TEMA 5: Toxicidad y mutagenicidad.

Caso práctico María ha aprendido sobre la tecnología del ADN, y además ha tenido la posibilidad de realizar PCR para determinar y analizar secuencias y determinar organismos infecciosos entre otras posibilidades. ¿Podrá utilizar esta técnica para determinar mutaciones? ¿Sabrá realizar una PCR con agentes mutagénicos y producir mutantes? Aunque hay muchas sustancias con efecto tóxico, en esta unidad vamos a centrarnos en aquellas sustancias que por su estructura son capaces de interaccionar con los ácidos nucleicos, presentando una posible actividad mutagénica y/o carcinogénica

Estudiaremos la toxicidad que afecta al material genético y que manifiesta una expresión retardada en el tiempo, también llamada genotoxicidad. Además, veremos que algunas sustancias genotóxicas son mutágenos, o lo que es lo mismo, incrementan la tasa de mutación. Algunas otras son carcinógenos, capaces de incrementar la tasa de aparición de un tumor.

También se ha demostrado que hay correlación positiva entre agentes genotóxicos y carcinógénicos, pero debes comprender que no todos los agentes que contribuyen al desarrollo de cánceres humanos son genotóxicos.

Pero, ¿Qué mecanismo de acción tienen estos carcinógenos que no son genotóxicos? Parece que interfieren en los mecanismos de reparación del DNA o de incrementar la respuesta mutagénica a otros agentes.

Muchas de estas sustancias pueden alcanzar el medio ambiente, fundamentalmente el acuático, y producir efectos directos o indirectos sobre el hombre y los animales, incluso a bajas concentraciones. Esto obliga a la adopción de estrictas medidas de control, siendo imprescindible la realización de pruebas de determinación de genotoxicidad, mutagenicidad y/o carcinogenicidad de todas las sustancias químicas de uso frecuente, así como de mezclas complejas debidas a actividad humana presentes en medio ambiente.

Y, ¿cómo se determina la toxicidad a nivel genético? Comprobarás que se utilizan ensayos más rápidos que utilizan como elementos de experimentación a microorganismos, sobre todo bacterias, o a cultivos celulares. Vamos a ello.

1. Agentes tóxicos y mutagénicos.

Caso práctico A María se le va a presentar la oportunidad de evaluar la influencia de un agente sobre un cultivo bacteriano, pero es necesario que sepa distinguir si lo que evalúa es un tóxico o un mutagénico.

En primer lugar, es importante definir el concepto de tóxico. Para comprender su significado es imprescindible tener presente la relatividad de dicho concepto. Así pues:

¿Por qué un medicamento me cura cuando estoy enfermo y me daña si abuso de él?

¿Por qué los niños toman menor cantidad de medicamento que los adultos?

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Todas estas preguntas nos llevan a concluir que no existen sustancias tóxicas de manera absoluta, sino que pueden tener un efecto positivo sobre el individuo hasta que se encuentran en cierta concentración, en la que producen efectos negativos no deseados.

Es importante que comencemos antes que nada por las definiciones de estos dos términos: Agente tóxico. Es un compuesto que a unas determinadas dosis y condiciones de exposición produce un efecto adverso sobre la salud humana. La evaluación de la toxicidad se realiza determinando la dosis a partir de la cual se producen efectos adversos en unas determinadas condiciones de exposición: aguda (DL50) y crónica NOAEL; LOAEL; MDT Agente mutagénico. Compuesto que ejerce su toxicidad sobre el ADN, que es capaz de alterar su estructura química. Para determinar la capacidad de un compuesto para interaccionar con el ADN necesitamos modelos experimentales in vitro. La respuesta es positiva o negativa, pero no hay umbral.

Estos agentes mutagénicos se pueden clasificar de la manera que vemos a continuación, en la siguiente presentación, en la que verás por ejemplo, agentes físicos que han inducido mutaciones en Drosophila.

Agentes mutagénicosMutágenos químicos

Son compuestos químicos capaces de alterar las estructuras del ADN de forma brusca, como por ejemplo el ácido nitroso (agente desaminizante), bromitas y algunos de sus compuestos

Mutágenos físicosSon radiaciones que pueden alterar la secuencia y estructura del ADN. Son ejemplos la

radiación ultravioleta que origina dímeros de pirimidina (generalmente de timina), y la radiación gamma y alfa que son ionizantes.

También se consideran agentes físicos los ultrasonidos, con 400.000 vibraciones por segundo, que han inducido mutaciones en Drosophila y en algunas platas superiores, y centrifugación, que también producen variaciones cromosómicas estructurales

Mutágenos biológicos

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Strychnos toxifera

Son aquellos organismos “vivos” que pueden alterar las secuencias del material genético de su hospedador; como por ejemplo: virus, bacterias y hongos. Son ejemplo los transposones (fragmentos autónomos de ADN)

Factores que no son agentes mutágenosPero que determinan si una mutación tendrá lugar o no. Temperatura, presión de oxígeno,

envejecimiento

Mutágenos que resultan de sustancias no carcinógenas metabolizadasPor ejemplo, el benzopireno es la sustancia resultante del metabolismo del hígado

Para saber más En el siguiente vídeo podrás ver cómo se produce la alteración de la estructura del ADN debida a la radiación ultravioleta.http://www.youtube.com/watch?v=I-oHPDemhOs&feature=player_embedded

2. Toxinas naturales y principales tóxicos antropogénicos.

Caso práctico María comenta a Pablo que quiere buscar alguna información más sobre las toxinas. Buscará en la

bibliografía el origen de las más habituales y comprobará qué tipos de ensayos se realizan para evaluar el grado de toxicidad.

Una toxina es un compuesto con actividad tóxica producido por un ser vivo. Da lugar, en general, a intoxicaciones agudas de carácter muy grave y de origen alimentario. Algunas de ellas se encuentran entre los tóxicos más potentes conocidos.

Algunas toxinas naturales pueden tener origen:

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Toxina botulínica.

- Vegetal: por ejemplo, toxinas fúngicas como las de Amanitas phalloides.- Animal: por ejemplo, tetrodoxina del pez globo.- Microorganismos:

Bacterias: por ejemplo, toxinas botulínicas.Dinoflagelados del plancton marino (mareas rojas) que contaminan moluscos bivalvos (mejillón,

almejas…).Hongos filamentosos (mohos) que producen micotoxinas consideradas contaminantes alimentarios.

Muchos de ellos tienen efectos mutagénicos. .

Los principales tóxicos antropogénicos son contaminantes ambientales de origen industrial y agrícola: - Productos de uso industrial (PCBs, Ftalatos…).- Productos derivados de la actividad industrial y de procesos de combustión (dioxinas, HAPs…).- Metales y derivados.- Plaguicidas organoclorados (DDT, lindano) y organosfosforados.

Muchos de ellos forman la gran familia de Contaminantes Orgánicos Persistentes (COPs) y se introducen en la cadena alimentaria, por lo que el ser humano puede estar expuesto a través del aire que respira, del agua de bebida y de los alimentos. La mayoría son mutágenos.

Reflexiona Las toxinas de tabaco permanecen en el aire desde días hasta meses, incluso después de que el humo y el olor aparentemente se hayan disipado. Además de que no existe un nivel seguro con respecto a la exposición al humo, ya que estas toxinas se adhieren a las partículas de polvo que existen en cualquier casa o lugar público.

Autoevaluación De los siguientes tóxicos, determina cuál es natural y cuál es antropogénico: Metano: NATURAL .Plomo: ANTROPOGÉNICO . A pesar de que el metano puede aumentar debido a la actividad humana, su origen es natural, y claro, el plomo, se debe a la actividad industrial.

3. Mutaciones. Tipos.

Caso práctico

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Lindano

Por fin se dedicará María a trabajar con los mutagénicos. Debe conocer el tipo de ensayos en los que

podrá evaluar el poder mutagénico de una sustancia. Pero deberá extremar las precauciones de trabajo. La mutación es un cambio estable y transmisible en la estructura del ADN.

Tipos: En función del tamaño.

Génicas o puntuales.Cromosómicas.

En función del efecto. Detectables por el fenotipo.No detectables por el fenotipo.

3.1. Mutaciones génicas o puntuales. Son:

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Molécula de ADN

- De pequeño tamaño (unos pocos pares de bases).- Reversibles.- Se detectan en ensayos con cambios en el fenotipo (Test de Ames). Son cambios que alteran la secuencia de nucleótidos del ADN. Estas mutaciones pueden llevar a la sustitución de aminoácidos en las proteínas resultantes. Un cambio en un solo aminoácido puede no ser importante si es conservativo y ocurre fuera del sitio activo de la proteína.

Las mutaciones génicas se detectan en sistemas experimentales para que la mutación se convierta en un cambio en el fenotipo.

El ensayo más utilizado es el Test de Ames que se realiza con bacterias de Salmonella typhimurium.

En el proceso de evaluación de la genotoxicidad es de los primeros que se realiza como screening.

Las mutaciones génicas se detectan mediante técnicas citogenéticas que permiten obtener un cariotipo, es decir las parejas de cromosomas de una célula ordenadas por tamaño y estructura.

Para saber más En el siguiente enlace puedes consultar la Nota Técnica de Prevención del Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo donde se comentan dos de los ensayos citógenéticos (0.18 MB) más empleados para el control biológico de poblaciones expuestas a agentes genotóxícos.

3.2. Aberraciones cromosómicas.

Son alteraciones en el número o en la estructura de los cromosomas. Se deben a errores durante la gametogénesis (formación de los gametos por meisosis) o de las primeras divisiones del cigoto.Son de gran tamaño, irreversibles y se detectan en ensayos citogenéticas. Aberraciones numéricas. Estas anomalías se denominan también mutaciones genómicas, ya que varía el número de cromosomas del genoma. El caso más común es la aneuploidía, que se produce cuando un individuo presenta accidentalmente algún cromosoma de más o de menos en relación con su condición

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Mutación

diploide. Se denominan monosomías, cuando en lugar de dos cromosomas homólogos sólo hay uno, y trisomías, cuando en lugar de dos hay tres cromosomas homólogos.

Ejemplo: Trisomía del cromosoma 21, más conocida como Síndrome de Down.

Aberraciones estructurales. Son los cambios en posición o presencia de fragmentos cromosómicos, se originan por la rotura de los cromosomas y recomposición de los segmentos resultantes. Cuando se rompe un cromosoma aparecen dos extremos adherentes o "pegajosos" inestables que se unen rápidamente con otro extremo, puede ser el original u otro. Pueden afectar uno, dos o más cromosomas.El índice de roturas cromosómicas aumenta por radiaciones ionizantes, agentes mutágenos, predisposición y virus. Se producen en 1 de cada 1000 gametos.

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Deleción. Es un tipo especial de anomalía estructural cromosómica que consiste en la pérdida de un fragmento de ADN de un cromosoma. Duplicación. Es el aumento del número de copias de un fragmento de DNA. Generalmente no presentan efectos, aunque si la región duplicada contiene reguladores de la división celular pueden causar neoplasias.Inversión. Se producen por la inversión de 180º del segmento que queda entre las dos roturas de un cromosoma. Generalmente no producen anomalías clínicas, aunque están relacionadas con un elevado riesgo de producir descendencia con una alteración cromosómica importante.Translocación. Se producen por la ruptura de dos cromosomas que intercambian fragmentos entre si, de manera que los genes que originalmente estaban en un cromosoma pasan al otro cromosoma. Generalmente esto determina una expresión alterada de los genes en la región translocada y determina el desarrollo de enfermedades neoplásicas como algunos tipos de leucemia.

Las delecciones y duplicaciones pueden modificar grandes segmentos del cromosoma. Las inversiones y translocaciones dan lugar a una pequeña o ninguna pérdida de información genética.

Autoevaluación Si tenemos el siguiente fragmento de ADN que tiene una eliminación de la base indicada

3'...T-G-A-C-G-G-C-C-A-A-T-G-T-T-T-C-A-T...5' Indica si la siguiente afirmación es verdadera o falsa. La mutación varía la proteína, puesto que a partir de la base eliminada, el patrón de lectura de los tripletes a lo largo de la proteína cambia, con lo que varían todos los tripletes siguientes. V Debes leer correctamente los tripletes después de la eliminación de la base.

4. Ensayos de toxicidad.

Caso práctico A María le han propuesto graficar los resultados de los ensayos del efecto de tres pesticidas que se han publicado en diferentes revistas. Su tutor de prácticas le pide que analice la rentabilidad de cada producto. Sabe que es de gran interés conocer la toxicidad relativa.

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Deleción

Deben distinguirse dos tipos de comportamientos de los efectos tóxicos: gradual y cuántico.

Comportamiento gradual. El efecto producido por un tóxico aumenta progresivamente con un incremento de la dosis (concentración de tóxico). Este efecto queda representado en la imagen siguiente: en el eje horizontal se

representa la dosis aplicada, y en el eje vertical, el efecto produ cido. Idealmente, la representación se asimilaría a una hipérbole con una asíntota horizontal que indicaría la dosis (Dm) a partir de la cual el efecto es máximo (Em) y, como tal, ya no aumenta. Pero, en realidad, la curva experimental que se obtiene se asimila más a una curva sigmoidea, tal y como se indica en la imagen siguiente. La explicación de ambos tipos de respuesta reside en el hecho de que los organismos vivos poseen unos mecanismos de regulación que les permiten amortiguar los efectos de dosis pequeñas, por lo que la parte inicial de la curva se suaviza, retardando los efectos mayores a dosis superiores. El comportamiento gradual solo aparece en estudios in vitro de órganos aislados, tejidos o células, puesto que no disponen por sí mismos de mecanismos de regulación.

Autoevaluación

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Dosis máxima

Letalidad toxicos

Efecto dosis

De entre esos tres pesticidas ensayados, señala cuál pondrías en el mercado, escribiendo su letra. B El B resulta el más rentable

4.1. Comportamiento cuántico.

A este comportamiento también se lo conoce como el “todo o nada”. Como se puede deducir, el individuo manifiesta la alteración máxima o no experimenta ningún tipo de alteración.

Este tipo de comportamiento requiere una representación distinta a la anterior, puesto que la cuantificación del efecto no es posible: se trata de SÍ o NO, blanco o negro, afectado o no afectado. Por este motivo, se representa la respuesta (el % de letalidad) de la población al tóxico en forma de proporción de individuos muertos . En la gráfica anterior se representa la letalidad acumulada de una población frente a dos tóxicos distintos. Se puede observar claramente que los efectos del tóxico A son mucho más devastadores que los del tóxico B, ya que, a igual concentración, la sustancia A puede matar prácticamente a toda la población, mientras que, en el caso de B, afectaría a un porcentaje mucho menor.

Las representaciones anteriores permiten determinar algunos parámetros característicos de un tóxico. Estos se presentan a continuación:

Dosis letal absoluta (DL100): concentración mínima que asegura la mortalidad total, es decir, que provoca la muerte de todos los individuos de la población.

Dosis letal 50 (DL50): concentración que provoca la muerte del 50% de la población. Dosis letal mínima: concentración mínima capaz de provocar la muerte a un individuo de la

población.Dosis umbral: concentración que asegura que, por debajo de ella, no provoca daño de ningún

tipo a ningún individuo de la población.

El parámetro más significativo de los anteriores es el DL50, que permite hacerse una idea de la toxicidad de una sustancia, comparando su valor con la tabla siguiente:

Toxicidad de una sustancia.

Categoría DL50Extremadamente tóxico < 1 mg/kg

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Dosis letal

Altamente tóxico 1-50 mg/kgModeradamente tóxico 50-500 mg/kgLigeramente tóxico 0.5-5 g/kgNo tóxico 5-15 g/kg

Debes conocer En este enlace puedes informarte sobre el método de cálculo de la DL50 (301 KB) .

5. Ensayos de mutagenicidad: Test de Ames.

Caso práctico Y a María, después de todo lo que ha ido asimilando sobre toxicidad y su forma de evaluarla, ahora le queda finalizar el paso por este laboratorio realizando un ensayo de mutagenicidad. A pesar de que en el mercado existen algunos ensayos rápidos o kits para evaluarla, ella va a optar por llevar a cabo todo el procedimiento con el test de Ames. Se encargará de conseguir la cepa apropiada y evaluará el mutágeno que le propongan, pero antes repasará los materiales necesarios para llevarlo a cabo. El test de Ames se usa para evaluar la mutagenicidad de un compuesto. Este test fue desarrollado por el Dr. Bruce Ames en la década de 1970 en la Universidad de Berkeley, en California. Concretamente, el test consiste en comprobar si unos microorganismos sufren una mutación de retroceso al estar en contacto con la sustancia “sospechosa”. De ser así, la sustancia sería catalogada de mutagénica y, por lo tanto, sería

motivo de estudios posteriores sobre su capacidad cancerígena, puesto que el 90% de las sustancias que dan positivo en el test de Ames resultan, posteriormente, ser cancerígenas.

Los microorganismos más utilizados en esta prueba son cepas mutantes de Salmonella typhimurium, que requiere histidina, ya que no puede sintetizar este aminoácido. El medio en que se cultivan dichos organismos no contiene histidina, por lo que sólo podrán crecer las células que retrocedan o reviertan (sufran una nueva mutación, esta vez de retroceso) a su estado natural, en el que no requieren histidina.

Las bacterias se extienden sobre una placa de agar con una pequeña cantidad de histidina y el compuesto químico cuyo efecto mutagénico se quiere comprobar. Esta pequeña cantidad de histidina en el medio de cultivo permite a las bacterias crecer por un tiempo inicial y tener la oportunidad de mutar.

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Histidina

Cuando la histidina se agota, sólo las bacterias que hayan mutado para obtener la capacidad de producir su propia histidina van a sobrevivir y multiplicarse. En el experimento la placa se incuba durante 48 horas, y la mutagenicidad de la sustancia será proporcional al número de colonias observadas en la placa.

Según el test de Ames una sustancia, natural o sintética, se considera mutagénica cuando el coeficiente de reversión, C.R., es mayor que 2. (C.R. = Nº de colonias revertantes por placa ensayada/ Nº de colonias revertantes por placa control -espontáneas-). Para la mayoría de los mutágenos ensayados, hay un rango de concentraciones que produce una curva dosis-respuesta lineal.

Test de Ames

Autoevaluación Completa el siguiente enunciado: El test de Ames es el primer ensayo de corta duración para detectar la mutagenicidad de AGENTES químicos. Utiliza cepas MUTANTES , deficientes para la HISTIDINA , para detectar MUTACIONES puntuales de una o pocas pares de bases. Detecta mutaciones que revierten las mutaciones originales de las cepas y restauran la capacidad de las bacterias para sintetizar el AMINOÁCIDO esencial. El test de Ames es el primer ensayo de corta duración para detectar la mutagenicidad de agentes químicos. Utiliza cepas mutantes, deficientes para la histidina, para detectar mutaciones puntuales de una o pocas pares de bases. Detecta mutaciones que revierten las mutaciones originales de las cepas y restauran la capacidad de las bacterias para sintetizar el aminoácido esencial.

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