"Desarrollo de anticuerpos policlonales IgY

contra Vitelogenina (Vtg), como

biomarcador esteroidogénico en

Oreochromis niloticus”

Jairo Caza Barcia

V Congreso Internacional de Acuicultura en Aguas Continentales

Sangolquí del 17 al 19 de mayo del 2016

(Carrillo, 2009)

Control hormonal y vitelogénesis

Biomarcadores

• Bioquímicos y moleculares

• Celulares

• Histológicos

• Individuales

• Poblacionales

• Comunidades

• Biomarcadores de exposición

• Biomarcadores de efecto

• Biomarcadores de

susceptibilidad

Maduración asincrónica

Falta de estacionalidad en la

producción de ovocitos y afectación

de la esteroidógenesis

Evaluación de productos

esteroidógenico ofrecen

información sobre el proceso

reproductivo

Compuestos químicos pueden

actuar como disruptores

endócrinos en cuerpos de agua

Diclorodifenil-tricloroetano y

tamoxifeno, inductores e

inhibidores de la vitelogenesis

Vitelogenina (Vtg)

Biomarcador

esteroidogénico

Biomarcador

ambiental

Ventajas del uso IgY

(Schade y col, 1991)

IgG IgY

Muestreo Invasivo No invasiva

Rendimiento 200 mg IgG por

sangramiento (40 ml)

50-100 mg IgY por

huevo

(5 a 6 por semana)

Rendimiento por mes 200 mg Aprox. 1600 mg

Rendimiento específico/proceso Aprox. 5% 2% a 10%

Interferencia con el factor

reumatoide

Si No

Activación de complemento Si No

OBJETIVO GENERAL

Producir anticuerpos policlonales (IgY) de

gallinas contra la proteína precursora,

vitelogenina (Vtg), como posible biomarcador

esteroidogénico en hembras adultas de

Tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus)

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Inducir la producción y purifica de Vtg con 17-ß

estradiol en machos adultos de tilapia (Oreochromis

niloticus)

Inmunizar gallinas Isa Brown, para inducir la

producción y purificación de inmunoglobulinas IgY

contra Vtg

Determinar la avidez y especificidad de

anticuerpos de IgY-anti Vtg de Tilapia, mediante

técnicas de inmuno detección

Metodología

Producción de IgY

(Born, 2015)

Resultados

Purificación de Vtg

Shi, y col. (2002) fueron capaces de separar

mediante cromatografía de intercambio aniónico

vitelogenina del pez dojo (Misgurnus

anguillicaudatus) y en el pez carpa (Cyprinus

carpio)

La elución en la que Vtg fue identificada y

validada en gradiente de 0,37 M

Se empleó el método fluorométrico

Qubit® Protein Assay (Invitrogen,

USA), que arrojó un resultado de Vtg

total de 1,127 mg vtg/ml

Shi y col. (2002), aislaron 1,067 mg/ml

a través del mismo método.

Ortiz y col., (2016) recuperó Vtg a una

concentración de 1,8 ± 0,4 mg Vtg/ml

Concentración Cuantificación

Identificación (SDS-PAGE)

Ortiz y col., (2016) en tilapia del

Nilo (Oreochromis niloticus) a una

altura de 210 KDa

Fukada y col., (2003) purificaron

Vtg de 150 KDa en carpa

(Cyprinus carpio)

Shimizu y col., (2002) halló Vtg en

medaka común (Oryzias latipes) a

220 KDa

Alícuotas de 800 µl de anticuerpos a una

concentración de máxima de 5,2 mg/ml

Shimizu y col., (1988) aislaron

anticuerpos IgY a partir de cromatografía

de intercambio iónico en matrices de

DEAE celulosa

Hwee y col., (2012) utilizaron doble

precipitación con sulfato de amonio al 30

y 20 % con un rendimiento de IgY de 5

mg/ml.

Purificación de IgY

•Nunes y col., (2014)

caracterizaron una cadena

pesada en los 68 KDa, y una

cadena liviana en los 27 Kda

•Oyarzún (2011) han reportado

utilizando SDS-PAGE al 12%

estructuras de IgY con cadena

pesada de 67 KDa y cadena

liviana de 25 KDa

Identificación de IgY por SDS-PAGE

Deslow (1999) propuso

dosis de concentración de

100 µg/ml y 50 µg/ml como

dosis de refuerzo

Moreno (2010) propuso

dosis similares de

inmunización

Wen y col., (2012)

utilizaron dosis de

antígeno a 1 mg/ml

Curva de inmunización de gallinas

en función de IgY purificadas

Sotiropoulou y col., (2012)

comprobaron la unión

antígeno-anticuerpo a una

concentración de 1 µg/ml

Tada y col., (2004)

utilizaron IgG anti

vitelogenina a una

concentración de 40 µg/mL

ELISA indirecto

Muestras pre-purificadas de plasma de O. niloticus. 1: plasma inducido día 10.

2: plasma inducido día 15. 3: plasma inducido día 20. 4: plasma inducido día 25.

- : plasma macho normal.

Western Blot IgY contra Vtg

Conclusiones

Se inoculó 17-ß estradiol en individuos

machos de Oreochromis niloticus, lo cual

indujo la producción Vtg, obteniéndose 1,127

mg /ml

Se obtuvieron inmunoglobulinas IgY

contra Vtg en huevos de gallinas Isa Brown,

inmunizadas a partir de 19 semanas de

nacidas. Los anticuerpos fueron purificados

mediante métodos bioquímicos.

Se determinó la especificidad de

anticuerpos de IgY-anti Vtg de Tilapia,

mediante el uso de ensayos inmunométricos,

tales como ELISA y WB.

Dr. Juan Ortiz Tirado, Director del Grupo de Investigaciones de Recursos

Bioacuáticos y Acuicultura de la ESPE (RAAE)

Dra. Marbel Torres del Laboratorio Inmunología-Virología-ESPE

Dr. Rodolfo Fernández-Gómez investigador-docente del Programa

Prometeo SENESCYT, de Biophysic Solurions, C.A., Caracas, Venezuela

Al personal científico-docente, técnico y administrativo de la Universidad

de las Fuerzas Armadas-ESPE, y en especial, del IASA I

Agradecimientos

Anticuerpos IgY

http

://ww

w.h

uev

o.o

rg

.es/e

l_h

uev

o_fo

rm

acio

n.a

sp

http

://ww

w.ig

yim

mu

ne.c

om

/the

-scie

nce

-of-ig

y.h

tml