

Buenos Air -ATTTTAGC- ---------- ---------

Entre Ríos -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TGCTTT---

Nagrota1 -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATATT-

Amristar1 -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATATT-

China TATTTTAATT TTGCCTGGTT TTGGTATT-

Hisar1 -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATATT-

España -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATATT-

Jammu -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATATT-

Nagrota -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATATT-

Rahastan A-ATTTTAGC TAATTCTTCT ATTGATATT

Rampuraful -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATATT-

Rapal -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATATT-

Ropar2 -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATATT-

Vietnam TATTTTAATT TTGCCTGGTT TTGGTATT-

Neuquen -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATATT-

Río Negro -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATAT--

Río Turbio -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATATT-

Santa Cruz -ATTTTAGCT AATTCTTCTA TTGATATT-

Limulus po CATTTTAATT CTTCCTGGGT TTGGAATA-

Figura 1: Alineamiento de los haplotipos de V.destructor encontrados en Argentina con las

descriptas para otros países (Genebank), realizados con el programa Clustal X del software

Bioedit®.

Los análisis de variación y divergencia de las secuencias obtenidas realizados usando los métodos

de Neighbour Joining y Maximum likelihood tuvieron una topología semejante. Para poder entender

la variación y la historia ancestral de los haplotipos encontrados se optó por utilizar la regresión

logística bayesiana que evidencia las relaciones evolutivas entre los haplotipos generados por SNP

(Single Nucleotide Polimorphism). Este modelo incorpora los factores ambientales junto con las

relaciones entre los SNP para realizar el modelo de regresión. Con este análisis se construyó el

árbol lógico (Fig. 2) usando a Limulus polyphemus como outgroup.

En base al árbol filogenético obtenido (Fig. 2) se observa que la totalidad de las secuencias

argentinas están relacionadas con las publicadas para las distintas variantes del haplotipo

coreano y, a su vez están igualmente distanciadas del haplotipo japonés.

Figura 2: Árbol filogenético obtenido donde se muestran las posiciones de sequencias de V. destructor presentes en Argentina.

Se pudo poner a punto la técnica de HRM-Real Time PCR (Fig. 3) para la caracterización de los

haplotipos de V. destructor..

No. Colour Name Genotype Confidence %

1

rio turbio Variation

3

tucuman Variation

5

santa cruz Variation

7

san luis Variation

8

neuquèn Wt 100,00

9

neuquèn 1/10 Wt 100,00

10

neuquèn 1/100 Wt 99,25

Fig. 3: Puesta a punto de la técnica de HRM-Real time. Las referencias de los colores de cada

curva se presentan en la tabla precedente.

Como grupo wild type (wt) se utilizó la secuencia de Neuquén, a la cual se le construyó la curva de

melting. Se puede observar que las muestras Tucumán y San Luis son semejantes a las utilizadas

como material de referencia (previamente secuenciado) de Santa Cruz y Río Turbio por los que se

las caracteriza como haplotipo coreano.

Una vez puesta a punto esta metodología se la utilizó para caracterizar el haplotipo de ácaros

provenientes de otras provincias de nuestro país (Fig. 4). Se usaron como control ácaros enviados

desde España y Francia caracterizados como provenientes del haplotipo coreano en el continente

europeo. El wt utilizado fue nuevamente el fragmento obtenido de Neuquén.

deg.

75,6 75,8 76,0 76,2 76,4 76,6 76,8 77,0 77,2 77,4 77,6 77,8 78,0 78,2 78,4 78,6 78,8 79,0 79,2 79,4 79,6 79,8 80,0 80,2 80,4

Norm

alis

ed m

inus w

t

20

15

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35

-40

-45

-50

No. Colour Name Genotype Peak 1

1

salta 78,50

11

neuquèn 79,17

15

rio turbio 21-10 78,90

16

tucuman 21-10 78,67

18

santa cruz 21-10 78,55

19

san luis 21-10

20

neuquèn 21-10 78,52

21

braun 2 27-10 79,35

22

españa 27-10 79,12

23

francia 27-10 79,37

Fig. 4: Caracterización de las muestras por HRM-Real Time PCR utilizando a Neuquén como wt.

Las referencias de los colores de cada curva se presentan en la tabla precedente.

Como se puede observar en el gráfico las muestras Francia y Braunstein (Apícola Malka SRL)

pertenecen a una misma variante del haplotipo coreano. Por otro lado las muestras Salta,

Tucumán, San Luis están relacionadas con la variante del haplotipo coreano publicada para España

y secuenciadas en este trabajo para Santa Cruz, Río Turbio las cuales fueron utilizadas

nuevamente como material de referencia.

Por cuestiones de baja calidad del fragmento obtenido para las muestras de Francia y el bajo

número de ácaros en la misma no se pudo obtener suficiente cantidad de DNA para su

secuenciación. Pero, gracias a la alta sensibilidad de la HRM-Real Time PCR se pudo obtener un

fragmento en cantidad suficiente para poder realizar el análisis.

En los últimos 30 años V. destructor se ha convertido en la enfermedad que más daño genera en

las colonias de Apis melífera. Este parásito colonizó A. mellifera a partir de A.cerana, cuando

ambas especies solaparon su rango de distribución. En la abeja oriental se identificaron dos

haplotipos; el coreano y el japonés, siendo el primero el considerado de mayor grado de virulencia

frente a la abeja occidental y el más distribuido a lo largo del mundo (Solignac, M. et al, 2005).

En el presente trabajo se detectó el haplotipo coreano de V. destructor en los apiarios de Apícola

Malka SRL como así, en las 9 provincias analizadas, encontrándose 5 variantes del mismo que se

repiten en las otras provincias. La mayoría de las variantes encontradas provienen del mismo

antecesor que las variantes del haplotipo coreano descripto principalmente en el continente

europeo (en este caso España) o de las abejas melíferas asiáticas lo cual podría indicarnos que la

fuente de ingreso en nuestro país puede deberse a alguno de los dos orígenes o a ambos. De

todos modos como puede observarse en el árbol filogenético las secuencia pertenecientes a Río

Negro, Buenos Aires y Entre Ríos provienen de un mismo ancestro y han sufrido variaciones

posteriores probablemente debidas a las diferencias en los distintos ambientes. La gran divergencia

encontrada en las muestras identificadas como Río Turbio y Santa Cruz puede deberse más que a

diferencias en el origen de ingreso de los ácaros a la presión de selección del ambiente hostil, ya

que son considerados los ácaros más australes del mundo.

También se pudo poner a punto una nueva metodología para la caracterización molecular de los

haplotipos estudiados, la HRM-Real Time PCR. Esta metodología está emergiendo actualmente

entre los biólogos que realizan análisis filogenéticos moleculares como una alternativa a la

secuenciación. Los análisis de HRM son, por lo tanto una alternativa fácil y de bajo costo a los

análisis que requerían de secuenciación. Usando esta metodología los productos de PCR pueden

ser discriminados de acuerdo a la secuencia, longitud, contenido de GC o complementaridad de

cadenas hasta cambios en una simple base (SNP) dando información útil para poder realizar una

correcta caracterización de los haplotipos y sus variantes.

Niveles de susceptibilidad del ácaro frente a los acaricidas de uso común en apicultura.

Determinación de Líneas de Base en apiarios pertenecientes a la cabaña Apícola Malka SRL.

La determinación de las líneas de base para las muestras remitidas por Apícola Malka SRL

fueron realizadas en el Laboratorio de Apicultura ubicado en la estación costera J.J. Nágera (38º 10′

06″ S; 57º 38′ 10″ W) y en el Laboratorio de Artrópodos ubicado en la Facultad de Ciencias Exactas

y Naturales, ambos pertenecientes a la Universidad Nacional de Mar del Plata.

Extracción de ácaros

La obtención de los ácaros fue realizada a partir de panales de cría remitidos al Laboratorio

de Artrópodos por Apícola Malka SRL. Las hembras adultas de Varroa fueron extraídas de las

celdas operculadas mediante su desoperculado e inspección, utilizando pinzas de disección y

pinceles. Una vez localizados los ácaros, los mismos fueron removidos y mantenidos en cápsulas

de Petri de una a tres horas hasta que se obtuvo suficiente número de individuos para realizar los

bioensayos. Al llevar a cabo los mismos no se tuvo en cuenta el estadío de cría de abeja a partir del

cual fueron extraídos los parásitos, debido a que Milani (1995) demostró que el estado de desarrollo

del insecto a partir del cual son obtenidos los ácaros no afecta la variabilidad de los resultados

obtenidos en los bioensayos.

Bioensayo de exposición completa

Una vez obtenidos los ácaros se procedió a determinar las CL50 para cada acaricida en

cada apiario muestreado, utilizando el método de toxicidad descrito por Ruffinengo et al. (2005).

Mediante la implementación de este bioensayo, los ácaros y las abejas entran en contacto

simultáneamente con el acaricida. Los tratamientos del experimento se realizaron en cápsulas de

Petri de 90 x 20 mm.

En los casos donde se contó con el número suficiente de ácaros para llevar a cabo los

experimentos, se diluyeron grados técnicos de tau-fluvalinato, flumetrina, amitraz y cumafós

(Pestanal®; Sigma Aldrich) en 1 ml de hexano (Laboratorio Cicarelli, Argentina, Pro-analisis) y se

prepararon concentraciones crecientes para cada acaricida que variaron de 0 (control) a 5 μg/ml.

En las muestras donde no se contó con el número suficiente de ácaros para estimar la

toxicidad del acaricida en concentraciones crecientes del mismo, se evaluó su mortalidad al ser

expuestos a la CL50 de base del acaricida objeto de estudio (Las CL50 de base discriminatorias

usadas en este estudio fueron las reportadas por Maggi et al. 2009). De este modo la respectiva

CL50 aplicada actuó como concentración discriminatoria para establecer susceptibilidad o

resistencia sobre las poblaciones de ácaros estudiadas. A modo de ejemplificar la interpretación de

los resultados: si se aplica la CL50 de un acaricida sobre 100 ácaros y estos son susceptibles, se

espera obtener un 50 % de mortalidad (50 ácaros muertos) luego de ser expuestos a esta

concentración. En caso de que la mortalidad sea significativamente menor a la esperada (50 % de

mortalidad), se concluye que existió resistencia al acaricida.

Las concentraciones ensayadas se aplicaron homogéneamente sobre la superficie interna

de las cápsulas de Petri. Luego de preparar la totalidad de los tratamientos las cápsulas se

mantuvieron abiertas a temperatura ambiente durante dos horas para lograr evaporar los residuos

de hexano. Una vez que el solvente se evaporó, se colocaron cinco hembras de V. destructor por

cápsula de Petri. Una hora después de colocar los ácaros se adicionaron tres abejas obreras y un

recipiente que contuvo candy (alimento para las abejas preparado con tres partes de azúcar

impalpable y una de agua, 3:1) y una esponja (1 x 1 x 0.5 cm) embebida en agua que funcionó de

bebedero para las abejas. La toxicidad fue estimada para cada concentración de acaricida y para

los controles utilizando cinco réplicas por tratamiento. Durante el tiempo que abarcaron los

bioensayos, las cápsulas de Petri se colocaron en incubadora a temperatura y humedad

controladas (29 ºC y 61.5 % humedad relativa).

La mortalidad de los ácaros se controló a las 24 h de iniciados los bioensayos mediante la

utilización de una lupa (modelo Leitz Wetzlar). Se consideró que un espécimen murió al finalizar los

ensayos, si el mismo no presentó movimientos luego de ser expuesto a estímulos táctiles

generados por el roce de un pincel contra el cuerpo del individuo a observar. Los ácaros perdidos o

que murieron accidentalmente durante los bioensayos fueron excluidos de los conteos finales.

Análisis estadísticos

En los casos donde solo se aplicó una única concentración (CL50 de base) por no contar con

el número de ácaros suficientes, el valor de mortalidad obtenido (expresado en porcentaje) se

comparó estadísticamente con el valor de mortalidad esperado (50 %) mediante el empleo de un

test estadístico de Chi-cuadrado.

En los casos donde se contó con el número suficiente de ácaros, la estimación de los

valores de CL50 y los límites de confianza al 95 % para los mismos se realizaron mediante el uso del

software EPA (versión 1.5) según lo establecido por USEPA (1986). Mediante el empleo de este

programa fueron ajustados los valores de mortalidad de acuerdo con Abbott (1925) en función de la

mortalidad natural registrada en los controles. Las CL50s obtenidas para cada acaricida en cada

apiario estudiado se compararon estadísticamente con las líneas de base de cada acaricida

reportadas por Maggi et al. (2009) siguiendo los procedimientos descritos por APHA (1992).

En el caso de detectarse poblaciones de ácaros resistentes a alguno de los acaricidas, el

índice de resistencia (IR) se calculó para las poblaciones de V. destructor resistentes de la siguiente

manera: IR = CL50 de ácaros resistentes / CL50 de ácaros susceptibles reportados por Maggi et al.

(2009)

RESULTADOS

Bioensayos de exposición completa

Se realizaron bioensayos de toxicidad sobre muestras remitidas correspondientes a dos

apiarios (Apiario I y II). En todos los bioensayos la mortalidad de ácaros registrada para los

controles fue inferior al 10 % y la de las abejas fue nula.

Los porcentajes de mortalidad para las poblaciones de ácaros de cada apiario estudiado

obtenidos para cada concentración de acaricida ensayada fueron reportados en la Tabla I. Los

valores de CL50 y límites de confianza al 95 % para las poblaciones de ácaros fueron reportados en

la Tabla II.

Para las poblaciones de ácaros pertenecientes al Apiario I, la CL50 estimada para el

fluvalinato fue de 0.38 μg/cápsula de Petri y fue similar a la registrada para la flumetrina (0.32

μg/cápsula de Petri). Para las poblaciones de ácaros pertenecientes al Apiario II la CL50 estimada

para el amitraz fue de 0.14 μg/cápsula de Petri y para la acrinatrina fue de 0.34 μg/cápsula de

Petri. Las CL50 y los límites de confianza al 95 % para cada una fueron reportadas en la Tabla II. Al

comparar las CL50s reportadas para el Apiario I y II con las líneas de base para las mismas

moléculas reportadas por Maggi et al., (2009), los análisis estadísticos indicaron que no hubo

diferencias significativas entre las mismas (p>0.05). Para el Apiario I, no se pudieron estimar las

CL50s del amitraz y del cumafós debido al escaso número de ácaros muestreados por lo cual se

procedió a aplicar las respectivas concentraciones discriminantes (CL50 reportadas por Maggi et al.

(2009)). En el Apiario II no fue posible estimar las CL50s del cumafós, fluvalinato y flumetrina, debido

también al escaso número de ácaros encontrado en los panales de creía de A. mellifera. La Tabla

III reporta el origen de las poblaciones de parásitos estudiadas y los porcentajes de mortalidad

observados para las mismas al ser expuestas a las CL50 de base de los acaricidas.

En ninguno de los casos se comprobaron fenómenos de resistencia a alguna de las

moléculas estudiadas y los porcentajes de mortalidades observados indican que el estado

de susceptibilidad de las poblaciones de ácaros del Apiario I y II fue alto.

Tabla I. Concentraciones utilizadas en los bioensayos (µg/capsula de Petri) y porcentajes de mortalidad a las 24 h (%) para cumafós, flumetrina, fluvalinato, acrinatrina y amitraz registrados para poblaciones de ácaros pertenecientes a cada apiario estudiado.

Apiario I Apiario II

Acaricida Cumafós Flumetrina Fluvalinato Amitraz Cumafós Flumetrina Fluvalinato Amitraz Acrinatrina

0.12 - - - 92 - - - - -

0.25 - 44.3 43.1 - - - - 72 39.2

0.27 - - - - - - - - -

0.3 - 49.3 48.5 - - 75 92 93 49.1

0.5 - 85 87.5 - - - - - -

0.55 89 - - - 86 - - - -

0.6 - - - - - - - 100 88.2

0.75 - 94.5 91.6 - - - - - -

1 - 100 95.8 - - - - - -

1.12 - - - - - - - - -

1.2 - - - - - - - 100 100

1.6 - - - - - - - - -

2 - 100 100 - - - - - -

2.16 - - - - - - - - -

2.25 - - - - - - - - -

2.5 - - - - - - - 96 100

4.5 - - - - - - - - -

5 - - - - - - - 100 98

Control 4 10 9.2 4 1 1 1 1 1

Tabla II. Valores de CL50 para el amitraz, acrinatrina, fluvalinato y flumetrina estimados para las poblaciones de ácaros provenientes de los apiarios estudiados mediante bioensayos de exposición completa.

Apiario Acaricida

CL50 (µg/cáp. Petri)

Apiario I Fluvalinato 0.38

Flumetrina 0.32

Apiario II Amitraz 0.14

Acrinatrina 0.34

Tabla III. Origen de las poblaciones de parásitos estudiadas y porcentajes de mortalidad observados para las mismas al ser expuestas a la CL50 base de reportada por Maggi y col. (2009).

Principio Activo

Apiario % de mortalidad esperada % Mortalidad observada

Cumafós Apiario I 50 89

Amitraz Apiario I 50 92

Cumafós Apiario II 50 86

Fluvalinato Apiario II 50 93

Flumetrina Apiario II 50 92

Paralelamente a las muestras analizadas de poblaciones de ácaros provenientes de colonias de la

Apícola Malka SRL se muestrearon otras poblaciones de parásitos correspondientes a la Región

Depresión del Salado (enmarcada en la división de regiones realizadas por la Mesa Provincial de

Desarrollo Apícola de la Provincia de Buenos Aires). Esta región comprende el área de localización

de la cabaña Apícola Malka SRL y partidos aledaños.

Se realizaron bioensayos de toxicidad para el cumafós sobre muestras correspondientes a

tres apiarios ubicados en Rauch, Magdalena y Brandsen. En todos los bioensayos la mortalidad de

ácaros registrada para los controles fue inferior al 10 % y la de las abejas fue nula. Los porcentajes

de mortalidad para las poblaciones de ácaros de cada apiario estudiado obtenidos para cada

concentración de acaricida ensayada son reportados en la Tabla I. Los valores de CL50 para las

poblaciones de ácaros son reportados en la Tabla II. Al comparar las CL50s reportadas para los

Apiarios 1, 2 y 3 con las líneas de base para el cumafós reportada por Maggi et al., (2009), se

determinó resistencia al cumafós en los tres apiarios muestreados (p<0.05).

Tabla I. Concentraciones utilizadas en los bioensayos (µg/capsula de Petri) y porcentajes de mortalidad a las 24 h (%) para cumafós registrados en poblaciones de ácaros pertenecientes a cada uno de los apiarios estudiados.

Cumafos

(ug/ml) Apiario 1 Apiario 2 Apiario 3

5 16 12 16

10 12 20 20

20 36 36 34

40 32 39 39

Control 12 12 11

Tabla II. Valores de CL50 para cumafós estimados para las poblaciones de ácaros provenientes de los apiarios de partidos aledaños a la Cabaña Malka SA estudiados mediante bioensayos de exposición completa e índices de resistencia

Apiario Acaricida

CL50 (µg/cáp. Petri)

Índice de Resistencia

1 Cumafós 114.5 200

2 Cumafós 105 184

3 Cumafós 107 187

Lineas de base Cumafós 0.57 -

CONCLUSIONES

Las poblaciones de parásitos encontradas en colonias de abejas de Apícola Malka SRL corresponden en su totalidad al haplotipo coreano

Las poblaciones de parásitos encontradas en colonias de abejas de Apícola Malka SRL presentan una alta susceptibilidad a las cuatro moléculas acaricidas de uso común en apicultura. No obstante, poblaciones de ácaros resistentes al cumafós se encuentran en zonas cercanas al emprendimiento apícola y esta información debe ser considerada al tiempo de definir los tratamientos sanitarios.

Recomendaciones

1. Rotación de moléculas acaricidas de síntesis: se sugiere realizar una rotación de las moléculas de síntesis utilizadas y evitar la incorporación del cumafós.

2. Incorporación de acaricidas orgánicos: se sugiere incorporar en el marco de la rotación acaricidas orgánicos tales como el ácido oxálico y timol

3. Realización de un estudio de los niveles de residualidad en la cera que permita conocer el estado de situación de la misma y el tipo y nivel de contaminantes presentes si los hay

Etapas cumplidas ETAPA

Nº DEARROLLO DE LAS ETAPAS PROGRAMADAS

1 Se caracterizó molecularmente el haplotipo coreano de Varroa destructor en apiarios de Apícola Malka SRL y se lo referenció con otros de poblaciones de distintas provincias y países de europa

2 Se ajustó la metodología para el cálculo de CL50 de ácaros y abejas con un 100% de supervivencia de los individuos en las réplicas control. Se calcularon las CL50 para las moléculas acaricidas utilizadas en apicultura

3 Se compararon las CL50 frente a las líneas de base y en los apiarios analizados de la Cabaña Malka SA no se comprobaron fenómenos de resistencia a ninguna de las moléculas estudiadas. Adicionalmente se comprobó resistencia al cumafós en poblaciones de ácaros pertenecientes a colonias de partidos vecinos a la localización de Apícola Malka SRL

4 Se redactó el informe final del proyecto. .

Dr. Martin Eguaras Investigador Independiente

CONICET