Diagnóstico molecular de PRRS

Reunión GITEP 11/12/13

Ariel Pereda

Laboratorio de Aves y Porcinos

Instituto de Virología - INTA

Clínica: Fallas reproductivas – Respiratorias (depende de patogenicidad)

Diagnóstico de PRRS

Adultos Camadas afectadas Lechones destetados

Reducción del apetito Mortinatos Pérdida de apetito - Letargia

Fiebre Alta mortandad pre destete Fallas en crecimiento

Partos prematuros - Abortos Lechones momificados Distress respiratorio

≥10% de mortandad Nacimientos deparejos Petequias y equimosis en piel

Prob. neurológicos Edema periorbital Pelo áspero

Complementarios: Laboratorio • Serología ELISA (Clasif. Granjas, circ. Viral, Cuarentena) • Virología Aislamiento (lento, no afectado x mutaciones) • Molecular RT-PCR – Real Time RT-PCR – EPIMOL

Diangóstico diferencial

Muestras a remitir para diagnóstico Serología: Suero o plasma. A partir de los 5 días post infección hay presencia de IgM y a los 14-21 dpi IgG sérica. Pico máximo a los 40-50 dpi y caen lentamente hasta los 4 a 6 meses Aislamiento viral y Diagnóstico Molecular: (1 – 2 dpi, pico de viremia a los 10 dpi) Sangre entera EDTA) Buffy Coat Suero Plasma Pulmones Linfonódulos (mediastínico) Bazo Tonsilas PRRSV replica en macrófagos alveolares

TEST MOLECULARES DISPONIBLES

RT-PCR CONVENCIONAL • Muchos protocolos existentes • La mayoría dirigidos al ORF7 • Simples o “nested” • Más rápidos que el aislamiento • No requiere de virus viable • Alta sensibilidad • Riesgo de contaminación cruzada

RT-PCR EN TIEMPO REAL • Menor cantidad de protocolos existentes • Dirigidos al ORF5, ORF 6 y ORF7 • Semi cuantitativos • Más rápidos que el aislamiento • No requiere de virus viable • Más sensibles que el convencional • Menor Riesgo de contaminación cruzada

Kits Comerciales para Real Time RT-PCR

Por la naturaleza del virus

Se deben tener al menos 2 o 3

diferentes test diagnósticos

2013 - USA

2012 - EU

Biología Molecular Epidemiología

Epidemiología Molecular

" el estudio de la distribución y determinantes de enfermedades que afectan

transitoriamente a muchos individuos en un sitio determinado"

Epidemiología: definición

Evolución: definición

La teoría que explica como los organismos cambian a través del tiempo

Fenotipo

• Caracteres: color de la flor

• Estados de cada carácter: rojo, amarillo, rosa.

Genotipo

Caracteres: cada posición de nucleótido o aminoácido

Estados de cada carácter: A, G, T o C

Secuencia

¿Para qué son necesarios

estudios filogenéticos?

•Filogenia: ¿Cuál es la historia de este grupo de especies? ¿Cómo se

relacionan? ¿cuál es la historia de este gen?

•Delimitación de especies: ¿Pertenecen estas dos poblaciones a una sola

especie o a dos especies diferentes?

•Estructura de poblaciones: ¿Como se explica la diferenciación entre

poblaciones de la especie X?

•Origen: ¿De dónde viene el individuo X?

•Relaciones: ¿Está este grupo de individuos relacionado?

•Individualización: ¿Cómo la muestra del individuo X se relaciona con el

individuo Y?

Metodologías aplicadas a los estudios

epidemiológicos

•Hibridización por sonda

•PCR diferencial

•Corte por enzima de restricción

PRESENCIA Y TIPIFICACIÓN

•RAPDs

•AFLP

•Microsat

•Secuenciación

PRESENCIA, TIPIFICACIÓN Y ANÁLISIS

FILOGENÉTICO

0.1 O1Campos58

OTaiwan97

Asia1

Paquistan54

SAT3

Bechuanaland 65

SAT1

Bostwana68

SAT2

Kenya57

A24Cruzeiro55

A27Colombia67

C1SantaPau58

C3Argentina85

Representación visual de la posible relación histórica entre los

organismos en estudio

Árbol filogenético

• Nucleótidos vs. proteínas

• Mutaciones: Cambios en la composición genética del individuo durante la

replicación del ADN en relación a un estado ancestral.

• 1.Sustituciones.

• 2.Eliminaciones.

• 3.Inserciones.

• 4.Inversiones.

Regiones conservadas vs. regiones variables

Saturación: se debe a múltiples cambios en el mismo sitio

•En el estudio de la evolución, es fundamental conocer la escala

temporal y espacial de la dinámica de los procesos

Análisis filogenético

Grupo monofilético

Ramas

Árbol sin raíz

Tiempo evolutivo

Dicotomía

Politomía

Ancestro

OTU

Árbol con raíz

98

remuestreo

Unidades

Taxonómicas

Operativas

La evolución de los patógenos presenta un desafío

para el sistema de salud.

Le permite escapar de la respuesta inmune del

huesped

Le permite cambiar el rango de hospedador y

modificar su virulencia.

La identificación de sitios claves en el genoma viral

Desarrollo de modelos de evolución viral y transmisión

Evolución

¿Para qué son necesarios

estudios filogenéticos?

•Filogenia: ¿Cuál es la historia de este grupo de especies? ¿Cómo se

relacionan? ¿cuál es la historia de este gen?

•Delimitación de especies: ¿Pertenecen estas dos poblaciones a una sola

especie o a dos especies diferentes?

•Estructura de poblaciones: ¿Como se explica la diferenciación entre

poblaciones de la especie X?

•Origen: ¿De dónde viene el individuo X?

•Relaciones: ¿Está este grupo de individuos relacionado?

•Individualización: ¿Cómo la muestra del individuo X se relaciona con el

individuo Y?

ORF 5

Conclusiones

Diagnóstico molecular de PRRS • Más Rápido • Más sensible • Más costoso

Sigue necesitando del diagnóstico clínico anamnesis

No es suficiente contar con un solo test

Epidemiología molecular de PRRSV • Ubicación temporo-espacial • Análisis de riesgo • Taxonomía - clasificación • Indicador de antigenicidad