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Desarrollo de un producto fermentado probiótico

no lácteo a base de leche de almendras Laura Isabel Delgadillo Garcés

Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia.

li.delgadillo10@uniandes.edu.co

Resumen

En Colombia, el consumo de bebidas vegetales ha aumentado considerablemente en los últimos años. Entre estas, es útil resaltar

los productos a base de almendras como la leche o bebidas fermentadas. Estos productos tienen un alto contenido nutricional,

dado que su contenido de fibra es significativamente mayor al compararlo con bebidas similares. En adición, estos pueden ser

probióticos, es decir, incluyen microorganismos vivos, lo que según la Organización Mundial de la Salud (OMS) puede contribuir

beneficios a la salud humana [1]. De acuerdo con esto, se pretende desarrollar un producto fermentado probiótico cuya base sea

la leche de almendras y el cultivo Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus y Streptococcus thermophilus. Para esto, se

estandarizó el proceso de elaboración del producto. Este incluyó el desarrollo y la caracterización de la bebida base y el proceso

de la bebida probiótica fermentada. De lo anterior, se analizó el efecto de la concentración de leche base y volumen de inóculo a

añadir en el número de Unidades Formadoras de Colonia al finalizar el proceso de fermentación. Los resultados indican que una

concentración de 27.2 g/100 mL de leche base y un volumen de 2.0 μL/mL de inóculo añadido implican un número mayor de

UFC en el producto fermentado. Asimismo, que los factores seleccionados son significativos para el crecimiento microbiano.

Palabras clave: Fermentación láctica, Almendras, Probióticos, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp.

Bulgaricus

1. Introducción

La demanda de bebidas vegetales ha incrementado en los

últimos años. Según Mintel, el mercado de leche vegetal ha

tenido un aumento en los últimos cinco años de cerca del 61%

en Estados Unidos [2]. En el año 2017, Colombia se ubicó en

el tercer lugar de la lista de países latinoamericanos con mayor

consumo de leches vegetales con una comercialización de 1.4

millones de litros [3]. Análogamente, Mintel establece que la

preferencia de los consumidores por las leches vegetales se

basa principalmente en el cuidado de la salud [2]. Lo anterior,

dado que algunos productos de origen animal pueden estar

relacionados a intolerancia a la lactosa o alergias a proteínas

animales, entre otros. De acuerdo con esto, las leches vegetales

cuya base son principalmente cereales y nueces son una

alternativa al consumo de bebidas lácteas.

Entre los cereales se encuentran avena y arroz. Mientras que,

las nueces utilizadas generalmente son almendras, nueces del

nogal y avellanas. Entre estas, es útil resaltar aquellas

realizadas a base de almendras. Esto dado que, al ser estos

frutos secos, son una fuente significativa de ácidos grasos

monoinsaturados y tienen una relación adecuada entre

contenido de proteína y grasa. Además, contienen antioxidantes

como flavonoides, vitamina E y fibra. La información

nutricional de 100 g de Almendras crudas, de la variedad

Nonpareil, se encuentra en el Anexo 1. Esta variedad

corresponde a la utilizada en la experimentación. Sin embargo,

para la fabricación de bebidas vegetales a base de almendras

generalmente se utilizan almendras blanqueadas. Esto quiere

decir que la piel de las almendras ha sido removida después de

remojar las semillas en agua a 85ºC–100°C por entre 2 y 5

minutos. La semilla se seca y enfría a temperatura ambiente [4].

La información nutricional de 100 g de Almendras blanqueadas

establecido por el Departamento de Agricultura de Estados

Unidos se presenta en la Tabla 1 [5].

Tabla 1. Información Nutricional de Almendras blanqueadas [5].

Las leches vegetales son emulsiones (Sistemas coloidales)

formadas por la dispersión de gotas de aceite, partículas sólidas,

proteínas y gránulos de almidón. De lo anterior, la estabilidad

de la mezcla es altamente sensible a varios factores, entre estos

el tamaño de las partículas de grasa y estabilidad física de la

dispersión líquida. Esta última se relaciona directamente con la

separación de fases entre partículas de grasa, materia no soluble

y agua. Industrialmente, las bebidas vegetales se producen

mediante la aplicación de procesos térmicos y mecánicos con

aditivos con el fin de disminuir los problemas mencionados

anteriormente. En general, el procedimiento utilizado para

procesar leches vegetales de nueces se encuentra en la Figura

1.

Nutriente Unidad Valor

Grasas g 52.52

Fibra dietaria g 9.90

Proteína g 21.40

Sacarosa g 4.63

Humedad g 4.51

2

Figura 1. Procedimiento estándar para la producción industrial de

leche de Almendras [6]

Según Bernat, la aplicación de tratamientos de presión y

temperatura y la adición de compuestos como hidrocoloides

pueden permitir el desarrollo de un producto de alta calidad [6].

En este sentido, es útil conocer

la composición química de la

leche obtenida. De esta forma,

los valores promedio de la

composición química de leche

almendras comercial a partir

de lo encontrado en literatura

se presenta en la Tabla 2. Es

útil resaltar que la composición

promedio se encuentra entre 2

y 8% w/v [7].

De modo que, se afirma que industrialmente es posible obtener

una mezcla homogénea caracterizada, que se puede fermentar

biológicamente. En este sentido, la bebida de almendras es

materia prima para desarrollar productos fermentados análogos

al yogur, como se ha realizado con otras leches vegetales como

la de soya. En adición, dado que las nueces presentan

componentes no digeribles con propiedades prebióticas, son

considerados sustratos adecuados para el crecimiento

bacteriano. Asimismo, el contenido de fibra de la bebida de

almendras es relevante dado que, según Bernat, el almidón y la

fibra mejoran la estabilidad física de la leche vegetal

fermentada y promueven la supervivencia de los iniciadores

utilizados [6].

En este punto, es pertinente describir el proceso de

fermentación láctica. Este consiste en la degradación de

carbohidratos por parte de microorganismos y la acidificación

de la mezcla por la formación de ácido láctico. Este proceso

implica la formación de un gel a partir de una emulsión.

Estudios previos de fermentación realizados con bebida de

almendras indican que utilizar microorganismos de cepas como

Lactobacillus y Streptococcus mejoran la eficiencia del proceso

analizado. En adición, es útil resaltar la cantidad promedio de

azúcares en la leche de almendras mencionadas anteriormente

(Tabla 2). Si se realiza una comparación con el contenido de

estas en la leche de vaca (4-5g/100mL), la adición de

carbohidratos simples (azúcares) que permitan el crecimiento

microbiano se hace necesaria para llevar a cabo el proceso.

Asimismo, dado que se busca obtener un producto probiótico

es pertinente mencionar que debe tener un mínimo de

107UFC/g. El rango establecido para la concentración de un

producto con bacterias microbianas beneficiosa para la salud se

encuentra 106 − 107UFC/100 mL [8].

Adicionalmente, existen normativas para alimentos lácticos y

en este caso análogo-lácteos. Según el Codex [9], una bebida

fermentada debe cumplir con los siguientes requerimientos.

Tabla 3. Normativa según Codex para bebidas fermentadas [9]

Teniendo en cuenta lo anteriormente mencionado, el objetivo

de este proyecto es desarrollar un producto fermentado

probiótico a base de leche de almendras y del cultivo

Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii ssp.

Bulgaricus como análogo-lácteo al yogur. Para esto se pretende

primero, estandarizar el proceso de leche de almendras base y

caracterizar la misma. Este análisis incluye propiedades como

pH, densidad y tamaño de partícula. En segundo lugar,

estandarizar el proceso de fermentación y analizar los factores

que intervienen en el mismo. De modo que, el siguiente

objetivo fue seleccionar los factores y niveles en concordancia

con el proceso de fermentación estandarizado, para realizar el

diseño de experimentos. De acuerdo con lo anterior, en este

proyecto se pretende analizar el efecto de la concentración de

leche de almendras y el volumen de inóculo a añadir para

obtener una bebida fermentada probiótica. En este sentido, se

realizaron análisis de las propiedades fisicoquímicas y

microbiológicas del producto.

2. Materiales y métodos

2.1 Preparación de leche base

Inicialmente, para la bebida de almendras base se utilizó una

relación (w/v) de frutos secos, remojados en agua durante 8

horas, y agua de 8:100. La preparación se llevó a cabo en la

licuadora Vitamix [10] en el ciclo 6 a temperatura ambiente.

Después de esto, el líquido obtenido fue procesado en un filtro

de tela con el fin descartar partículas significativamente

grandes que contribuyeran a los procesos de coagulación,

floculación y sedimentación de partículas. Estos procesos de

migración interfieren con la estabilidad el producto final. El

líquido lechoso obtenido se utilizó como muestra de control o

blanco. Antes de iniciar el proceso de fermentación y con el fin

Unidad Valor

Proteína % w/w mín. 2.7%

Grasa % w/w menos del 15 %

Ácido láctico % w/w mín. 0.6%

Unidades formadores

de colonia (UFC)UFC/g mín. 10

7

Nutriente Bebida de

Almendras

Lípidos 1.5-2.6

Proteínas 1.1-1.8

Fibra 12.5

Azúcares 0.1-1.6

Fibra 0.4-2.0

Tabla 2. Valores promedio de la

composición química de Leche

de Almendras comercial por 100

mL de producto líquido [6]

3

de aumentar en contenido de carbohidratos en la bebida base se

adicionó 0.75 g/mL de glucosa.

Sin embargo, los resultados de los procesos de fermentación

con la concentración de 8% no fueron satisfactorios. Esto dado

que bajo las condiciones establecidas no se formó un gel estable

y significativo respecto al volumen de leche base inicial. Por lo

que, la concentración de la bebida base cambió a 26, 27.2 y

28% (w/v). Es necesario mencionar que los valores

mencionados corresponden a la concentración de la leche base

después de la remoción de sólidos con el filtro de tela y que no

se añadió glucosa a la leche resultante.

2.2 Tratamientos de homogenización térmicos

Los tratamientos de homogeneización térmicos se realizaron en

un horno de secado por convección. Estos consistieron en

tratamientos a baja y alta temperatura. Por un lado, el

tratamiento a baja temperatura (LT) sometió las muestras a 85

º C durante 30 minutos. Por el otro, el tratamiento de alta

temperatura (HT) utilizó 121 º C durante 15 minutos para

homogenizar las mezclas.

2.3 Caracterización de leche base

Se realizaron mediciones de pH y densidad a la bebida de

almendras base con concentraciones de: 8, 26, 27.2 y 28.5

g/100 mL a temperatura ambiente. Para esto, se utilizó un pH-

metro Mettler Toledo y un picnómetro de 25 mL de capacidad.

Análogamente, se realizó la caracterización de estas mismas

bebidas. Esta incluyó la cuantificación de: humedad, cenizas,

proteína, y azúcares. Es relevante mencionar que estos se

determinaron a partir de lo establecido según Matissek [11] y

AOAC Internacional [12]. Los procedimientos empleados se

especifican a continuación.

•Humedad: Para este análisis se utilizó un Termobalanza Series

330XM. El procedimiento tarda cerca de 45 minutos.

•Cenizas: La muestra se secó en un horno durante 4 horas.

Después de desecar la muestra se calcula el residuo por

diferencia de peso.

•Azúcares: Se utilizó refractómetro a través de la medición de

°Brix como estimación sacarosa.

•Proteínas: Se utilizó el método de Kjeldahl. Este consiste en

calcular el contenido de proteína teniendo en cuenta el

contenido medio de nitrógeno.

En adición, la distribución de tamaño de partícula de las

muestras se realizó en un difractómetro láser (Mastersizer

2000). Para las mediciones se utilizó un índice de refracción y

absorción de 1.33 y 0.1 respectivamente y una tasa de

oscurecimiento entre 10 y 20%. Las muestras se diluyeron en

agua desionizada a 2000 rpm.

2.4 Diseño experimental

Dado que el diseño presenta como variables la concentración

de leche base y el volumen de inóculo a añadir se utilizó la

metodología de diseño factorial. Esto con el fin de obtener el

número de experimentos a realizar. En este, la variable de

respuesta se especificó como la cantidad de unidades

formadoras de colonia (UFC) después del finalizar el proceso

de fermentación. Es útil resaltar que para esto se utilizaron los

siguientes niveles de las variables mencionadas:

Tabla 4. Factores y niveles seleccionados para el diseño de

experimentos

Los criterios de selección de los niveles para cada factor se

describen a continuación. Por un lado, para el volumen de

inóculo a añadir se estableció el nivel Alto y Medio de acuerdo

con lo especificado en la ficha técnica del medio cultivo.

Mientras que, el nivel Bajo se estableció con el fin de asegurar

que el producto final correspondiera a una bebida probiótica.

Por el otro, los niveles para el factor de la concentración de

leche base se establecieron conforme a la normativa de Codex

[9] y con el aumento del módulo de almacenamiento G’ de

modo que se obtuviera una bebida fermentada con la menor

separación de fases.

2.5 Producto fermentado

Para el proceso de fermentación se utilizó el cultivo Lyofast

Y430-A. Este contiene los microorganismos Streptococcus

thermophilus y Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus. El

cultivo contiene entre 4 y 8 𝑥107 UFC/mL. La muestra por

fermentar se calentó a 50 °C durante 15 minutos con el fin de

evitar microbiota inicial patógena. Después de esto, se enfrió

hasta 40°C y se inoculó a la misma temperatura en una cabina

de flujo laminar.

El proceso de fermentación se llevó a cabo en un Shaker a una

temperatura de 40°C con el fin de evitar cambios en la

viscosidad a temperaturas mayores y tiempos de incubación

menores a los esperados (Entre 4 y 8 horas) [13]. Cuando el pH

de las muestras se encontraba en 4.8, se detuvo el proceso de

fermentación y las muestras se almacenaron a 4°C para los

análisis siguientes. Es útil resaltar que cada experimento se

realizó con una réplica y que los análisis mencionados se

realizaron tras 12 horas de almacenamiento.

2.6 Caracterización de producto fermentado

Se realizaron mediciones de °Brix con el fin de cuantificar el

contenido de sacarosa después del proceso de fermentación

para todas las muestras. Además, se realizaron mediciones de

Volumen de inóculo a

añadir (µL/mL leche )

Concentraciónde

leche base (g/100 mL)Nivel

2.0 28.5 Alto

1.0 27.2 Medio

0.4 26.0 Bajo

4

pH, acidez y potencial Z. Esto con el fin de establecer si el valor

de pH era cercano al punto isoeléctrico de la proteína de la

almendra (4.8) [14] [15] y cuál era la cantidad de ácido láctico

formado. Para la acidez se utilizó un titulador automático con

una solución de Hidróxido de Sodio (0.1 M) con 20 mL de la

muestra de bebida fermentada y con agitación constante. La

cantidad de ácido se determinó cuando el pH de la muestra

alcanzaba un valor de 8.2. Mientras que, para el potencial Z se

analizaron las muestras en un Zetasizer Nano Zs-Malvern

Instrumnets a 20 °C.

2.6.1 Conteo microbiano

Se realizó la preparación del agar de cultivo MRS selectivo para

bacterias ácido-lácticas. Para las siembras se utilizaron placas

de Petri con 20 mL aproximadamente del medio cultivo. Se

realizaron diluciones en solución salina de 10−7. La siembra de

todos los productos fermentados se realizó en una cabina de

flujo laminar bajo condiciones estériles con el fin de evitar

contaminación externa. Todos los materiales empleados

durante toda la experimentación fueron sometidos al Autoclave

con el fin de esterilizarlos.

Es útil resaltar que se realizaron siembras de leche base con el

fin de identificar microbiota inicial que afectara el proceso de

fermentación. Dado que no se realiza proceso de esterilización

de la bebida base, pero no se encontró crecimiento microbiano

contaminante en las placas de Petri.

2.6.2 Comportamiento reológico

Se realizó un análisis al comportamiento reológico de los

productos obtenidos. Para esto se utilizó una prueba de flujo en

un reómetro rotacional (TA Instruments HR-1). Esta prueba se

realizó con una geometría de cilindros concéntricos con un

esfuerzo de corte desde 0.01 a 100 𝑠−1. Se aplicó una corrida

de ida y una de vuelta para observar la histéresis presentada en

la viscosidad.

2.6.3 Estabilidad

Se realizó un análisis de estabilidad a los productos

fermentados en el Analizador Óptico Turbiscan Lab. Para esto

se emplearon 20 mL de producto que fueron sometidos cada 25

segundos, durante 30 minutos, a una fuente de luz infrarroja

con longitud de onda de 880 nm. Esto permitió establecer las

señales de Retrodispersión.

2.6.4 Textura

Las propiedades de textura fueron establecidas a través de un

Texturómetro (TAXT plus). Para esto, se utilizaron muestras

de 50 mL y un cilindro de aluminio de 35 mm encargado de

deformar y vencer las fuerzas de atracción del fluido. Las

pruebas realizadas incluyeron dos esfuerzos y alcanzar una

altura de 45 mm de la base.

2.6.5 Morfología

Se observó la morfología de las bebidas fermentadas con

mayores UFC en un Microscopio Óptico de Barrido (SEM).

Para esto, fue necesario congelar las muestras a -5 °C en el

equipo con el fin de evitar un cambio de fase por el haz de

electrones utilizado para visualizar la morfología. Se utilizaron

resoluciones de 300, 1000 y 2000x.

3. Resultados y discusión

3.1 Leche base

3.1.1 Concentración 8% (w/v)

En la bebida base con concentración de 8% (w/v) se

encontraron diferencias en los valores de pH y densidad entre

la muestra sin tratamientos y las sometidas a tratamientos

térmicos. El valor promedio del blanco fue de 6.86, mientras

que las muestras tratadas resultaron en un valor de pH de 6.95.

En estos valores no se encontró una diferencia significativa

respecto a los tratamientos de alta y baja temperatura.

Análogamente, los valores de densidad de las muestras no

tratadas resultaron en 1001.3 kg/m3. Mientras que en las

muestras tratadas se observó una disminución de la densidad

con valor promedio para ambos tratamientos térmicos de 985.8

kg/m3(p>0.05). Lo anterior, se explica por los cambios en la

composición y estructura de la bebida base a causa de la

desnaturalización de la proteína de la almendra. Según Sathe

[14] [16], la mayor parte de las proteínas de la almendra inician

su desnaturalización a partir de una temperatura de 72 °C. Esto

se comprobó experimentalmente como se demuestra en la

Figura 2.

Figura 2. Bebida base (26 % w/v) después de A) Tratamiento baja

temperatura B) Tratamiento Alta Temperatura.

Pese a la desestabilización de las muestras, se realizó el análisis

de tamaño partícula. La Figura 3 muestra la distribución de

tamaño de partícula obtenida para leche de almendras base con

concentración de 8% (w/v) sometida a los tratamientos

térmicos de alta y baja temperatura.

A

B

5

Figura 3. Relación entre el Tamaño de partícula y la Densidad de las

muestras blanco, con tratamiento de baja y alta temperatura

Como se observa en la Figura 3, la muestra Blanco presenta una

distribución relativamente bimodal. Lo anterior, indica que hay

un porcentaje significativo de partículas grandes y también de

menor tamaño. Estas probablemente estén constituidas por

gotas de grasa y proteínas respectivamente. La aplicación de

tratamientos térmicos implicó un cambio en la distribución del

tamaño de partícula hacia un comportamiento monomodal. Las

partículas más pequeñas aumentaron su tamaño por la

formación de agregados, mientras que no hubo un cambio

significativo en la distribución de las partículas más grandes.

El comportamiento observado coincide con lo encontrado por

Bernat [6], en donde especifica que, el efecto del tratamiento

térmico llevó a la desaparición de las partículas más finas. Esto

probablemente ocurrió debido a la desnaturalización la

proteína, agregaciones de partículas y aumento en el tamaño de

los glóbulos de grasa [17].

En este punto, es útil mencionar que los tratamientos térmicos

se aplicaron con el fin de homogenizar la leche base. Es decir,

obtener una distribución del tamaño de partícula monomodal

con la reducción en el diámetro medio de las partículas más

grandes como los glóbulos de grasa y células vegetales. Sin

embargo, de acuerdo con los resultados obtenidos los

tratamientos térmicos de baja y alta temperatura no reducen el

tamaño de las partículas más grandes y por ende no funcionan

como tratamiento de homogenización. En contraste, permiten

la formación de aglomerados de partículas pequeñas y generan

una separación de fases en las muestras.

Según Bernat y Flores [6] [18], el cambio en la conformación

se contrapone con los tratamientos de presión. Sin embargo, no

es posible aplicar estos tratamientos en el estudio. De acuerdo

con esto, se descartó la implementación de procesos de

homogenización térmicos dado que aumentaban la

inestabilidad de la leche base y desnaturalizaban la proteína

vegetal antes del proceso de fermentación. Es útil resaltar que,

dado que los tratamientos térmicos permitían asegurar la

reducción de microbiota patógena inicial en las muestras, será

necesario calentar las muestras antes de iniciar el proceso de

fermentación a 50°C.

3.1.2 Proceso de fermentación con concentración de

leche base de 8%(w/v)

Las bebidas fermentadas obtenidas

presentaban una separación de

fases considerable como se

observa en la Figura 4. Como se

puede observar se presenta una

sinéresis espontánea a causa de la

conformación de una red inestable.

La sinéresis se define como la

separación de suero, conformado

por proteína soluble, de la red

formada. Esto se presenta por un

tamaño de poros inadecuado en el

gel formado en el proceso de

fermentación [13] [17].

Con el fin de analizar la estabilidad del producto obtenido se

realizó un análisis en el equipo Turbiscan. Los resultados se

presentan en la Figura 5. De acuerdo con lo observado, el gel

formado es altamente inestable. Esto ya que se obtiene

cremación en la muestra dado que hay migración de partículas

o gotas hacia parte superior de la celda. El desplazamiento

señalado se presenta por interferencias dadas en el tamaño de

partícula y viscosidad del medio en que se encuentran.

Figura 5. Retrodispersión de bebida fermentada con concentración

de leche base de 8% (w/v).

En adición, el tiempo de fermentación era 2.5 horas, tiempo

significativamente menor al reportado en literatura (Entre 4 y 8

horas) [6] [7]. Esta diferencia se debe principalmente a una

mezcla inadecuada de las variables que intervienen en el

proceso de fermentación. Entre estas es útil resaltar las que,

además, intervienen en la estabilidad del producto final:

contenido de materia seca y homogenización de leche base,

temperatura de incubación y catalizadores proteicos [13].

Según Lee y Lucey, las soluciones para mejorar la estabilidad

Figura 4. Bebida fermentada

probiótica resultante con

concentración de leche de

almendras base de 8% (w/v).

6

de una bebida fermentada son: usar estabilizadores, como

pectina, gelatina y almidón y/o aumentar la cantidad de materia

seca de la bebida base, especialmente el contenido de proteína.

Lo anterior, con el fin de reducir el efecto del suero.

Por consiguiente, se buscó aumentar el contenido total de

sólidos y por ende aumentar el módulo de almacenamiento G'

del producto base [13]. Es relevante mencionar que, el módulo

de almacenamiento G' representa la parte elástica del

comportamiento viscoelástico, que describe el comportamiento

de la muestra. Para seleccionar el valor de concentración de

leche base es necesario tener en cuenta las restricciones de

composición formuladas por el Codex. En la Tabla 6 se

presentan valores seleccionados.

Tabla 5. Niveles de concentración seleccionados para leche base

Es pertinente resaltar que con esos valores se obtuvieron

tiempos de fermentación entre 4 y 4.5 horas que coinciden con

el rango reportado en literatura [6] [8].

3.1.3 Leche base con niveles de concentración

En la bebida de almendras base no se encontraron diferencias

significativas en los valores de pH ni densidad entre las

muestras de las concentraciones de leche base analizadas. Los

valores promedio fueron de 6.86 y 1001.3 kg/m3 (p> 0.05). La

composición química de la bebida base con las concentraciones

utilizadas se presenta en la Tabla 7.

Tabla 6.Composición (g/100 g) de leche de almendras base

La composición obtenida para la concentración de 8% (w/v) fue

similar a la encontrada por otros autores [7] [19]. Mientras que,

las composiciones de las concentraciones más altas son

significativamente mayores a las reportados para leches de

almendras industrial. Esto se debe a que, estas bebidas tienen

concentraciones menores que las empleadas en el estudio. Sin

embargo, es necesario mencionar que los valores de sacarosa

son mayores a los obtenidos en la literatura después de que en

los estudios se adicionara azúcares. Esto se puede deber a que

como su nombre lo indica el refractómetro emplea la refracción

para cuantificar sacarosa. Pero en esta medición, también se

puede incluir materia seca de otras características que pueden

inferir en los resultados.

Además, como coincide con lo esperado, una mayor

concentración de almendras en la leche base implicó un

aumento considerable en el contenido de proteína y aunque no

se cuantificó, también lo será en el contenido de grasa. Si se

realiza una comparación con la leche de vaca (3,4 g/100 mL de

proteína) las concentraciones más altas tienen un contenido de

grasa y proteína mayor. Sin embargo, contienen fibra vegetal y

cumplen con las restricciones establecidas en el Codex.

3.2 Diseño de experimentos

A partir de los factores y niveles seleccionados, es útil

establecer las muestras a realizar según el diseño de

experimentos. Este corresponde a un diseño factorial completo

32 con réplica.

Tabla 7. Muestras por realizar

3.3 Caracterización de producto fermentado

En la Tabla 9 se observa una reducción en los °Brix y presencia

de acidez después del proceso de fermentación. Esto coincide

con lo esperado dado la transformación de sacarosa a ácido

láctico parte del cultivo inoculado de bacterias ácido-lácticas.

Sin embargo, los resultados de acidez obtenidos son menores a

los establecidos para un yogur estándar (Entre 0,8 y 1 g de ácido

láctico/100 mL) y a lo reglamentado en el Codex para bebidas

fermentadas.

Tabla 8. Resultados de °Brix, acidez y potencial Z de las muestras

fermentadas

En cuanto al potencial Z, es útil resaltar que esta propiedad

permite concluir acerca de la estabilidad de los sistemas

analizados. Cuando el pH corresponde al punto isoeléctrico, las

cargas netas de las proteínas son cero de modo que el potencial

Z será igual a cero. Este punto implica la desnaturalización

completa de la proteína. Sin embargo, valores negativos pueden

Porcentaje de remoción promedio Concentración de leche base (g/mL)

14.4 +/- 0.3 28.5

12.8 +/- 0.2 27.2

10.9 +/- 0.3 26.0

Composición (g/100g) 8.00 26.00 27.20 28.50

Humedad 91.20 73.40 72.20 70.90

Cenizas 0.23 0.72 0.81 0.91

Sacarosa 2.80 1.80 2.10 2.40

Proteínas 1.89 6.58 6.95 7.01

Concentración inicial de leche base (g/100g)

Muestra Volumen de inóculo a

añadir (µL/mL leche )

Concentración inicial de

leche base (g/100 mL)

1 A B

2 A M

3 A A

4 M B

5 M M

6 M A

7 B B

8 B M

9 B A

Muestra °BrixAcidez (g Ácido

láctico/100 mL)Potencial Z

1 1.30 0.27 0.31

2 1.55 0.32 0.21

3 1.70 0.41 0.49

4 1.24 0.32 -0.05

5 1.70 0.27 -0.07

6 1.84 0.32 0.35

7 1.41 0.27 -0.08

8 1.68 0.28 0.30

9 1.78 0.36 -0.07

7

relacionarse con la formación de un gel inestable a causa de la

floculación de partículas. De los resultados obtenidos, se

observa que coinciden en gran parte con la supervivencia del

cultivo, ya que las muestras con valores negativos

corresponden a las muestras con un número menor de UFC al

final del proceso de fermentación.

Adicionalmente, los resultados de los análisis de tamaño de

partícula en términos de los diámetros medios de partículas se

presentan en la Tabla 10. Los diámetros medios de partículas

las muestras fermentadas aumentaron de tamaño. Esto coincide

con lo esperado dado que, la acidificación del sistema permite

la floculación de partículas. Los diámetros medios máximos se

obtuvieron en las Muestras, cuyo potencial Z fue mínimo.

Tabla 9. Resultados de diámetros medios de partículas

3.4 Conteo microbiano

Se realizaron los experimentos de acuerdo con lo arrojado por

Minitab (Anexo 2). Después de incubar los medios de cultivos

sembrados durante 48 horas se realizó el conteo microbiano.

Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 11. Estos

muestran el número de UFC 107/g de bebida fermentada.

Tabla 10. Resultados conteo microbiano UFC (107)

A partir de los resultados obtenidos se confirma que todas

muestras corresponden a bebidas fermentadas probióticas. Esto

dado que superan la restricción de 107 UFC/g establecida en el

Codex. Además, se observa que la muestra con un número

mayor de UFC obtenida es la Muestra 2. Esta corresponde a los

niveles alto y medio del volumen de inóculo a añadir y la

concentración de leche base respectivamente.

3.4.1 Análisis estadístico

Para el análisis de los datos de conteo microbiano se estableció

un intervalo de confianza del 95%. Los resultados obtenidos se

analizaron en el programa Minitab. Es relevante mencionar que

los resultados indican que el bloqueo respecto a la réplica no es

significativo para el número de UFC obtenidas. De con esto, el

termino mencionado no fue tenido en cuenta.

Sin embargo, con el fin de comprobar si los supuestos del

modelo estadístico se cumplen es necesario analizar los

residuos de las pruebas. En la Figura 6 se presenta el

Histograma de residuos estandarizado. La estandarización se

realizó con el fin de observar de una mejor forma la distribución

de residuos. El Histograma de residuos generales se presenta en

el Anexo 2.

Figura 6. Histograma de residuos estandarizado

En esta figura se observa una distribución normal, centrada en

0 y sin desviación significativa respecto a las colas. Lo anterior

indica que los residuos presentan una distribución simétrica.

De igual forma, la gráfica de probabilidad normal de residuos

se presenta en la Figura 7. En esta se observa que los valores si

se distribuyen normalmente dado que se ubican cercanos a la

línea recta de tendencia. En adición, es útil resaltar que la

prueba de Anderson-Darling arrojo un p-value igual a 0.064,

valor mayor al error establecido. Lo anterior indica que no se

debe rechazar la hipótesis nula que establece la distribución de

residuos uniforme.

Figura 7.Probabilidad normal de residuos

En adición, es necesario evaluar el supuesto de

homocedasticidad que indica varianza constante a lo largo de

las observaciones. De este modo, la relación entre el

comportamiento de valor ajustado respecto al residuo

estandarizado se presenta en la Figura 8.

Muestra D 4,3 (µm) D 3,2 (µm)

No tratada 82.8 3.97

1 106 6.35

2 104 7.57

3 109 8.51

4 113 8.56

5 114 9.01

6 105 7.66

7 115 9.13

8 105 6.34

9 113 8.82

Muestra Experimento Réplica

1 7.29 7.64

2 8.69 8.57

3 7.90 8.02

4 5.15 5.43

5 6.33 6.16

6 5.06 4.91

7 6.67 6.68

8 4.87 5.31

9 4.24 4.61

8

Figura 8. Comportamiento entre el valor ajustado y el residuo

estandarizado

A partir de lo observado en la Figura 8 es posible mencionar

que dado que no hay un comportamiento especifico entre el

valor ajustado y los residuos no se rechaza la hipótesis de

homocedasticidad. El último de los supuesto a evaluar implica

que el orden en que se realizaron las pruebas no influyó en los

resultados obtenidos. Para esto, la Figura 9 describe el

comportamiento entre las observaciones y el residuo

correspondiente.

Figura 9.Comportamiento entre la observación realizada y el

residuo correspondiente

Dado que no se observa ningún patrón comportamiento, la

hipótesis no se rechaza. De todo lo anterior, es posible afirmar

que los resultados del análisis estadístico realizado son

confiables con un nivel de significancia del 95%.

Después de haber comprobado la confiabilidad del estudio

realizado es posible afirmar que el volumen de inóculo añadido

y la concentración de la bebida base son factores significativos

para el número de UFC al final del tiempo de fermentación en

la bebida producto. Lo anterior, indica que variaciones en el

volumen de inóculo añadido y la concentración de leche base

implicarán cambios en la bebida fermentada probiótica en

términos del número de UFC obtenidas. Teniendo en cuenta los

resultados, de las gráficas de efectos e interacción, es posible

afirmar que no hay diferencia notable entre los niveles Medio

y Bajo de ambos factores. Sin embargo, el nivel Alto de la

concentración de leche base implicó una disminución en el

número de UFC, lo opuesto a lo encontrado para el volumen a

añadir (Anexo 2).

3.5 Textura

La dureza y la cohesión dependen de la fuerza requerida sobre

un fluido para deformarlo y su grado de deformación, de modo

que varían respecto a cada muestra. Los resultados obtenidos

para estas propiedades se presentan en la Tabla 12.

Tabla 11. Resultados dureza y cohesión

De los resultados obtenidos, es posible afirmar que la dureza

depende significativamente de la concentración de leche base y

del volumen de inóculo añadido. Esto coincide con lo esperado

dado que, esta propiedad depende de la matriz proteica formada

y de la cantidad de sólidos totales. Mientras que, la cohesión

depende del volumen de inóculo añadido. Lo anterior, indica

que la variación entre los niveles de concentración de leche

base no es significativa para la cohesión del producto

fermentado (p>0.05).

3.6 Estabilidad

Los resultados de Retrodispersión de las Muestras 2, 3, 5 y 7 se

presentan en la Figura 10. La primera muestra corresponde al

número mayor de UFC obtenidas, mientras que las demás

muestras se presentan dado que obtuvieron un comportamiento

diferencial de las demás. De lo observado en la Figura 10, es

posible afirmar que el sistema coloidal formado en todas las

muestras es relativamente estable en el tiempo. Esto dado que

no hay variación significativa en el valor de Retrodispersión

con el paso del tiempo y con la altura de la celda.

Sin embargo, en la Muestra 3 y 5 se observa un incremento en

el tamaño de partícula específicamente fenómenos de

floculación o coalescencia. Esto ocurre principalmente por la

disminución de la fuerza de barrera entre partículas y gotas del

sistema y por su viscosidad. No es posible especificar cuál de

los fenómenos mencionados ocurrió por las limitaciones de la

prueba. Sin embargo, es útil mencionar que ambos fenómenos

implican la aglomeración de gotas o partículas y por ende un

cambio en el tamaño de estas. La diferencia radica en que este

cambio sea reversible o no, la floculación es un fenómeno

reversible con procesos como la agitación de la muestra. Es útil

resaltar que este incremento es más visible en la Muestra 3 que

corresponde a los niveles altos de los dos factores

seleccionados.

Adicionalmente, en la Muestra 7 se observa la migración de

partículas por sedimentación. Este fenómeno implica el

traslado de las partículas suspendidas hacia la parte inferior del

líquido por acción de la gravedad. Esto se debe al tamaño de

partícula y viscosidad del medio. Es relevante mencionar que

esta muestra corresponde a los niveles bajos de los dos factores

seleccionados.

Experimento Réplica Experimento Réplica

1 35.33 35.15 1.08 1.08

2 35.40 35.68 1.08 1.07

3 35.12 35.05 1.08 1.06

4 32.35 32.10 1.05 1.04

5 33.11 32.61 1.05 1.05

6 32.25 32.44 1.05 1.05

7 29.63 30.33 1.06 1.06

8 30.65 30.36 1.07 1.06

9 30.25 30.92 1.04 1.03

Dureza [g] Cohesión [-]Muestra

9

Figura 10. Retro dispersión de A) Muestra 2. B) Muestra 3. C) Muestra 5 D) Muestra 7

A

B

C

D

10

3.7 Comportamiento reológico

A las 9 muestras y sus réplicas se realizó caracterización

reológica a través de una prueba de flujo. Los resultados por

muestras se presentan en la Figura 11. De los resultados

obtenidos, se comprueba el comportamiento pseudoplástico de

la muestra. Esto dado que, la viscosidad disminuye con el

aumento en la velocidad de cizalla. En la Figura 11 se observa

diferencias entre las curvas resultantes de las pruebas de ida y

vuelta para todas las muestras. Esta discrepancia se denomina

histéresis y se presenta por un cambio en la viscosidad inicial

de la muestra. Esto dado que, someter el fluido a un esfuerzo

implica reconstruir y adaptar su estructura un tiempo

específico.

Es relevante mencionar que las muestras 1,3 y 4 son las que

presentan mayores histéresis. De lo anterior, es posible afirmar

que concentraciones menores en la leche base implican una

variante en la viscosidad, es decir la disminución en la proteína

de almendra. En contraste, un volumen de inóculo añadido

mayor resultó en una variación mayor de la viscosidad de la

muestra. Asimismo, los resultados obtenidos para la viscosidad

de las muestras son mayores a los reportados en literatura [7]

[8]. Esto se debe que con el aumento del módulo de

almacenamiento G’, gracias a un número mayor de sólidos

totales, la también se incrementó.

3.8 Morfología

El microscopio óptico de barrido (SEM) permitió observar la

estructura de agregados formados en las bebidas fermentadas.

Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 12. Estos

incluyen el estudio morfológico de las Muestras 1, 2, 3, que

corresponden a las muestras con el número mayor de UFC

resultantes.

De los resultados obtenidos, es posible afirmar que se

generaron agregados en todos los geles (Sistemas coloidales) y

que estos varían morfológicamente para cada muestra. De

modo que, se confirma la formación de una red tridimensional

entre proteínas que permite la contención de ácidos grasos.

Además, se evidencia que los agregados formados en la

Muestra 1 fueron más grandes que los formados en la Muestra

2 y 3, con mayores UFC obtenidas y una concentración de leche

de almendras menor respectivamente. Mientras que, en las

imágenes no se observa una diferencia notable entre las

Muestras 2 y 3. Lo anterior, puede indicar una relación entre la

morfología de las muestras y la concentración de leche base,

que coincide con lo esperado.

A B

C D

11

Figura 11. Prueba de flujo relación entre la Viscosidad (Pa.s) y la taza de cizalla (1/s) A) Muestra 1. B) Muestra 2. C) Muestra 3. D) Muestra

4 E) Muestra 5. F) Muestra 6. G) Muestra 7. H) Muestra 8. I) Muestra 9.

E F

G H

I

12

Figura 12. Microscopia óptica de barrido (SEM) de Muestras 1, 2, 3

4. Conclusiones

En primer lugar, fue posible estandarizar el proceso de

obtención de la leche de almendras base y se comprobó que

los tratamientos de homogeneización térmicos afectaron las

propiedades físicas y la estabilidad de las bebidas base. De

modo que, las emulsiones no fueron estables y se evidenció

la separación de fases y la aglomeración de partículas con la

desnaturalización de la proteína de la almendra.

En segundo lugar, se realizó la estandarización del proceso

de fermentación de bebidas fermentadas, de modo que, se

obtuvo una bebida fermentada probiótica estable a base de

leche de almendras. De los factores que intervienen en el

proceso se seleccionó a la concentración de bebida base (%

w/v) y al volumen de inóculo a añadir como factores del

diseño de experimentos. Esto con el fin de realizar una

comparación entre el comportamiento de los productos con

variaciones en los factores seleccionados. La combinación

de factores de crecimiento que resultó en una mayor

población celular en el producto fermentado fue de 27.2

g/100 mL de leche base y un volumen de 2.0 μL/mL.

De lo anterior, se concluye que los dos factores

seleccionados son significativos para el crecimiento

microbiano identificado como el número de Unidades

Formadoras de Colonias al final de proceso de fermentación.

De igual forma, se estableció que la interacción entre los

factores no es significativa y no se requiere un estudio

posterior.

En tercer lugar, se analizaron propiedades físicas y químicas

de las muestras fermentadas. Los resultados indicaron una

acidez entre 0.27 y 0.41 g/100 mL de ácido láctico.

Adicionalmente, se comprobó el consumo de sacarosa y que

los valores de potencial Z fueron cercanos a 0. También, se

confirmó la formación de una red tridimensional de

agregados de proteína de almendra en respuesta a la

disminución del pH, por la formación de ácido láctico. Los

geles formados fueron estables y permitieron confirmar la

naturaleza pseudoplástica del producto. Sin embargo, deben

estudiarse modificaciones a los factores y niveles

seleccionados y vida útil del producto.

A B C

13

5. Referencias

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