EFyM I - Manual de Laboratorio 2006
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICO BIOLÓGICA
AUTORES:
QFB Guadalupe Alejandra Aceves Rosas M. en C. José Luis Balderas López
QFB Ángeles García Fernández M. C. Amada López García
M. en C. Evangelina López Nieto QFI Estela Valencia Plata
México, D.F., febrero de 2006
Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
Tabla de contenido
Tabla de contenido I. Presentación II. Forma de trabajo en el laboratorio
a) Formación de los equipos de trabajo
b) Material necesario para el trabajo en laboratorio
c) Normas de trabajo del Laboratorio de Farmacología
d) Mecanismos de evaluación
e) Programación de las prácticas
III. Guías de trabajo a) Guía para la elaboración de fichas resumen de artículo
b) Guía para la elaboración de trabajos de investigación / cuestionarios de
investigación bibliográfica
c) Guía para la elaboración de informes
d) Guía para la presentación del seminario
IV. Prácticas de Laboratorio Tema 1. Posología
Práctica 1. Posología.
Tema 2. Manejo de animales
Práctica 2. Manejo de la rata y el ratón en el laboratorio de farmacología
Tema 3. Farmacocinética: absorción
Práctica 3. Determinación del perfil farmacocinético de la sulfacetamida
sódica en conejo
Tema 4. Farmacocinética: distribución
Práctica 4. Distribución de la sulfacetamida sódica en rata
Tema 5. Farmacocinética: eliminación
Práctica 5. Determinación de la ruta de eliminación principal de la
sulfacetamida sódica
Tema 6. Relación dosis – respuesta cuantal
Práctica 6. Determinación de dosis letal media (DL50), dosis efectiva media
(DE50), índice terapéutico (IT) y margen estándar de seguridad (MS) del
1
3
4
4
4
5
6
6
8
8
9
9
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20
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50
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Manual de Laboratorio
pentobarbital sódico
Práctica 7. Bioensayo de toxicidad en Artemia salina L.
Tema 7. Relación dosis – respuesta gradual
Práctica 8. Acción de la acetilcolina sobre el músculo recto anterior de
rana
Tema 8. Interacción de fármacos
Practica 9. Efecto de la succinilcolina en la acción de la acetilcolina en
músculo recto anterior de rana
V. Bibliografía recomendada VI. Anexos
Anexo 1. Respuestas a los problemas de la práctica de posología. Anexo 2. Manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos. Anexo 3. Formularios.
Formulario 1. Parámetros farmacocinéticos
Formulario 2. Cálculo de Kp órgano/sangre
Formulario 3. Método Sigma minus
Formulario 4. Análisis probit
Formulario 5. Índice Terapéutico y Margen Estándar de Seguridad
Formulario 6. Ecuación de Hill
55
60
66
75
82
84
84
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
I. Presentación
El trabajo experimental, siempre y cuando se cuente con el lugar y material necesario, es un
complemento indispensable par ayudar a los estudiantes a la comprensión de la Farmacología.
Confirmar a través del experimento los eventos comentados o discutidos en el aula, los libros,
las revistas, etc.
Por lo tanto, hay que conceder la máxima importancia al laboratorio, espacio donde conviven
maestros y alumnos, aprendiendo, por qué no, unos de otros. Así, el estudio por parte del
alumno no quedará reducido a memorizar cantidad de nombres, fórmulas, dosis, gráficas, etc.
Cosas que pueden olvidarse rápidamente.
Es conveniente que antes de abordar una práctica se documenten sobre el tema, y consultar
con sus maestros los problemas que se vayan presentando.
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Manual de Laboratorio
II. Forma de trabajo en el laboratorio
a) Formación de los equipos de trabajo
Al inicio de cada semestre escolar, los alumnos se distribuirán en equipos de trabajo los cuales
formarán de acuerdo a los siguientes criterios:
• Se formarán equipos de trabajo de acuerdo al número de alumnos.
• Los equipos se formarán con alumnos inscritos. Los alumnos que se den de alta
posteriormente, serán asignados a un equipo determinado por los profesores del módulo
• Los equipos deberán ser integrados por alumnos de ambos géneros, no se aceptarán
equipos con integrantes de un mismo género.
• Una vez formados los equipos no se aceptarán cambios de integrantes.
• Cualquier imprevisto será resuelto por los profesores del módulo.
b) Material necesario para el trabajo en laboratorio
La lista de materiales para un buen desarrollo de las prácticas de laboratorio se enlista a
continuación. Cabe señalar que este material es obligatorio y debe tenerse siempre disponible
en cada práctica.
Material individual
• Bata de laboratorio
• Marcador de tinta indeleble
• Cinta adhesiva
• Pipeta Pasteur de 1 mL con bulbo de plástico
• Libreta de laboratorio
• Este manual de prácticas
Material por equipo
• Perilla de succión o propipeta
• 8 Jeringas desechables de 1 mL
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
• 3 Jeringas desechables de 3 mL
• 2 Jeringas desechables de 20 mL
• Franela
• Papel higiénico
• 2 Rastrillos para rasurar sin lubricante
• 10 Tubos de ensaye de 13x100 mm
• Escobillón para tubos de ensaye
c) Normas de trabajo del Laboratorio de Farmacología
1. Para el trabajo experimental dentro del laboratorio es obligatorio el uso de bata, la cual
deberá estar correctamente abotonada. No se permitirá el trabajo e inclusive la
permanencia de los alumnos en el laboratorio sin bata, durante las sesiones
experimentales.
2. La tolerancia para el ingreso a la clase de laboratorio será de 10 minutos, después de
este tiempo el alumno podrá ingresar a la clase, sin embargo, tendrá inasistencia.
3. Está estrictamente prohibido fumar e ingerir alimentos dentro del laboratorio, tanto en las
sesiones teóricas como en las prácticas.
4. Cada equipo de trabajo es responsable de su material, la limpieza del mismo y de la
mesa.
5. Quedan estrictamente prohibidas las visitas dentro del laboratorio.
6. Al inicio del semestre se programarán las sesiones prácticas, teóricas, seminarios y
examen, de acuerdo con el calendario escolar en vigencia.
7. Al inicio del semestre se programarán los equipos que se encargarán de los cadáveres y
restos de los animales utilizados.
8. Los alumnos no podrán retrasar las sesiones programadas. No obstante, en caso de
suspensión de alguna de las sesiones por una causa de fuerza mayor, ésta será
reprogramada por los profesores del módulo.
9. Ningún alumno podrá retirarse si la sesión práctica o teórica no ha concluido. El traslape
de asignaturas es exclusivamente responsabilidad del alumno.
10. Cualquier imprevisto será resuelto por los profesores del módulo.
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Manual de Laboratorio
d) Mecanismos de evaluación
La evaluación del módulo se realizará tomando en cuenta los siguientes criterios:
• Trabajo de laboratorio
• Trabajo de investigación (cuestionario)
• Examen previo a la práctica
• Lectura de artículo (ficha de resumen)
• Informe de la práctica
• Seminario
Bajo las siguientes condiciones:
• La asistencia es obligatoria, para tener derecho a la calificación el alumno deberá tener
como mínimo un 80% de la misma.
• El alumno que no entregue su Trabajo de investigación/Cuestionario no tendrá derecho
a realizar la práctica.
• El alumno que no asista a la práctica, no tendrá derecho a entregar el informe de la
misma.
• Para obtener una buena calificación dentro del Trabajo de laboratorio (cuestionario), el
alumno deberá mostrar interés, cooperación y conocimientos durante el desarrollo de la
práctica. Este punto será evaluado constantemente por los profesores del módulo.
• Para obtener calificación aprobatoria, el alumno deberá tener todos los criterios de evaluación con calificación aprobatoria.
e) Programación de las prácticas
El formato para la programación de las prácticas se encuentra en la siguiente hoja. Los
profesores al inicio del semestre indicarán las fechas correspondientes.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
Actividad / Práctica Fecha(s) de realización
Organización
Práctica 1. Posología
Práctica 2. Manejo de animales
Práctica 3. Absorción
Práctica 4. Distribución
Práctica 5. Eliminación
Seminario 1.
Practica 6. Curva Dosis - Respuesta Cuantal
Practica 7. Bioensayo de toxicidad
Práctica 8. Curva Dosis - Respuesta Gradual
Práctica 9. Interacción de fármacos
Seminario 2.
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Manual de Laboratorio
III. Guías de trabajo
a) Guía para la elaboración de fichas resumen de artículo
1. La ficha deberá escribirse en una ficha tamaño media carta o en una hoja tamaño carta, a
máquina de escribir o computadora. No se recibirán manuscritos.
2. Los artículos podrán ser asignados por el asesor o seleccionados por del alumno.
3. Si el alumno elige sus artículos, éstos podrán estar escritos en español u otros idiomas, ser
de carácter experimental y la fecha de publicación deberá estar dentro de los últimos 5
años.
4. En el contenido de la ficha deberá especificarse claramente el objetivo del artículo, el
procedimiento seguido, los resultados obtenidos y las conclusiones a las que se llegaron.
Además de una breve introducción.
5. En las fichas en las cuales sólo se tradujo el Abstract, tendrán calificación igual a cero, sin
excepciones.
6. Los datos adicionales que contendrá la ficha son: referencia y datos del alumno como se
especifica en el siguiente ejemplo:
Tema: Relación Dosis-Respuesta cuantal. Toussaint M, Shedd T y Leather G. 1995. A comparison of standard acute toxicity test with rapid-screening toxicity test. Enviromental Toxicology and Chemistry, 14(5):907-915.
Alumna: Isabel Rivera F. Equipo: 3, Grupo: 1601
Las pruebas de toxicidad en animales son muy importantes debido a...
• Las fichas se entregarán únicamente el día de inicio de la práctica correspondiente, sin
prórroga.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
b) Guía para la elaboración de Trabajos de Investigación/Cuestionarios de investigación bibliográfica
1. Deberán entregarse a máquina de escribir, a computadora o en la libreta destinada al
laboratorio de farmacología. Por ningún motivo los trabajos deberán contener recortes o
texto digitalizado.
2. La extensión mínima es de tres cuartillas y la máxima de cinco. Por lo que la información
deberá ser resumida. Por cada cuartilla de menos o de más repercutirá en la calificación.
3. Cumplir con un mínimo de cinco referencias, tres de las cuales deberán ser
obligatoriamente de la lista anexa. Las referencias deberán escribirse en sistema
Vancouver.
4. El formato de entrega es libre.
5. Criterios de evaluación: cumplimiento de los puntos del cuestionario, calidad del resumen,
ortografía y limpieza.
6. Los trabajos de investigación (cuestionarios) se entregarán únicamente el día señalado en
el calendario de prácticas, sin prórroga.
7. Los trabajos de los alumnos que sean más del 50% igual tendrán una calificación igual a cero, sin excepciones.
c) Guía para la elaboración de informes
1. Encabezado: El informe no deberá contener portada ni adornos en las hojas. Se comenzará en una hoja
blanca colocando en renglón separado la siguiente información:
Titulo del informe, el cual tendrá que ser diferente al de la práctica, y no debe tener más
de 25 palabras.
Autor o autores, es decir, los nombres de los integrantes del equipo y subrayado el
nombre del integrante que entrega el informe.
Lugar y dirección donde se realizó el trabajo experimental, es decir, el nombre del
laboratorio, de la facultad y su dirección.
Ejemplo de la práctica de farmacocinética del equipo 4 que contiene 3 integrantes y es
entregado individualmente por uno de ellos:
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Manual de Laboratorio
Perfil farmacocinético de la sulfacetamida sódica en conejo.
Pérez O Juan, Ramírez M Elisa y Hernández J Francisco
Laboratorio de Farmacología L-202, Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM.
Av. Guelatao 66, Col. Ejército de Oriente, 09230, México D.F.
2. Resumen: El resumen deberá tener una extensión no mayor a media cuartilla, y en el se explicará
brevemente, el objetivo perseguido, el procedimiento y resultados obtenidos, así como la
conclusión principal de la práctica.
Ejemplo:
“Para realizar la determinación de la DE50 del pentobarbital sódico se utilizaron 6 grupos de
ratones a los cuales se les administraron dosis crecientes del fármaco por vía intraperitoneal y
se midió su perfil neurofarmacológico durante 30 minutos, registrando los cambios que
indicaran que había pasado al efecto de sedación. Los datos fueron analizados por el análisis
probit y se obtuvo una DE50 de 25.67 µg/kg con un LIC de 18.34 µg/kg y un LSC de 32.56
µg/kg que demuestran la efectividad del pentobarbital como sedante a concentraciones bajas”
3. Abstract: El abstract no necesariamente debe ser la traducción del resumen. Debe ser redactado de tal
forma que exprese la misma idea que el resumen aunque no proporcione la misma información.
Ejemplo de abstract para el resumen anterior:
“ED50 of sodium pentobarbital was calculated. Six mice groups were administrated
intraperitoneally with sodium sulfacetamide in increasing doses. Neuropharmacological profile
was observed for 30 minutes in order to detect sedation effect. Probit analysis was performed in
order to calculate ED50 and confidence interval. The results were ED50=25.67 µg/kg, UCL=18.34
µg/kg and LCL de 32.56 µg/kg, proved it efficacy in lower doses”.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
El abstract no tiene calificación, pero es obligatorio que este presente en el informe.
4. Introducción: La introducción no debe confundirse con el Marco Teórico donde se exponen los fundamentos y
conceptos de la práctica. En la introducción debe redactarse como la presentación del trabajo,
es decir, de manera breve interesar al lector y explicar que beneficios o conocimientos adquirirá
al leer el informe o los temas relacionados.
5. Marco Teórico: En el Marco Teórico se exponen los conceptos y fundamentos de la práctica, encontrados ya
sea, en libros o revistas. Su entrega es opcional y no tiene calificación.
6. Objetivo: El objetivo deberá responder a tres preguntas fundamentales:
¿Qué se va a hacer?
¿Cómo se va a hacer?
¿Para que se va a hacer?
Su redacción deberá ser breve, no mayor a 3 ó 5 renglones. El siguiente ejemplo es de una
práctica hipotética de determinación de la potencia relativa.
“Se determinará la potencia relativa de la metacolina por medio de la contracción de músculo
liso del ileon de cobayo utilizando la acetilcolina como estándar, para conocer su posible
aplicación en terapéutica en enfermedades gastrointestinales”
7. Hipótesis La hipótesis es una afirmación que se sujetará a comprobación mediante el protocolo
experimental que se desarrollará. No es necesario que esta afirmación sea cierta, sino que es lo
que queremos comprobar o refutar. La hipótesis siempre deberá estar relacionada con el
objetivo.
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Manual de Laboratorio
Su redacción por ningún motivo será en forma condicional, ni mencionar que “si trabajo bien el
experimento saldrá bien”, como:
“Si se realiza adecuadamente el experimento, podemos obtener los resultados esperados”
Un ejemplo de hipótesis de acuerdo con el objetivo anterior sería:
“La potencia relativa de la metacolina es mayor a 1 lo que indica que contrae con mayor eficacia
al músculo liso del íleon y por mayor tiempo que la acetilcolina”
8. Metodología: La metodología se divide principalmente en Materiales y Procedimiento.
a) Materiales. Se refiere a material biológico utilizado, sustancias y reactivos,
equipo e instrumentos. Con respecto al material biológico debe especificarse el
género y cepa del animal utilizado, de los reactivos la concentración, y de los
equipos e instrumentos el modelo o marca.
b) Procedimiento: Se describe el procedimiento realizado durante la práctica
incluyendo todas las modificaciones. Debe redactarse en pretérito y en prosa, sin
enumerar.
Pueden utilizarse diagramas de flujo o de bloques para describir mejor el procedimiento y por
ningún motivo éste último sustituirá a la redacción.
9. Resultados: Los resultados deberán expresarse en gráficas, esquemas o cuadros. Las gráficas deberán
contener los valores, unidades y nombres de los ejes, así como un título y pie de gráfica como
en el ejemplo:
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
Perfil farmacocinético del sulfametoxazol en rata
tiempo (min)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Log
conc
entra
ción
(mg/
mL)
0
1
2
3
4
Grafica 1. Perfil farmacocinético del sulfametoxazol en rata,
administrado por vía intraperitoneal.
Los esquemas y cuadros deberán contener un título y un pie de esquema o figura. Los valores
informados deberán tener sus unidades respectivas. No es necesario que se coloquen los
cálculos realizados.
10. Discusión de Resultados: En la discusión de resultados, no deben describirse los resultados como por ejemplo:
• La gráfica muestra un aumento en el tiempo 5 y una disminución al tiempo 30.
• Los resultados muestran que el Kp del músculo es el mayor.
• Los datos muestran una gran variación.
• Las muestras presentaron diferentes colores al igual que el blanco.
• Etc.
Para realizar una buena discusión deberán investigar y analizar, por ejemplo:
• ¿Por qué hay un aumento en el tiempo 5 y una disminución al tiempo 30?
• ¿Qué significa que el Kp del músculo sea el mayor?
• ¿Por qué hay una gran variación en los datos?
• ¿Por qué las muestras no tienen el color debido?
• Etc.
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Manual de Laboratorio
Cada análisis deberá estar bien fundamentado, referenciado en estilo Vancouver, y se deberá
omitir aquellas en las cuales:
• Los reactivos no servían
• Los equipos no estaban calibrados o no sirven.
• No trabaje bien.
• El clima influyó en la determinación.
La discusión es la parte principal del informe por lo que influye mucho su calidad en la
calificación.
11. Conclusiones: Las conclusiones deberán ser breves y deben redactarse con respecto a los objetivos. No son
validas las conclusiones como:
“Se cumplió con el objetivo y la hipótesis fue cierta”
Un ejemplo de conclusiones con respecto al objetivo anterior sería:
“La potencia relativa, con respecto a la acetilcolina, de la metacolina fue de 1.27 al realizar el
experimento en íleon de cobayo. Esta valor indica que es más potente que la acetilcolina que
junto con su característica de hidrolizarse lentamente, lo hace adecuado para patologías
asociadas a una falta de estimulo por acetilcolina en músculo liso”
12. Sugerencias: Las sugerencias son todas aquellas observaciones que nos ayudarán a que.
• El experimento cumpla con sus objetivos, es decir, se obtenga los resultados esperados.
• El alumno adquiera mayores conocimientos y práctica, así como criterios para la toma
de decisiones.
• Se minimicen los problemas que aparecen durante el desarrollo.
Esta parte del informe no tiene calificación y puede omitirse cuando no haya observaciones.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
13. Referencias: Las referencias deberán escribirse en estilo Vancouver. Deberán escribirse por orden de
aparición sin omitir los datos de la referencia y las páginas consultadas. El mínimo de
referencias para el informe es 5 (cinco).
Para mayor información del estilo Vancouver deberán consultar el siguiente sitio de Internet:
http://www.icmje.org/
d) Guía para la presentación del seminario
• El seminario deberá contener los siguientes puntos:
• Resumen
•
•
•
•
•
•
• Sugerencias
Introducción
Marco teórico
Objetivos e hipótesis
Desarrollo experimental
Discusión de resultados
Conclusiones
• Todos los puntos, con excepción de la discusión de resultados deberán tratarse
brevemente.
• Se deberán utilizar acetatos, diapositivas o proyector (cañón). El material deberá ser
totalmente legible a una distancia mínima de 5 m.
• El tema de exposición deberá ser dominado por todos los integrantes del equipo, sean o no
expositores.
• No se permitirá que el expositor sólo lea su información: deberá de explicarla y darla a
entender. Además, siempre deberá estar frente al grupo y hablar apropiadamente.
• Al final de cada exposición habrá una sesión de preguntas, donde, tanto alumnos como
profesores harán las mismas.
• Todos los equipos receptores están obligados a expresar sus dudas y/o sugerencias al final
de la exposición.
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Manual de Laboratorio
• No se permitirá que los alumnos realicen otras actividades en el momento de la exposición.
Además no se permitirá que se sienten en las últimas filas si las primeras están
desocupadas.
• La evaluación correrá a cargo de todos los profesores. Cada uno dará una calificación a
cada uno de los integrantes de los equipos, las cuales se promediarán para dar la
calificación de la exposición.
• Por ningún motivo habrá prórrogas o segundas oportunidades, sin excepción.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
IV. Prácticas de Laboratorio
Tema 1. Posología
PRÁCTICA 1. POSOLOGÍA.
OBJETIVO
Conocer las principales vías de administración de fármacos más comúnmente utilizadas en
animales, así como los procedimientos para los cálculos de dosificación empleados para una
adecuada administración de fármacos y medicamentos en animales de experimentación.
INTRODUCCIÓN
Existe una relación entre los efectos farmacológicos, ya sean terapéuticos o tóxicos, y la
cantidad administrada del fármaco, por eso es tan importante calcular las dosis ajustándose a
las necesidades de cada individuo teniendo en cuenta los factores que pueden modificar las
respuestas como:
• El peso corporal,
• Edad,
• Raza,
• Género,
• Constitución genética, etc.
También deben considerarse otros factores como los
• Inherentes al fármaco
• Inherentes a la vía de administración
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Manual de Laboratorio
En esta sesión se resolverán algunos problemas relacionados con las dosis a administrar en
función de diversos factores como el peso corporal, concentración y especie animal, cálculos
muy usuales en el laboratorio de farmacología.
CUESTIONARIO
1. Describe brevemente los siguientes conceptos: fármaco, droga, medicamento y xenobiótico.
2. Indica la diferencia entre los estudios in vivo, in vitro, e in situ.
3. Indica las ventajas y desventajas de las principales vías de administración de fármacos en
animales.
4. Describe los factores inherentes al fármaco que influyen en la dosificación
5. Describe los factores inherentes al individuo que influyen en la dosificación.
6. Indica los principales vehículos utilizados para la administración de fármacos en animales.
PROBLEMARIO
1. Al realizar la lectura de una muestra en el espectrofotómetro, la lectura de la misma está
fuera del margen de la curva estándar, por lo que se tiene que hacer diluciones. Indique
como prepararía las diluciones 1:2, 1:5, y 1:10 de la muestra considerando que el volumen
mínimo que lee el espectrofotómetro es de 5 mL.
2. Para preparar una disolución de sulfacetamida, se disolvieron 2.38 g de sulfacetamida
sódica en 100 mL de agua. ¿Cuál es la concentración en %p/v de sulfacetamida libre?
3. Calcule las diluciones necesarias para obtener 100 mL de una disolución de acetilcolina con
una concentración de 16 μg/mL a partir de 200 mg de acetilcolina en polvo, utilizando agua
destilada como disolvente.
4. Tiene 3 ratones de 24.3 g, 19.8 g y 21.7 g de peso, y desea administrarles xilacina para
anestesiarlos. El efecto anestésico de la xilacina en ratones es a 0.2 mg/Kg de peso.
Indique el volumen y las dosis que se administrarán a cada ratón si se tiene una disolución
stock de 20 µg/mL y una jeringa de 1 ml con divisiones de 0.02 mL.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
5. Calcule la dosis y el volumen que debe administrarse de meperidina como preanestésico a
un paciente de 72 Kg de peso, tomando en cuenta que:
a) La dosis usual es de 1 mg/Kg de peso
b) La presentación farmacéutica disponible es en ampolletas de 2 mL de una disolución
al 2.5% para administración intramuscular.
6. Para realizar un perfil farmacocinético en conejo, se le administró 3.1 mL de una disolución
de ácido acetilsalicílico con una concentración de 2%. ¿Cuál fue la dosis administrada?
7. Calcule la dosis y el volumen necesario de pentobarbital sódico para un ratón de 28 g. La
dosis anestésica es de 50 mg/Kg y la presentación farmacéutica es de 63 mg/mL.
a. ¿Es posible medir el volumen calculado o es necesario hacer alguna dilución?
b. Si hace la dilución, tome en cuenta que el máximo volumen a administrar es de
10 mL/Kg.
8. Tiene tres disoluciones de paracetamol cuyas concentraciones son:
a. 150 µg/mL
b. 0.0001 M
c. 0.03%
Sin embargo, para realizar un experimento necesita que todas las disoluciones estén en las
mismas unidades de concentración. ¿Cuál es la concentración en mg/mL de cada
disolución?
9. Indique el procedimiento para preparar 100 mL de una disolución de acetilcolina a una
concentración de 200 µg/mL a partir de:
a. Cloruro de acetilcolina al 98% de pureza
b. Una disolución de acetilcolina a 300 µg/mL y agua
c. Dos disoluciones de acetilcolina a 250 µg/mL y 50 µg/mL
10. Se tienen dos conejos de 5.4 y 5.7 Kg de peso. A dichos conejos se les debe administrar las
mismas dosis de sulfadiazina que es de 400 mg. Si se tiene una disolución de sulfadiazina
de 0.125 g/mL, ¿qué volumen se debe administrar a cada conejo?
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Manual de Laboratorio
Tema 2. Manejo de animales
PRÁCTICA 2. MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO.
OBJETIVO
Conocer y aplicar las normas éticas para el manejo adecuado de los animales de laboratorio;
así como, los métodos de sujeción, inmovilización y transporte de la rata y ratón, que han dado
mejores resultados en el laboratorio.
INTRODUCCIÓN
La investigación científica requiere el uso de animales para experimentación. Asimismo el uso
de sistemas experimentales in vivo en investigación permite tener un modelo integrador de
procesos fisiológicos y funcionales, que lleva una aplicación más segura en tratamientos
médicos para el ser humano. Es evidente que sólo se justifica el uso de animales para
experimentación, en investigaciones científicas perfectamente encaminadas a ampliar el saber
en beneficio de la sociedad. Por ello es imprescindible que, por un lado, se optimice el uso de
animales mediante un manejo correcto de los mismos y, por otro lado, que los animales
utilizados sean los adecuados y que sean confiables en las pruebas a las que son sometidos
por los investigadores.
Saber manejar a los animales es un aspecto que debe conocer perfectamente el estudiante de
ciencias de la salud, ya que durante sus estudios y posteriormente en la práctica profesional,
requiere de métodos seguros, útiles, prácticos y rápidos para la sujeción e inmovilización de las
diferentes especies animales.
Quien de una manera u otra maneja animales, ante todo ha de perder el temor que por ellos
sienta, pero no debe volverse confiado y comprometer su seguridad.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
Tampoco debemos olvidar, hechos como el celo que muestran algunos machos hacia su
derecho de posesión (territorio, hembras), el de las madres por sus crías y viceversa.
Se deben tomar en cuenta muchos factores como son : los hábitos naturales de la especie, sus
reacciones ante determinados actos, la raza y la individualidad, estudiando dentro de ellas la
edad, el sexo, el estado de salud o enfermedad y el momento fisiológico (estro, gravidez,
estado postoperatorio).
En la actualidad los tranquilizantes y anestésicos, facilitan el manejo de animales, suministrados
por vía parenteral o inhalados.
Por último, y esto es muy importante, es necesario que la persona que desarrolla esta actividad,
tenga control completo de sí mismo como del animal. La tensión o el nerviosismo pueden influir
y causar dificultades.
Recordemos, también, que una nueva tendencia de la genética es la de crear animales de fácil
manejo y en la actualidad ya se producen nuevas líneas de animales dóciles y apacibles, por lo
tanto, fáciles de manejar.
En la presente práctica se han recopilado los métodos más sencillos para tales fines y se hace
mención del material necesario y fácil adquisición. Se mencionan algunos procedimientos
clínicos para la administración de sustancias, donde el manejo se ve facilitado por el empleo de
aparatos y dispositivos, así como de tranquilizantes, sedantes y anestésicos.
En los cursos de laboratorio de Farmacología, se llevan a cabo tres tipos de
experimentos con los animales: in vivo, in vitro e in situ. Cuando se utiliza al animal íntegro y
vivo; cuando se utiliza una muestra de órgano o tejido en condiciones ambientales adecuadas,
y; cuando se utiliza algún órgano o tejido en el sitio original, respectivamente.
Los animales de uso común en los experimentos farmacológicos son el conejo, la rata, el ratón
y la rana de laboratorio. Esto es, por su costo, tamaño, reproducción y fácil manejo. Para otras
investigaciones básicas del área biomédica también se utilizan especies como el perro, el gato,
primates, etc.
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Manual de Laboratorio
Por lo anterior, es importante tener conocimiento de las técnicas de manejo de los animales y
todos los procedimientos durante las prácticas del laboratorio de Evaluación de Fármacos y
Medicamentos que han tenido éxito durante los últimos semestres.
METODOLOGÍA
Material por equipo de trabajo:
Material biológico:
• Una rata hembra Wistar
• Un ratón hembra CD-1
Cristalería y equipo
• Jeringas de 1, 5 y 10 mL
• Vaso de precipitados
• Tabla y estuche de disección
• Franela
• Hilo de cáñamo
Reactivos
• Azul de metileno al 5%
DESARROLLO EXPERIMENTAL
I. Técnicas de marcaje para identificación individual de los animales.
Frecuentemente se utilizan más de un animal en las diferentes investigaciones, por lo que
resulta necesario identificar de manera individual a los animales de un grupo. Las técnicas más
utilizadas son las siguientes:
• Marcado con ácido pícrico al 10%, aplicado en la parte dorsal de los animales con un
pincel, esta sigue una clave.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
• Marcado de las orejas. Consiste en hacer perforaciones o muescas con unas pinzas
especiales, tanto para la rata como el ratón. Esta técnica se recomienda cuando los
experimentos son de larga duración y se utilizan grandes cantidades de animales. La
clave que se sigue en el laboratorio de Farmacología se muestra en la figura 1.
• Marcado con plumón marcador. El marcado se realiza en la cola del animal, siguiendo la
clave de la figura 2. Esta técnica se recomienda cuando se utilizan pocos animales y en
experimentos muy cortos en duración.
II. Técnicas de sujeción
Sujetar: es “impedir la acción o movimiento, sea por medio de la acción física o moral o por la
interposición de un obstáculo”. “Someter al dominio de alguno”. Inmovilizar: “Dejar sin
movimiento”.
Se debe elegir entre una sujeción general, la sujeción de un área particular o algo que evite el
movimiento para distraer la atención del animal.
Cada especie fue dotada por la naturaleza de medios de defensa especiales (dientes, uñas,
etc.); en la práctica deben conocerse estas armas para cuidarse de ellas.
Todo método de sujeción e inmovilización debe permitir la libre respiración, por lo que se evitará
entre otras cosas, la obstrucción de la nariz, opresión del cuello u otra región evitando la
circulación normal de aire o sangre. Muchos animales resultan heridos por el abuso de las
técnicas de sujeción o por aplicación de las mismas indebidamente.
Conejo
En el manejo de esta especie frecuentemente se incurre en prácticas no adecuadas que
ocasionan trastornos a los animales y en consecuencia a la exploración.
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Manual de Laboratorio
La mayoría de las personas tienden a levantar a los conejos por las orejas (Figura 3) por ser
una de las partes más sobresalientes en estos animales; esto nunca debe hacerse, pues no
sólo se maltratan sino pueden lesionarse las orejas y el oído.
Hay dos formas correctas de manejar a los conejos:
Con la mano izquierda se suspenden de la piel floja del dorso, arriba de las espaldillas y con la
mano derecha se les sujetan las patas (Figura 4).
También se pueden manejar (sobre todo cuando se sacan de sus jaulas) en la siguiente forma:
con la mano derecha se sujeta de la piel floja de la región dorsal comprendida entre los
miembros anteriores y el cuello, después con el brazo y la mano izquierda se inmoviliza el
animal (Figura 5).
Rata
Junto con el ratón, estos animales ofrecen mayor dificultad en su manejo porque al sentirse
capturados con frecuencia muerden.
Para capturar a la rata dentro de la jaula, la manera más práctica es tomarla con una mano de
la cola y con la otra sujetar la piel del cuello, con esto no puede atacar y queda inmovilizada
(Figura 6).
También puede sujetarse con una sola mano, rodeando el cuello con el pulgar y el índice,
cuidando de no ejercer mucha presión y provocar asfixia. Abrazar con la palma de la mano,
levantar y voltear la parte ventral hacia el manejador (Figura 7). Esta técnica de sujeción nos
servirá para la administración intraperitoneal e intramuscular. Se requiere mucha práctica para
perfeccionar la técnica.
Ratón
Los ratones facilitan aún más su manejo, bastando con tomarlos de la cola con los dedos medio
e índice (como se toma un cigarro) y rodearlo con el resto de la mano (Figura 8).
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
Para inyecciones o inoculaciones deberá tomarse de la piel del dorso con el pulgar y el índice,
sosteniéndolo de la cola con el meñique y el anular apoyados en la palma de la mano (Figura
9).
Rana
Para el manejo de la rana es necesario humedecer las manos antes de tomarla. Luego,
se debe tomar firmemente entre la mano dejando expuesta la cabeza, con el fin de desmedular
y descerebrar a la rana.
Doblar ligeramente la cabeza del animal, se introduce un estilete en el orificio que se
encuentra en la línea media de la cabeza a nivel de las membranas timpánicas. Con un
movimiento circular hacia la derecha se destruye el cerebro (Figura 10). Luego se cambia la
dirección del estilete a la izquierda, se introduce hasta en el canal medular, se rota hasta
observar la relajación de las extremidades inferiores o traseras (Figura 11).
III. Técnicas para la administración de fármacos o medicamentos
Intravenosa
Durante la práctica de Farmacocinética, se requiere administrar algunas sustancias como tomar
muestras de sangre en un conejo. Este procedimiento se lleva acabo en las venas marginales
que se encuentran en la oreja del conejo (Figura 12). Es muy importante seguir las indicaciones
del maestro de mesa.
Intramuscular
La administración intramuscular se aplica en la parte muscular de las patas traseras, en la
región glútea, ya sea del conejo, la rata o el ratón (Figura 13).
Intraperitoneal
Después de haber sujetado a la rata y el ratón, por la técnica anteriormente descrita, se divide,
de manera imaginaria, la región ventral en cuatro cuadrantes. Se puede elegir cualquiera de los
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Manual de Laboratorio
cuadrantes, se coloca la jeringa en un ángulo de 45º, para luego administrar el fármaco (Figura
14). Antes de inyectar se debe verificar que se encuentra en el peritoneo, al jalar el embolo de
la jeringa debe entrar aire, si esto no ocurre debemos tratar nuevamente.
Subcutánea
Generalmente se lleva a cabo en el conejo, se toma la piel floja de la espalda, se introduce la
jeringa y se administra nuestra sustancia problema (Figura 15).
Intracardiaca
En la práctica de Farmacocinética (Volumen de distribución), se debe obtener una muestra de
sangre por punción intracardiaca. Con la ayuda del medio se percibe el pulso cardiaco a un
centímetro, aproximadamente, de la última costilla de la rata. Se introduce una jeringa de
insulina a 90º, y se toma la muestra de sangre.
Oral
Por otro lado, para la administración oral es necesario sujetar, con la ayuda de dos pedazos de
hilo los dientes incisivos y caninos, para mantener el hocico del animal abierto. Luego, se
introduce una cánula, que esta conectada a una jeringa, por la que se introduce la sustancia
prueba (Figura 16).
La anestesia poco profunda que se logra colocando a los animales dentro de un frasco donde
previamente se coloca un algodón impregnado en cloroformo, facilita mucho cualquier maniobra
dolorosa como las inoculaciones por vía oral o la obtención de sangre por punción
intracardiaca.
Todas las técnicas descritas, necesitan para su aplicación, suficiente práctica por parte del
alumno, la cual se podrá adquirir en esta sesión.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
IV. Técnicas de eutanasia
Eutanasia se define como la opción de favorecer la muerte deliberadamente de algún individuo
con una enfermedad incurable o una lesión irreparable. Puede ser de manera activa, con la
administración de una sustancia letal, o pasiva, dejando que el individuo muera sin ningún
tratamiento.
Es importante saber que después de haber utilizado los animales, en experimentos in vivo, se
deben sacrificar adecuadamente. Los métodos comúnmente aplicados son la sobredosis de
algún anestésico por vía intravenosa o intraperitoneal, inhalación de éter, cloroformo, bióxido de
carbono, nitrógeno, etc. ¿Cuándo se deben eliminar a los animales? Después de utilizarlos más
de una ocasión, por enfermedad o defectos genéticos.
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Manual de Laboratorio
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
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Manual de Laboratorio
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
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Manual de Laboratorio
TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS De acuerdo con los resultados discuta sobre:
• Las técnicas de manipulación de animales.
• Las diferentes vías de administración
• Las técnicas de eutanasia.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son las principales formas de sacrificar a los animales y cuándo se llevan a cabo?
2. ¿Qué tipo de investigaciones se realizan con las diferentes especies animales utilizadas en
el laboratorio?
3. ¿Cuáles son las características ideales que debe tener un animal para ser incluido en un
protocolo de investigación?
4. ¿Qué significa eutanasia?
5. ¿A qué se le denomina xenobiótico?
6. ¿A qué se refiere cuando hablamos de experimentos in vivo, in vitro e in situ?
7. ¿Qué características individuales debemos conocer de las diferentes especies animales?
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Manual de Laboratorio
Tema 3. Farmacocinética: Absorción
PRÁCTICA 3. DETERMINACIÓN DEL PERFIL FARMACOCINÉTICO DE LA SULFACETAMIDA
SÓDICA EN CONEJO.
OBJETIVO
Realizar el estudio farmacocinético de la sulfacetamida sódica en conejo ensayando diferentes
vías de administración, para determinar cuál de ellas es mejor.
INTRODUCCIÓN
Cuando se administra un fármaco a un organismo varios procesos como la absorción,
distribución, biotransformación y eliminación influirán en la biodisponibilidad del fármaco. Estos
procesos tienen lugar durante un período determinado y por esto pueden medirse y expresarse
como velocidades. La ciencia que mide las velocidades de absorción, distribución y eliminación
de un fármaco se llama Farmacocinética.
La administración de un fármaco tiene por objeto la obtención de un efecto que está
estrechamente relacionado con la concentración plasmática por lo tanto es posible predecir que
los cambios en la concentración plasmática producirán cambios en el efecto del fármaco. El
conocimiento de los parámetros cinéticos que gobiernan las concentraciones plasmáticas es de
gran ayuda para elegir la dosis, el intervalo y la vía de administración apropiada para obtener el
efecto deseado.
Para la determinación de los parámetros farmacocinéticos existen modelos matemáticos los
cuales consideran al organismo como compartimientos y así tenemos el modelo abierto de un
compartimiento (MAUC) y el modelo abierto de dos compartimientos ó bicompartimental
(MABC).
Para el modelo abierto de un compartimiento se hacen las siguientes consideraciones:
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
a) El fármaco se absorbe siguiendo una cinética de primer orden.
b) La distribución del fármaco es instantánea en un compartimiento central que es la sangre.
c) La concentración plasmática es representativa de los tejidos por establecerse un equilibrio.
d) La eliminación del fármaco ocurre a partir del compartimiento central con una cinética de
primer orden.
Para el modelo abierto de dos compartimientos:
a) El fármaco se absorbe con una cinética de primer orden.
b) El fármaco se distribuye del compartimiento central a un segundo compartimiento llamado
periférico.
c) La eliminación del fármaco es a través del compartimiento central con una cinética de primer
orden.
METODOLOGÍA
Material por equipo de trabajo:
Material biológico:
• Un conejo de 2.0 a 2.5 Kg con 12 horas de ayuno
Cristalería y equipo
• 10 tubos de ensaye de 13x100 mm
• 10 tubos de ensaye de 15x150 mm
• 1 gradilla
• 2 jeringas de 1 mL
• 2 jeringas de 3 mL
• 1 rastrillo
• 1 balanza de dos platillos
• 1 balanza con canastilla
• 1 centrífuga
• 1 colorímetro
• 1 cepo para conejo
• Papel Parafilm
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Manual de Laboratorio
• Algodón
Reactivos.
• Sulfacetamida sódica (disolución al 10%)
• Heparina (disolución 5000 UI/mL.)
• N-naftiletilendiamina al 0.05%
• Ácido tricloroacético al 25%
• Nitrito de sodio al 0.5%
• Sulfamato de amonio al 0.5%
• Xilol
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Preparación de la curva patrón de sulfacetamida sódica.
Pesar 0.2 g. de sulfacetamida sódica, disolver con agua destilada en un matraz volumétrico de
100 mL y aforar. De esta disolución pasar a matraces volumétricos de 100 mL 0.1, 0.2. 0.4, 0.8,
1.0, y 2.0 mL y llevar al aforo con agua destilada siendo la concentración final de 2.0, 4.0, 8.0,
16.0, 20.0 y 40.0 μg/mL. Mida 2.0 mL de cada una de las disoluciones y siga la técnica de
Bratton-Marshall para determinar las absorbancias.
Con las absorbancias construya una gráfica colocando las concentraciones en las abscisas y
las absorbancias en el eje de las ordenadas.
Preparación del material biológico.
Pese al conejo y proceda a rasurar ambas orejas. No utilizar rastrillo con lubricante o jabón.
Heparinización. Administre una dosis de 1500 U/Kg de heparina por vía intravenosa. Deje transcurrir 5 minutos
y tome una muestra de 0.2 mL de sangre (muestra blanco t=0).
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
Administración del fármaco.
Calcule la dosis y el volumen a administrar de la sulfacetamida sódica de acuerdo al peso del
conejo (dosis: 75 mg/Kg).
Para la vía intravenosa utilice la vena marginal de la oreja (sitio diferente a la administración de
la heparina). Tome el tiempo.
Para la vía intramuscular utilice el muslo de la pata trasera.
Toma de muestras.
Se tomarán 0.2 mL de sangre de la vena marginal de la oreja donde se administró la heparina a
los siguientes tiempos: 5, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos. Procese las muestras siguiendo la
técnica de Bratton-Marshall.
Determinación colorimétrica de sulfonamidas en sangre total (Bratton–Marshall.)
Medir 0.2 mL de sangre y añadir 1.8 mL de agua destilada, deje reposar 5 minutos, agregar 0.6
ML. de ácido tricloroacético al 25 % agitar y reposar 5 minutos. Centrifugar a 3000 rpm durante
5 minutos. Observe que el sobrenadante esté transparente, si presenta turbidez centrifugue 5
minutos más. Medir 2 mL de sobrenadante y adicione dos gotas de nitrito de sodio al 0.5%
mezclar y dejar en reposo 2 minutos. Añadir 1.0 mL de sulfamato de amonio al 0.5%, agitar y
reposar 2 minutos. Para el desarrollo de color al momento que vaya a leer en el colorímetro
adicionar 2 mL de N-naftiletilendiamina al 0.05% y mezclar. Se obtiene una coloración rosa.
Leer a 540 nm la absorbancia.
Interpole las absorbancias en la curva patrón para determinar la concentración de la
sulfacetamida en cada una de las muestras y recopile los resultados de todos los equipos de
trabajo llenando cada uno de los cuadros de resultados.
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Manual de Laboratorio
TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS
Con los resultados construya las graficas de concentración contra tiempo y aplique las
ecuaciones de acuerdo al modelo matemático (ver formulario anexo) y calcule para cada vía de
administración:
• Área bajo la curva (ABC)
• Concentración máxima (Cmax)
• Tiempo de concentración máxima (tmax)
• Constante de absorción (Ka)
• Constante de eliminación (Ke)
• Volumen aparente de distribución (Vd)
• Tiempo de vida media biológica (t1/2)
• Biodisponibilidad absoluta (Fabs)
• Biodisponibilidad relativa (Frel)
Con los parámetros anteriores analice y determine:
• La vía de administración que presenta el mayor tiempo de actividad.
• El régimen de dosificación por cada vía de administración.
• La mejor vía extravascular de administración.
CUESTIONARIO
1. Describe brevemente los conceptos de farmacocinética y farmacodinamia.
2. Describe las fases que comprende el proceso LADBE.
3. Indica el concepto de Compartimento y su utilidad en la descripción de los parámetros
farmacocinéticos.
4. Indica y localiza los principales parámetros farmacocinéticos en una curva Cp = ƒ(t).
5. Describe brevemente los conceptos de Concentración Mínima Efectiva (CME) y
Concentración Máxima Tolerada (CMT).
6. Indica las propiedades físicas, químicas, farmacológicas y toxicológicas de la sulfacetamida
sódica.
7. Indica el valor de Concentración mínima efectiva de la sulfacetamida sódica.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
8. Indica el procedimiento para elaborar un Régimen de dosificación.
9. Describe el fundamento químico de la determinación colorimétrica de sulfonamidas.
10. Indica el procedimiento para el cálculo de la Biodisponibilidad relativa y Biodisponibilidad
absoluta y utilidad de dichos parámetros.
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Manual de Laboratorio Manual de Laboratorio
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
Tema 4. Farmacocinética: Distribución
PRÁCTICA 4. DISTRIBUCIÓN DE LA SULFACETAMIDA SÓDICA EN RATA.
OBJETIVO Calcular experimentalmente la concentración de sulfacetamida sódica en diferentes órganos y
líquidos corporales de la rata, después de haberla administrado por vía intraperitoneal para
determinar el perfil de distribución.
INTRODUCCIÓN
La Farmacología puede ser definida como la ciencia de los fármacos. Incluye el estudio de sus
fuentes (materia médica); sus acciones en los organismos animales vivos (Farmacodinamia),
la manera en la cual son absorbidos, trasportados a través del cuerpo, y excretados
(Farmacocinética); su uso en medicina (Terapéutica); y sus efectos adversos (Toxicología).
Uno de los objetivos de la farmacocinética es describir en términos relativamente simples el
fenómeno complejo que involucra la disposición del fármaco y la respuesta. Lo último incluye la
cinética de la absorción de la droga, distribución y eliminación, así como la cinética de la
respuesta farmacológica. Están implicados varios procesos físico-químicos, bioquímicos y
fisiológicos en la disposición del fármaco y pueden ser descritos por algunas relaciones
matemáticas. La aplicación de los principios básicos de la farmacocinética en la terapéutica es
estudiada por la Farmacocinética Clínica.
Las tres etapas que se muestran en la Figura 16, biodisponibilidad, distribución y
depuración son las principales variables farmacocinéticas. Varios procesos fisiológicos
(maduración de la función de órganos en infantes) y patológicos (daño cardíaco y renal)
sugieren el ajuste de dosis en pacientes de manera individual. Basado en la modificación de
parámetros farmacocinéticos específicos. Las dos variables básicas en la farmacocinética son
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Manual de Laboratorio
la depuración, parámetro para medir la forma de eliminar la droga del organismo; y el volumen
de distribución, parámetro para calcular el fármaco disponible en el organismo.
El proceso de extrapolación requiere del avance de muchas disciplinas diferentes que podrían
incluir la ingeniería, física, biología, química, patología, farmacología, fisiología, salud pública,
inmunología, epidemiología, bioestadística y salud ocupacional.
Dosis del fármaco
Concentración del fármacoen circulación sistémica
Fármaco en tejidos(distribución)
Fármaco biotrransformadoo excretado
Concentración del fármacoen el sitio de acción
Efecto farmacológico
Respuesta clínica
Toxicidad Eficacia
Utilidad
biodisponibilidad
depuracióndistribución
farmacocinética
farmacodinamia
Figura 16. Representación esquemática del proceso farmacocinético y farmacodinámico que vincula la administración del fármaco y sus efectos.
Distribución.
Una vez absorbido, el fármaco puede ser distribuido a través de varios compartimientos en el
cuerpo. La distribución de un fármaco depende de sus características físico-químicas y de las
propiedades de los compartimentos corporales. Además de su afinidad por los tejidos, su
hidrosolubilidad, liposolubilidad, unión a sustancias extracelulares y captación intracelular.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
La albúmina sérica posee muchos sitios de unión no-específicos para los xenobióticos, y por lo
tanto llega ser un sistema de transporte para muchas sustancias. La albúmina es la principal
proteína del plasma (50% del total). La mayor parte de los procedimientos rutinarios para la
determinación de las concentraciones del fármaco comienzan con la desproteinización.
Invariablemente este paso es una precipitación (ejemplo, con el ácido tricloroacético), seguido
por la separación de las proteínas por filtración o centrifugación. En tales procedimientos de
datos analíticos representarán las concentraciones totales de fármaco debido a que el fármaco
unido a la proteína se libera a la solución sobrenadante o filtrado.
El balance entre los estados disociados (polar) y no disociados (no polar) afecta la distribución
de un químico, porque el pH cambia del fluido extracelular (pH 7) al del plasma (pH 7.4). El
coeficiente de partición de una sustancia también influye en su distribución, determinando, por
ejemplo, el grado de secuestro en la grasa. Las sustancias altamente liposolubles serán
secuestradas en el tejido adiposo por largo tiempo. La cantidad varía de acuerdo a la edad y a
la localización.
La velocidad de entrada de un fármaco a los diferentes tejidos del cuerpo depende obviamente
de las velocidades relativas del flujo sanguíneo a través de los lechos capilares respectivos y de
la permeabilidad de los capilares a las moléculas del fármaco en particular.
El equilibrio de distribución del fármaco en la sangre y los tejidos depende del riego sanguíneo
que llega al órgano. Este equilibrio se ve influido por el “Volumen aparente de distribución” de
cada fármaco, que se considera como “el volumen líquido en cual parece distribuirse un
fármaco (Vd)”.
El rango de distribución de una sustancia esta en función del flujo sanguíneo a través de los
tejidos (irrigación de tejidos). Primero se acumulará en los órganos más irrigados, y al último, en
los menos irrigados. Entonces se establece un equilibrio, luego se distribuirá en base a su
solubilidad. En seguida de la administración intravenosa de una sustancia con un alto
coeficiente de partición, el equilibrio se alcanza instantáneamente en el riñón y el hígado por su
alta vascularidad, casi inmediatamente en el cerebro, a los 30 minutos en el músculo, y a las 3
horas en el tejido graso.
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Manual de Laboratorio
Los fármacos actúan sobre la superficie de la membrana externa, para luego pasar a través de
ella. Se debe tomar en cuenta las propiedades bioeléctricas, las funciones bioquímicas, los
receptores superficiales y el mecanismo para el paso de los fármacos al interior de las células.
Para las células secretoras y las neuronas es importante no olvidar la salida de sustancias.
El fármaco puede entrar a los tejidos del sistema nervioso central por dos vías distintas: la
circulación capilar y el líquido cefalorraquídeo (LCR). Las membranas que rodean al cerebro y
las separan de los vasos sanguíneos constituyen la barrera hematoencefálica, solo dejará pasar
agentes liposolubles, tales como los anestésicos.
El intercambio de alimentos, oxígeno y bióxido de carbono, así como de los fármacos, debe
ocurrir principalmente a través de la placenta, de la sangre arterial materna por medio de los
espacios intervellosos a los capilares fetales en las vellosidades y por último a la sangre venosa
principal.
Volumen de distribución.
El volumen de distribución puede modificarse en función de factores inherentes al individuo y al
fármaco. Factores del individuo como sexo, edad, enfermedad, grasa corporal, influyen en el
volumen de los diversos compartimentos. Factores inherentes al fármaco como el pK, pH, grado
de unión a proteínas del plasma, coeficiente de reparto lípido/agua y grado de unión de la
molécula, activan a otros tejidos del organismo.
Volumen aparente de distribución.
El volumen aparente de distribución (Vd) de un fármaco es el volumen líquido en que
aparentemente se disuelve. La determinación del Vd es un principio simple. Una cantidad
conocida de fármacos se inyecta por vía intravascular y después de suficiente tiempo para su
distribución se toma una muestra de sangre en la que se determina la concentración de
fármaco en el agua plasmática.
El volumen de distribución (Vd) relaciona la cantidad de fármaco administrado y la cantidad de
droga (C) en sangre o plasma:
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
cantidad total del fármaco administrado (mg) Vd =
concentración de fármaco en el plasma (mg/L)
Una gran cantidad de sustancias se distribuye aproximadamente en el volumen de líquido
extravascular. Un problema práctico al calcular el Vd es el hecho de que a menudo los fármacos
no tiene un compartimiento ideal. Se biotransforman, se excretan o se secuestran, de tal
manera que nunca se obtiene la meseta real de distribución. Primero, la concentración
plasmática disminuye rápidamente, después con más lentitud, para que después continúe
disminuyendo. Lo que se necesita hacer es tratar de determinar cuál sería la concentración
plasmática si no estuviera presente el proceso responsable de la disminución continua. Esta
determinación se obtiene por extrapolación de la que finalmente sería la velocidad de
declinación, retrocediendo hasta el momento de la inyección. Naturalmente, esto se tiene que
hacer en una gráfica semilogarítmica, suponiendo que las diferentes fases de desaparición del
fármaco del plasma son de primer orden.
Las moléculas del fármaco son distribuidas a través del cuerpo por la circulación sanguínea. El
volumen de sangre total (cerca de 6 litros) es bombeado a través del corazón cada minuto;
después de unos minutos la droga entra al sistema circulatorio y es diluido en el total de la
sangre. El fármaco se restringe al espacio vascular y puede penetrar libremente a los eritrocitos
que tiene un volumen de distribución de 6 litros. Si el fármaco no logra atravesar los vasos
sanguíneos el volumen se disminuye a 3 litros (volumen plasmático).
El volumen total de los compartimentos líquidos de un individuo de 70 Kg, es de
aproximadamente 40 L, y constituye el 60% del peso del sujeto. El volumen relativo de cada
compartimento es como sigue:
• Líquido plasmático 5 litros
• Líquido intersticial 12 litros
• Líquido intracelular 23 litros
En la presente sesión se determinará la distribución de sulfacetamida sódica en sangre, orina,
hígado, riñón, corazón, pulmón, bazo, cerebro, intestino y músculo; midiendo su concentración
después de su administración por vía intraperitoneal, a los 5, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos.
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Manual de Laboratorio
METODOLOGÍA
Material por equipo de trabajo:
Material biológico:
• 6 ratas hembra Wistar
Cristalería y equipo:
• Espectrofotómetro
• Centrífuga
• Balanza
• Báscula
• 1 jeringa de 3 mL
• 1 jeringa de 1 mL
• 10 tubos de ensaye chicos
• 10 tubos de ensaye grandes
• 10 pipetas volumétricas de 1mL
• 3 pipetas volumétricas de 5 mL
• 2 vasos de precipitados de 20 mL
• Morteros (los disponibles)
• Algodón
Reactivos:
• Hidróxido de sodio al 0.1 N
• Ácido tricloroacético al 25%
• Nitrito de sodio al 0.5 %
• Sulfamato de amonio al 0.5 %
• N-naftiletilendiamina al 0.05%
• Sulfacetamida sódica al 10%
• Éter etílico
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Cada equipo pesará a su rata para administrar sulfacetamida sódica, a una dosis de 0.1
g/Kg de peso. Se recomienda que inicien los equipos a los cuales les tocó los últimos
tiempos.
2. Colocar a la rata en una jaula metabólica para colectar una muestra de orina. Sí la rata no
orinó antes del siguiente paso, se debe estimular al animal a que lo haga.
3. Anestesiar a la rata con éter y extraer una muestra de sangre por punción cardiaca.
4. Cada equipo sacrificará su rata a los tiempos de: 5, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos
respectivamente.
5. Una vez sacrificada la rata, abrir la cavidad abdominal para obtener muestras de 0.5 g de
los siguientes órganos: hígado, riñón, bazo y duodeno; de la cavidad torácica, corazón y
pulmón; de la pierna, músculo esquelético; y de la cavidad craneana, cerebro.
6. Las muestras se pesan sobre un portaobjetos y posteriormente son trituradas en un
mortero.
7. Inmediatamente se colocan en tubos de ensaye en un volumen de 5 mL de hidróxido de
sodio.
8. Dejar reposar, para después centrifugar.
9. Tomar 2 mL del sobrenadante.
10. Seguir la técnica modificada de Bratton-Marshall descrita en la práctica anterior, para llevar
a cabo la reacción colorimétrica.
11. Leer las absorbancias en el espectrofotómetro a 540 nm.
12. Interpolar el valor de la lectura en una curva patrón.
13. Calcular la concentración de la sulfacetamida sódica considerando las diluciones realizadas.
TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS
Con los resultados obtenidos:
• Calcula las concentraciones a cada tiempo de sulfacetamida sódica por cada órgano o
tejido.
• Realiza una gráfica concentración-tiempo por cada órgano o tejido.
• Calcula el ABC y el Kp para cada órgano o tejido.
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Manual de Laboratorio
Con las gráficas realizadas y los valores calculados, analice y determine:
• Los órganos en los cuales se presenta actividad de la sulfacetamida sódica.
• El o los órganos blanco de la sulfacetamida sódica.
• Compare con la información de la literatura sobre las sulfonamidas.
CUESTIONARIO
1. Defina brevemente Distribución de fármacos.
2. Describa brevemente los mecanismos de transporte que se llevan a cabo en las membranas
celulares.
3. Describa brevemente las propiedades y constitución de las principales barreras del
organismo (hematoencefálica y placentaria).
4. Indique las propiedades fisicoquímicas los fármacos que influyen para atravesar cada una
de las barreras.
5. Indique las proteínas principales que se unen a los fármacos y la influencia de la estructura
de éstos últimos en la unión.
6. Describa brevemente la relación entre la estructura química de un fármaco y su distribución
en el organismo.
7. Defina brevemente el concepto de volumen aparente de distribución.
8. Describa los factores que afectan el valor de volumen aparente de distribución.
9. Describa el perfil de distribución en el organismo de las sulfonamidas.
10. Indique el procedimiento para el cálculo de Kp (constante de reparto) para cada órgano y
significado del mismo.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
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Manual de Laboratorio
Tema 5. Farmacocinética: Eliminación
PRÁCTICA 5. DETERMINACIÓN DE LA RUTA DE ELIMINACIÓN PRINCIPAL DE LA
SULFACETAMIDA SÓDICA.
OBJETIVO.
Determinar la ruta principal de eliminación de la sulfacetamida sódica en rata por medio de la
medición de las concentraciones en orina, para determinar la influencia de esta en los efectos
terapéuticos y tóxicos.
INTRODUCCIÓN
El último paso para la determinación de las propiedades farmacocinéticas de los fármacos
corresponde a la determinación de las rutas de eliminación y sus posibles consecuencias tanto
en los efectos terapéuticos como en los tóxicos.
Existen dos mecanismos de eliminación:
• Excreción
• Biotransformación
Todas las rutas de eliminación siguen forzosamente alguno de estos dos mecanismos o incluso
combinación de éstas.
METODOLOGÍA
Material por equipo de trabajo:
Material biológico:
• Una rata hembra Wistar
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
Cristalería y equipo
• 1 jaula metabólica
• 1 caja Petri
• 10 Tubos de ensayo de 10x100 mm
• 10 Tubos de ensayo de 13x150
• Espectrofotómetro
• Gradilla
• Pipetas de 1, 5 10 mL
• Centrifuga
• Balanza de dos platos
Reactivos
• Sulfacetamida sódica al 10%
• Furosemida inyectable
• N-naftiletilendiamina al 0.05%
• Ácido tricloroacético al 25%
• Nitrito de sodio al 0.5%
• Sulfamato de amonio al 0.5%
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Preparación del material biológico.
1. Hidratar a la rata con 2 mL de agua por vía oral.
2. Se toma la muestra de orina a t = 0, colocando a la rata en la jaula metabólica (si después
de 10 min no orina, se omite la muestra).
3. Administrar 0.1 g/Kg de sulfacetamida sódica por vía intraperitoneal conjuntamente con 0.5
mL de furosemida.
4. Se coloca nuevamente la rata en la jaula metabólica y se toma la orina en intervalos de
tiempo de:
0-10 min
10-20 min
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Manual de Laboratorio
20-30 min
30-60 min
60-90 min
90-120 min
5. Se debe medir el volumen total de orina en cada intervalo y tomar una muestra de 0.2 mL
para la determinación colorimétrica.
6. Se determinan las concentraciones de la muestra por medio de la determinación
colorimétrica de Bratton-Marshall descrita en las prácticas anteriores.
TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS
Con los resultados construya las graficas de cantidad acumulada contra tiempo promedio y
aplique el método Sigma minus para determinar los siguientes parámetros:
• Constante de eliminación total (Ke)
• Constante de eliminación renal (Kr)
• Constante de eliminación no renal (Knr)
• Depuración total (ClT)
• Depuración renal (ClR)
• Depuración hepática (ClH)
Con los parámetros anteriores analice y determine:
• La vía principal de eliminación de la sulfacetamida sódica.
• Los metabolitos principales de la sulfacetamida sódica y su relación con los resultados
obtenidos.
• Los resultados obtenidos en comparación con los informados para otras sulfonamidas.
• Los resultados obtenidos en las tres últimas prácticas y su relación con las
presentaciones comerciales existentes de la sulfacetamida sódica.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
CUESTIONARIO
1. Indique la diferencia entre Eliminación, Excreción y Biotransformación.
2. Describa las principales vías de excreción del organismo.
3. Describa el concepto de Xenobiótico.
4. Describa brevemente la diferencia entre metabolismo y biotransformación.
5. Describa brevemente el concepto de Depuración.
6. Indique el procedimiento para calcular ClR, ClH, ClT, ke renal, ke hepática y ke total.
7. Describa el significado biológico de cada uno de los parámetros anteriores.
8. Describa las fases de la biotransformación de xenobióticos y en qué consisten cada una de
ellas.
9. Indique las principales rutas de eliminación de las sulfonamidas.
10. Indique los metabolitos principales de la biotransformación de las sulfonamidas.
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Manual de Laboratorio Manual de Laboratorio
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
Tema 6. Relación Dosis – Respuesta Cuantal
PRÁCTICA 6. DETERMINACIÓN DE DOSIS LETAL MEDIA (DL50), DOSIS EFECTIVA MEDIA
(DE50), ÍNDICE TERAPÉUTICO (IT) Y MARGEN ESTÁNDAR DE SEGURIDAD (MS) DEL PENTOBARBITAL SÓDICO.
OBJETIVO
Determinar experimentalmente los estados clínicos de: sedación, hipnosis y muerte en el ratón,
del pentobarbital sódico para la determinación de sus DE50, DL50, IT y MS.
INTRODUCCIÓN
A la farmacología le interesan los efectos de los fármacos sobre los sistemas vivos o sobre los
componentes íntimamente relacionados, como células, membranas o enzimas. En
consecuencia, pueden estudiarse muchos niveles de organización o complejidad de los
sistemas, que abarcan desde la interacción molecular de los fármacos hasta su efecto sobre las
poblaciones. Como en todas las disciplinas científicas, la farmacología tiene su vocabulario y
lenguaje propios. Estos términos comprenden entre otros; farmacodinamia, farmacocinética,
farmacoterapia, farmacoepidemiología, farmacoeconomía, toxicología, relación riesgo-beneficio,
etc.
La farmacodinamia describe la acción que realiza un fármaco. La farmacocinética describe el
estudio de cómo el organismo absorbe, distribuye, biotransforma y excreta los fármacos.
En los estudios farmacodinámicos, que vienen a ser el estudio detallado de cómo actúan los
fármacos, suelen emplearse métodos cuantitativos y análisis matemáticos para comparar los
efectos de los fármacos y para asegurar una descripción exacta y completa de ellos. Esta clase
de estudios incluyen la medida de los efectos del fármaco a diferentes concentraciones del
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Manual de Laboratorio
mismo y esta información suele presentarse en forma de gráfico como Curva Dosis-Respuesta. Las curvas de dosis-respuesta pueden ser representadas y analizadas de
diferentes formas para que los fármacos y sus efectos puedan analizarse y compararse.
Existen dos tipos de curva de dosis-respuesta:
a) Curva Dosis-Respuesta Gradual.
b) Curva Dosis-Respuesta Cuantal.
METODOLOGÍA
Material por equipo de trabajo:
Material biológico:
• 48 ratones hembra CD-1
Cristalería y equipo:
• Balanza granataria para animales
• 8 jeringas de 1 mL
• Marcador de tinta indeleble
• Solución salina fisiológica
Reactivos:
• Disoluciones de pentobarbital sódico a 1, 2, 4, 8, 16 y 32 mg/mL.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Cada equipo de alumnos, recibirá 8 ratones, los cuales se pesarán y se marcarán de
acuerdo a la técnica de marcado conveniente para este experimento. Los datos del peso de
cada ratón deberán ser registrados para así poder calcular la dosis para cada uno de ellos.
2. Se asignarán las dosis correspondientes de pentobarbital (10, 20, 40, 80, 160 y 320 mg/Kg),
por números aleatorios a cada equipo de alumnos.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
3. Se proporcionará a cada equipo una solución de pentobarbital de acuerdo a la dosis que le
haya sido asignada.
4. Se utilizará un ratón como control, y solo se le administrará 0.1 ml de solución salina
fisiológica.
5. De acuerdo a la dosis asignada a cada equipo de trabajo y al peso de cada ratón se
procede a calcular la cantidad de fármaco que deberá ser administrada a cada uno de ellos,
recuerde siempre anotar todos los datos.
6. Con una jeringa de insulina se administra el fármaco por vía intraperitoneal.
8. Una vez administrado el fármaco, se observa el comportamiento de cada uno de los
ratones, durante 30 minutos a partir del momento de la aplicación del pentobarbital.
9. Debe registrar el efecto farmacológico presentado en cada uno de los animales de
experimentación (sedación, hipnosis o muerte).
10. Una vez concluidas sus observaciones, procederá a sacrificar los ratones de acuerdo a las
normas éticas del manejo de animales.
TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS
Con los resultados obtenidos:
• Construya una curva dosis-respuesta cuantal para el pentobarbital sódico.
• Calcule la DE50 para los efectos de sedación e hipnosis del pentobarbital sódico por
medio de
a) Por interpolación en la curva dosis-respuesta
b) Por unidades Probit
• Calcule la DL50 para el efecto muerte del pentobarbital sódico por los dos métodos
anteriores.
• Calcule el Índice Terapéutico y el Margen Estándar de Seguridad para cada uno de los
efectos medidos.
Con la gráfica realizada y los valores calculados, analice:
• La seguridad, efectividad y selectividad de los efectos del pentobarbital sódico.
• La importancia de las curvas dosis-respuesta cuantales.
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Manual de Laboratorio
CUESTIONARIO
1. Describa el concepto de Farmacometría.
2. Explique la diferencia entre una Respuesta Gradual y una Respuesta Cuantal.
3. Describa las características que componen a una curva Dosis-Respuesta.
4. Indique el procedimiento gráfico que se utiliza para calcular DL50 y DE50.
5. Indique el procedimiento utilizando unidades Probit que se utiliza para calcular DL50 y DE50.
6. Indique los principales organismos utilizados para el cálculo de DL50, DE50, DT50.
7. Describa la utilidad de los estudios dosis-respuesta cuantal en diversas áreas o campos.
8. Indique las propiedades farmacológicas y toxicológicas del pentobarbital.
9. Indique los mecanismos de acción del pentobarbital.
10. Describa el procedimiento para calcular el Índice Terapéutico y el Margen Estándar de
Seguridad e indique la utilidad de cada parámetro.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
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Manual de Laboratorio
PRÁCTICA 7. BIOENSAYO DE TOXICIDAD EN Artemia salina L.
OBJETIVO
Determinar la CE50 y la potencia relativa del cloruro de mercurio (II) y del sulfato de plata por
medio del bioensayo en Artemia salina L. para determinar el grado de toxicidad de los mismos
en el sistema de prueba.
INTRODUCCIÓN
Un bioensayo de toxicidad es una herramienta fundamental en ecotoxicología, un campo de la
farmacología, que combina las técnicas ecológicas y la química para determinar los efectos de
que una sustancia puede tener en un organismo. Los bioensayos de toxicidad involucra la
exposición de organismos a una serie de diferentes concentraciones de la sustancia y
determinando la respuesta del organismo. La respuesta del organismo usualmente depende de
la especie y el tipo de prueba, y puede incluir una reducción del crecimiento o supervivencia.
Las especies o estadíos de vida que son especialmente sensitivos a las sustancias son ideales
para las pruebas de toxicidad. Por ejemplo, los estados de desarrollo temprano de organismos
marinos son más sensitivos que sus equivalentes adultos. Porque el estrés del medio ambiente
que afecta el desarrollo larvario puede tener serias consecuencias potenciales para la población
del ecosistema, esos estados de vida tempranos son muy útiles para identificar el efecto dañino
del medio ambiente. También ayuda si el organismo de prueba tiene una amplia distribución
geográfica, es una parte importante del ecosistema, es económico, o fácilmente cultivable, y
puede ser colectado a lo largo del año o puede ser mantenido bajo condiciones de laboratorio.
Opciones de pruebas de toxicidad.
Los bioensayos de toxicidad aguda son pruebas rápidas diseñadas para medir los efectos de
sustancias en especies durante un corto tiempo. Los bioensayos, los cuales típicamente tardan
de 48 a 96 horas, usualmente miden los efectos de sustancias en la supervivencia de la
especie. Los resultados de esas pruebas son reportadas como CE50, la cual es la concentración
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
efectiva de una muestra de prueba que causa un efecto específico (aquí un 50% de la
reducción de la supervivencia). Sin embargo, los ensayos de toxicidad crónica son usados para
sustancias de bajo nivel en situaciones de alto riesgo. Estas son pruebas de largo tiempo
relativo a la vida de la especie utilizada y son diseñados para medir el desarrollo larvario o
crecimiento y el éxito o falla de la reproducción.
En esta práctica se realizará un bioensayo de toxicidad aguda utilizando el crustáceo Artemia
salina, el cual es muy utilizado para pruebas ecotoxicológicas, o como pruebas de screening
para la búsqueda de sustancias citotóxicas.
METODOLOGÍA
Material por equipo de trabajo:
Material biológico:
• Huevecillos liofilizados de Artemia salina L.
Cristalería y equipo:
• Pecera de vidrio capacidad 2 L
• Tubos de ensaye
• Pipetas de vidrio
• Jeringas de 1 mL
• Foco sumergible de 5 W
• Termómetro para pecera
• Pecera de 500 mL
• Matraz Erlenmeyer de 1 L
• Vasos de precipitados de 100, 500 mL
• 5 Pipetas Pasteur con bulbo
• Balanza
• Gradillas
• Aereador con manguera y filtro
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Manual de Laboratorio
Reactivos:
• Disolución de cloruro de mercurio (II) al 1 %
• Disolución de sulfato de plata al 1%.
• Agua de mar artificial
• Anticloro (tiosulfato de sodio al 1 %)
PROCEDIMIENTO
a) Incubación de los huevecillos 1. Se arma el dispositivo de incubación como se muestra en la figura 17.
Figura 17. Pecera con dispositivos de incubación (1), aeración (2) e iluminación (3).
2. Se preparan 400 mL de agua de mar artificial, pesando 12.2 g de sal marina y disolver en
un volumen final de 400 mL. Adicionar una gota de anticloro y dejar reposar durante 5
minutos.
3. De la solución anterior se colocan 300 ml en la pecera de incubación.
4. Colocar una cantidad de agua corriente en la pecera mayor, aproximadamente a una
temperatura de 26-28OC y dejar que alcance el equilibrio con el agua de la pecera de
incubación.
5. Conectar los dispositivos de aeración y luz.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
6. Adicionar los huevecillos en la pecera de incubación con una espátula limpia y seca
(aproximadamente 10 μg de huevecillos), colocar en la zona obscura de la pecera de 500
mL. Dejar incubar durante 24 h.
b) Preparación de las muestras
1. Las muestras se prepararán de acuerdo con la siguiente tabla:
Muestra Volumen de
disolución de HgCl2 ó Ag2SO4
(mL)
Volumen de agua de mar artificial
(mL) Concentración
(mg/mL)
1 0 2
2 0.2 1.8
3 0.4 1.6
4 0.6 1.4
5 0.8 1.2
6 1 1
7 1.2 0.8
8 1.4 0.6
9 1.6 0.4
10 1.8 0.2
11 2 0
c) Realización del bioensayo
1. Se colocará el volumen de disolución de prueba en cada tubo de ensaye previamente
marcado.
2. Se colocarán 10 nauplios de Artemia salina L. por cada uno de los tubos de ensaye,
evitando agregar demasiada agua de mar artificial.
3. Se colocará el volumen de agua de mar artificial necesario para completar a un volumen
total de 2 mL.
4. Se observará el movimiento de los organismos por un periodo de 120 minutos.
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Manual de Laboratorio
5. Al término del periodo de observación se contarán los nauplios de Artemia salina L. que
sobrevivieron de la siguiente manera:
a) Los nauplios que presentan movimiento, aunque sea este mínimo, se consideran
vivos.
b) Los nauplios que permanecen inmóviles, se consideran muertos.
TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS
Con los resultados obtenidos:
• Realizar la curva dosis-respuesta cuantal para las sustancias probadas, utilizando los
datos de todos los equipos del grupo.
• Calcular la CL50 de cada una de las sustancias probadas por medio del análisis Probit.
• Calcular la potencia relativa de cada una de las sustancias probadas tomando al cloruro
de mercurio (II) como referencia.
Con la gráfica realizada y los valores calculados, analice:
• Los datos encontrados con respecto a los datos informados en la literatura.
• Las ventajas y desventajas de los bioensayos con respecto a los ensayos con
organismos superiores.
CUESTIONARIO
1. Indique las diferencias principales entre DL50 y CL50.
2. Indique los organismos utilizados para las pruebas de toxicidad.
3. Describa las características del crustáceo Artemia salina.
4. Indique los campos de aplicación de las pruebas de toxicidad.
5. Indique las ventajas de utilizar organismos inferiores en las pruebas farmacológicas.
6. Defina el concepto de pruebas de screening farmacológico.
7. Indique los organismos utilizados para las pruebas de screening farmacológico.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
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Manual de Laboratorio
Tema 7. Relación Dosis – Respuesta Gradual
PRÁCTICA 8. ACCIÓN DE LA ACETILCOLINA SOBRE EL MÚSCULO RECTO ANTERIOR DE RANA.
OBJETIVO
Comprender la relación dosis - efecto que existe en la respuesta de tipo gradual de la
acetilcolina en el músculo recto anterior de rana para la determinación del efecto, de la CE50 y la
potencia relativa.
INTRODUCCIÓN
Aquéllas respuestas de un organismo que dentro de ciertos límites, aumentan en magnitud a
medida que se incrementa la dosis del medicamento se denomina de tipo gradual. Cuando
tales respuestas se analizan en un tipo de coordenadas cartesianas, en el cual las ordenadas
representan la magnitud de las respuestas y las abscisas las dosis o los logaritmo de las dosis,
se obtiene un trazo hiperbólico o una curva sigmoidea, que para fines prácticos puede
considerarse como una línea recta.
Para que los fármacos actúen se requiere de sus mecanismos de acción: los efectos de los
fármacos se ven influenciados por la interacción que presentan con las macromoléculas del
organismo, ya que el interactuar modifica la función del componente y con ello se dan los
cambios bioquímicos y fisiológicos que determinan la respuesta al fármaco.
Entre una de las consecuencias más importantes, consiste en que el medicamento es capaz de
modificar la velocidad con que ocurre cualquier función corporal, y no genera efectos sino
modula funciones.
Principales mecanismos de acción de un fármaco: una vez que el fármaco agonista se une a su
receptor, algún mecanismo efector se activa para muchos medicamentos, éste efecto se
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
localiza dentro de la célula o modifica algún efecto intracelular. Se han definido cuatro
mecanismos de acción:
1. Fármacos liposolubles (hormonas esteroides) pueden cruzar las membranas y
mezclarse con un receptor intracelular
2. Los fármacos que regulan los conductos iónicos (acetilcolina en el receptor nicotínico)
pueden accionarse en forma directa la apertura de un conducto iónico.
3. Los fármacos que actúan enzimáticamente (insulina) pueden accionarse en la porción
extracelular de enzimas que se expanden a través de la membrana y modificar su
actividad intracelular.
4. Fármacos que pueden unirse a receptores que se enlazan por medio de proteínas
acopladoras a efectores intracelulares.
Existen varios tipos de receptores de fármacos:
Tipo 1: se encuentran en la superficie externa de la membrana plasmática de las células diana
e interactúan con fármacos que imitan o bloquean las acciones de mediadores autónomos
como las catecolaminas, algunas hormonas peptídicas y ciertos factores liberadores.
Tipo 2.- Están situados en el protoplasma de las células diana y se combinan con fármacos que
imitan o bloquean las acciones de hormonas esteroideas. La combinación fármaco receptor
puede ser modificada y traslocada al núcleo, donde quizá regule la concentración de un ácido
ribonucléico (RNA) mensajero específico y la síntesis de proteínas
Tipo 3.- Se encuentra en el núcleo celular. La hormona tiroidea representa el mejor ejemplo.
Para que un fármaco llegue al sitio de acción, es necesario que atraviese por varias
membranas celulares del organismo, en donde la absorción, transporte capilar, penetración en
dicha célula y excreción son los movimientos básicos de los fármacos a través de las
membranas.
Debido a su naturaleza lipídica, la membrana celular es muy permeable a las sustancias
liposolubles, por lo que se cree, que la membrana lipídica tiene poros que permiten el pasaje de
las moléculas insolubles en lípidos. Además del movimiento pasivo a través de las membranas,
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Manual de Laboratorio
también hay procesos más complejos para el pasaje de glucosa, aminoácidos, algunos iones
inorgánicos y algunos fármacos; entre éstos mecanismos se encuentran:
1.-Transporte pasivo: a.-Difusión simple b.-Filtración.
2.-Transporte especializado: a.-Transporte activo b.-Difusión facilitada c.-Pinocitosis.
Los medicamentos actúan por medio de receptores, en muchos de los casos, pero no siempre.
Receptor es un sitio específico de una macromolécula en una membrana celular, a las cuales
necesita unirse o debe interactuar un neurotransmisor o fármaco par producir su respuesta
biológica característica.
Receptor metabotrópico: no actúa sobre conducto iónicos, sino sobre enzimas intracelulares,
son activados de manera selectiva por trans-1amino-ciclopentil-1,3-dicarboxilato (ACPD): están
acoplados a proteínas G y se acoplan positivamente a fosfolipasa C (la estimulan) o
negativamente a adenilciclasa.
Los medicamentos para unirse a su receptor necesitan tener afinidad y eficacia, la afinidad es la
capacidad de un fármaco de unirse a su receptor y formar con el un complejo estable, depende
de la estructura química del fármaco y del receptor, por lo menos del grupo de anclaje del
agonista o antagonista y la eficacia: es la capacidad de estímulo para un grado determinado de
ocupación del receptor.
Otras características del fármaco según su estructura química es que sea: agonista, agonista
parcial, agonista completo, agonista inverso, antagonista, antagonista competitivo, no
competitivo. Agonista: fármacos que interactúan con el receptor y desencadenan una
respuesta. Agonista parcial: tiene afinidad, pero menor eficacia que el agonista. Agonista
completo: los compuestos que interactúan con los receptores previniendo la acción de los
agonistas. Agonista inverso: no se puede hablar de un antagonismo clásico por la falta de un
receptor, como el caso de las benzodiacepinas donde no se demuestra un agonista endógeno,
un agonista de receptor a benzodiacepinas que antagoniza un efecto. Antagonista: fármaco que
tiene afinidad y carece de eficacia. Antagonista competitivo: se produce cuando es posible
revertir el efecto de un fármaco antagonista por un incremento en la dosis del agonista, que
compite por el mismo receptor. Antagonista no competitivo: un antagonista se une fuertemente,
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
casi de forma irreversible con uniones químicas de alta energía, a un receptor, tal unión no se
revierte aumentando la dosis.
En la práctica utilizaremos el fármaco acetilcolina (ACh) que es un agonista y a la vez un
neurotransmisor que es una sustancia química que se libera en las terminaciones nerviosas
para producir excitación o inhibición de una neurona o una célula muscular adyacente, en la
región de la sinápsis y puede activar o inhibir a la célula post sináptica al unirse a una molécula
de receptor especializado. La acetilcolina tiene receptores muscarínicos y nicotínicos, los
muscarínicos se encuentran en los músculos lisos, en el músculo cardíaco, en glándulas
exócrinas y en el SNC. Los nicotínicos se localizan en los ganglios del SNA y en las sinápsis
neuromuscular esquelética y en los ganglios nerviosos vegetativos.
Almacenamiento de ACh. La ACh que es sintetizada en el citoplasma neuronal, es captada y
almacenada en las vesículas que se hallan concentradas en las terminaciones nerviosas, la
liberación de ACh se desencadena `por la despolarización de las terminaciones nerviosas,
permitiendo el ingreso de calcio para producir el proceso de liberación de ACh. Terminación de
la acción de la ACh: la ACh se hidroliza para formar acetato y colina, por medio de catálisis con
la enzima acetilcolinesterasa, donde la colina puede ser transportada de regreso a la
terminación nerviosa.
En un músculo esquelético aislado se puede inducir contracción estimulando su nervio motor o
adicionando acetilcolina a la solución Ringer en que está sumergido. El efecto de la acetilcolina
liberada por la acción de la estimulación del nervio (o adicionada), es reversible, porque
también la unión con su receptor es reversible, basta renovar la solución en que se sumerge el
músculo para que desaparezca el efecto, debido a que la acetilcolina libre, tanto la que aún no
logra fijarse al receptor como la que proviene de disociación del complejo droga receptor, queda
expuesta a una enzima que la hidrolizara rápidamente en ácido acético y colina, productos que
carecen de actividad biológica. Otras substancias pueden inducir la contracción del músculo
esquelético, pero las que tienen estructura parecida a la acetilcolina son las más activas para
estimular la contracción muscular o para inhibirla, esto depende también de que las
substancias sean agonistas, antagonistas etc.
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Manual de Laboratorio
METODOLOGÍA
Material por equipo de trabajo:
Material biológico:
• Una rana Moctezuma
Cristalería y equipo:
• 1 tabla y estuche de disección
• 2 varillas de vidrio con punta fina
• Hilo de seda
• 1 cámara para órgano aislado
• 1 pinzas de tres dedos con nuez
• 5 vasos de precipitados de 30 mL
• 1 vaso de precipitados de 200 mL
• 3 pipetas de 1 mL, 5 mL, 10 mL
• 1 Caja Petri
• Fisiógrafo
• Miógrafo F–60
• Soporte con tensómetro
• Papel para fisiógrafo
• Tachuelas
Reactivos
• Disolución de cloruro de acetilcolina (100 μg/mL)
• Disolución Ringer rana
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Preparación de músculo de rana 1. Descerebrar y desmedular a la rana de acuerdo a lo mostrado en la práctica Manejo de
animales.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
2. Disecar y amarrar con hilo seda los músculos rectos anteriores desde la región torácica a la
pélvica
3. Irrigar con solución Ringer rana constantemente los músculos rectos anteriores, para que no
se deshidraten.
4. Colocar en la caja Petri con solución Ringer rana los músculos disecados.
5. Colocar inmediatamente, el músculo en la cámara para órgano aislado.
6. Amarrar la porción pélvica hacía el miógrafo y la torácica en la parte baja de la cámara para
órgano aislado
7. Llenar la cámara para órgano aislado con solución Ringer rana hasta cubrir el músculo y
ajustar el Fisiógrafo.
Realización del ensayo
1. Ajustar el fisiógrafo antes de colocar la preparación.
2. Una vez colocada la preparación se ajustará la tensión del músculo.
3. Se deja reposar la preparación bajo disolución Ringer durante un minuto y se registrará en
el fisiógrafo dicho reposo. Este registro será la Línea Basal.
4. Realice el experimento desalojando primeramente la disolución Ringer y posteriormente
colocando la primera disolución en la cámara de órgano aislado, cuidando que dicha
disolución cubra totalmente al músculo.
5. El efecto se observará durante un minuto, o cuando se obtenga un desplazamiento
constante o cuando empiece a disminuir el efecto.
6. Después de observar el efecto se desalojará la disolución Ringer, y se lavará la preparación
con disolución Ringer, hasta que la plumilla del fisiógrafo retorne a la línea basal.
7. Se repiten los pasos 3, 4, 5 y 6 para las demás disoluciones de acetilcolina.
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Manual de Laboratorio
Las disoluciones se prepararan de la siguiente manera:
Muestra
Volumen de la disolución de acetilcolina
(mL)
Volumen de la disolución
Ringer (mL)
Volumen final de la muestra
(mL)
Concentración de acetilcolina
(μg/mL)
1 0.4 19.6 20
2 0.8 19.2 20
3 1.6 18.4 20
4 3.2 16.8 20
5 6.4 13.6 20
TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS
Con los resultados obtenidos:
• Construya una curva dosis-respuesta para la de acetilcolina de cada equipo del grupo.
• Ajuste cada gráfica por medio de la Ecuación de Hill.
• Calcule la DE50 para cada disolución de acetilcolina.
• Calcule la potencia relativa para cada disolución de acetilcolina, tomando una de ellas
como estándar.
Con las gráficas realizadas y los valores calculados, analice y determine:
• El tipo de ligado al que corresponde la acetilcolina.
• La importancia de las curvas dosis-respuesta graduales.
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
CUESTIONARIO
1. Describa los conceptos de Neurotransmisor, Hormona, Ligando y Receptor.
2. Indique los principales tipos de ligandos y describa las diferencias entre ellos.
3. Describa brevemente las principales características de los ligandos.
4. Elabore una curva dosis-respuesta en la que se ilustre la forma de las curvas de los tipos de
ligandos.
5. Describa los principales tipos de receptores que se conocen actualmente.
6. Describa brevemente el mecanismo de transducción de señales de la acetilcolina.
7. Indique los tipos y subtipos de receptores de la acetilcolina, así como la función en el
organismo de cada uno de ellos.
8. Indique los usos terapéuticos de lo principales agonistas de la acetilcolina.
9. Indique el procedimiento para ajustar una curva dosis-respuesta por medio de la Ecuación
de Hill.
10. Indique el procedimiento para el cálculo de la potencia relativa.
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Manual de Laboratorio Manual de Laboratorio
- 74 - - 74 -
Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
Tema 8. Interacción de fármacos
PRACTICA 9. EFECTO DE LA SUCCINILCOLINA EN LA ACCIÓN DE LA ACETILCOLINA EN MÚSCULO
RECTO ANTERIOR DE RANA.
OBJETIVO.
Observar los efectos provocados por la interacción farmacológica de dos fármacos (acetilcolina
y succinilcolina), en el músculo recto anterior de la rana, para determinar el tipo de interacción
que ocurre con esta asociación.
INTRODUCCIÓN
Es la relación que tienen dos o más medicamentos al administrarse para tratar enfermedades
coexistentes, provocando la probabilidad de que algunas veces uno de los medicamentos altere
la intensidad del efecto farmacológico del otro medicamento que se administra en forma
concurrente: Esto puede causar el aumento o la disminución de los efectos de uno o de ambos
medicamentos, la aparición de un nuevo efecto que no presente ninguno de los medicamentos
administrados. Las interacciones pueden deberse a alteraciones en la fase farmacéutica,
farmacocinética y farmacodinámica.
Interacciones Farmacéuticas:
Disposición: que tenga buena calidad, para que esté disponible y no se tarde mas en absorber y
pueda interactuar con otros medicamentos. Disolución: en general, agentes en solución se
absorben más de prisa que en suspensión, el tiempo de disolución afecta la velocidad de
absorción, el inicio de la acción de agentes poco solubles se retrasa debido a que tarda en
disolverse.
- 75 -
Manual de Laboratorio
Interacciones Farmacocinéticas:
Absorción: la absorción de sitios subcutáneos puede hacerse lenta por la administración
simultánea de vasoconstrictores, por ejemplo: anestésicos locales y adrenalina
Distribución: puede ser alterada por medicamentos que compiten por los sitios de fijación: por
ejemplo la quinidina puede desplazar a la digoxina; o alterar el compartimento físico en el cual
otro medicamento se distribuye: por ejemplo, los diuréticos pueden reducir el agua corporal total
en la que se distribuyen los aminoglucósidos
Biotransformación: puede ser acelerado por agentes: por ejemplo, barbitúricos que son
inductores de las enzimas hepáticas, o pueden ser inhibido por agentes como cimetidina,
inhibidora de la MAO.
Eliminación: la excreción de medicamentos por el riñón puede cambiar por la presencia de
medicamentos que reducen el flujo sanguíneo renal, por ejemplo, agentes β-bloqueadores, o
que inhiben mecanismos específicos de transporte renal, por ejemplo la acción de la aspirina
sobre la secreción del ácido úrico.
Interacciones Farmacodinámicas:
Antagonismo: es un medicamento que se une a los receptores pero no los activa. Los efectos
de los antagonistas son el resultado de impedir la acción de los agonistas y éstos pueden ser
competitivos y no competitivos
Sinergismo: es cuando el efecto conjunto de dos medicamentos es superior a la suma
algebraica de los efectos individuales.
Adición: el efecto aditivo se refiere a la misma adición, pero cuando ambos tienen el mismo
mecanismo de acción.
Sumación: es cuando ambos medicamentos evocan la misma respuesta aparente sea cual
fuere el mecanismo de acción y su efecto combinado es la suma algebraica de los efectos
individuales
- 76 -
Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
Siempre hay que tener presentes éstas interacciones ya que nos pueden dar efectos que a
veces son convenientes, pero a veces son contraproducentes.
METODOLOGÍA
Material por equipo de trabajo:
Material biológico:
• Una rana Moctezuma
Cristalería y equipo
• 1 tabla y estuche de disección
• 2 varillas de vidrio con punta fina
• Hilo de seda
• 1 cámara para órgano aislado
• 1 pinzas de tres dedos con nuez
• 5 vasos de precipitados de 30 mL
• 1 vaso de precipitados de 200 mL
• 2 pipetas de 1 mL, 5 mL, 10 mL
• 1 Caja Petri
• Fisiógrafo
• Miógrafo F–60
• Soporte con tensómetro
• Papel para fisiógrafo
Reactivos
• Disolución de cloruro de succinilcolina (10 μg/ mL)
• Disolución de cloruro de acetilcolina (100 μg/mL)
• Disolución Ringer rana
- 77 -
Manual de Laboratorio
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Preparación de músculo de rana 1. Descerebrar y desmedular a la rana de acuerdo a lo mostrado en la práctica Manejo de
animales.
2. Disecar y amarrar con hilo seda los músculos rectos anteriores desde la región torácica
a la pélvica
3. Irrigar con solución Ringer rana constantemente los músculos rectos anteriores, para
que no se deshidraten.
4. Colocar en la caja Petri con solución Ringer rana los músculos disecados
5. Colocar inmediatamente, el músculo en la cámara para órgano aislado.
6. Amarrar la porción pélvica hacía el miógrafo y la torácica en la parte baja de la cámara
para órgano aislado
7. Llenar la cámara para órgano aislado con solución Ringer rana hasta cubrir el músculo y
ajustar el Fisiógrafo.
Realización del ensayo
1. Ajustar el fisiógrafo antes de colocar la preparación.
2. Una vez colocada la preparación se ajustará la tensión del músculo.
3. Realice el experimento utilizando la disolución de acetilcolina, tal y como se realizó en la
práctica anterior.
4. Al finalizar la última dosis, deje reposar el músculo durante 10 minutos en disolución
Ringer fresca.
5. Después del reposo, se realizará el experimento con las disoluciones de acetilcolina-
succinilcolina. Es muy importante que se realice en el mismo músculo que el
experimento anterior.
6. El efecto se observará durante un minuto, o cuando se obtenga un desplazamiento
constante.
7. Después de cada disolución, se lavará la preparación las veces que sea necesario,
hasta que la plumilla del fisiógrafo llegue a la línea basal.
- 78 -
Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
Las disoluciones se prepararán de la siguiente manera:
Experimento 1.
Muestra
Volumen de la disolución de acetilcolina
(mL)
Volumen de la disolución
Ringer (mL)
Volumen final de la muestra
(mL)
Concentración de acetilcolina
(μg/mL)
1 0.4 19.6 20
2 0.8 19.2 20
3 1.6 18.4 20
4 3.2 16.8 20
5 6.4 13.6 20
Experimento 2.
Muestra
Volumen de la disolución de succinilcolina
(mL)
Volumen de la disolución
Ringer (mL)
Volumen final de la muestra
(mL)
Concentración de succinilcolina
(μg/mL)
1 0.4 19.6 20
2 0.8 19.2 20
3 1.6 18.4 20
4 3.2 16.8 20
5 6.4 13.6 20
Experimento 3.
Muestra
Volumen de la disolución de acetilcolina
(mL)
Volumen de la disolución de succinilcolina
(mL)
Volumen de la disolución Ringer
(mL)
Volumen final de la muestra
(mL)
1 0.4 0.1 19.5 20 2 0.8 0.1 19.1 20 3 1.6 0.1 18.3 20 4 3.2 0.1 16.7 20 5 6.4 0.1 13.5 20
- 79 -
Manual de Laboratorio
TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS
Con los resultados obtenidos:
• Construya una curva dosis-respuesta para la acetilcolina y para acetilcolina-
succinilcolina.
• Calcule la DE50 para cada fármaco y la combinación de los mismos.
Con la gráfica realizada y el valor calculado, analice y determine:
• El tipo de interacción que ocurre en la combinación acetilcolina-succinilcolina.
• El tipo de ligado al que corresponde la succinilcolina.
• La potencia relativa de la combinación de acetilcolina-succinilcolina con respecto a la
acetilcolina.
CUESTIONARIO
1. Describa los principales tipos de Antagonismo que se conocen actualmente.
2. Indique la diferencia entre Antagonismo y Antagonista.
3. Indique la diferencia entre una Interacción Farmacológica y una Interacción
Farmacocinética.
4. Describa lo principales mecanismos de Interacciones Farmacológicas por interacción con
receptores.
5. Describa lo principales mecanismos de Interacciones Farmacocinéticas.
6. Indique los diferentes tipos de antagonistas y las diferencias entre cada uno de ellos.
7. Describa en que consiste el Modelo del Complejo Ternario para los receptores
Metabotrópicos.
8. Describa el procedimiento experimental para diferenciar los diferentes tipos de agonistas y
antagonistas.
9. Describa los mecanismos de acción propuestos para antagonistas no competitivos.
10. Indique los principales agonistas y antagonistas nicotínicos, así como sus propiedades y
usos.
- 80 -
Evaluación de Fármacos y Medicamentos I Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
- 81 - - 81 -
Manual de Laboratorio
V. Bibliografía recomendada
1. Altamirano A.1994. Manual para el manejo de animales de laboratorio. FES Zaragoza, UNAM, México.
2. Arrellín Rosas G. 1996. Efectos de los factores microambientales sobre la respuesta del animal a la manipulación experimental. Animales de Experimentación. 1:9-30.
3. Avendaño M. 1993. Introducción a la química farmacéutica. Interamericana-McGraw Hill. España.
4. Brody T, Larner J, Minneman K y Neu H. 1994. Human pharmacology. Molecular to clinical. 2nd edition. Mosby, EUA.
5. Burgos M y Martínez J. La rata de laboratorio. Manual. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM, México.
6. Clark B y Smith D. 1989. Introducción a la farmacocinética. Acribia, España.
7. Craig Ch, Stitzel R C, Stitzel R E (editores). 2003. Modern Pharmacology With Clinical Applications, Sixth Edition. Lippincott Williams & Wilkins, EUA.
8. Curry S. 1977. Drug disposition and pharmacokinetics with a consideration of pharmacological and clinical relationships. 2nd edition. Blackwell Scientific Pub., Oxford
9. Finney D. 1978. Statistical method in biological assay. 3rd edition. Mc Millan Pub. Co., EUA.
10. Flores J. 1998. Farmacología Humana 3ª edición. Masson Editores, España.
11. Grahame-Smith. 1977. Drug interactions. University Park Press, GB.
12. Hansch C, Sammers P y Taylor J. (editores). 1990. Comprehensive Medicinal Chemistry. The rational design, mechanistic study and therapeutic application of chemical compounds. Vol. 1 to 6. Pergamon Press, GB.
13. Hardman J, Limbird L, y Goodman A. 2001. Goodman & Gilman´s The pharmacological basis of therapeutics. 10th edition. McGraw Hill, EUA.
14. Hladky S. 1990. Pharmacokinetics. Manchester University Press, GB.
15. Infante S y Calderón L. 1994. Manual de análisis probit. Colegio de postgraduados, México
16. Kalant H y Roschlau W. 1989. Principles of medical pharmacology. 5th edition. B C Decker, Philadelphia, EUA.
17. Katzung B. 2000. Basic & Clinical Pharmacology, 8th edition. McGraw-Hill/Appleton & Lange, EUA.
- 82 -
Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
18. Korolkovas A. 1988. Essentials of medicinal chemistry. 2nd edition. John Wiley and Sons, EUA.
19. Levine R. 2000. Pharmacology, Drug actions and reactions. 6th edition. The Parthenon Publishing Group, GB.
20. Madroñero R. 1980. Química médica. Métodos fundamentales en la búsqueda de nuevos fármacos. Alhambra, España.
21. McLaughlin J. 1991. Crow gall tumors on potato disc and Brine Shrimp lethality; Two simple bioassay for higher plant screening and fractionation. Methods in Plant Biochemistry. Volume 6. Assay for bioactivity. Academic Press Limited, EUA, 1-30.
22. Munson P (Editor). 1994. Principles of pharmacology. Basic concepts and clinical applications. Chapman and Hall, NY, EUA.
23. Mycek M, Harvey R y Champe P. 2000. Pharmacology. 2nd edition. Lippincott Wlliams & Wilkins, Philadelphia, EUA.
24. Oteiza Fernández J. 1979. Manejo de animales. UNAM, México.
25. Rang H, Dale M y Ritter J. 2000. Farmacología. 4ª edición. Harcourt, España.
26. Shargel L y Yu A. 1999. Applied biopharmaceutics and pharmacokinetics. 4th edition. Appleton and Lange, EUA.
27. Short D y Woodnott D (editores). 1963. The A.T.A. manual of laboratory animal practice and techniques. Charles C. Thomas-Publisher, EUA.
28. Smith A, Van de Waterbeemd H, D. K. Walker D, Mannhold R, Kubinyi H y Timmerman H, 2001. Pharmacokinetics and Metabolism in Drug Design. Wiley-VCH Verlag GmbH, EUA.
29. Smith C y Reynard A. 1993. Farmacología. Edit. Médica Panamericana, Argentina.
30. Smith D, Van de Waterbeemd H, Walker D, Mannhold R, Kubinyi H y Timmerman H. 2001. Pharmacokinetics and Metabolism in Drug Design. Wiley-VCH Verlag GmbH, USA.
31. Smith G. 1977. Drug Interactions. University Park Press, GB.
32. Taylor M y Reide P. 1998. Lo esencial en farmacología. Harcourt, España.
33. Velasco A, Lorenzo P, Serrano J y Andrés-Trelles F. 1993. Velázquez Farmacología. 16ª edición. Interamericana-McGraw Hill, España.
34. Vogel G y Vogel W (editores). 1997. Drug discovery and evaluation. Pharmacological assays. Springer, Alemania.
35. Wepierre J. 1988. Manual de farmacología general y molecular. Masson Editores, España.
36. Wolff M. (editor) 1995. Burger’s medicinal chemistry and drug discovery. Volúmenes 1 a 3. John Wiley and Sons Inc., EUA.
- 83 -
Manual de Laboratorio
VI. Anexos
Anexo 1. Respuestas a los problemas de la práctica de posología.
Problema 1. Dilución 1:2 = 2.5 mL de la muestra y 2.5 mL de agua.
Dilución 1:5 = 1 mL de la muestra y 4 mL de agua.
Dilución 1:10 = 0.5 mL de la muestra y 9.5 mL de agua.
Problema 2. Concentración de sulfacetamida = 2%
Problema 3. Se disuelven los 200 mg de acetilcolina en 100 mL de agua, esta disolución de diluye 1:10
tomando 1 ml de la disolución y 9 mL de agua, posteriormente se toman 8 mL de esta última
disolución y se aforan a 100 mL.
Problema 4. Ratón de 24.3 g = dosis, 4.86 µg y volumen, 0.24 mL
Ratón de 19.8 g = dosis, 3.96 µg y volumen, 0.20 mL
Ratón de 21.7 g = dosis, 4.34 µg y volumen, 0.22 mL
Problema 5. Dosis a administrar = 72 mg
Volumen a administrar = 2.88 mL
Problema 6. Dosis = 62 mg
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Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
Problema 7. No es posible medir el volumen, es necesaria una dilución 1:10
Dosis a administrar = 1.4 mg
Volumen a administrar = 0.22 mL
Problema 8. Concentraciones: a. 150 µg/mL = 0.15 mg/mL
b. 0.0001 M = 15.1 mg/mL
c. 0.03% = 0.3 mg/mL
Problema 9. a. Se pesan 20 mg de cloruro de acetilcolina al 98% y se afora a un volumen de 100 mL con
agua.
b. Se toman 66.67 mL de la disolución y se afora a un volumen de 100 mL con agua.
c. Se toman 60 mL de la disolución de 250 µg/mL y 40 mL de la disolución de 50 µg/mL.
Problema 10. Conejo de 5.4 Kg = 3.2 mL
Conejo de 5.7 Kg = 3.2 mL
- 85 -
Manual de Laboratorio
Anexo 2. Manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos.
CLASIFICACIÓN DE LOS RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICO-INFECCIOSOS
De acuerdo con la NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo, se consideran residuos peligrosos biológico-infecciosos los
siguientes:
La sangre:
• La sangre y los componentes de ésta, sólo en su forma líquida, así como los derivados
no comerciales, incluyendo las células progenitoras, hematopoyéticas y las fracciones
celulares o acelulares de la sangre resultante (hemoderivados).
Los cultivos y cepas de agentes biológico-infecciosos:
• Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación, así como
los generados en la producción y control de agentes biológico-infecciosos.
• Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de
agentes biológico-infecciosos.
Los patológicos:
• Los tejidos, órganos y partes que se extirpan o remueven durante las necropsias, la
cirugía o algún otro tipo de intervención quirúrgica, que no se encuentren en formol.
• Las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e histológico,
excluyendo orina y excremento.
• Los cadáveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes
enteropatógenos en centros de investigación y bioterios.
Los residuos no anatómicos
• Los recipientes desechables que contengan sangre líquida.
- 86 -
Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
• Los materiales de curación, empapados, saturados, o goteando sangre o cualquiera de
los siguientes fluidos corporales: líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido pleural,
líquido Céfalo-Raquídeo o líquido peritoneal.
• Los materiales desechables que contengan esputo, secreciones pulmonares y cualquier
material usado para contener éstos, de pacientes con sospecha o diagnóstico de
tuberculosis o de otra enfermedad infecciosa según sea determinado por la SSA
mediante memorándum interno o el Boletín Epidemiológico.
• Los materiales desechables que estén empapados, saturados o goteando sangre, o
secreciones de pacientes con sospecha o diagnóstico de fiebres hemorrágicas, así
como otras enfermedades infecciosas emergentes según sea determinado por la SSA
mediante memorándum interno o el Boletín Epidemiológico.
• Materiales absorbentes utilizados en las jaulas de animales que hayan sido expuestos a
agentes enteropatógenos.
Los objetos punzocortantes:
• Los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biológicas
durante el diagnóstico y tratamiento, únicamente: tubos capilares, navajas, lancetas,
agujas de jeringas desechables, agujas hipodérmicas, de sutura, de acupuntura y para
tatuaje, bisturís y estiletes de catéter, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el
laboratorio, el cual deberá desinfectar o esterilizar antes de ser dispuesto como residuo
municipal.
SEPARACIÓN Y ENVASADO DE LOS RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICO-INFECCIOSOS
Los residuos peligrosos biológico-infecciosos se separarán y envasarán para su almacenaje
temporal de la siguiente forma:
- 87 -
Manual de Laboratorio
TIPO DE RESIDUOS ESTADO FÍSICO ENVASADO COLOR
Sangre Líquidos Recipientes herméticos Rojo
Cultivos y cepas de agentes infecciosos Sólidos Bolsas de polietileno Rojo
Sólidos Bolsas de polietileno Amarillo Patológicos
Líquidos Recipientes herméticos Amarillo
Sólidos Bolsas de polietileno Rojo Residuos no anatómicos
Líquidos Recipientes herméticos Rojo
Objetos punzocortantes Sólidos Recipientes rígidos polipropileno Rojo
Las bolsas se llenarán al 80 por ciento (80%) de su capacidad, cerrándose antes de ser
transportadas al sitio de almacenamiento temporal y no podrán ser abiertas o vaciadas.
Además, las bolsas deberán estar marcadas con el símbolo universal de riesgo biológico y la
leyenda Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos.
SÍMBOLO UNIVERSAL DE RIESGO BIOLÓGICO:
RESIDUOS
PELIGROSOS BIOLÓGICO – INFECCIOSOS
- 88 -
Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
Anexo 3. Formularios.
FORMULARIO 1. PARÁMETROS FARMACOCINÉTICOS
Modelo de Un Compartimento (Administración Intravascular)
Ecuación general: tkeeCpCp *0 * −=
ed K
ClCpDV == 0
ABCkDV
edárea *
=
ABCDCl =
eKCpABC
0
0=∞
∑=
++
+−=
k
n
nnnn
t CCttABC1
110
)2
)((
ekt 2ln
21 =
Modelo de Un Compartimento (Administración Extravascular)
Ecuación general: )(* **0 tktk ae eeCpCp −− −=
ed k
ClV =
ABCkDFV
edárea *
*=
ABCDFCl *
=
- 89 -
Manual de Laboratorio
ae kCp
kCpABC
00
0−=∞
EVIV
IVEVabsoluta DABC
DABCF**
=
problemaestándar
estándarproblemarelativa DABC
DABCF
**
=
Modelo de Dos Compartimentos (Administración Intravascular)
Ecuación general: tt eBeACp ** ** βα −− −=
BACp +=0
β2ln
21 =t
0CpDVc =
βDVd =
ABCDV
áread *β=
2)**()(***
BAADVV
ssárea dd αββαβ
+−
+=
21
2112 )(k
kkVV cdss
+=
)**(**
βαα
βββ ABDClVkV de
d +===
ABCDkVVCl ecd === ** ββ
βαBAABC +=
ekkk ++=+ 2112βα
ekk ** 21=βα
- 90 -
Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
2110
*k
kk eβα
==
102112 kkk −−+= βα
021)*()*(
CpBAk αβ +
=
Modelo de Dos Compartimentos (Administración Extravascular)
Ecuación general: tktt aeCeBeACp *** *** −−− −+= βα
ABCDFV
áread **
β=
2)**()(*)*(**
BAAFDVV
ssárea dd αββαβ
+−
+=
21
2112*k
kkVV cdss
+=
βββClVkV ce
d ==*
ββ dVABC
DFCl **==
akCpBAABC
0
−+=βα
- 91 -
Manual de Laboratorio
FORMULARIO 2. CÁLCULO DE Kp órgano/sangre
Cálculo de la constante de reparto órgano/sangre (Kp):
sangre
tórgano
t
órganoABC
ABCKp
0
0=
∑=
++
+−=
k
n
nnnn
t CCttABC1
110
)2
)((
- 92 -
Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
FORMULARIO 3. MÉTODO Sigma minus
Ecuación general: )ln()ln( ∞∞ +∗−=− DutkDuDu
kt 2ln
21 =
[ ]Ke
CpABC0
0 =∞
Cálculo de constantes de eliminación:
enr kkk +=
0
·D
kDuke
∞
=
nrm kk ≈
Cálculo de depuraciones:
[ ]∞=0
0
ABCDClT
[ ]∞∞
=0ABC
DuClR
RTNR ClClCl −=
NRH ClCl ≈
- 93 -
Manual de Laboratorio
FORMULARIO 4. ANÁLISIS PROBIT
Ecuación general: αβ += CUP log*
Cálculo de DE50 ó DL50:
βαμ −
=5
50 501050μ=DL
Cálculo de una DE ó DL específica:
βαμ −
=UP
n nnDL μ10=
Tabla de transformación de Probabilidad a Unidades Probit Probabilidad 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09
0.00 --- 2.67 2.95 3.12 3.25 3.36 3.45 3.52 3.59 3.66 0.10 3.72 3.77 3.82 3.87 3.92 3.96 4.01 4.05 4.08 4.12 0.20 4.16 4.19 4.23 4.26 4.29 4.33 4.36 4.39 4.42 4.45 0.30 4.48 4.50 4.53 4.56 4.59 4.61 4.64 4.67 4.69 4.72 0.40 4.75 4.77 4.80 4.82 4.85 4.87 4.90 4.92 4.95 4.97 0.50 5.00 5.03 5.05 5.08 5.10 5.13 5.15 5.18 5.20 5.23 0.60 5.25 5.28 5.31 5.33 5.36 5.39 5.41 5.44 5.47 5.50 0.70 5.52 5.55 5.58 5.61 5.64 5.67 5.71 5.74 5.77 5.81 0.80 5.84 5.88 5.92 5.95 5.99 6.04 6.08 6.13 6.18 6.23 0.90 6.28 6.34 6.41 6.48 6.55 6.64 6.75 6.88 7.05 7.33
Probabilidad 0.000 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009
0.97 6.88 6.90 6.91 6.93 6.94 6.96 6.98 7.00 7.01 7.03 0.98 7.05 7.07 7.10 7.12 7.14 7.17 7.20 7.23 7.26 7.29 0.99 7.33 7.37 7.41 7.46 7.51 7.58 7.65 7.75 7.88 8.09
- 94 -
Evaluación de Fármacos y Medicamentos I
FORMULARIO 5. ÍNDICE TERAPÉUTICO Y MARGEN ESTÁNDAR DE SEGURIDAD
Cálculo del Índice Terapéutico (IT):
50
50
DEDLIT =
Cálculo del Margen Estándar de Seguridad (MS):
100*99
991
DEDEDLMS −
=
- 95 -
Manual de Laboratorio
FORMULARIO 6. ECUACIÓN DE HILL
Ecuación general: 50max
log*log*log CEhChEE
E−=⎟⎟
⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛−
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛−
=EE
EYmax
log
110max
+= −Ycalculado
EE
hb
CE−
=1050
- 96 -