LA DETECCIN DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Y EL PARKINSON A PARTIR DE LA

RESPIRACIN EXHALADA AL USAR UN NANOMATERIAL BASADO EN SENSORES

Objetivo:

Para estudiar la viabilidad de un nuevo mtodo en la nanomedicina que se basa en las

pruebas de aliento para la identificacin

La enfermedad de Alzheimer (AD) y la enfermedad de Parkinson (PD), como ejemplos

representativos de condiciones neurodegenerativa.

Pacientes y mtodos:

Aliento alveolar se recogi de 57 voluntarios (los pacientes con EA, los pacientes con EP y

controles sanos) y analizados mediante combinaciones de sensores basados en

nanomateriales (orgnicamente nanotubos de carbono funcionalizados y nanopartculas de

oro). Anlisis factorial discriminante se aplic a detectar diferencias estadsticamente

significativas entre los grupos de estudio y el xito de clasificacin se estim utilizando la

validacin cruzada. La identificacin de patrones fue apoyada por el anlisis qumico de las

muestras de aliento mediante cromatografa de gases combinada con espectrometra de

masas.

Resultados:

Las combinaciones de sensores podran distinguir claramente AD de los estados sanos, PD

de los estados sanos, y AD de los estados con EP, con una precisin de clasificacin de 85,

78 y 84%, respectivamente. La cromatografa de gases combinada con el anlisis de masas

de espectrometra mostr diferencias estadsticamente significativas en la abundancia

promedio de varios compuestos orgnicos voltiles en el aliento de AD, PD y los sujetos

sanos, apoyando as la respiracin grabados observados con los sensores.

Conclusin: Las impresiones de la respiracin que se identificaron con combinaciones de sensores

basados en nanomateriales tienen potencial futuro como rentable, rpido y biomarcadores

fiables para AD y PD.

La enfermedad de Alzheimer (AD) y mal de Parkinson (PD) son dos enfermedades

neurodegenerativas. AD afecta a ms de 26 millnes de personas

en todo el mundo al da de hoy[1] Y PD prevalece actualmente en 1,6% de la poblacin

mundial [2]

La prevalencia de incremento de las enfermedades neurodegenerativas, como

la poblacin envejece, causa un desafo cada vez mayor para los pacientes, los cuidadores,

los mdicos y la sociedad [3,4]. AD y PD suelen ser espordicos y Generalmente

complejos.

AD se caracteriza por un deterioro progresivo, cognitivo y conductual. Su

caractersticas patolgicas principales son las placas amiloides y ovillos neurofibrilares[5].

PD es el caracterterizado por el temblor en reposo, bradicinesia, rigidez

y la inestabilidad postural, y se asocia con despigmentacin y la prdida neuronal

progresiva en la sustancia negra compacta, generalizada un agregado de sinuclena y

agotamiento progresivo de dopamina [6-9].

Actualmente, el diagnstico antemortem de estas condiciones se basa principalmente en los

sntomas clnicos y por lo tanto est asociado con la sensibilidad y especificidad muy

variable, dependiendo de la habilidad del mdico tratante [3]. Convergencia de las pruebas

de gentica en riesgo cohortes de AD, PD y las personas mayores clnicamente normales,

sugiere que el proceso fisiopatolgico de estas condiciones comienza aos, si no dcadas

antes de que el diagnstico clnico | 10 |. Biomarcadores apropiados cou1d permiten la

identificacin temprana de alteraciones patolgicas caractersticas antes desarrolla dao

neuronal y, por lo tanto, podra convertirse en una piedra angular para el desarrollo de

frmacos modificadores de pequeas molculas que se dirigen especficamente a las firmas

de cambios patolgicos en estas condiciones 131. alteraciones-AD caracterstica en

cefalorraqudeo fluido (CSF) biomarcadores que reflejan los cambios neuropatolgicos

(cola total cola fosforilada en la treonina 181 [p-tau 18], y b-amiloide [Ab42,]) han surgido

posteriormente analitos tan fiables asociados con la confirmacin anatomopatolgica

eventual, aunque hay un equilibrio entre la sensibilidad y la especificidad debido a cambios

similares en los sujetos cognitivamente sanos. Adems, la puncin lumbar para recoger

lquido cefalorraqudeo es un 11 I3.5.H1 procedimiento invasivo. Las placas seniles que

antes eran visibles slo durante la autopsia, ahora se pueden obtener imgenes en vivo con

PET, usando A (3 ligandos especficos [6]. Sin embargo, este procedimiento requiere

equipo costoso y su especificidad es an indeterminado. La situacin para la EP es similar:

los niveles de LCR de una-sinuclena pueden disminuir en personas con diversos sndromes

clnicos caracterizados neuropatolgicamente por acumulaciones de un synudein. Sin

embargo, los informes de LCR a-sinucleina como un marcador biolgico de PI) han sido

contradictorios [6,12-17].

Un enfoque diagnstico novela se basa en la identificacin de patrones de compuestos

orgnicos voltiles (COV) en el aire exhalado 1 se-231-Enfermedad especfica impresiones

aliento podra ser til como biomarcadores robustos y de fcil acceso. El fundamento de

este enfoque es que los cambios relacionados con la enfermedad en la qumica de la sangre

pueden, en parte, se transmitirn al aliento exhalado alveolar a travs de los pulmones,

incluso en el mismo inicio de la enfermedad. Cabe sealar que el perfil de los compuestos

orgnicos voltiles en el aliento exhalado no requiere la administracin de sustancias

isotpicas tales como compuestos marcados-L3C antes de la prueba. El uso de istopos

estables est muy extendida en el diagnstico mdico de enfermedades metablicas, por

ejemplo, para determinar en la oxidacin in vivo de una carga de glucosa administrada por

va oral para detectar diabetes [24,25]

Haick y colaboradores han demostrado previamente que una matriz de sensores basados en

nanomaterial podra ser adaptada para identificar varias enfermedades, incluyendo

enfermedad renal [26,27], enfermedades neurodegenerativas tales como la esclerosis

mltiple [22] y varias formas de cncer (mama, pulmn, colon, prstata y cncer de cabeza

y cuello, incluyendo precursores y subtipos) de aliento alveolar exhalado, con

independencia de la edad, el gnero, el estilo de vida, hbitos de fumar de los pacientes y

otros factores de confusin [20,21,28-31]. Adems, los sensores similares se han utilizado

para identificar el aliento de impresin de las lesiones dopaminrgicas nigroestriatales

asintomticos en ratas [32]. Nanomateriales tienen innumerables ventajas para sen cantan

aplicacin s y puede superar muchas limitaciones de los sensores a granel de material tales

como sensores semiconductores de xido metlico estndar y sensores de polmero

capacitivo [33]. Sus atractivos incluyen dimensiones pequeas caractersticos (1-100 nm) y

correspondientemente grandes relaciones superficie-volumen, qumica tailorable y

propiedades fsicas, que se relacionan directamente con el tamao, la composicin y la

forma, la unin de destino inusual propiedades y robustez estructural global [33]. Nano

materiales mejoran la sensibilidad, tiempos de respuesta y se recuperan) 'veces mediante el

aumento de un rea de superficie activa los sensores y la generacin de nuevas interfaces de

[33]. El gran solapamiento con las dimensiones de la respiracin tpica VOCs hace

nanomateriales particularmente adecuado para pruebas de aliento mdica.

Aqu, ofrecemos una prueba de concepto forthe viabilidad del concepto sensor-matriz como

una prueba de biomarcadores de diagnstico para las enfermedades neurodegenerativas,

utilizando AD y PD como ejemplos representativos. Presentamos combinaciones de

sensores basados en nanomateriales que podran distinguir los grupos de pacientes con AD

y PD de un grupo de control sano, y de la otra. Los resultados presentados podran

proporcionar la base para el desarrollo de una futura prueba de aliento a base de

nanotecnologa para el diagnstico diferencial de enfermedades neurodegenerativas tales

como la AD y PD. Una prueba de aliento rpido y fiable puede allanar el camino a una,

manejo de enfermedades personalizada integral [34]. La prueba de aliento podra ser

utilizado para identificar a las poblaciones en situacin de riesgo que deben ser remitidos a

un especialista para someterse a las pruebas de imagen convencionales de diagnstico y

monitorizacin de biomarcadores CSF, especialmente en reas remotas donde el acceso a

los especialistas es raro.

Pacientes y mtodos

poblacin de prueba

La poblacin del estudio incluy 57 voluntarios no fumadores de edades 37-82 aos (Tabla

1). Estos 15 pacientes incluidos AD (edad 51-81 aos), 30 pacientes con EP (edad 37-82

aos) y 12 controles sanos (edad 51-73 aos). Los pacientes fueron reclutados de la

poblacin ambulatoria del Servicio de Trastornos del Movimiento y la Unidad de

Neurologa Cognitiva, Campus Rambam Cuidado de la Salud (Haifa, Israel). Los controles

fueron reclutados de los cuidadores y las personas acompaantes de los pacientes. Los

pacientes con EA fueron diagnosticados segn el Instituto Nacional de Trastornos

Neurolgicos y comunicativas y accidente cerebrovascular y enfermedad de Alzheimer y

Trastornos Relacionados Asociacin (NINCDS-ADRDA) criterios diagnsticos; los

pacientes con EP fueron diagnosticados de acuerdo con el Reino Unido de Parkinson

Criterios de Enfermedades Sociedad banco de cerebros. Los controles fueron evaluados

para descartar condiciones mdicas y neurolgicas significativas. Todos los pacientes

fueron evaluados, mientras que en sus medicaciones diarias habituales. La medicacin

vari entre los pacientes del mismo grupo de estudio.

Diseo del estudio

Este estudio fue un estudio comparativo de la seccin transversal de la poblacin de prueba.

Grabados Aliento para los tres grupos de prueba se obtuvieron utilizando sensores basados

rial-NanoMate comparando: pacientes con AD a controles sanos; Pacientes con EP a

controles sanos; AD a los pacientes con EP; y todos los tres grupos de prueba entre s. Los

tres grupos de prueba fueron emparejados por edad, aproximadamente. La proporcin de

gnero de los pacientes con AD fue similar a la de los controles sanos pero difera de la de

los pacientes con EP. Esta relajacin de los criterios de reclutamiento es aceptable, ya que

sensores similares han mostrado poca sensibilidad a los factores de confusin como el

gnero (por ejemplo, 121,22]).

coleccin Aliento

Incumplimiento alveolar exhalado se recogi de una manera controlada de los pacientes y

de los controles sanos en el entorno de hospital. Se recogieron todas las muestras durante

las horas de la maana (09 a.m.-12 p.m.). Antes de la prueba de aliento, los voluntarios

alistados no comer, beber caf o alcohol, y no ejercen por al menos 2 h. El personal del

hospital se asegur de que todos los voluntarios maintrained higiene oral razonable. El aire

inhalado se limpi de contaminantes ambientales por la inhalacin repetida a la capacidad

pulmonar total para 3-5 molino a travs de una boquilla (adquirido de Eco Medics, Duerten,

Suiza) que contiene un cartucho de filtro en el puerto inspiratorio, lo que reduce

considerablemente la concentracin de exgena VOCs y la eliminacin de 99,99% de los

compuestos exgenos desde el aire durante la inspiracin | 28J5J6]. Inmediatamente

despus del lavado pulmonar, temas exhalado a travs de un puerto espiratorio

independiente de la boquilla contra la presin del agua 10 a 15 cm para asegurar el cierre de

la vitela para que se excluy el arrastre nasal del gas. Aliento exhalado es una mezcla de

aire alveolar y el aire del espacio muerto respiratorio. El aire del espacio muerto

respiratorio es exhalado primero, seguido por el aire alveolar de los pulmones. Durante el

proceso de muestreo para respirar, el aire del espacio muerto se llen de forma automtica

en una bolsa separada y el aliento alveolar en una bolsa de muestreo Mylar de 750 ml

(adquirido de Eco Medics). La coleccin aliento descrito es un proceso de un solo paso que

no requiere que el voluntario para cuidar al cambiar entre el espacio muerto y aliento bap

alveolar. Las bolsas de Mylar fueron re-utilizados y completamente limpiados antes de cada

uso con un chorro de N, gas (99.999% de pureza) durante 5-8 minutos. Notablemente,

cromatografa de gases-espectrometra de masas (GC-MS) en conjugacin con fase slida

micro-extraccin (SPME) ha demostrado que este proceso de purificacin elimina 98% de

los contaminantes y / o biomarcadores voltiles de la muestra anterior probado en una bolsa

de Mylar especfica | 2l]. Uno o dos bolsas se recogieron por persona de prueba para el

anlisis con los sensores basados en nanomateriales y / o para el anlisis con GC-MS (ver

"Anlisis de la respiracin utilizando los sensores basados en nanomateriales 'secciones y'

El anlisis estadstico de las seales de deteccin '). Adems, las muestras de aire sin filtrar

el hospital se recogieron directamente en bolsas de Mylar en cada da de recogida para

controlar la contaminacin de fondo. Todas las bolsas se analizaron inmediatamente en el

mismo da, a excepcin de una bolsa que contiene una muestra del grupo de control sano.

La muestra se analiz retardada 5 das despus de la recoleccin, despus de ser

almacenado en un ambiente controlado a temperatura constante (22 C) y humedad

constante de aire (humedad relativa ~ 40%). De acuerdo con nuestros experimentos de

control, las muestras pueden empezar a deteriorarse despus de 3 semanas de

almacenamiento en estas condiciones I21.28J5]. Cabe sealar que el estudio de

biomarcadores en el aliento exhalado todava sufre de una falta de estandarizacin de la

recoleccin y anlisis de aliento. Amann y colaboradores han propuesto recientemente una

estandarizacin del proceso de recoleccin de la respiracin que podran ser generalmente

aceptado en el futuro [37].

anlisis de aliento utilizando los sensores basados en nanomateriales

Una matriz de 20 sensores basados en nanomateriales funcionalizados orgnicamente en

una cmara de exposicin de acero inoxidable fue expuesto alternativamente Tor 5 min

para las muestras de aliento y Tor 5 min a un vaco, y las seales de deteccin se registra

como una funcin del tiempo, como se ha descrito anteriormente | 2i.28-3oj5.36]. Cuatro

caractersticas de deteccin fueron extrados por sensor de las seales de deteccin en

funcin del tiempo: el cambio de la resistencia normalizada despus de la exposicin a las

muestras de aliento en medio de la seal; el cambio de la resistencia normalizada despus

de la exposicin a las muestras de aliento al final de la seal; el rea bajo la curva de

respuesta al comienzo de la seal; y el rea bajo la curva de respuesta al final de la seal.

Los sensores de la matriz se basan en redes aleatorias orgnicamente funcionalizados de

nanotubos de carbono de pared simple (RN-CNT) [22j5.38.39] y nanopartculas de oro

funcionalizadas orgnicamente (PNB)

[2o, 23,35,36,40]. Las funcionalidades orgnicas proporcionan sitios de absorcin en

trminos generales de reaccin cruzada para los COV aliento [23,41]. Los sensores fueron

desarrollados por Haick y compaeros de trabajo, y la fabricacin se describi en detalle

anteriormente [36.4o [. Los RN-CNT y PNB orgnicamente funcionalizados han sido

completamente caracterizado previamente [33,35 3 6,38,40,421. Cada sensor se someti a

un cambio rpido y totalmente reversible en la resistencia elctrica cuando se expone a los

VOCs caractersticos (incluyendo alcanos metilados y derivados del benceno tales como el

estireno) a concentraciones que van desde piezas individuales por mil millones (ppb) a

cientos de partes por milln, que muestra los tiempos de respuesta de menos de 5 s, los

tiempos de recuperacin que van from20 sup a 2 min, y los lmites de deteccin tpicos de

1-5 ppb en una relacin seal a ruido de 3. Las respuestas eran nicas debido a la

diversidad qumica de los ligandos y de PNB las sobrecapas orgnicos que cubren los RN-

CNT. El conjunto de sensores de reaccin cruzada form una olfactor) -sistema artificial

que podra identificar y olores diferentes separadas, incluso si las diatribas odo se presentan

en concentraciones muy bajas y sus diferencias son muy sutiles [33431. De este modo, cada

sensor mostr una respuesta caracterstica a todos o un cierto subconjunto de los VOCs

aliento caractersticos. La deteccin principio se describe en detalle en [2o.2l.3o.33.351-

diferentes sensores con la misma funcionalidad orgnica mostr resultados similares,

dentro de 5% desviaciones, mientras que diferentes funcionalidades orgnicas como

resultado diferentes respuestas que oscilaban entre -770 y + 330% [32,39]. En otras

palabras, el efecto de la funcionalidad orgnica fue generalmente mayor que las variaciones

de dispositivo a dispositivo y, por lo tanto, las huellas de la respiracin observados pueden

atribuirse a la influencia de la funcionalidad orgnica [33.35J6.38.40,421. Para el estudio

actual, se seleccionaron las combinaciones de tres o seis sensores para las diferentes

aplicaciones (Tabla2).

El anlisis estadstico de las seales de deteccin

Las impresiones de aliento para los grupos de ensayo se establecieron mediante un anlisis

computarizado de la respuesta colectiva del conjunto de sensores y la eleccin automtica

del conjunto ms adecuado de las caractersticas de deteccin, utilizando el anlisis

discriminante de los factores (DFA) 14445]. DFA es un mtodo lineal, bajo la supervisin

de reconocimiento de patrones. Las clases para ser discriminadas se definen antes de

realizar el anlisis. DFA determina las combinaciones lineales de valores de lectura de los

sensores, de tal manera que la varianza dentro de cada clase se minimiza y la varianza entre

las clases se maximiza. Las variables de DFA de salida, es decir, las variables cannicas

(CVS) se obtienen en las dimensiones ortogonales entre s. La primera variable cannica

(CV1) ser la ms potente dimensin discriminante en un caso de clasificacin de dos

grupos, pero el segundo CV (CV2) tambin puede representar una dimensin adicional de

diferenciacin, si tres grupos se han de distinguir. Por lo tanto, DFA reduce eficazmente los

datos experimentales multidimensionales, mejora la percepcin humana de los datos y

permite la distincin de las agrupaciones a travs de la percepcin visual de CV1, o CV1 y

CV2. Evitar el exceso de montaje es una prioridad durante el anlisis de conjuntos de datos

pequeos pero el segundo CV (CV2) tambin puede representar una dimensin adicional de

diferenciacin, si tres grupos se han de distinguir. Por lo tanto, DFA reduce eficazmente los

datos experimentales multidimensionales, mejora la percepcin humana de los datos y

permite la distincin de las agrupaciones a travs de la percepcin visual de CV1, o CV1 y

CV2. Evitar el exceso de ajuste es una prioridad durante el anlisis de conjuntos de datos

pequeos, sobre todo si se utilizan mtodos estadsticos supervisados. Por lo tanto, el

nmero de caractersticas de entrada para el modelo de DFA buildinga debe ser restringido.

La posterior validacin del modelo desarrollado es vital para asegurar que el exceso de

ajuste de hecho se ha evitado. La tasa de xito de clasificacin de los problemas binarios se

calcul a travs 1eave-un-out validacin cruzada. Para este propsito, DFA se calcul

utilizando un conjunto de datos de entrenamiento que exclua una muestra de ensayo.

Despus de que el clculo DFA, la muestra de ensayo se proyecta sobre el espacio DFA

2D, definido por CV1 y CV2 que se calcula utilizando el conjunto de entrenamiento. De

este modo, la muestra de ensayo fue 'cegado' contra el modelo DFA, de manera que su

afiliacin clase era desconocido. Todas las posibilidades de dejar de lado una muestra

fueron probados y la muestra fue omitido clasifican como verdadero anlisis de

conglomerados positivo, como verdaderos negativos, como falso positivo o falso negativo,

utilizando el estndar. El reconocimiento de patrones y clasificacin de los datos se

realizaron utilizando MATLAB (The MathWorks).

El anlisis de la respiracin mediante GC-MS

Los compuestos orgnicos voltiles en las muestras de aliento recogidas y en las muestras

recogidas de aire hospitales se identificaron utilizando GC-MS (GC-6890N; MS-5975;

Agilent Technologies Ltd). El anlisis GC-MS fue precedida por SPME para

preconcentrating la VOCs en las muestras. Un soporte de SPME manual con una fibra de

extraccin se inserta en la bolsa de Mylar durante 30 min antes de ser entregado a la GC-

MS. Las fibras con divinybenzene / Carboxen / polidimetilsiloxano (/ / PDMS CAR DVB)

de recubrimiento se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Israel). La fibra extrada en el soporte

manual de SPME se insert en el inyector de la GC (modo sin fraccionamiento). El

siguiente perfil de horno se utiliz: 35 C durante 10 min, 7,5 C por minuto hasta 130

C, 13 C por minuto hasta 290 C y 1 min a 290 C. Un capilar) * columna SLB-5MS

con baja metil fenil Se utiliz el contenido de siloxano (30 m de longitud, 0,25 mm de

dimetro interno, 0,50 m de espesor, de Sigma-Aldrich). La presin de la columna se fij

en 8,22 PSI, y la inicial Cmo tasa fue de 1,0 ml por minuto. Los cromatogramas GC-MS

se analizaron mediante el programa de anlisis de postrun GC-MS (GC-MS soluciones

versin 2.53SU1, Shimadzu Corporation), y los compuestos fueron identificados

tentativamente spera partidos biblioteca espectral (compuestos de la biblioteca del

Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa , ML), EE.UU.). El COV comn a> 80% de

las muestras sanas y AD (> 75% de las muestras sanas y PD), as como su abundancia con

el error experimental (error estndar de la media [SEM]), se identificaron utilizando el

espectro de masas automatizado deconvolucin y software del sistema de identificacin. El

COV que mostraron diferencias significativas (corte de valor de p: 0,05) entre los grupos de

estudio se determinaron mediante el nonpara mtrica prueba de Wilcoxon / Kurskal-Wallis

para las poblaciones cuyos datos no se puede suponer que se distribuye normalmente [46],

utilizando IMP, versin 9.0.0 (SAS Institute Inc. NC, EE.UU.).

resultados

La identificacin de AD & PD impresiones aliento utilizando los sensores basados en nanomateriales

Hemos demostrado la factibilidad de los sensores basados en nanomateriales para

identificar tanto AD y pacientes con EP mediante la construccin de dos modelos DFA

usando slo tres sensores cada uno (Tabla 2). De esta manera, el nmero de los parmetros

de entrada de DFA se restringi a fin de evitar la sobre-ajuste. DFA fue utilizado como un

enfoque heurstico para seleccionar los tres sensores ms adecuados desde un depsito de

20 sensores basados en nanomateriales disponibles que

fueron expuestos simultneamente a las muestras de aliento (vase "Anlisis de la

respiracin utilizando los sensores basados en nanomateriales 'secciones y' El anlisis

estadstico de las seales de deteccin '). Los sensores seleccionados lograron separacin

ptima entre los grupos de estudio. El primer modelo discrimina bien entre los pacientes

con EA y los controles sanos. Figura la muestra que dos grupos distintos, que corresponden

a los estados de AD y saludables, se pudieron observar en la CV espacio. De hecho, los

pacientes con EA se distinguan de los controles sanos a lo largo del eje del CV1, con

valores negativos para los primeros y positivos valores para este ltimo. Deja fuera de una

validacin cruzada se utiliz para evaluar el xito de clasificacin del modelo de DFA en

trminos de clasificaciones correctas y falsas (Tabla 3). De esto, la sensibilidad,

especificidad y exactitud de la discriminacin de AD de controles sanos se determinaron

como 93, 75 y 85%, respectivamente. El elevado nmero de muestras correctamente

clasificados confirm que el exceso de ajuste de los datos experimentales efectivamente se

ha evitado. El segundo Modelo DFA distingue bien entre los pacientes PD y los controles

sanos, como puede verse en la Figura IB. La validacin cruzada tambin produjo el xito de

alta clasificacin para este modelo de DFA (70% de sensibilidad, 10 0% de especificidad y

7 9% de precisin) (figura y tabla). Marcadores Bio seran particularmente atractiva para

uso clnico si reflejan la fisiopatologa especfica de la enfermedad neurodegenerativa.

Figura 1C muestra que un tercer modelo de DFA dio muy buena separacin de los

pacientes con EA y PD junto CV1, con xito la clasificacin alta despus de la validacin

cruzada (Taile3). La sensibilidad, especificidad y exactitud de la identificacin de pacientes

con AD dentro de un grupo mixto de pacientes con AD y PD se estimaron como 80, 87 y

84%, respectivamente.

FIGURA 1D tambin muestra que los tres grupos de prueba juntos podan distinguirse en la

misma parcela DFA, usando un cuarto modelo de DFA basado en seis sensores (Tabla2). El

uso de ms parmetros de entrada es permisible, porque el aumento de Ofthe nmero total

de muestras. NowCV2 tambin representa una dimensin considerable de la diferenciacin,

y se observa una superposicin ms grande entre los grupos de los pacientes PD y los

controles sanos. Tenga en cuenta que los grupos en la Figura ad aparecen de manera

diferente en el espacio CV, debido a que los datos de entrada de DFA son diferentes.

El anlisis qumico de las muestras de aliento

Se analiz la composicin qumica del aire exhalado de pacientes con AD y PD y se

compara con el aliento de los controles sanos como mtodo de apoyo para validar los

modelos que se derivan de la respuesta del conjunto de sensores a la respiracin del

paciente, mediante GC-MS en combinacin con SMPE. Algunos hospitalario

contaminaciones pueden estar presentes en muy gran concentracin [37,47]. Las sustancias

que se identificaron en el aire sin filtrar el hospital como contaminantes tpicos

hospitalarios (2-metil-2-propanol, etanol y metilisobutilcetona [27.471) fueron excluidos

del anlisis. Estos compuestos se identificaron en baja abundancia en menos de 10% de la

poblacin de estudio, lo que indica que la filtracin del aire inhalado fue eficiente (ver

seccin de recogida de Breath ').

A partir de entonces, los cambios relativos de los perfiles de COV entre los grupos de

estudio se determinaron mediante la comparacin de las abundancias medidos en masas

compuestos similares y tiempos de retencin. Se observ que existen ciertas diferencias en

la composicin qumica media de las muestras de aliento de pacientes con AD o PD y

controles sanos, lo que podra dar lugar a las impresiones impresionantes sensores Arrav

observados. Ficum2shows 24 compuestos orgnicos voltiles que estaban presentes tanto

en> 80% de los pacientes con EA y> 80% de los controles sanos y que no mostr (o poco)

superposicin en promedio abundancia, bajo consideracin ofthe95% Cl, correspondiente a

1,96 x SEM. Los compuestos detectados se identificaron tentativamente a travs partido

biblioteca espectral (Tah.e4). La confirmacin de los nombres compuestos, as como la

estimacin de las concentraciones absolutas de los compuestos de inters a travs de la

medicin de los estndares externos independientes, de alta pureza en concentraciones

definidas estn en marcha y se publicarn en otros lugares. Ficike3 muestra siete VOCs

identificados tentativamente que estaban presentes tanto en> 75% de los pacientes con EP

y> 75% de los controles sanos y que no mostr (o poco) superposicin en abundancia

media (underconsideration del 95% Cl).

discusin

La impresora aliento de AD & PD derivados de los sensores basados en nanomateriales

Los pacientes con AD podran ser claramente distinguido tanto de los controles sanos y de

los pacientes con EP, con una precisin similar (85 y 84%, respectivamente) a lo largo del

eje CV1, utilizando el mismo sensor-subconjunto que contiene dos sensores de RN-CNT y

un sensor PNB (Tabla 2). El anlisis DFA identific dos subconjuntos diferentes de

sensores de la mejor separacin entre la EP y estados saludables, que incluan nicamente

sensores RN-CNT. La impresin de la respiracin de los pacientes con EP frente a los

controles sanos fue algo menos pronunciada, con una separacin menor entre los grupos de

DFA

patrones de respiracin bien definidas y estables. Sin embargo, un conocimiento a priori de

los perfiles de COV de las diferentes subpoblaciones no era necesario para la eleccin de

los sensores, porque DFA fue utilizado como un enfoque heurstico para identificar los

sensores ms adecuados. En otras palabras, se seleccionaron los sensores, en el curso del

anlisis de datos, basado en su capacidad para distinguir entre los grupos de estudio. En

este estudio no hemos podido establecer una correlacin clara entre los COV aliento

caractersticos para AD y pacientes con EP que fueron identificados por GC-MS / SPME

(vase la seccin 'El anlisis qumico de las muestras de aliento') y las funcionalidades

orgnicas de los sensores del rendimiento mejor separacin entre los grupos de prueba, de

hecho, los sensores similares se han utilizado anteriormente para la identificacin de

patrones de respiracin de COV de otras enfermedades internas, tales como enfermedad

renal, esclerosis mltiple y varios tipos de cncer [20,21,26-28,30.33. 35.36,39,41]. Esto se

debe a los COV aliento de origen metablico pueden aparecer en diferentes proporciones

de concentracin en el aliento de personas sanas y pacientes que sufren de diferentes

enfermedades. Por lo tanto, no es de extraar que los patrones de COV de la EA. PD,

enfermedad renal y cncer podran ser identificados con diferentes combinaciones de

caractersticas de deteccin que se leyeron a cabo a partir de los mismos o similares

sensores | 27].

Es importante tener en cuenta la posible influencia de factores confontiding como la edad,

el gnero, la medicacin, hbitos de fumar y otros factores de estilo de vida que pueden

afectar la composicin qumica del aire exhalado 011 las impresiones aliento de AD, PD y

otras enfermedades I20.21.27.28ja37 0,47]. En este estudio se excluyeron cuidadosamente

el posible efecto de confusin de consumo de tabaco por alistar slo voluntarios que no

fuman. Hemos demostrado anteriormente que los sensores basados en el PNB tenan poca

sensibilidad a las diferencias en la edad [21]. TabliE1 muestra que los pacientes con EP

probados fueron entre 37 y 82 aos, que cubre una amplia gama de edades. Los sujetos

sanos tenan entre 51 y 73 aos de edad (es decir, que eran totalmente dentro del rango de

edad de los pacientes con EP). Por lo tanto, los controles PD y sanos fueron agrupados de

manera adecuada con respecto a la edad, con una edad media y desviacin estndar de 62

10 aos, y 61 7 aos, respectivamente. Los pacientes con EA tenan entre 51 y 81 aos de

edad, con una edad media de 68 10 aos. Su rango de edad muestra la superposicin

adecuada con el PD y los grupos sanos, pero varios pacientes con EA eran mayores que los

controles sanos, y varios pacientes con EP eran ms jvenes que los pacientes con EA. Por

ello, hemos verificado cuidadosamente que la distribucin por edades en los grupos de los

cuatro modelos discriminativos DFA muestra en Desde que yo era al azar. Los sujetos que

fueron mal clasificados durante la validacin cruzada eran ni sistemtica edad emparejados,

ni eran sistemticamente-coincidentes edad.

All AD and PD patients were under medication. Systematic differences in

medication could in principle affect the discrimination between the groups.

However, the medication within the AD and PD groups was sufficiently diverse to

reduce the risk of false-positive distinction due to the disease-specific medication.

We have recently identified asymptomatic nigrostriatal dopaminergic lesions in

rats, using two RN-CNT sensors |J2]. The human response to graded striatal

dopaminergic depletion is similar, although the applied model does not represent

all aspects of PD, since the PD pathology develops over decades, and the majority

(~90%) of cases are idiopathic. El modelo de rata permite la determinacin precisa del

grado de prdida de clulas dopaminrgicas , as como poseer la ventaja de una situacin

fisiolgica uniforme sin complicaciones del tratamiento de drogas y condiciones variables

dietticas , entre otros. Nuestra observacin anterior de impresiones aliento bien definidos

tor el modelo de rata PD apoya firmemente los impresionantes grabados PD en sujetos

humanos en el presente estudio , independientemente de la medicacin administrada. Es ol

particular, relevancethat los mismos dos sensores RN- CNT tor identificar la lesin

dopaminrgica nigroestriatal en ratas tambin se encontraban entre los tres sensores RN-

CNT que mejor distinguidos entre PD y Healt Instates en los seres humanos

Composicin qumica de las muestras de aliento

Los tres subpoblaciones estudiadas tenan diferentes perfiles de COV, el apoyo a las

impresiones de aliento que se derivaron de las seales de los sensores. Los 24 compuestos

orgnicos voltiles que diferan en abundancia media en muestras de aliento tomadas de los

pacientes con EA y controles sanos pueden ser considerados como potenciales

biomarcadores de COV para AD, y los siete VOCs que distinguieron los pacientes con EP

de los controles pueden ser considerados como potenciales biomarcadores PD. Cabe

sealar, sin embargo, que antes de biomarcadores pueden ser identificados de forma fiable,

las diferencias en los perfiles de COV y la identidad de

los compuestos orgnicos voltiles constituyentes deben ser confirmados a travs de la

medicin de los estndares externos independientes, de alta pureza en concentraciones

definidas. Esto est actualmente en curso y ser publicado en otros lugares.

El origen de algunos de los compuestos identificados preliminarmente puede tener

explicaciones lgicas, mientras que el origen de otros an no se puede entender fcilmente.

Cabe sealar que la etiologa general de AD y PD y los mecanismos de neurodegeneracin

no estn todava bien entendido. Sin embargo, ahora est bien establecido que el estrs

oxidativo juega un papel importante en el desarrollo y progresin de AD y PD | 49].

Muchos de los compuestos identificados tentativamente de hecho puede estar relacionado

con el estrs oxidativo. AD y PD implican aumento de muerte celular en general. Adems,

PD se asocia especficamente con la muerte de neuronas dopaminrgicas. Aluf ETAI. han

demostrado previamente que el nivel de estrs oxidativo se ha mejorado en el cuerpo

estriado de ratas lesionadas con dopaminergjc nigroestriatales, que pueden conducir a la

peroxidacin de lpidos [50,51]. Los fosfolpidos estn asociados con ruptura de la pared

celular, y podra conducir a un aumento de la formacin de alcanos y alcanos metilados.

Fmi2 muestra que 2,3,6,7-tetramethyloctane y 5-etil-2-metiloctano se incrementaron en el

aliento de los pacientes con EP. Curiosamente, estos dos compuestos tambin estaban

aumentados en el modelo de rata PD | 32]. El estireno es conocida como una toxina

ambiental que puede estar vinculado al dao del ADN. Podra ser aumentado en pacientes

con AD y PD debido al aumento del estrs oxidativo. Curiosamente, el estireno tambin se

encontr en cantidades elevadas en el aliento de las ratas con una lesin dopaminrgica

nigroestriatal asintomtica, que se mantuvo durante 6 semanas en el mismo entorno y

recibi la misma comida que los animales de control, lo que indica un posible origen

endgeno [32] .

La comparacin entre los pacientes con AD y los controles sanos dio 24 sustancias que se

produjeron en significativamente diferentes concentraciones, pero la comparacin entre los

pacientes PD y los controles sanos produjo slo siete. La significativamente mayor nmero

de AD-char acto erstico COV est de acuerdo con la observacin de los patrones de

respiracin ot claras tor AD en comparacin con EP. Esto podra indicar que AD podra

causar cambios fuertes en la qumica de la respiracin de la EP. Sin embargo, la diferencia

en el nmero de pacientes con AD y PD debe ser considerado antes de sacar conclusiones.

Un estudio prolongado con un mayor nmero de pacientes est actualmente en curso, que

puede ayudar a aclarar esta cuestin.

A pesar de las dit ter una hielos observados de abundancia en una serie de sustancias, las

capacidades discriminatorias de los sensores de nanomateriales basado se puede esperar

que excedan de las de GC-MS / SPME [21]. Los dos mtodos son fundamentalmente

diffrait: los sensores son de amplia reactividad cruzada y se seleccionan en funcin de su

poder de discriminacin, de manera que cada sensor responde a un nmero sustancial de los

compuestos de inters. Las respuestas a la misma compuesto a una determinada

concentracin son individualmente diferentes entre los sensores constituyentes, debido a la

diversidad qumica del ligando orgnico s. Sin embargo, el signa Es que los compuestos

de la mezcla que estn presentes en la muestra de aliento son aditivos, de modo que la seal

general de un sensor se deriva de un total de aproximadamente partes por milln cantidad

de los COV aliento de inters. Por lo tanto, las respuestas de los sensores se ven menos

afectadas por el ruido de las detectadas concentraciones (sub) ppb de los compuestos

orgnicos voltiles distintos en el anlisis GC-MS / SPME. Adems, se ha comprobado que

los sensores PNB muestran muy poca sensibilidad a compuestos orgnicos voltiles que se

derivan de factores estafadores-fundador como la edad, el gnero, la medicacin, hbitos de

fumar y otros factores de estilo de vida (para ms detalles vase [21.27.30.40]). Sin

embargo, en este estudio se incluyeron temas nica que no fuman, y los grupos de estudio

fueron aproximadamente emparejados por edad dentro de los lmites de error, para

minimizar el efecto de los factores de confusin en las seales del sensor de RN-CNT (s).

Por el contrario, GC-MS detecta todos confusin biomarcadores voltiles,

que introduce ruido en la medicin de la abundancia de los compuestos de inters y, por lo

tanto, afecta a la precisin global del mtodo.

Resumen y conclusin

Hemos entregado un concepto-proot ot tor la capacidad de los sensores RN-CNT y PNB

basados en nanomateriales para la identidad y distinguir las huellas de aliento de AD y PD.

como ejemplos representativos tor enfermedades neurodegenerativas. Los sensores podran

distinguir claramente entre los pacientes con EA, los pacientes con EP y controles sanos.

En apoyo de estos resultados, se observ en un enfoque de cortesa diferencias

estadsticamente significativas en la composicin qumica del aire exhalado de los tres

grupos de estudio, mediante GC-MS / SPME. Veinte compuestos tursticos fueron

identificados tentativamente que estn presentes en ms del 80% de los estados sanos y

AD, y siete compuestos que estaban presentes en ms del 75% tanto de los pacientes con

EP y los controles sanos. Estos compuestos pueden ser candidatos Tor biomarcadores

moleculares aliento voltiles. Un mayor estudio clnico est en marcha para verificar las

huellas de aliento observados.

Perspectivas futuras

Los resultados presentados podran constituir la base de una futura prueba de aliento

biomarcador sencilla, no invasiva, utilizando sensores basados en nanomateriales. Este

mtodo nanodiagnostic podra ayudar al diagnstico diferencial de la EA, PI) y

posiblemente tambin otras enfermedades neurodegenerativas, especialmente en entornos

no especialistas. Este enfoque podra tener un impacto significativo en la gestin de la

enfermedad y podra ser utilizado para apoyar el desarrollo de nuevas terapias. Por otra

parte, este mtodo puede tener un potencial como prueba de deteccin para la poblacin

mundial envejece. La prueba de aliento podra ser utilizado para identificar a las

poblaciones en situacin de riesgo que deben ser remitidos a un especialista para someterse

a pruebas de diagnstico ms especializados, como el PET y la puncin lumbar invasivo

para recoger lquido cefalorraqudeo.

Agradecimientos

Los autores agradecen me Finberg (Tecfmion - Israel Institute of Technology) til para los

debates.

Financieros y los intereses en competencia divulgacin

Los autores no tienen afiliaciones pertinentes o participacin financiera con cualquier

organizacin o entidad con un inters financiero en o conflicto financiero con el tema o

materiales discutidos en el manuscrito. Esto incluye empleo, consultoras, honorarios,

propiedad de acciones u opciones, testimonios de expertos, subvenciones o patentes

recibidas o pendientes, o regalas.

Sin la ayuda de escritura fue utilizada en la produccin de este manuscrito.

La conducta tica de la investigacin

Los autores afirman que han obtenido la aprobacin de la junta de revisin institucional

apropiada o han folloived los principios enunciados en la Declaracin de Helsinki para

todos experimental humano o animal en instigaciones. Adems, para las investigaciones en

seres humanos, el consentimiento informado se ha obtenido de los participantes

involucrados. El estudio fue aprobado por el Comit de tica de la bam Ram Salud

Cuidado Gimp nosotros y el comit de opi- Tech para la supervisin de los experimentos

humanos, Haifa, Israel y se registr en clinicaltrials.gov (registro no .: 'CTO! 291550).

Todos los participantes firmaron un formulario de consentimiento informado por escrito.

Fondo

Una prueba de viabilidad se present para un mtodo de diagnstico novedoso que puede identificar la enfermedad de Alzheimer (AD) y la enfermedad de Parkinson (PD), como

ejemplos representativos para las enfermedades neurodegenerativas.

El mtodo nanodiagnostico propuesto se basa en la deteccin de huellas de aliento que se derivan de AD o compuestos orgnicos voltiles relacionados con EP-en el aliento

exhalado de los pacientes, ya que los cambios relacionados con la enfermedad en la

qumica de la sangre tal vez reflejan en cambios mensurables del aliento a travs del

intercambio a travs de los pulmones.

Mtodos

Las impresiones de aliento fueron identificados con combinaciones adecuadas de sensores que se basaban en las nanopartculas de oro funcionalizadas orgnicamente y / o

redes aleatorias de los nanotubos de carbono

Resultados

Los sensores podran distinguir, con gran precisin, entre AD y estados saludables, PD y los estados sanos, y AD y estados PD. Conclusin

Grabados aliento podran constituir la base para el desarrollo del futuro rentable,

biomarcadores simples y fiables, lo que podra ayudar al diagnstico de enfermedades

neurodegenerativas como el AD y PD, especialmente en entornos no especialistas.