Diagnostico Microbiologico de Secreciones Respiratorias Resp

MICROBIOLOGIA DE LAS MICROBIOLOGIA DE LAS MUESTRAS RESPIRATORIASMUESTRAS RESPIRATORIAS

Lic TM: MIGUEL FLORES Lic TM: MIGUEL FLORES FERNANDEZFERNANDEZ

HERM-2003HERM-2003

MUESTRAS DEL TRACTO RESPIRATORIO SUPERIORMUESTRAS DEL TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR

1.0 INTRODUCCIÓN1.0 INTRODUCCIÓN

Las vías respiratorias altas se extienden desde los orificios Las vías respiratorias altas se extienden desde los orificios nasales hacia la laringenasales hacia la laringe y comprende la nasofaringe y la y comprende la nasofaringe y la orofaringe,a, los senos paranasales, trompa deorofaringe,a, los senos paranasales, trompa de Eustaquio y Eustaquio y el oído medio.el oído medio.

Las infecciones del tracto respiratorio superior más Las infecciones del tracto respiratorio superior más frecuentes son: laringitis,faringitis, epiglotitis, sinusitis, frecuentes son: laringitis,faringitis, epiglotitis, sinusitis, otitis externa y media, difteria, tos ferina, angina deotitis externa y media, difteria, tos ferina, angina de Vincent Vincent y candidiasis oral.y candidiasis oral.

Es fundamental conocer la flora comensal para la Es fundamental conocer la flora comensal para la interpretación de los resultadosinterpretación de los resultados

dde laboratorio.e laboratorio.

FLORA NORMAL DEL TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR

-Streptococcus spp (alfa, beta, no hemolíticos) -Veillonella spp.-Neisseria spp. -Peptostreptococcus spp.-Haemophilus spp. -Actynomyces spp.-Corynebacterium spp. -Mycoplasma spp.-Staphylococcus spp -Bacteroides spp.-Micrococcus spp. -Fusobacterium spp.-Candida spp.

TOMA DE MUESTRATOMA DE MUESTRA

Se debe evitar la contaminación de las muestras Se debe evitar la contaminación de las muestras durante la fase de recogida. durante la fase de recogida.

En todos los casos se realizará en condiciones de En todos los casos se realizará en condiciones de esterilidad por parte del personal que realiza la esterilidad por parte del personal que realiza la técnica y del material que se utiliza.técnica y del material que se utiliza.

Las muestras deben ser representativas del lugar de Las muestras deben ser representativas del lugar de la infección por lo que se utilizarán preferentemente la infección por lo que se utilizarán preferentemente aquellas técnicas que permitan obtener muestras de aquellas técnicas que permitan obtener muestras de calidad. calidad.

TOMA DE MUESTRATOMA DE MUESTRA

Una vez tomadas las muestras serán identificadas, Una vez tomadas las muestras serán identificadas, en los medios de transporte y en los impresos del en los medios de transporte y en los impresos del Laboratorio especificando el método que se ha Laboratorio especificando el método que se ha seguido para su obtención.seguido para su obtención.

Las muestras potencialmente peligrosas deberán Las muestras potencialmente peligrosas deberán ser adecuadamente identificadas.ser adecuadamente identificadas.

TRANSPORTE DE LA TRANSPORTE DE LA MUESTRAMUESTRA

El transporte al Laboratorio de Microbiología debe realizarse de El transporte al Laboratorio de Microbiología debe realizarse de forma rápida, y no debe demorarse la llegada de la muestra forma rápida, y no debe demorarse la llegada de la muestra respiratoria en más de 1 hora. respiratoria en más de 1 hora.

En los casos en que no sea posible deben guardarse a temperatura En los casos en que no sea posible deben guardarse a temperatura inferior a 4ºC. inferior a 4ºC.

Para las muestras obtenidas mediante aspirado traqueal y LBA se Para las muestras obtenidas mediante aspirado traqueal y LBA se utilizarán contenedores estériles de boca ancha y tapón de rosca. utilizarán contenedores estériles de boca ancha y tapón de rosca.

Para las muestras obtenidas por CTT o biopsias pulmonares se Para las muestras obtenidas por CTT o biopsias pulmonares se utilizarán tubos estériles con 1 cc de suero fisiológico. utilizarán tubos estériles con 1 cc de suero fisiológico.

CALIDAD DE LA CALIDAD DE LA MUESTRAMUESTRA

El primer paso del procesamiento El primer paso del procesamiento consiste en evaluar la posible consiste en evaluar la posible contaminación con bacterias del tracto contaminación con bacterias del tracto respiratorio superior. respiratorio superior.

Para las muestras obtenidas mediante Para las muestras obtenidas mediante aspiración traqueal se utilizan los aspiración traqueal se utilizan los criterios de Murray/Washington , no criterios de Murray/Washington , no debiéndose procesar aquellas muestras debiéndose procesar aquellas muestras con nivel de calidad 0 o 1.con nivel de calidad 0 o 1.

CALIDAD DE LA MUESTRACALIDAD DE LA MUESTRA

Para las muestras respiratorias Para las muestras respiratorias broncoscópicas o ciegas se admite que la broncoscópicas o ciegas se admite que la presencia de más de un 1% de células presencia de más de un 1% de células epiteliales escamosas traduce una epiteliales escamosas traduce una contaminación orofaríngea significativa y contaminación orofaríngea significativa y será muy difícil poder interpretar será muy difícil poder interpretar correctamente los resultados.correctamente los resultados.

Además, estos especímenes no deben Además, estos especímenes no deben mostrar menos de un 10% de neutrófilos.mostrar menos de un 10% de neutrófilos.

ESPUTOESPUTO• La calidad de la muestra es esencial para una

adecuada interpretación.

• Los criterios de calidad de la muestra propuestos por Murray y Washington, quienes establecieron criterios de calidad según la proporción de células inflamatorias (leucocitos polimorfonuclares) en relación a las células epiteliales (contaminación por saliva).

• Según estos criterios, el laboratorio debe rechazar las muestras de mala calidad, ya que los resultados del cultivo no aportan al diagnóstico.

ESPUTOESPUTO

Procesamiento del esputoProcesamiento del esputo Debe procesarse dentro de los 30'-2 horas Debe procesarse dentro de los 30'-2 horas de recogido o conservarse a 4°C para evitar de recogido o conservarse a 4°C para evitar el sobrecrecimiento de la flora el sobrecrecimiento de la flora acompañante. Es conveniente seleccionar acompañante. Es conveniente seleccionar las porciones purulentas, evitando tocar las las porciones purulentas, evitando tocar las partes salivosas.partes salivosas.

Para que cultivo de Esputo ?Para que cultivo de Esputo ? Neumonía por aspiración

Infección micobacteriana atípica

Neumonía atípica

Blastomicosis

Bronquiectasis

Coccidioidomicosis pulmonar aguda primaria

Coccidioidomicosis pulmonar crónica

Coccidioidomicosis diseminada

Criptococcosis

Tuberculosis diseminada (infecciosa)

Para que cultivo de Esputo ?Para que cultivo de Esputo ?

Histoplasmosis pulmonar aguda primaria Histoplasmosis pulmonar crónica Neumonía adquirida en el hospital Neumonía por micoplasma Peste Aspergiloma pulmonar (micetoma) Aspergilosis pulmonar de tipo invasivo Tuberculosis pulmonar Neumonía viral

ESPUTOESPUTO

Rendimiento del cultivo de esputoRendimiento del cultivo de esputo Aproximadamente 60-70% en personas con Aproximadamente 60-70% en personas con neumonía y sin tratamiento antibiótico neumonía y sin tratamiento antibiótico previo y 30-40% en personas con previo y 30-40% en personas con tratamiento antibiótico previo. tratamiento antibiótico previo.

CRITERIOS DE RECHAZO PARA LAS MUESTRAS DE EXPECTORACION SEGUN MURRAY Y WASHINGTON*.

GRUPO

N° células por campo de menor aumento

Realizar cultivoCélulas epiteliales Escamosas Leucocitos polimorfonucleares

1 25 10 No

2 25 10-25 No

3 25 25 No

4 10-25 25 No

5 <10 25 Sí

Coloración de Gram

CEECs (10x) PMN (10x)Germen

Predominante (1000x)

FPM (1000x)Cultivo

PredominanteCultivo: FPM Informe

>10 <25 X XXX FPM

<10 >25 X X Género y especie Antibiograma

<10 >25 X X FPM o (1)

<10 >25 X X FPM

>10 >25 X X Género y especie Antibiograma

>10 >25 X X FPM o (1)

<10 <25 X XXX FPM

<10 <25 X X Género y especie

(1) Tratar de aislar el morfotipo predominante visto en la coloración de Gram, tipificar y realizar pruebas de sensibilidad correspondientes; sugerir confirmación con nueva muestra Si no se puede reaislar el germen predomiante informar el exámen directo haciendo hincapié en el predominio e informar flora polimicrobiana (2) La única utilidad sería como cultivo de vigilancia para estudio de colonización. Sugerir nueva muestra CEECs: células epiteliales escamosas PMN: neutrófilos XXX: No se aconseja el cultivo, en caso de realizarse informar FPM. FPM: Flora polimicrobiana

MUESTRAS DEL TRACTO MUESTRAS DEL TRACTO RESPIRATORIO BAJORESPIRATORIO BAJO

A.-MUESTRAS RESPIRATORIA A.-MUESTRAS RESPIRATORIA TOMADA POR METODOS NO TOMADA POR METODOS NO INVASIVOS:INVASIVOS:

ASPIRADO TRAQUEALASPIRADO TRAQUEAL


B.-MUESTRAS RESPIRATORIA TOMADA B.-MUESTRAS RESPIRATORIA TOMADA POR METODOS INVASIVOS:POR METODOS INVASIVOS:

1.1. Cepillado bronquial mediante catéter Cepillado bronquial mediante catéter telescopadotelescopado

2.2. Lavado broncoalveolar (LBA)Lavado broncoalveolar (LBA)

BroncofibroscopioBroncofibroscopio

Diagnóstico bacteriológicoDiagnóstico bacteriológico

A) Muestras de primera elecciónA) Muestras de primera elección 1)1) Muestras tomadas por fibrobroncoscopía: Muestras tomadas por fibrobroncoscopía:

lavado broncoalveolar (BAL), cepillo protegido lavado broncoalveolar (BAL), cepillo protegido (CEP). (CEP).

B)Muestras alternativas de segunda elección B)Muestras alternativas de segunda elección

2)2) BAL y CEP no broncoscópicos, tomados a BAL y CEP no broncoscópicos, tomados a través de distintos sistemas de doble catéter través de distintos sistemas de doble catéter

3)3) Secreciones traqueales para cultivo cuantitativo. Secreciones traqueales para cultivo cuantitativo.


Secreciones traquealesSecreciones traqueales

Coloración de GramColoración de GramRealizar en primer lugar un recuento de Realizar en primer lugar un recuento de neutrófilos y células epiteliales escamosas, neutrófilos y células epiteliales escamosas, considerándose representativa una muestra con > considerándose representativa una muestra con > 25 PMN y < 10 células epiteliales (10x). 25 PMN y < 10 células epiteliales (10x). Búsqueda de bacterias intra y extracelulares. Búsqueda de bacterias intra y extracelulares.

GRAMGRAM


Siembra Siembra CualitativaCualitativa:: Similar a lo descripto para Similar a lo descripto para esputo en lo que hace a siembra e esputo en lo que hace a siembra e interpretación. interpretación.


Siembra cuantitativaSiembra cuantitativa

Mezclar partes iguales de secreciones y de N-acetil Mezclar partes iguales de secreciones y de N-acetil cisteína al 1%, dejar actuar durante un minutocisteína al 1%, dejar actuar durante un minuto

Realizar una dilución 1/100 (0,1 en 9,9 ml de solución Realizar una dilución 1/100 (0,1 en 9,9 ml de solución fisiológica estéril)fisiológica estéril)

Sembrar 100 µl (dilución final 1/1000) en los medio Sembrar 100 µl (dilución final 1/1000) en los medio citados en el punto anterior. Es conveniente el agregado de citados en el punto anterior. Es conveniente el agregado de al menos 2 diluciones más: 1/10.000 y 1/100.000. Se debe al menos 2 diluciones más: 1/10.000 y 1/100.000. Se debe considerar como representativo un punto de corte de 106 considerar como representativo un punto de corte de 106 ufc/ml. ufc/ml.

En este caso la especificidad mejora considerablemente En este caso la especificidad mejora considerablemente con respecto al procesamiento semicuantitativo pero se con respecto al procesamiento semicuantitativo pero se mantiene aún por debajo de los correspondientes valores mantiene aún por debajo de los correspondientes valores de BAL o CEP. de BAL o CEP.


Mezclar partes iguales de secreciones y de N-Mezclar partes iguales de secreciones y de N-acetil cisteína al 1%, dejar actuar durante un acetil cisteína al 1%, dejar actuar durante un minutominuto

Realizar una dilución 1/1000 (en solución Realizar una dilución 1/1000 (en solución fisiológica estéril).fisiológica estéril).

Mezclar en vortex por 3 minutos.Mezclar en vortex por 3 minutos.

Sembrar con asa calibrada de 1/1000Sembrar con asa calibrada de 1/1000

Dilucion final 1/1000 0000.Dilucion final 1/1000 0000.


Muestras tomadas por fibrobroncoscopíaMuestras tomadas por fibrobroncoscopía

Cepillo protegido (CEP) Cepillo protegido (CEP)

Procesamiento:Procesamiento: La muestra puede llegar al laboratorio de La muestra puede llegar al laboratorio de

Bacteriología dentro de la doble cánula o Bacteriología dentro de la doble cánula o bien en 1 ml de solución fisiológica. bien en 1 ml de solución fisiológica.

Diagnóstico bacteriológicoDiagnóstico bacteriológico En el primer caso, antes de extraer el cepillo debe desinfectarse En el primer caso, antes de extraer el cepillo debe desinfectarse

la cánula externa por fuera con alcohol etílico de 70¼la cánula externa por fuera con alcohol etílico de 70¼

Se extrae y se corta el cepilloSe extrae y se corta el cepillo

Se coloca en 1 ml de caldo BHI (la solución fisiológica puede Se coloca en 1 ml de caldo BHI (la solución fisiológica puede disminuir los recuentos de S. pneumoniae y H. influenzae e disminuir los recuentos de S. pneumoniae y H. influenzae e inhibir el crecimiento de L. pneumophila) inhibir el crecimiento de L. pneumophila)

Se agita con vortex durante 1 minuto.Se agita con vortex durante 1 minuto.

Se siembra esta dilución y una dilución 1/1000 en agar sangre, Se siembra esta dilución y una dilución 1/1000 en agar sangre, agar chocolate, Mc conkey o similar y agar anaerobio; este agar chocolate, Mc conkey o similar y agar anaerobio; este último tiene mayor importancia en el caso de pacientes en los último tiene mayor importancia en el caso de pacientes en los que se produjo una franca aspiración de contenido orofaríngeoque se produjo una franca aspiración de contenido orofaríngeo


La cantidad de muestra tomada por este procedimiento La cantidad de muestra tomada por este procedimiento es muy pequeña, alrededor de 0,01 a 0,001 ml de es muy pequeña, alrededor de 0,01 a 0,001 ml de secreciones respiratorias, lo cual indica que un secreciones respiratorias, lo cual indica que un recuento de 103 ufc/ml corresponde a recuentos de recuento de 103 ufc/ml corresponde a recuentos de 105 o 106 ufc/ml en la secreción. 105 o 106 ufc/ml en la secreción.

El punto de corte de 103 ufc/mlEl punto de corte de 103 ufc/ml ha sido validado por ha sido validado por comparación con cultivos de biopsia de pulmón a comparación con cultivos de biopsia de pulmón a cielo abierto. cielo abierto.

La sensibilidad de esta técnica se encuentra en el La sensibilidad de esta técnica se encuentra en el orden de 80% (rango 64-100%) y la especificidad en orden de 80% (rango 64-100%) y la especificidad en 92% (rango 69-100%). 92% (rango 69-100%).


Lavado broncoalveolar (BAL) Lavado broncoalveolar (BAL)

ProcesamientoProcesamiento : : Con respecto al exámen directo es fundamental Con respecto al exámen directo es fundamental

que el porcentaje de células epiteliales escamosas que el porcentaje de células epiteliales escamosas sea < 1%, contando por lo menos 200-300 sea < 1%, contando por lo menos 200-300 elementos entre macrófagos, células epiteliales elementos entre macrófagos, células epiteliales escamosas y neutrófilos; si este porcentaje se escamosas y neutrófilos; si este porcentaje se supera se estaría en presencia de una muestra supera se estaría en presencia de una muestra contaminada con secreciones respiratorias de vías contaminada con secreciones respiratorias de vías superiores.superiores.

Procesamiento esquem‡tico de Procesamiento esquem‡tico de BAL y CEPBAL y CEP

Muestra broncoscópica

Sitio anatómicoCantidad de

muestraDilución

Punto de corte (ufc/ml)

Lavado bronquial Bronquios 10-20 ml 1/10-1/100

Cepillo protegido Bronquiolos 0,01-0,001 ml 1/1000 103

Lavado broncoalveolar

Alveólos 10-100 ml 1/10-1/100 104

Biopsia transbronquial

Parénquima pulmonar

0,1 g

Comparación entre distintas técnicas fibrobroncoscópicas.


El lavado broncoalveolar y/o el cepillo protegido El lavado broncoalveolar y/o el cepillo protegido broncoscópicos o no, sembrados en forma cuantitativa, son las broncoscópicos o no, sembrados en forma cuantitativa, son las muestras de elección para ser analizadas junto con un score muestras de elección para ser analizadas junto con un score clínico y radiológico. clínico y radiológico.

De esta forma se puede realizar un uso racional de De esta forma se puede realizar un uso racional de antibióticos, evitando sobretratamientos, acortando la duración antibióticos, evitando sobretratamientos, acortando la duración de la terapia empírica, minimizando la emergencia de cepas de la terapia empírica, minimizando la emergencia de cepas resistentes y disminuyendo la morbi-mortalidad asociada.resistentes y disminuyendo la morbi-mortalidad asociada.

Dentro de los agentes etiológicos más frecuentes se Dentro de los agentes etiológicos más frecuentes se encuentran los bacilos gram negativos, aproximadamente un encuentran los bacilos gram negativos, aproximadamente un 70% con respecto al total, principalmente Pseudomonas 70% con respecto al total, principalmente Pseudomonas aeruginosa, seguida por Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter aeruginosa, seguida por Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Enterobacter spp, Serratia marcescens, con un baumannii, Enterobacter spp, Serratia marcescens, con un orden de frecuencia que depende de cada hospital. orden de frecuencia que depende de cada hospital.

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