I

Versión Final Comité - Diciembre 2006 NORMA CHILENA

NCh3044/1-2006

ISO 14673-1:2004 (4)/IDF 189-1:2004

Leche y productos lácteos - Determinación del contenido de nitritos y nitratos - Parte 1: Método usando reducción por cadmio y espectrometría Preámbulo El Instituto Nacional de Normalización, INN, es el organismo que tiene a su cargo el estudio y preparación de las normas técnicas a nivel nacional. Es miembro de la INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) y de la COMISION PANAMERICANA DE NORMAS TECNICAS (COPANT), representando a Chile ante esos organismos. Esta norma se estudió a través del Comité Técnico Ensayos en leche, para especificar un método de ensayo para la determinación del contenido de nitritos y nitratos en leche y productos lácteos, mediante reducción por cadmio y espectrometría. Esta norma es idéntica a la versión en inglés de la Norma Internacional ISO 14673-1:2004 (4)/IDF 189-1:2004 (E) Milk and milk products - Determination of nitrate and nitrite contens - Part 1: Method using cadmium reduction and spectrometry. La Nota Explicativa incluida en un recuadro en cláusula 2 Referencias normativas y Anexo Bibliografía, es un cambio editorial que se incluye con el propósito de informar la correspondencia con norma chilena de las normas internacionales citadas en esta norma. La norma NCh3044/1 ha sido preparada por la División de Normas del Instituto Nacional de Normalización, y en su estudio el Comité estuvo constituido por las organizaciones y personas naturales siguientes: Instituto Nacional de Normalización, INN José Manuel Román M. Nestlé Chile S.A. Manuel González G.

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En forma adicional a las organizaciones que participaron en Comité, el Instituto recibió respuesta durante el período de consulta pública de esta norma, de las entidades siguientes: Universidad de Santiago de Chile Vialat S.A. El Anexo A no forma parte de la norma, se inserta sólo a título informativo.

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Contenido

Página

Preámbulo I

1 Alcance 1

2 Referencias normativas 2

3 Términos y definiciones 2

4 Principio 3

5 Reactivos 3

6 Aparatos 6

7 Muestreo 7

8 Preparación de la muestra de ensayo 7

8.1 Leche deshidratada y suero deshidratado 7

8.2 Caseína y caseinatos 7

8.3 Queso 8

8.4 Queso de suero 8

9 Procedimiento 8

9.1 Preparación de la columna de cadmio cuprizado 8

9.2 Comprobación de la capacidad de reducción de la columna 9

9.3 Regeneración de la columna 10

9.4 Preparación de la porción de ensayo 10

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Contenido

Página

9.5 Extracción y desproteinización 11

9.6 Reducción de nitrato a nitrito 12

9.7 Ensayo en blanco 12

9.8 Determinación 12

9.9 Preparación del gráfico de calibración 13

10 Cálculo y expresión de resultados 13

10.1 Contenido de nitrito 13

10.2 Contenido de nitrato 14

11 Precisión 15

11.1 General 15

11.2 Repetibilidad 15

12 Informe de ensayo 17

Anexos

Anexo A (informativo) Bibliografía 19

Figuras

Figura 1 Columna de reducción 18

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Leche y productos lácteos - Determinación del contenido de nitritos y nitratos - Parte 1: Método usando reducción por cadmio y espectrometría Advertencia: El uso de esta norma puede implicar materiales, operaciones y equipos peligrosos. No es propósito de esta norma acercarse a todos los problemas de seguridad asociados con su uso. Es responsabilidad del usuario de esta norma establecer prácticas de seguridad y salud, y previo al uso, determinar la aplicabilidad de las limitaciones reglamentarias. 1 Alcance Esta parte de la norma especifica un método de ensayo para la determinación del contenido de nitratos y nitritos en leche y productos lácteos, mediante reducción por cadmio y espectrometría. El método es aplicable a: - leche deshidratada entera, semi descremada y descremada; - quesos duros, semi duros y blandos; - queso procesado; - queso de suero, caseínas y caseinatos y queso de suero deshidratado. El método se puede realizar utilizando equipo automático, en particular mediante análisis de flujo segmentado (SFA) o análisis de inyección de flujo (FIA), ambos reduciendo así la contaminación por cadmio en los lugares de trabajo del laboratorio y en las aguas de desecho. NOTA - Estos métodos se describen en ISO 14673-2/IDF 189-2 e ISO 14673-3/IDF 189-3, respectivamente.

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2 Referencias normativas Los siguientes documentos referenciales son indispensables para la aplicación de este documento. Para referencias fechadas, se aplica sólo la edición citada. Para referencias no fechadas se aplica la última edición del citado documento, (incluidas las enmiendas). ISO 565 Test sieves - Metal wire cloth, perforated metal plate and electroformed

sheet - Nominal sizes of openings. ISO 648 Laboratory glassware - One-mark pipettes. ISO 835-1 Laboratory glassware - Graduated pipettes - Part 1: General requirements. ISO 1042 Laboratory glassware - One-mark volumetric flasks. NOTA EXPLICATIVA NACIONAL

La equivalencia de las normas internacionales señaladas anteriormente con norma chilena, y su grado de correspondencia es el siguiente:

Norma internacional Norma nacional Grado de correspondencia

ISO 565 No hay -

ISO 648 No hay -

ISO 835-1 No hay -

ISO 1042 No hay -

3 Términos y definiciones Para los propósitos de este documento se aplican los términos y definiciones siguientes: 3.1 contenido de nitrato: fracción de masa de nitrato, determinada por el procedimiento especificado en esta norma NOTA - El contenido de nitrato se expresa como masa en miligramos de iones nitrato (NO3−) por kilogramo de producto. 3.2 contenido de nitrito: fracción de masa de nitrito determinada por el procedimiento especificado en esta norma NOTA - El contenido de nitrito se expresa como masa en miligramos de iones nitrito (NO2−) por kilogramo de producto.

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4 Principio Una porción de ensayo es dispersada en agua caliente, con precipitación de grasas y proteínas, y luego filtrada. Los iones nitrato son reducidos a iones nitritos en una porción del filtrado, por medio de cadmio cuprizado. Por la adición de sulfanilamida y N-1- naftil etilendiamina dihidrocloruro, se desarrolla un color rojo, tanto del filtrado no reducido, como de la solución reducida. Las mediciones espectrométricas se realizan a una longitud de onda de 538 nm. El contenido de nitrito de la muestra y el contenido total de nitrito después de la reducción de los iones nitratos, se calcula por comparación de las absorbancias medidas, con aquellas de un set de soluciones de calibración de nitrito de sodio. El contenido de nitrato se calcula a partir de la diferencia entre estos dos contenidos. 5 Reactivos Usar solamente reactivos de reconocido grado analítico, salvo especificaciones en otro sentido. 5.1 Agua, destilada o desionizada, o agua de pureza equivalente, libre de iones nitrato y nitrito. Para evitar la posible inclusión de pequeñas burbujas de gas en la columna de cadmio cuprizado (ver 9.1.6) hervir suavemente el agua destilada o desionizada y enfriarla a temperatura ambiente. Usar el agua así preparada para la preparación de la columna (ver 9.1), para comprobar la capacidad de reducción de la columna (ver 9.2) y para regenerar la columna (ver 9.3). 5.2 Gránulos de cadmio, de 0,3 mm a 0,8 mm de diámetro. Preparar los gránulos de cadmio, si no están disponibles comercialmente, como sigue: Colocar una cantidad apropiada de varillas de zinc en un vaso de precipitado. Cubrir las varillas con una solución de sulfato de cadmio (ver 5.3). Raspar la capa de cadmio de las varillas, ocacionalmente, por un período de 24 h. Retirar las varillas de zinc y dejar decantar el residuo de cadmio formado. Dejar agua suficiente para cubrir la capa de cadmio. Lavar dos o tres veces el residuo de cadmio con agua. Transferir la capa de cadmio a un mezclador de laboratorio, junto con 400 ml de solución de trabajo de ácido clorhídrico (ver 5.7) y mezclar durante unos pocos segundos para obtener gránulos del tamaño requerido. Devolver el contenido del mezclador al vaso de precipitado y dejarlo en reposo por varias horas, revolviendo ocasionalmente para eliminar burbujas. Retirar la mayoría del líquido e inmediatamente, cuprizar los gránulos, como se describe en 9.1. PRECAUCION - A causa de su toxicidad, el cadmio utilizado debiera ser enviado como desecho químico a las autoridades pertinentes.

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5.3 Solución de sulfato de cadmio, c (CdSO4 x 8H2O) = 40g/L. Disolver 40 g de solución de sulfato de cadmio en agua, en un matraz volumétrico de 1 000 ml (ver 6.4). Diluir con agua hasta el aforo y mezclar. 5.4 Solución de sulfato de cobre (II), c (CuSO4 x 5H2O) = 20g/L. Disolver 20 g de sulfato de cobre (II) en agua, en un matraz volumétrico de 1 000 ml (ver 6.4). Diluir con agua hasta el aforo y mezclar. 5.5 Acido clorhídrico, (HCl), (ρ20=1,19 g/ml) 5.6 Acido clorhídrico diluido, c (HCl) ≈ 2 mol/L Agregar cuidadosamente 160 ml de ácido clorhídrico (ver 5.5) a aproximadamente 700 ml de agua, en un matraz volumétrico de 1 000 ml (ver 6.4) agitando regularmente el contenido. Enfriar el contenido a temperatura ambiente. Diluir con agua hasta el aforo y mezclar cuidadosamente. 5.7 Solución de trabajo de ácido clorhídrico, c (HCl) ≈ 0,1 mol/L. Agregar 50 ml de ácido clorhídrico diluido (ver 5.6) a un matraz volumétrico de 1 000 ml. Diluir con agua hasta el aforo y mezclar. 5.8 Solución de sulfato de zinc, c (ZnS04 x 7H2O) = 535 g/L. Disolver 53,5 g de sulfato de zinc en agua, en un matraz volumétrico de 100 ml (ver 6.4). Diluir con agua hasta el aforo y mezclar. 5.9 Solución de potasio hexacianoferrato (II), c (K4[Fe (Cn)6] x 3H2O) = 172 g/L. Disolver 17,2 g de hexacianoferrato de potasio trihidratado (II), en agua, en un matraz volumétrico de 100 ml (ver 6.4). Diluir con agua hasta el aforo y mezclar. 5.10 Solución de disodio etilendiamina tetraacetato dihidratado (EDTA), (Na2C10H14N2O8 x 2H2O) Disolver 33,5 g de EDTA en aproximadamente 900 ml de agua, en un matraz volumétrico de 1 000 ml (ver 6.4). Diluir con agua hasta el aforo y mezclar. 5.11 Solución I Cuidadosamente agregar 450 ml de ácido clorhídrico (ver 5.5) en un matraz volumétrico de 1 000 ml (ver 6.4). Diluir con agua hasta el aforo y mezclar.

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5.12 Solución II Disolver por calentamiento en un baño de agua (ver 6.15), 0,5 g de sulfanilamida (NH2C6H4SO2NH2) en una mezcla de 75 ml de agua y 5 ml de ácido clorhídrico (ver 5.5) en un matraz volumétrico de 100 ml (ver 6.4). Enfriar a temperatura ambiente. Diluir con agua hasta el aforo y mezclar. Filtrar la solución obtenida, si es necesario. 5.13 Solución III Disolver en agua 0,1 g de N-1-naftiletilendiamina dihidroclórica (C10H7NHCH2CH2NH2 x 2HCl), en un matraz volumétrico de 100 ml (ver 6.4). Diluir con agua hasta el aforo y mezclar. Filtrar la solución obtenida, si es necesario. La solución se puede almacenar en un refrigerador por más de una semana en una botella café bien tapada. 5.14 Solución stock de nitrito de sodio, (NaNO2) Secar unos pocos gramos de nitrito de sodio en un horno (ver 6.16) entre 110°C y 120°C hasta masa constante (es decir, hasta que la diferencia entre dos pesadas sucesivas no exceda de 1 mg). Disolver 0,150 g de nitrito de sodio en agua, en un matraz volumétrico de 1 000 ml (ver 6.4). Diluir con agua hasta el aforo y mezclar. 5.15 Solución de trabajo de nitrito de sodio Preparar la solución de trabajo de nitrito de sodio en el día de uso. Transferir con una pipeta (ver 6.5), 10 ml de la solución stock (ver 5.14) y 20 ml de la solución tampón (ver 5.19) a un matraz volumétrico de 1 000 ml (ver 6.4). Diluir con agua hasta el aforo y mezclar. El contenido de nitrito en la solución de trabajo de nitrito de sodio es 1 µg/ml. 5.16 Solución stock de nitrato de potasio, (KNO3) Secar unos pocos gramos de nitrato de potasio en un horno (ver 6.16) entre 110°C y 120°C, hasta masa constante (es decir, hasta que la diferencia entre dos pesadas sucesivas no exceda de 1 mg). Disolver 1,468 g de nitrato de potasio en agua en un matraz volumétrico de 1 000 ml (ver 6.4). Diluir con agua hasta el aforo y mezclar. 5.17 Solución de trabajo de nitrato de potasio Preparar la solución de trabajo de nitrato de potasio en el día de uso. Transferir con una pipeta (ver 6.5), 5 ml de la solución stock de nitrato de potasio (ver 5.16) y 20 ml de la solución tampón (ver 5.19) a un matraz volumétrico (ver 6.4) de 1 000 ml. Diluir con agua hasta el aforo y mezclar El contenido de nitrato en la solución de trabajo de nitrato de potasio es 4,50 µg/ml.

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5.18 Solución de amoníaco, (NH3), (ρ20 = 0,91 g/ml) Si no se dispone de una solución de amoníaco de la concentración antes mencionada, en 5.19 se puede utilizar una cantidad equivalente de una solución de amoníaco más concentrada [por ejemplo, 103 ml de una solución de amoníaco de 35% (fracción de masa), (ρ20 =1,19 g/ml)]. 5.19 Solución tampón, pH 9,6 a 9,7 Diluir 50 ml de ácido clorhídrico (ver 5.5) con 600 ml de agua en un matraz cónico (ver 6.3) y mezclar. Agregar 135 ml de solución de amoníaco (ver 5.18) y diluir a 1 000 ml con 215 ml de agua y mezclar. Ajustar el pH, si fuere necesario, entre 9,6 y 9,7. 6 Aparatos Limpiar cuidadosamente todo el material de vidrio y enjuagar con agua destilada para asegurarse que esté libre de iones nitritos y nitratos. Equipamiento usual de laboratorio y en particular el siguiente: 6.1 Balanza analítica, capaz de pesar con una exactitud de 1 mg, con lectura de 0,1 mg. 6.2 Contenedor de muestra, provisto de tapa hermética. 6.3 Matraces cónicos, de 250 ml, 500 ml y 1 000 ml de capacidad. 6.4 Matraces volumétricos, de 100 ml, 500 ml, y 1 000 ml de capacidad nominal, que cumplan con los requisitos de ISO 1042, clase B. 6.5 Pipetas, capaces de entregar 2 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 8 ml,10 ml, 12 ml, 20 ml y 25 ml, que cumplan con los requisitos de ISO 648 clase A, o ISO 835-1. Cuando sea apropiado, se puede utilizar buretas en lugar de pipetas. 6.6 Cilindros de medición, de 5 ml, 10 ml, 25 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml y 1 000 ml de capacidad. 6.7 Embudos de vidrio, de 7 cm de diámetro, con vástago corto. 6.8 Papel filtro, grado medio, de diámetro aproximado de 15 cm, libre de iones nitrato y nitrito. 6.9 Columna de reducción, hecha de vidrio, un ejemplo de la cual se muestra en Figura 1. 6.10 Espectrómetro, adecuado para medir absorbancia en una longitud de onda de 538 nm, con celdas de trayectoria óptica de 1 cm a 2 cm de longitud.

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6.11 Dispositivo de molienda, adecuado para moler la muestra de ensayo, si es necesario. Para evitar pérdidas de humedad, el dispositivo no debe producir calor indebido. No se debe usar molino de martillo. 6.12 Mezclador de laboratorio u homogeneizador, con contenedores de vidrio de 250 ml o 400 ml de capacidad, apropiados para poner en suspensión porciones de ensayo de queso o queso de suero. 6.13 Tamiz de ensayo, de tejido de malla metálica de 200 mm de diámetro, aberturas de tamaño nominal de 500 µm y un recipiente que cumpla con los requisitos de ISO 565. 6.14 Agitador magnético. 6.15 Baño de agua, capaz de hervir agua. 6.16 Horno, capaz de mantener la temperatura entre 110°C y 120°C. 7 Muestreo El muestreo no es parte del método especificado en esta norma. Un método de muestreo recomendado se indica en ISO 707. Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea realmente representativa y que no haya sido dañada o cambiada durante el transporte o almacenamiento. Almacenar la muestra de ensayo de tal modo que se prevenga deterioro o cambios en la composición. 8 Preparación de la muestra de ensayo 8.1 Leche deshidratada y suero deshidratado Transferir la muestra de ensayo a un contenedor de muestra (ver 6.2) con capacidad aproximada de dos veces el volumen de la muestra de ensayo. Cerrar el contenedor inmediatamente. Mezclar completamente la muestra de ensayo mediante agitación e inversión reiterada del contenedor, hasta que se obtenga una muestra homogénea. 8.2 Caseína y caseinatos 8.2.1 Si es necesario, después de transferir toda la muestra a un contenedor (ver 6.2) de capacidad adecuada, mezclar ésta cuidadosamente, mediante agitación e inversión reiterada del contenedor. 8.2.2 Transferir 50 g de la muestra de ensayo al tamiz de ensayo (ver 6.13). Si la porción de 50 g pasa directamente a través del tamiz, o casi completamente, pasar la totalidad de la muestra de ensayo mezclada (ver 8.2.1) a través del tamiz.

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8.2.3 Si la muestra de ensayo no pasa completamente a través del tamiz, usar el dispositivo de molienda (ver 6.11) para conseguir tal condición. Inmediatamente transferir el total de la muestra de ensayo tamizada al contenedor de muestra (ver 6.2) y mezclar cuidadosamente en el contenedor cerrado. Durante esas operaciones, tomar precauciones para evitar cualquier cambio en el contenido de agua del producto. 8.2.4 Después que la muestra de ensayo haya sido preparada, proceder con la preparación de la porción de ensayo (ver 9.4) tan pronto como sea posible. 8.3 Queso 8.3.1 Antes de los análisis, remover la corteza o capa superficial mohosa de la muestra de ensayo, de modo de proporcionar una muestra de ensayo representativa del queso como es generalmente consumido. 8.3.2 Moler la muestra de ensayo mediante un dispositivo apropiado (ver 6.11). Mezclar la masa molida rápidamente y si es posible, moler una segunda vez y nuevamente mezclar cuidadosamente. Limpiar el dispositivo después de la molienda de cada muestra. Si la muestra de ensayo no puede ser molida, mezclarla cuidadosamente revolviendo y amasando intensamente. 8.3.3 Tan pronto como sea posible después de la molienda, transferir la muestra de ensayo a un contenedor de muestra (ver 6.2) hermético para esperar la determinación, la cual preferentemente se debiera hacer inmediatamente. Si es inevitable una demora, tomar todas las precauciones para asegurar adecuada conservación de la muestra de ensayo y para prevenir la acumulación de humedad en la superficie interior del contenedor. 8.3.4 No examinar queso molido que muestre crecimiento no deseado de mohos o que se empiece a deteriorar. 8.4 Queso de suero Preparar la muestra de ensayo como se especifica en 8.3.2. 9 Procedimiento 9.1 Preparación de la columna de cadmio cuprizado 9.1.1 Transferir una cantidad de gránulos de cadmio (ver 5.2) de 40 g a 60 g por cada columna a un matraz cónico de 250 ml (ver 6.3). Agregar suficiente solución de trabajo de ácido clorhídrico (ver 5.7) para cubrir el cadmio. Agitar por algunos minutos. 9.1.2 Decantar la solución (ver 9.1.1). Lavar el cadmio en el matraz cónico con agua hasta que esté libre de iones cloruro (es decir, hasta que la reacción con nitrato de plata sea negativa).

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9.1.3 Cuprizar los gránulos de cadmio agregando la solución de sulfato de cobre (II) (ver 5.4), de la cual se requiere aproximadamente 2,5 ml de solución cúprica por gramo de cadmio. Agitar durante 1 min. 9.1.4 Decantar la solución (ver 9.1.3) y lavar el cadmio cuprizado inmediatamente con agua, teniendo cuidado que el cadmio esté continuamente cubierto con agua. Terminar el lavado cuando el agua de lavado esté libre de cobre precipitado. 9.1.5 Ajustar un tapón de lana de vidrio al fondo de la columna de vidrio (ver 6.9) destinado a contener el cadmio cuprizado (ver Figura 1). Llenar la columna de vidrio con agua. 9.1.6 Transferir el cadmio cuprizado a la columna de vidrio con una mínima exposición al aire. La altura del cadmio cuprizado debe ser de 15 cm a 20 cm. Evitar burbujas de aire atrapadas entre los gránulos de cadmio cuprizado. El nivel del líquido no debe descender por debajo de la parte superior del cadmio cuprizado. 9.1.7 Acondicionar la columna recién preparada haciendo correr a través de ella, una mezcla de 750 ml de agua, 225 ml de solución de trabajo de nitrato de potasio (ver 5.17), 20 ml de solución tampón (ver 5.19) y 20 ml de solución EDTA (ver 5.10), a una velocidad que no exceda 6 ml/min. Lavar la columna con 50 ml de agua. 9.2 Comprobación de la capacidad de reducción de la columna 9.2.1 Comprobar la capacidad de reducción de la columna al menos dos veces al día, como también al inicio y al término de una serie de determinaciones. 9.2.2 Colocar 20 ml de solución de trabajo de nitrato de potasio (ver 5.17) dentro del depósito en la parte superior de la columna. Inmediatamente agregar 5 ml de solución tampón (ver 5.19) al contenido del depósito. Eluir el contenido del depósito a través de la columna a un flujo que no exceda de 6 ml/min. Recoger el eluyente en un matraz volumétrico de 100 ml (ver 6.4). 9.2.3 Cuando el depósito de la columna de reducción esté cercano a quedar vacío, lavar las paredes del depósito con aproximadamente 15 ml de agua. Después que el agua haya salido, repetir el lavado con otros 15 ml de agua. Cuando el segundo lavado haya corrido dentro de la columna, llenar completamente el depósito con agua. Correr el contenido completo del depósito a través de la columna a la máxima velocidad de flujo. Recoger aproximadamente 100 ml de eluyente. 9.2.4 Remover el matraz volumétrico de 100 ml (ver 9.2.3). Diluir su contenido con agua hasta el aforo y mezclar bien. 9.2.5 Colocar 10 ml de eluyente (ver 9.2.4) dentro de otro matraz volumétrico (ver 6.4). Diluir el eluyente con agua hasta, aproximadamente, 60 ml y mezclar. Proceder como se especifica en 9.7 a 9.9.

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9.2.6 Calcular el porcentaje de capacidad de reducción de la columna (0,067 µg de NO2−

por mililitro corresponde a 100% de capacidad reductora) a partir del contenido de nitrito obtenido en 10.1 del eluyente diluido (ver 9.2.5) y determinado del gráfico de calibración (ver 9.9.4). Si la capacidad de reducción es menor de 95%, regenerar la columna como se especifica en 9.3. 9.3 Regeneración de la columna 9.3.1 Regenerar la columna al final de cada día de uso, o más frecuentemente, si la comprobación (ver 9.2) indica pérdida de eficiencia. 9.3.2 Agregar aproximadamente 5 ml de solución EDTA (ver 5.10) y 2 ml de solución de trabajo de ácido clorhídrico (ver 5.7) a 100 ml de agua y mezclar. Correr esta solución así obtenida a través de la columna a una velocidad de flujo aproximada de 10 ml/min. 9.3.3 Cuando el depósito esté vacío, lavar la columna sucesivamente con agua, con solución de trabajo de ácido clorhídrico (ver 5.7) y otra vez, con agua. 9.3.4 Si la eficiencia de la columna aún no es satisfactoria, repetir el procedimiento especificado en 9.1.7. 9.4 Preparación de la porción de ensayo 9.4.1 Leche deshidratada Pesar, con una exactitud de 1 mg, aproximadamente 10 g de la muestra de ensayo preparada (ver 8.1). Transferir la porción de ensayo cuantitativamente a un matraz cónico de 500 ml (ver 6.3). Agregar progresivamente a la porción de ensayo, 136 ml de agua precalentada entre 50°C y 55°C. Dispersar la porción de ensayo revolviendo con una varilla de vidrio o agitando el matraz cónico. 9.4.2 Suero deshidratado Pesar, con una exactitud de 0,1 mg, aproximadamente 5 g de la muestra de ensayo preparada (ver 8.1). Transferir la porción de ensayo cuantitativamente a un matraz cónico de 500 ml (ver 6.3). Agregar progresivamente a la porción de ensayo, 136 ml de agua precalentada entre 50°C y 55°C. Dispersar la porción de ensayo revolviendo con una varilla de vidrio o agitando el matraz cónico. Cubrir el matraz cónico con una lámina de aluminio o un vidrio reloj y colocarlo durante 15 min al baño de agua (ver 6.15) hirviendo. Remover el matraz del baño de agua y esperar que la temperatura haya descendido entre 50°C y 60°C.

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9.4.3 Caseínas Pesar, con una exactitud de 1 mg, aproximadamente 10 g de la muestra de ensayo preparada (ver 8.2). Transferir la porción de ensayo cuantitativamente a un matraz cónico de 500 ml (ver 6.3). Agregar progresivamente a la porción de ensayo, 136 ml de agua precalentada entre 50°C y 55°C y 10 ml de solución tampón (ver 5.19). Dispersar la porción de ensayo mediante agitación utilizando el agitador magnético (ver 6.14). 9.4.4 Caseinatos Pesar, con una exactitud de 0,1 mg, aproximadamente 2 g de la muestra de ensayo preparada (ver 8.2). Transferir la porción de ensayo cuantitativamente a un matraz cónico de 500 ml (ver 6.3). Agregar progresivamente a la porción de ensayo, 136 ml de agua precalentada entre 50°C y 55°C y 10 ml de solución tampón (ver 5.19). Dispersar la porción de ensayo mediante agitación utilizando el agitador magnético (ver 6.14). 9.4.5 Queso Pesar, con una exactitud de 1 mg, aproximadamente 10 g de la muestra de ensayo preparada (ver 8.3). Transferir la porción de ensayo cuantitativamente al contenedor de vidrio del mezclador u homogeneizador de laboratorio (ver 6.12). Agregar progresivamente a la porción de ensayo, 144 ml de agua precalentada entre 50°C y 55°C. Mezclar en el mezclador u homogeneizador (ver 6.12) hasta que la porción de ensayo esté bien suspendida. 9.4.6 Queso de suero Pesar, con una exactitud de 1 mg, aproximadamente 5 g de la muestra de ensayo preparada (ver 8.4). Transferir la porción de ensayo cuantitativamente al contenedor de vidrio del mezclador u homogeneizador de laboratorio (ver 6.12). Agregar progresivamente a la porción de ensayo, 134 ml de agua precalentada entre 50°C y 55°C. Mezclar en el mezclador u homogeneizador (ver 6.12) hasta que la porción de ensayo esté bien dispersada. 9.5 Extracción y desproteinización 9.5.1 Leche deshidratada, suero deshidratado, caseinas y caseinatos y queso de suero 9.5.1.1 Agregar a la porción de ensayo (9.4.1, 9.4.2, 9.4.3, 9.4.4 ó 9.4.6, respectivamente), en el orden siguiente, 12 ml de solución de sulfato de zinc (ver 5.8), 12 ml de solución de hexacianoferrato de potasio (II) (ver 5.9) y 40 ml de solución tampón (ver 5.19), agitar cuidadosamente después de cada adición y mezclar. Para obtener un filtrado claro dejar la mezcla en el matraz cónico por, al menos 15 min, pero no por más de 1 h. Luego pasar a través de un papel filtro (ver 6.8), recogiendo el filtrado en un matraz cónico de 250 ml (ver 6.3).

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9.5.1.2 Es esencial obtener un filtrado claro dentro del tiempo especificado. Para este propósito puede ser necesario utilizar un mayor volumen de cada reactivo de precipitación (ver 5.8 y 5.9) (por ejemplo, si es analizado un queso bien maduro). Reducir el volumen del agua precalentada, ajustándose a la necesidad de mantener el volumen de filtrado en aproximadamente 200 ml. NOTA - El volumen total del filtrado debe ser de aproximadamente 200 ml. Este volumen es asumido en los cálculos (ver 10.1 y 10.2). 9.5.2 Queso Agregar a la porción de ensayo (ver 9.4.5) en el orden siguiente, 6 ml de solución de sulfato de zinc (ver 5.8), 6 ml de solución de hexacianoferrato de potasio (II) (ver 5.9) y 40 ml de solución tampón (ver 5.19), agitar cuidadosamente después de cada adición y mezclar. Para obtener un filtrado claro dejar la mezcla en el contenedor de vidrio por al menos 15 min, pero no por más de 1 h. Luego pasar a través de un papel filtro (ver 6.8), recogiendo el filtrado en un matraz cónico de 250 ml (ver 6.3) (ver 9.5.1.2 y Nota). 9.6 Reducción de nitrato a nitrito 9.6.1 Colocar 20 ml del filtrado (ver 9.5.1 ó 9.5.2) dentro del depósito en la parte superior de la columna de reducción (ver 9.1) preparada. Agregar 5 ml de solución tampón (ver 5.19) al contenido del depósito. Mezclar revolviendo con una pequeña varilla de vidrio. Pasar el contenido del depósito a través de la columna a una velocidad de flujo que no exceda de 6 ml/min. Recoger el eluyente en un matraz volumétrico de 100 ml (ver 6.4). 9.6.2 Cuando el depósito de la columna de reducción esté cercano a quedar vacío, lavar las paredes del depósito con aproximadamente 15 ml de agua. Después que el agua haya salido, repetir el lavado con otros 15 ml de agua. Cuando el segundo lavado haya corrido dentro de la columna, llenar completamente el depósito con agua. Eluir el contenido completo del depósito a través de la columna a la máxima velocidad de flujo. Recoger aproximadamente 100 ml de eluyente en un matraz volumétrico de 100 ml (ver 6.4). 9.6.3 Remover el matraz volumétrico de 100 ml. Diluir con agua su contenido hasta el aforo y mezclar bien. 9.7 Ensayo en blanco Llevar a cabo un ensayo en blanco en paralelo con la determinación, pero reemplazando en 9.8.1 la porción de ensayo por un volumen igual de agua 9.8 Determinación 9.8.1 Colocar volúmenes iguales (por ejemplo 25 ml) del filtrado obtenido en 9.5.1 ó 9.5.2 y del eluyente (ver 9.6.3) en matraces volumétricos de 100 ml separados (ver 6.4). Agregar agua a cada uno de los matraces para obtener un volumen de aproximadamente 60 ml y mezclar.

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9.8.2 Agregar 6 ml de solución I (ver 5.11) a la solución del matraz (ver 9.8.1) y seguidamente, 5 ml de solución II (ver 5.12). Mezclar las soluciones cuidadosamente y dejar el matraz durante 5 min a temperatura ambiente y protegido de la luz solar. 9.8.3 Agregar 2 ml de solución III (ver 5.13) a la solución del matraz (ver 9.8.2). Mezclar nuevamente estas soluciones cuidadosamente y dejar el matraz por 5 min a temperatura ambiente y protegido de la luz solar. Diluir con agua el contenido del matraz hasta el aforo de 100 ml y mezclar. 9.8.4 Medir la absorbancia de la solución obtenida en 9.8.3 en contraste con la del test en blanco (ver 9.5) utilizando el espectrómetro (ver 6.10), a una longitud de onda de 538 nm, en el plazo de 15 min. 9.9 Preparación del gráfico de calibración 9.9.1 Colocar 0 ml (blanco), 2 ml, 4 ml, 6 ml, 8 ml, 12 ml y 20 ml de solución de trabajo de nitrito de sodio (ver 5.15) en matraces volumétricos separados, de 100 ml. (ver 6.4). Agregar agua a cada uno de los matraces para obtener volúmenes aproximados de 60 ml. 9.9.2 Proceder como se especificó en 9.8.2 y 9.8.3. 9.9.3 Utilizando el espectrómetro (ver 6.10), medir la absorbancia de las soluciones de trabajo de nitrito de sodio, en contraste con la del blanco, a una longitud de onda de 538 nm, en el plazo de 15 min. 9.9.4 Registrar las absorbancias obtenidas en 9.9.3, en contraste con las concentraciones de nitrito, en microgramos por mililitro, calculadas de las cantidades agregadas de solución de trabajo de nitrito de sodio (ver 9.9.1). 10 Cálculo y expresión de resultados 10.1 Contenido de nitrito 10.1.1 Cálculo del contenido de nitrito Calcular el contenido de nitrito de la muestra, 1Nω , utilizando la ecuación siguiente:

mV

cN

100020

1 =ω

en que:

1Nω =contenido de nitrito de la muestra, en miligramos de iones nitrito por kilogramo;

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1c =valor numérico de la concentración leída desde el gráfico de calibración,

correspondiendo a la absorbancia medida de la solución de ensayo (ver 9.8.4), en microgramos de iones nitrito por mililitro;

m =masa de la porción de ensayo (ver 9.4) en gramos; V =volumen de la porción alícuota tomada del filtrado (ver 9.8.1), en

mililitros. 10.1.2 Expresión de resultados Expresar los resultados con una cifra decimal 10.2 Contenido de nitrato 10.2.1 Cálculo del contenido de nitrato Calcular el contenido de nitrato de la muestra, 2Nω , utilizando la ecuación siguiente:

⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡−⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛= 12

2000100

35,1 Nc

N mVωω

en que:

2Nω = contenido de nitrato de la muestra, en miligramos de iones nitrato por kilogramo;

2c = valor numérico de la concentración leída desde el gráfico de calibración,

correspondiente a la absorbancia medida de la solución de ensayo (ver 9.9.4), en microgramos de iones nitrito por mililitro;

m = masa de la porción de ensayo (ver 9.4) en gramos; V = volumen de la porción alícuota tomada del eluyente (ver 9.8.1), en

mililitros. 10.2.2 Cálculo del contenido de nitrato, considerando la capacidad de reducción de la columna Si se toma en cuenta la capacidad de reducción de la columna, calcular el contenido de nitrato de la muestra 2Nω utilizando la ecuación siguiente:

⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡−⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛×= 12

10000010035,1 2

Nc

N rmVωω

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en que:

r = valor numérico de la capacidad de reducción de la columna, al término de una serie de determinaciones.

10.2.3 Expresión de resultados Expresar los resultados en números enteros. 11 Precisión 11.1 General Los valores para los límites de repetibilidad y reproducibilidad se expresan para un nivel del 95% de probabilidad y no pueden ser aplicables a rangos de concentración y matrices diferentes de aquellas dadas. NOTA - Los valores para repetibilidad y reproducibilidad han sido adoptados de las antiguas normas internacionales para la determinación de contenido de nitrito y nitrato en productos lácteos, ISO 4099, ISO 6736, ISO 6739, ISO 6740 e ISO 8195. Estas normas internacionales fueron anuladas y reemplazadas por ISO 14673-1:2001. 11.2 Repetibilidad 11.2.1 Nitritos La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayos simples independientes, obtenidos utilizando el mismo método sobre idéntico material, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, empleando el mismo equipamiento, dentro de un corto intervalo de tiempo será, en no más del 5% de los casos, mayor que 1 mg/kg de producto. 11.2.2 Nitratos La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayos simples independientes, obtenidos utilizando el mismo método sobre idéntico material, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, empleando el mismo equipamiento, dentro de un corto intervalo de tiempo será, en no más del 5% de los casos, mayor que: - para leche deshidratada, suero deshidratado, caseínas,

caseinatos y queso con un contenido de nitrato < 30 mg/kg

3 mg/kg;

- para leche deshidratada, suero deshidratado, caseínas,

caseinatos y queso con un contenido de nitrato ≥ 30 mg/kg

10% de la media aritmética de los resultados;

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- para queso de suero con un contenido de nitrato

< 30 mg/kg 5 mg/kg;

- para queso de suero con un contenido de nitrato

≥ 30 mg/kg 15% de la media aritmética de los resultados.

11.2.3 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayos simples, obtenidos utilizando el mismo método sobre idéntico material de ensayo, en diferentes laboratorios, con diferentes operadores empleando diferente equipamiento será, en no más del 5% de los casos, mayor que: - para leche deshidratada con un contenido de nitrato

< 30 mg/kg: 8 mg/kg;

- para leche deshidratada con un contenido de nitrato

≥ 30 mg/kg: 25% de la media aritmética de los resultados;

- para suero deshidratado con un contenido de nitrato

< 30 mg/kg: 5 mg/kg;

- para suero deshidratado con un contenido de nitrato

≥ 30 mg/kg: 15% de la media aritmética de los resultados;

- para caseínas y caseinatos: 25% de la media

aritmética de los resultados;

- para queso con un contenido de nitrato < 30 mg/kg:

6 mg/kg; - para queso con un contenido de nitrato ≥ 30 mg/kg:

25% de la media aritmética de los resultados;

- para suero de queso con un contenido de nitrato

< 30 mg/kg: 10 mg/kg;

- para suero de queso con un contenido de nitrato

≥ 30 mg/kg: 15% de la media aritmética de los resultados.

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12 Informe de ensayo El informe de ensayo debe especificar: - toda información necesaria para la completa identificación de la muestra; - el método de muestreo usado, si es conocido; - el método de ensayo usado, con referencia a esta norma; - todos los detalles operativos no especificados en esta norma, o considerados como

opcionales, junto con detalles de todos los incidentes que puedan haber influenciado el (los) resultado(s);

- el (los) resultado(s) del ensayo obtenido(s), o si se ha comprobado la repetibilidad, los

resultados citados obtenidos.

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Anexo A

(Informativo)

Bibliografía [1] ISO 707:1997 Milk and milk products - Guidance on sampling. NOTA EXPLICATIVA NACIONAL

La equivalencia de la norma internacional señalada anteriormente con norma chilena, y su grado de correspondencia es el siguiente:

Norma internacional Norma nacional Grado de correspondencia

ISO 707:1997 NCh1011/2 Equivalente