IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARESGENERALIDADES:

Este test se realiza en un suero problema (entre las que se encuentran, muestras de pacientes, donantes, mujeres embarazadas) que presenten alo o isoanticuerpos (test de screening de AI +) a fin de conocer la especificidad del Ac detectado, por lo que una vez detectado un Ac, el paso siguiente ser, si es necesario, la identificacin de este. El procedimiento consiste en examinar el suero en estudio con un panel de clulas rojas que se adquiere comercialmente: IDENTIGEN, RESOLVE, PANOCELL. Estos paneles traen 10 a 18 frascos con suspensiones globulares de composicin antignica conocida para lo cual se acompaan de un listado del perfil antignico del total de las clulas que lo integran.

Esta tcnica, bsicamente es similar a la deteccin y seleccin de anticuerpos irregulares, con la diferencia de que en este caso se enfrenta el suero en estudio a una batera de varias clulas de grupo O ampliamente fenotipadas, y cuya reactividad nos indicar la especificidad del anticuerpo en estudio.

PRINCIPIO DEL TEST:

Usando las condiciones bajo las cuales el anticuerpo fue originalmente detectado, se mezcla el suero en estudio con cada tipo celular del panel de identificacin, observando la presencia o ausencia de lisis o aglutinacin y comparando el pattern de reactividad con el perfil antignico de las clulas.

Generalmente se usa para el estudio: Salino inmediato a temperatura ambiente Incubacin a 37 grados C AntiglobulinaRecordar que siempre deben seguirse las instrucciones del fabricante.Existen varios tipos de paneles (fros, calientes, tratados con enzimas, etc.) por lo que el procedimientos para realizar este test vara de acuerdo a las caractersticas de cada tipo de panel.

Puede usarse LISS como medio de suspensin de cada clula del panel, y de esa forma puede disminuirse el tiempo de incubacin.Este test debe permitir identificar los Acs clnicamente significativos que mas frecuentemente se encuentran (anti D, anti E, anti K, anti c). La temperatura de incubacin se puede variar de acuerdo al Ac que se cree estar estudiando (T ambiente, agregar aditivo e incubar a 37 y seguido de Coombs). Recordar que es importante ensayar en las mismas fases en que el Ac fue detectado (test de screening).

LECTURA E INTERPRETACION: Una vez anotados adecuadamente los resultados se debe verificar primero ver si existen reacciones claramente negativas y otras claramente positivas y de una intensidad similar.

A continuacin ver si ese resultado se corresponde a algn patrn, entre los ms frecuentes est Anti-D que se observa en pacientes D (-), mujeres multparas Rh negativas, embarazadas que acaban de recibir la inmunoglobulina anti-D (inmunizacin pasiva). El modelo de reaccin se interpreta de acuerdo a las tablas de Ags del panel usado.

Para la interpretacin de los resultados se utiliza generalmente la eliminacin sistemtica de los anticuerpos correspondientes a antgenos de todas las clulas del panel que reaccionan negativamente, ya que todas las clulas que son aglutinadas son aquellas que poseen el Ag correspondiente.Una reaccin negativa indica:

a) Que el panel de GR no contiene el antgeno para el anticuerpo del suero en estudio

b) Que el mtodo utilizado no es el ms sensible.c) Que hay un error tcnico.

Se deben revisar las reacciones obtenidas con el panel y si todas las reacciones positivas se registran en clulas que presentan el antgeno y todas las reacciones negativas se registran con clulas que carecen del Ag, el anticuerpo ha sido identificado.

Despus de una identificacin tentativa se puede confirmar este resultado fenotipificando las clulas del paciente o embarazada en busca del correspondiente Ag, el cual debe estar ausente.

Es usualmente fcil reconocer la especificidad de un nico Ac observando las reacciones positivas y negativas.

Ejemplo: En un set lote RA 547; se estar en presencia de un anti Fya, ya que el suero reacciona solo en la fase de antiglobulina con las clulas 2, 3, 8, 9, 10 y 11. Los 6 tipos de clulas son Fya positivas.

Cuando el suero contiene dos o ms Acs la identificacin puede ser difcil.

En las personas Rh (-) anti D a menudo se acompaa por anti C, anti E, anti K, anti Fya, o anti P1.

El anti C raramente esta solo y comnmente se encuentra junto a anti D.

A veces existe mezcla: anti-Ce, anti-DC

En personas Rh.+ las combinaciones ms comunes son: anti E + anti K, anti K + anti Fya, anti c + anti K, anti E + anti c.

LA MEZCLA DE ANTICUERPOS SE SOSPECHA POR:

1. Modelo de reaccin no se ajusta a aquellos de un solo Ac.

2. Se pueden observar reacciones de fuerza variable con el pannel de clulas. 3. El suero reacciona con distintas clulas por diferentes medios y/o tcnicas.

4. Se observan aglutinaciones inexplicables cuando la especificidad de un solo Ac es confirmado enfrentando el suero contra clulas conocidas que carecen del Ag. Ej.: Cuando se sospecha de anti e y aglutina clulas e negativas.En tales casos es importante:1. Determinar Ags a las clulas autlogas para as eliminar Acs dirigidos a Ags presentes en ellas.

2. Examinar el fenotipo de las clulas que reaccionan no tratadas y no son reactivas en test de enzimas (efecto de enzimas).

3. Examinar el patrn de reaccin de cada fase: verificar si hay variacin en la fuerza de reaccin (intensidad).4. Ver si influy la cigocidad: observar si la reaccin con GR homocigotos es ms intensa. Efecto de dosis: Rh, Duffy, Kidd, MNS5. Resultado de la prueba autloga y test de Coombs directo.6. Recurrir a absorcin y elucin para separar mezclas de anticuerpos. 7. Descartar un error tcnico.

ANTICUERPOS CONTRA ANTIGENOS DE ALTA FRECUENCIA

Es de importancia tener en cuenta que pueden existir en el suero en estudio aloacs ocultos por Acs contra Ags de alta incidencia, situacin que debe ser aclarada. A continuacin una lista de algunos Ags de alta frecuencia, destacados con color rojo.Incluidos en sistemas de grupos sanguneos:MNS: U, Ena, ENKT, N, ENEP, ENEH, ENAV, ENDA, ENEV

Rh: Hro, Hr, hrs, Rh29, hrB, HrB, Rh39, Nou, Sec, Dav, MAR

Lutheran (LU): Lub, Lu3, Lu4, Lu5, Lu6, Lu7, Lu8; Lu11, Lu12, Lu13, Lu16, Lu17, Lu20, Lu21

Kell (KEL): k, Kpb, Ku, Jsb, K11, K12, K13, K14, K16, K18, K19, Km, K22, Tou, RAZ, KALT, KTIM, KYO

Duffy (FY): Fy3, Fy4, Fy5, Fy6

Kidd (JK):Jk3

Diego (DI): Dib, Wrb

Yt (YT): YtaXg (XG) :CD99

Scianna (SC):Sc1, Sc3, STAR, SCER, SCAN

Dombrock (DO):Gya, Hy, Joa

Colton (CO): Coa, Co3

Landsteiner-Wiener (LW):LWa, LWab

Chido-Rodgers (CH/RG): Ch1,Ch2, Ch3, Ch4, Ch5, Ch6

H: HKx (XK): Kx

Gerbich (GE): Ge2, Ge3, Ge4

Cromer (CROM): Cra, Tca, Dra, Esa, IFC, CROV, CRAM

Knops (KN): Kna, McCa, Sla, Yka, Sl3

Indian (IN):Inb, INFI, INJA

Ok (OK): Oka

John Milton Hagen (JMH): JMH,JMHK, JMHL, JMHG, JMHM

I(I): I

P1/Pk : PGill (GIL): GIL

Incluidos en Colecciones:

Cost: Csa

Er :Era

Vel: Vel, ABTI

Incluidos en la serie 901:

Lan, Ata, Jra, Emm, AnWj, Sda, Duclos, PEL, MAM

Identificacin final del Ac de alta incidencia

Prueba negativa frente a 2 clulas carentes del Ag de alta incidencia El fenotipo del paciente para el correspondiente Ag debe ser negativoPRUEBA AUTOLOGAEs muy til en estudios de identificacin, ser negativa cuando se encuentra presente solo un aloAc. En los pacientes con AHA toda la batera del panel resulta positiva, debindose recurrir a tcnicas que permitan estudiar el aloAc en presencia de autoAcs.Se debe tener cuidado en interpretarla en casos de pacientes recin transfundidos, pueden presentar un aloAc que reaccione con las clulas circulantes del donante, causando una aglutinacin falsa positiva, pudiendo ser interpretado el aloAc por autoanticuerpo.

MEDIOS UTILIZADOS:Existen varios medios que pueden ser agregados a la mezcla suero-clulas.

La albmina de bovino al 22% - 30% es un medio utilizado como potenciador para pruebas de screening e identificacin. Algunos Acs IgG (especialmente anti Rhesus) aglutinan mejor en presencia de este potenciador.

Las soluciones de bajo poder inico (Liss) pueden son empleadas rutinariamente en pruebas de identificacin de Acs. Liss permite acortar los tiempos de incubacin de 60 a 10 - 15 minutos, al facilitar la asociacin Ag-Ac.

EFECTO DE LAS ENZIMAS:

El uso de enzimas puede dar los siguientes efectos principales:

Puede perderse totalmente la actividad del Ag

Aumentar la reactividad del Ac Puede aumentarse la potencia de la reaccin Ag-Ac

Puede mantenerse inalterada.

Algunos Antgenos que se destruyen en presencia de enzimas son: Fya, Fy b, M-N-S-s y Xga, a veces K.Algunos Anticuerpos que aumentan su reactividad despus del tratamiento enzimtico son: Rhesus, Kidd, Lewis, I, P.

Los Acs fros aumentan su reactividad con el empleo de enzimas y muchos individuos tienen anticuerpos reactivos solo en tcnicas enzimticas y sin importancia clnica, por lo que no se recomienda efectuar paneles con tcnicas enzimticas.

IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS EN LA TT

Tras la identificacin del Ac deber elegirse para el paciente: hemates negativos para el antgeno correspondiente al anticuerpo inesperado o irregular, para lo cual es importante realizar:

FENOTIPIFICACION DEL DONANTE

PROBABILIDAD:Para que la especificidad de un Ac sea concluyente, se requiere que el suero en estudio sea probado frente a una cantidad suficiente de GR (al menos tres) que carezcan y tambin frente a una cantidad adecuada de hemates que presenten Ags relevantes o Ags de importancia clnica.

Este nmero mnimo de reacciones (3 con GR con el Ag y 3 sin el Ag) aseguran una probabilidad (p) de 1/20 de que la identidad del Ac sea la indicada.

La tabla siguiente muestra las probabilidades de identificacin de varias combinaciones de test reactivos y no reactivos calculados por el mtodo exacto de Fisher de estimacin de probabilidades.

PROBABILIDAD DE IDENTIFICACION DE COMBINACIONES DE TEST REACTIVOS Y NO REACTIVOS.

MUESTRAS PROCESADASREACTIVOSNO REACTIVOSp

6421/15

6331/20

7521/21

7431/35

8711/8

8621/28

8531/56

8441/70

9811/9

9721/36

9631/84

10911/10

10821/45

10731/120

10641/210

10551/252

Un valor de p de 1/20 (0.05) en un set idntico de resultado puede ser obtenido por 1 posibilidad en 20 estudios similares, esto indica que la interpretacin de datos es correcta. Por ejemplo: Si un suero aglutina 3 muestras de GR que son D + y no aglutinan 3 que son D(-), el p es 1/20, hay una probabilidad de 19 en 20 de que el Ac sea un anti D y 1 en 20 de que las reacciones se hayan dado por azar.

Un p de 1/20 (0.05) es el mnimo valor con el cual una interpretacin es considerada estadsticamente valida, se debe tener presente que muchos de los paneles de GR son limitados en su habilidad de dar resultados estadsticamente concluyentes en algunos Acs de grupo sanguneo, es importante recordar estas inevitables limitaciones cuando solo un panel de GR este disponible para usar; un valor de p menor de 1/20 se considera como con mayores probabilidades de que las reacciones obtenidas se deban al azar.

p de 1/20 o mayores se consideran satisfactorios para confirmar la identidad del anticuerpoCALCULO: Los niveles de probabilidad para la identificacin de anticuerpos se calculan construyendo tablas de 2x2 en las que la presencia y ausencia de reactividad srica se relaciona con la presencia o ausencia de un antgeno concreto en las muestras de hemates analizadas. Una tabla 2x2 se construye como sigue:CALCULO DE LAS PROBABILIDADES (p de la tabla)

Reacciones del SueroAg presenteAg ausente Total

POSITIVOABA + B

NEGATIVOCDC + D

TOTAL A+ CB+ D N

A: N de reacciones positivas observadas con el Ag + en los GR.

B: N de reacciones positivas observadas con el Ag (-) en los GR.

C: N de reacciones negativas observadas con el Ag + en los GR.

D: N de reacciones negativas observadas con el Ag (-) en los GR.

N: N total de muestras de GR procesadas.

La frmula para calcular la probabilidad (p) a partir de una tabla 2x2 es la siguiente:FORMULA (A+B)! x (C+D)! x (A+C) ! x (B+D)!

p =

N! x A! x B! x C! x D!

NOTA:

!: Smbolo de nmero factorial, que es el producto de todos los nmeros enteros desde 1 hasta el nmero en cuestin. Ej.: De nmero factorial (!)

6! = 6x5x4x3x2x1 = 7203! = 3x2x1 = 61! = 1

0! = 1EJEMPLO DE CLCULO:

Para un suero reactivo con 3 muestras de clulas E+ y no reactivo con 3 muestras E(-), la tabla 2x2 es: HEMATIES

REACCIONES

SERICAS Ag PRESENTE

E+ Ag AUSENTE

E(- )TOTAL

POSITIVO 3 0 3

NEGATIVO 0 3 3

TOTAL 3 3 6

p= 3! x 3! x 3! x 3! ____________________ = 36 = 1 = 0.05

6! x 3! x 0! x 0! x 3! 720 20

El ejemplo indica que hay una probabilidad de 1 en 20 de que un anticuerpo distinto de anti-E pudiera, haber ocasionado las reacciones observadas, debido al azar. Este nivel de probabilidad es el mnimo aceptable para la significacin estadstica. La prueba del suero frente a 10 muestras de hemates, 6 E (-) y 4 E+, mejora drsticamente el nivel de probabilidad para anti-E.CONSIDERACIONES A TOMAR EN CUENTA EN LA IDENTIFICACION DE ACS

1. Es de utilidad, como parte de la identificacin de un Ac, confirmar que los GR del paciente no presenten el Ag, al cual esta dirigido el Ac. Ejemplo: Si se sospecha de la presencia de un anti JKa en el suero de un paciente, sus GR debern ser tipificados y resultar JKa (-) (normalmente un individuo no forma Acs contra Ag presentes en sus propios glbulos rojos).

2. Se debe tener mximo cuidado al interpretar los resultados de las tipificaciones del fenotipo de pacientes con Test de Coombs positivos o de individuos recientemente transfundidos. En el primer caso solamente debe efectuarse la tipificacin del fenotipo despus de eluir las Igs que sensibilizan sus eritrocitos. En individuos recientemente transfundidos, las clulas del donante pueden tipificarse positivamente, a pesar de que el paciente carece del Ag respectivo. Puede mal interpretarse el resultado y dar un fenotipo errado al paciente. 3. Los Acs de tipo fro, a bajas temperaturas fijan Co a los GR. El Ac IgM aglutina y sensibiliza los eritrocitos con Co. Al incubar a 37, el Ac se disocia quedando los GR sensibilizados solamente con Co, el cual es visualizado en la fase de antiglobulina con antisuero poliespecfico. La intensidad de la reaccin generalmente es dbil y depender de la reactividad del Ag en los eritrocitos estudiados.

4. En algunas ocasiones el Ac fro se detecta solo en la fase antiglobulina, sin haber reaccionado en la fase de centrifugacin inmediata, pudindose en esta ocasin confundir con un Alo Ac de tipo caliente.

Para definir cul es el Ac que est reaccionando es de utilidad emplear un suero antiglobulina que carezca de anti-complemento. La reaccin con este reactivo ser positiva en el caso de que sea IgG la que esta sensibilizando los GR.

5. Debe recordarse que algunos AloAcs de tipo caliente que fijan Co y que tienen importancia clnica generalmente son de especificidad anti Kidd y otros anti Lewis que reaccionan a 37 C, pero son de escasa ocurrencia.

6. Antes de proceder a la identificacin de Acs inesperados debe conocerse del paciente: Grupo ABO

Tipificacin RhD Resultados del test de AI Sexo y edad

Antecedentes previos de test de identificacin realizados

Diagnstico

Historia transfusional y gestacionalPROBLEMAS EN LA IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS

Casos complejos se presentan cuando existen:

Sueros conteniendo Acs mltiples Anticuerpos contra antgenos de alta frecuencia Transfusin en AHAIGR raros son definidos como la unidad de componente sanguneo negativo para los antgenos de alta frecuencia y mezcla de antgenos mas comunes (AABB).

PARA LA SELECCIN DEL MEJOR METODO

Uso de metodologas sensibles: Deben ser tan buenas como el test de AGH con LISS (LISS-IAT) en el uso de rutina. (Gold Standard) Entregar resultados reproducibles Costo efectivas No detectar Acs sin importancia clnica (crioaglutininas) Para ser empleadas en tubo, Gel, Microplacas, molecular, etc.Automatizacin de procesos permite: Mejor utilizacin del tiempo, recursos humanos y econmicos Lectura objetivadaCuando se sospecha la presencia de un Ac, pero no puede ser demostrada, son tiles los siguientes procedimientos:

1) Tcnicas Enzimticas: Se recomienda realizarlas cuando no se usan rutinariamente; son tiles para detectar algunos anticuerpos (Rh, Kidd).

2) Reduccin de la Temperatura: muchos aloanticuerpos que reaccionan a T ambiente, reaccionan mejor a bajas temperaturas. Otros se hacen evidentes solo a 4 C.

3) Aumentar la relacin suero-clulas: A menudo aumenta la reactividad de Acs presentes en baja concentracin (5 a 10 volmenes de suero por 1 de glbulos rojos); se debe tener la precaucin de remover muy bien el suero antes de lavar para Coombs.

4) Aumentar el Tiempo de Incubacin: para algunos Acs en salino o albmina una incubacin de 15-30 minutos puede ser insuficiente y necesitarse una hora, lo que puede aumentar la reactividad y ayudar a clarificar el modelo de reaccin observado.

5) Alteracin del pH: La reactividad de algunos Acs como el anti H puede realzarse al disminuir el pH del medio a 6.5. Cuando se sospecha su presencia, un test con suero acidificado (1 vol de HC1 0,2 N a 9 volmenes de suero disminuye el pH a 6.5) puede mostrar un pattern de reactividad definitivo.

CONCLUSIONES (ISP 2014) NO EXISTE UN MTODO UNICO QUE SEA CAPAZ DE DETECTAR TODOS LOS ACS DE IMPORTANCIA. ELEGIRLO EN BASE A UN ANLISIS DE CALIDAD Y COSTO-BENEFICIO EN CADA INSTITUCION. MUCHA DEDICACION Y TRABAJO EDUCACION Y CAPACITACION DEL PERSONAL DEL SS Y DEL HOSPITAL Indicacin de la Transfusin Pesquisa, manejo y estudio de RPT Comit Hospitalario de Transfusiones

LECTURA DE LOS RESULTADOS

EMBED PowerPoint.Slide.8

_1256228940.ppt

Lote RA 547