Departamento de Farmacología

Departamento de Farmacología

Efecto de la tetrahidrobiopterina en la fibrosis

pulmonar inducida por bleomicina

TESIS DOCTORAL

Presentada por: Patricia Almudéver Folch

Dirigida por: Dr. D. Julio Cortijo Gimeno

Valencia, 2011

D. Julio Cortijo Gimeno, Catedrático de Universidad

adscrito al Departamento de Farmacología de la Universidad

de Valencia.

CERTIFICA:

Que Dña. Patricia Almudéver Folch, Licenciada en

Farmacia por la Universidad de Valencia, ha realizado bajo mi

dirección la presente Tesis titulada:

Efecto de la tetrahidrobiopterina en la fibrosis

pulmonar inducida por bleomicina

para la obtención del título de Doctor.

Y para que así conste a los efectos oportunos, firmo

la presente certificación.

Valencia, marzo de 2011.

Fdo. Julio Cortijo Gimeno

Mi más sincero agradecimiento a las siguientes personas:

Dr. Julio Cortijo Gimeno, por darme la oportunidad de incorporarme a su

grupo de investigación y por la confianza depositada en mi durante este

tiempo.

Dr. Manuel Mata Roig y Dr. Javier Milara Payá, por sus enseñanzas y

por su ayuda en todo momento.

Pedro Santamaría Ferrer, Dr. David Ivars Santacreu, y Dra. Lara Milián

Medina, por su soporte técnico, de gran utilidad para la confección de

este trabajo.

Dr. Alfredo de Diego Damiá, por su colaboración con la investigación

traslacional y con esta tesis en particular, a pesar de su trabajo

asistencial.

Dra. Teresa Garrigues Pelufo y Dr. José Esteban Peris Ribera, por

despertar mi interés por la investigación, porque trabajar con ellos fue

muy enriquecedor, y por su gran ayuda siempre que la he necesitado.

A mis compañeros de laboratorio, que sufren mi día a día y siempre

están dispuestos a colaborar: Pilar, Adela, Teresa, Javi, Kaya, Elena,

Amelia y Nicla; y a los que lo sufrieron en el pasado: Eva, Adrián,

Marco, Mariola, Begoña y Sonia.

A los investigadores de la Fundación de Investigación del Hospital

General de Valencia (FIHGV), a la Dra. María Dolores Miñana y a su

grupo: Amparo, Elena y Jordi. Al Dr. Rafael Sirera y la Dra. Eloisa

Jantus y su equipo “las oncogirls”: Sandra, Elena y Marta. A Sisco y a

Carmen del laboratorio de cardiovascular. También a mis compañeros

de administración y servicios de la FIHGV, en especial a Susi, Cristina,

Olivia, Enrique, José, Amparo y Patricia. Y a las bibliotecarias: Julia,

Pepa y Elvira. A todos ellos gracias por su ayuda y compañerismo.

A todos mis amigos, por su respeto hacia mi trabajo siempre.

A mi familia en general, y a mis padres en particular por su sacrificio y

confianza durante toda mi carrera.

A Jesús, por su apoyo incondicional, sin el cual este trabajo no habría

sido posible.

A mis padres

A mi familia

A Jesús

“Es justamente la posibilidad de descubrir, lo que hace

que la vida sea más interesante.”

Índice

9

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN ........................................................................... 13

1.1. Vías respiratorias .................................................................... 14

1.1.1. Histología ......................................................................... 17

1.1.2. Funciones pulmonares ..................................................... 20

1.2. Fibrosis pulmonar idiopática ................................................... 22

1.2.1. Patogenia ......................................................................... 25

1.2.2. Farmacología de la fibrosis pulmonar idiopática ............. 31

1.2.2.1. Corticoides ................................................................ 32

1.2.2.2. Agentes inmunomoduladores ................................... 33

1.2.2.3. Tratamientos alternativos .......................................... 34

1.2.3. Modelos experimentales .................................................. 41

1.3. Estrés oxidativo y fibrosis pulmonar idiopática. ...................... 47

1.4. Tetrahidrobiopterina y sepiapterina......................................... 51

2. OBJETIVOS ................................................................................... 57

3. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................... 61

3.1. Material .................................................................................... 62

3.1.1. Fármacos ensayados ....................................................... 62

3.1.2. Reactivos utilizados ......................................................... 67

3.1.3. Animales de experimentación .......................................... 69

3.1.4. Pacientes ......................................................................... 70

Índice

10

3.2. Métodos ................................................................................... 72

3.2.1. Modelo animal .................................................................. 72

3.2.2. Protocolo experimental .................................................... 74

3.2.3. Preparación y administración de fármacos ...................... 80

3.2.4. Extracción de muestras .................................................... 83

3.2.5. Ensayos de inflamación pulmonar ................................... 84

3.2.6. Histología ......................................................................... 88

3.2.7. Método analítico para la determinación de BH4 en

muestras biológicas ................................................................... 88

3.2.7.1. Validación del método analítico ................................ 93

3.2.8. Análisis de la expresión génica. RT-PCR ........................ 95

3.2.8.1. Extracción de ARN total ............................................ 95

3.2.8.2. Transcripción inversa (RT) ........................................ 96

3.2.8.3. RT-PCR a tiempo real ............................................... 99

3.2.9. Análisis estadístico de los resultados ............................ 106

4. RESULTADOS ............................................................................. 107

4.1. Validación del modelo murino de fibrosis pulmonar inducida

con bleomicina. ............................................................................ 108

4.2. Validación del método analítico para la determinación de BH4

en muestras biológicas. ............................................................... 113

4.3. Cuantificación de niveles sanguíneos y tisulares de

tetrahidrobiopterina en modelos experimentales de fibrosis (ratón

Índice

11

C57BL/6J, rata wistar) y en enfermos diagnosticados de fibrosis

pulmonar idiopática. ..................................................................... 116

4.4. Efecto farmacológico de la tetrahidrobiopterina (BH4) 20

mg/Kg/día via oral en ratón a día 7 y a día 14 de la inducción de

fibrosis pulmonar. ......................................................................... 119

4.4.1. Evolución del peso corporal ........................................... 119

4.4.2. Peso del pulmón, proteínas en pulmón e índice de

hipertrofia ventricular derecha.................................................. 120

4.4.3. Expresión génica ............................................................ 123

4.4.4. Determinación de la concentración de tetrahidrobiopterina

................................................................................................. 129

4.5. Efecto farmacológico de la sepiapterina 10 mg/Kg/día via oral

en la fibrosis pulmonar inducida con bleomicina en ratón a día 7 y a

día 14. .......................................................................................... 132





4.5.4. Determinación de la concentración de tetrahidrobiopterina.

................................................................................................. 142

4.5.5. Estudio farmacocinético de la sepiapterina vía oral……145

4.6. Efecto farmacológico de la BH4 5mg/Kg/día vía intratraqueal,

en la fibrosis pulmonar inducida con bleomicina en rata wistar a día

14.................................................................................................. 148


Índice

12

4.6.2. Peso de pulmón, proteínas en pulmón e índice de


4.6.3. Células extravasadas en lavado broncoalveolar. .......... 152

4.6.4. Concentración de proteínas en lavado broncoalveolar

(LBA). ....................................................................................... 154


4.6.6. Determinación de los niveles de BH4. ........................... 162

4.7. Efecto farmacológico del roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral en la

fibrosis pulmonar inducida con bleomicina. ................................. 164




4.7.3. Células extravasadas en lavado broncoalveolar (LBA). 168

4.7.4. Concentración de proteínas en lavado broncoalveolar

(LBA). ....................................................................................... 169


4.7.6. Determinación de los niveles de BH4. ........................... 177

4.8. Tabla resumen resultados ..................................................... 179

5. DISCUSIÓN.................................................................................. 181

6. CONCLUSIONES ......................................................................... 193

7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................ 197

8. ABREVIATURAS .......................................................................... 213

1. INTRODUCCIÓN

Introducción

14

1.1. Vías respiratorias

Los pulmones están ingeniosamente estructurados para

llevar a cabo su principal función, el intercambio de gases:

extraer oxígeno del aire para llevarlo a la sangre venosa y

eliminar anhídrido carbónico al exterior. Además filtran

materiales tóxicos para eliminarlos de la circulación,

metabolizan determinadas sustancias (medidores inflamatorios,

hormonas,…), son fuente de otros mediadores y citoquinas y

actúan como diana de hormonas circulantes o generadas

localmente. Es una de las principales interfases entre el

organismo y el medio exterior1.

El sistema respiratorio está formado por los pulmones y

las vías respiratorias.

El pulmón normal del adulto pesa entre 500 y 600

gramos. Anatómicamente los pulmones, con una superficie lisa

y brillante, comprenden varios lóbulos; el pulmón derecho tiene

tres lóbulos denominados superior, medio e inferior mientras

que el izquierdo cuenta sólo con dos lóbulos y la língula que

representa al lóbulo medio.

Las vías respiratorias están formadas por la boca, las

fosas nasales, la faringe, la laringe, la tráquea, los bronquios y

los bronquiolos (Figura 1).

Introducción

15

Figura 1. Vía aérea respiratoria.

Los bronquios principales derecho e izquierdo se originan

en la tráquea y posteriormente comienzan a dividirse dando

lugar cada vez a vías más pequeñas. En la tráquea y bronquios

principales, el cartílago tiene forma de placas en C, quedando

libre de cartílago la porción membranosa posterior. Sólo existe

músculo liso en esta porción membranosa. Sin embargo a

medida que el bronquio principal penetra en el pulmón, cambia

esta organización de manera que el cartílago forma placas

discontinuas y el músculo rodea toda la pared. La ramificación

progresiva va a dar lugar a los bronquiolos, que se diferencian

de los bronquios por la ausencia de cartílago y aparición de

glándulas submucosas en su pared. Los bronquiolos se

ramifican generando los denominados bronquiolos terminales,

Introducción

16

que miden menos de 2 mm de diámetro. En la parte terminal de

estos bronquiolos encontramos el acino o unidad respiratoria

terminal, con forma esférica y un diámetro de 7 mm. Estos

acinos contienen los alveolos, lugar donde se produce el

intercambio gaseoso. Un acino está formado por los

bronquiolos respiratorios (procedentes del bronquiolo terminal),

que se continúan con los conductos alveolares, e

inmediatamente se ramifican y desembocan en los sacos

alveolares cuyas paredes están formadas enteramente por

alvéolos, que constituyen los extremos ciegos de las vías

respiratorias (Figura 2).

Figura 2. Esquema de un acino.

Introducción

17

1.1.1. Histología

Desde el punto de vista microscópico, excepto las

cuerdas vocales que estan tapizadas por el epitelio escamoso,

todo el árbol respiratorio incluyendo la laringe, tráquea,

bronquios y bronquiolos, está tapizado por células epiteliales

pseudoestratificadas, columnares altas, ciliadas, muy

entremezcladas y con células caliciformes mucosecretoras. La

mucosa bronquial también presenta células neuroendocrinas2,

que contienen gránulos de neurosecreción: serotonina,

calcitonina y péptido liberador de gastrina (bombesina).

Dispersas por toda la pared de la tráquea y de los bronquios,

pero no de los bronquiolos, existen numerosas glándulas

submucosas mucosecretoras. La superficie bronquial está

recubierta por cilios que se rodean de una capa de agua y

proteínas, ricas en lisozima e inmunoglobulinas, pero al

contrario que los alvéolos no contiene surfactante pulmonar y a

diferencia de los bronquios no contiene moco. Cómo ya se ha

comentado, no hay células mucosas en las paredes de los

bronquiolos, en su lugar existen las células clara que segregan

una proteína de revestimiento pobre en moco.

Las paredes alveolares o septos alveolares no son

sólidas, sino que están perforadas por numerosos poros de

Khon, que permiten el paso de las bacterias y exudados entre

alvéolos adyacentes. Estas paredes alveolares están formadas

por:

Introducción

18

�� El endotelio capilar : los capilares pulmonares

tienen un diámetro muy pequeño (5 a 7 µm) y están

limitados por el endotelio que descansa sobre la

membrana basal. Las células endoteliales miden la

mitad de los neumocitos tipo I, presentan una región

perinuclear de 3 mm de espesor y largas

prolongaciones citoplásmicas enrolladas que forman la

pared misma de los capilares. Las células endoteliales

están unidas entre sí por uniones menos estrechas que

las de las células epiteliales (mácula occludens o spot

juntions), de una longitud de 40 nm; las membranas

celulares están separadas por un espacio de 10 a 15

nm pero permiten la existencia de varios

estrechamientos de sólo 4 nm (spot). Lo esencial de las

transferencias convectivas y de difusión del agua,

electrolitos y moléculas hidrosolubles de un PM<40.000

se lleva a cabo a través de estas uniones, pero la

transferencia de macromoléculas se ve limitada por su

escaso diámetro y por la existencia de un gel proteico y

mucopolisácarido cuyas mallas retienen las grandes

moléculas. Las células endoteliales son ricas en

filamentos y son susceptibles de contraerse bajo el

efecto de la histamina, serotonina y bradicinina,

aumentando la permeabilidad capilar al abrirse las

uniones.

Introducción

19

�� La membrana basal y el tejido intersticial

adyacente: separan las células endoteliales del

revestimiento epitelial alveolar. En estas porciones del

septo alveolar, se fusionan las membranas basales del

epitelio, mientras que en las porciones más gruesas,

están separadas por un espacio intersticial (el intersticio

pulmonar) que contiene fibras elásticas, pequeños

haces de colágeno, algunas células de tipo fibroblástico,

células musculares lisas, células cebadas, linfocitos y

unos pocos monocitos.

�� El epitelio alveolar: forma una capa continua con

dos tipos celulares, los neumocitos tipo I o neumocitos

membranosos, células aplanadas, que tapizan el 95%

de la superficie celular y alveolar y los neumocitos tipo II

o neumocitos granulares, que tienen microvellosidades

en su superficie, son de forma cuboidal y sintetizan y

secretan un fosfolípido denominado surfactante

pulmonar. Estas células tipo II son importantes ya que

es el principal tipo celular implicado en la reparación del

epitelio alveolar tras la destrucción de los neumocitos

tipo I.

Unidas de forma laxa a las células epiteliales se

encuentran los macrófagos alveolares, éstos derivan de los

monocitos de la sangre y pertenecen al sistema fagocítico

mononuclear.

Introducción

20

Junto al revestimiento epitelial alveolar existe una capa

de glicoproteínas sobre la cual se sitúa una fina película de

fosfolípidos, principalmente fosfatidilcolina (lecitina), que es el

surfactante pulmonar. Esta lecitina disminuye la tensión del

revestimiento y mantiene la estabilidad del alveolo. La mitad de

la adaptabilidad del pulmón se debe a esta fuerza de

disminución de la tensión superficial y no al tejido elástico. El

surfactante, producido en los neumocitos tipo II, resulta

esencial para mantener abierta la superficie respiratoria y

defenderla frente a la entrada de microorganismos a las células

epiteliales y a través de estas a los capilares sanguíneos y al

resto del organismo.

1.1.2. Funciones pulmonares

La principal función del sistema respiratorio es el

intercambio gaseoso, pero también existen otras funciones

pulmonares no respiratorias entre las que podemos incluir la

defensa frente a sustancias inhaladas, funciones relacionadas

con la circulación sanguínea y funciones metabólicas.

Cada día las vías respiratorias están expuestas a más

de 10.000 litros de aire contaminado con polvo, sustancias

químicas, y microorganismos nocivos. Sin embargo, el pulmón

normal es ésteril, gracias a la eficacia de los mecanismos de

filtrado y aclaramiento:

Introducción

21

� Aclaramiento nasal: en las regiones donde el

epitelio no es ciliado, las partículas se eliminan durante

el estornudo y con el moco nasal. En la parte posterior,

con epitelio ciliado, las partículas son barridas hacia la

nasofaringe y después deglutidas. La presencia de

epitelio pseudo-estratificado ciliar y las secreciones de

las células calciformes (moco) son los responsables del

aclaramiento. Cada célula ciliar del sistema de

conducción tiene alrededor de 250 cilios que producen

aproximadamente mil pulsaciones por minuto. De

manera que las partículas suspendidas en el aire de un

tamaño entre 3-10µm son atrapadas en este epitelio y

de aquí rápidamente eliminadas por el movimiento del

moco hacia la faringe, para ser finalmente deglutidas.

� Aclaramiento traqueobronquial: es la acción

mucociliar en este caso la que arrastra las partículas a

la orofaringe, donde serán deglutidas o expectoradas

como hemos visto anteriormente.

� Aclaramiento alveolar: las bacterias o partículas

sólidas depositadas en los alveolos son fagocitadas por

los macrófagos alveolares, que las eliminan por

digestión o por transporte a los bronquios respiratorios.

Si la sobrecarga de partículas es intensa y sobrepasa la

capacidad de transporte de los macrófagos, algunas

partículas pueden llegar a los ganglios linfáticos y a

Introducción

22

través del flujo sanguíneo llegar a cualquier parte del

organismo.

La actividad metabólica de los pulmones es muy

intensa, participan en los fenómenos de conversión y activación

de sustancias vasoactivas y en la producción, almacenamiento

y liberación de sustancias utilizadas localmente o en otras

partes del cuerpo. Muchas sustancias vasoactivas de la sangre

se inactivan, se alteran o son eliminadas al pasar por los

pulmones. Se cree que esta actividad metabólica se realiza en

el endotelio de los capilares pulmonares3.

1.2. Fibrosis pulmonar idiopática

Las enfermedades pulmonares intersticiales difusas son

un grupo de patologías que se caracterizan por la inflamación y

cicatrización de los alveolos y del intersticio. Se produce una

pérdida de las unidades funcionales alveolares y una reducción

en la transferencia de oxígeno a la sangre.

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI), también llamada

alveolitis fibrosante criptogénica, es la enfermedad pulmonar

intersticial de mayor incidencia y peor pronóstico. Es una forma

específica de neumonía intersticial fibrosante crónica, de origen

desconocido y limitada al pulmón, con la apariencia histológica

de neumonía intersticial usual en la biopsia de pulmón. Cursa

con la sintomatología inicial de insuficiencia respiratoria

causada por ejercicio y tos seca.3-6

Introducción

23

La FPI afecta a 5 millones de personas en todo el mundo

de edades comprendidas entre 40 y 75 años, siendo más

frecuente en hombres que en mujeres, con una incidencia de

10,7/100.000 y 7,4/100.000 y una prevalencia de 20,2/100.000

y 13,2/100.000 respectivamente7-9. Todavía no existe ningún

tratamiento eficaz para combatirla, siendo la supervivencia

media de 2,8 años10,11, similar a la de pacientes con cáncer de

pulmón3.

Actualmente, la clínica y el diagnóstico de la FPI está

bien consensuado y establecido, ya que a principios de este

siglo, el grupo multidisciplinario internacional de la American

Thoracic Society (ATS) y la European Respiratory Society

(ERS) redactaron un consenso donde se compilan los criterios

clínicos, radiológicos y anatomopatológicos que permiten el

diagnóstico de la FPI4,5. Los síntomas ya nombrados de disnea

y tos improductiva surgen de forma insidiosa y empeoran

progresivamente; en fases avanzadas aparece insuficiencia

respiratoria, hipertensión pulmonar y signos de cor pulmonale.

A la auscultación respiratoria destacan los estertores

crepitantes. En un 50% de los casos se puede observar

acropaquia en los dedos de las manos. La tomografía axial

computerizada (TACAR), con una sensibilidad diagnóstica del

90%6, permite observar, en más de la mitad de los casos,

imágenes características de neumonía intersticial usual12, es

decir, afectación de predominio basal y periférico caracterizada

por alteraciones reticulares, bronquiectasias de tracción y áreas

Introducción

24

en panal subpleural, con escaso o ausente vidrio deslustrado,

junto con disminución del volumen pulmonar. Las alteraciones

del lavado broncoalveolar (LBA) suelen consistir en neutrofilia

asociada o no a moderada eosinofilia. La linfocitosis no es una

característica de la FPI; cuando el porcentaje de linfocitos es

superior al 15% o el de eosinófilos mayor del 20%, deben

descartarse otros diagnósticos5.

Cuando los pacientes no cumplen estrictamente los

criterios clínico-radiológicos, la biopsia pulmonar a cielo abierto

sigue siendo necesaria, lo que ocurre en el 25-40% de casos.

Los hallazgos histológicos principales en la FPI, son daño

epitelial persistente, acumulo de fibroblastos/miofibroblastos, y

abundante depósito de colágeno con afectación predominante

subpleural, y en algunos casos discreta inflamación

intersticial13. Se denominan cambios en panal a las zonas

aéreas alargadas y quísticas con neumocitos tipo II anormales.

La heterogeneidad temporal, zonas modificadas alternando con

zonas de parénquima normal, es lo que la diferencia de otras

patologías intersticiales. La presencia de abundantes focos

fibroblasticos y miofibroblásticos se correlaciona con la

mortalidad en la FPI14,15, y se intenta unificar los criterios de su

cuantificación para su utilidad pronóstica16.

La evolución de la enfermedad es progresiva y cursa con

episodios de agudización que empeoran la situación clínica del

paciente. Los parámetros funcionales utilizados para evaluar el

pronóstico de la FPI, son la FVC (capacidad vital forzada) y la

Introducción

25

DLCO (capacidad de transferencia de CO) al diagnóstico y

evolución17-20. Otros estudios sugieren que la prueba de

marcha de seis minutos21 y los cambios tomográficos18 también

pueden ser útiles para valorar la evolución de la FPI.

1.2.1. Patogenia

Inicialmente se pensaba que la causa principal de la

fibrosis pulmonar era la inflamación alveolar crónica22,23. Esta

hipótesis quedó en entredicho tras observar clínicamente que

el grado de inflamación pulmonar no se correlacionaba con la

gravedad de la fibrosis y que el uso de fármacos

antiinflamatorios e inmunosupresores no modificaban la historia

natural de la enfermedad4,5,13. En su lugar, apareció una nueva

hipótesis que proponía que la FPI es consecuencia de una

lesión epitelial de causa desconocida seguida de un proceso

anormal de cicatrización, y que es independiente de la

inflamación inicial.

Durante la última década se han desarrollado diferentes

conceptos que nos aportan información para perfilar esa

hipótesis:

Introducción

26

1. Importancia de la membrana basal (MB) de la barrera

alveolo-capilar para conservar la arquitectura del pulmón

dañado.

La barrera alveolo-capilar es el área de intercambio de

gases en el pulmón y supone la superficie más grande del

pulmón que separa su interior del ambiente. Está compuesta

por células epiteliales alveolares tipo I, células endoteliales

capilares y sus membranas basales respectivas.

Aproximadamente a mitad de la barrera las dos membranas se

fusionan, y por el resto están separadas por una pequeña capa

de intersticio. Como ambos tipos celulares son aplanados, tiene

mucha superficie pero poco citoplasma, y la barrera está

compuesta básicamente por cuatro bicapas lipídicas, el mínimo

citoplasma posible y las MBs, con un espesor de 0,3µm.

Cuando se lesiona la barrera, se produce hemorragia y

extravasación de plasma al tejido pulmonar; la activación

plaquetaria y la desgranulación producen liberación de

mediadores lipídicos, citoquinas, y factores de crecimiento a la

matriz que generan la activación de células epiteliales,

endoteliales, fibroblastos/miofibroblastos y leucocitos. Cuando

la MB no está afectada y el estímulo de la lesión se elimina, se

produce una reparación normal y completa mediante los

procesos simultáneos de reabsorción de los depósitos en la

matriz extracelular, y de reepitelialización y reendotelización de

la barrera alveolo-capilar24,25. En cambio, en pacientes con FPI,

se producen las siguientes circunstancias25-31 (Figura 3).

Introducción

27

� Perdida de células endoteliales y epiteliales tipo I.

� Pérdida de la integridad de la membrana basal de la

barrera alveolo-capilar con colapso de las estructuras

alveolares y fusión de sus membranas basales.

� Proliferación de células epiteliales alveolares tipo II

y células endoteliales en una matriz extracelular

inapropiada, sin restablecimiento de la estructura

epitelial normal.

� Reclutamiento y proliferación de fibroblastos y

miofibroblatos con depósito de matriz extracelular

madura generándose el estado final de fibrosis alveolar.

Figura 3. Diagrama representativo de la respuesta fibrótica fisiológica y patológica tras lesión pulmonar.

Introducción

28

2. Fallo en la reepitelialización y reendotelización como

pérdida de la integridad de la membrana basal en la

neumonía intersticial asociada a fibrosis pulmonar conlleva

destrucción de la estructura pulmonar y fibrosis patológica.

El análisis estructural del tejido pulmonar de pacientes con

FPI demuestra que:

� Las células endoteliales y los neumocitos tipo I han

sufrido daños y se ha perdido la integridad de la barrera.

� Se produce depósito intralveolar de matriz con

acumulación de fibroblastos y miofibroblastos.

� Existe obstrucción y fibrosis alveolar; se produce el

denominado foco fibroblástico, con la consecuente

pérdida de la estructura y la función alveolar.

3. El Tgf-β (factor transformador del crecimiento beta) es

necesario pero no imprescindible para generar fibrosis

permanente.

Se ha demostrado que la sobreexpresión condicionada de

Tgf-β promueve la fibrosis peribronquial con extensión al

parénquima pulmonar en modelos animales y que si se

elimina el gen una vez instaurada la fibrosis, ésta desaparece

y se normaliza la estructura peribronquial y del parénquima

pulmonar32.

Introducción

29

4. Para que se produzca la fibrosis pulmonar, es necesaria la

exposición de manera persistente a agentes irritantes,

antígenos, o lesión.

Se produce inflamación crónica, lesión epitelial y endotelial

de la barrera alveolo-capilar con pérdida de la membrana

basal, colapso alveolar, activación de fibroblastos y

miofibroblastos y deposito de la matriz extracelular.

5. La transición epitelio-mesenquimal (EMT) y el fibrocito son

mecanismos celulares críticos en la regulación de la

fibrosis.

Los fibroblastos y los miofibroblastos juegan un papel

importante en el depósito de matriz extracelular en la fibrosis

pulmonar. Se ha observado que los fibrocitos circulantes son

células progenitoras mesenquimales que se extravasan al

foco de la lesión tisular, se diferencian a fibroblastos y

miofibroblastos, y contribuyen a la generación de matriz

extracelular durante la fibroproliferación31,33 (Figura 4). Se

cree que el daño tisular con presencia de Tgf-β, induce la

transición de células epiteliales tipo II o neumocitos tipo II a

estas células con fenotipo mesenquimal, fibroblastos y

miofibroblastos, que contribuyen a la fibroproliferación34-37.

Introducción

30

Figura 4. Posibles fuentes de fibroblastos pulmonares.

La EMT, evento crítico en la patogénesis de la fibrosis,

está inducida principalmente por Tgf-β, que es activado por

especies reactivas de oxígeno, y se ha visto atenuado por el

óxido nítrico (NO), el cual es un potente mediador de la

alveolización y del crecimiento pulmonar38,39. Las células

alveolares epiteliales producen NO por la acción de la enzima

óxido nítrico sintasa endotelial (NOS), principalmente por las

isoformas endotelial (eNOS) e inducible (iNOS). La

administración exógena de NO atenúa la acumulación de

matriz extracelular, aumenta el crecimiento pulmonar y

disminuye el número de miofibroblastos40.

Introducción

31

Otro desequilibrio observado en la alteración mesenquimal

de la FPI es la respuesta inmune Th1/Th2, en la que existe un

aumento en la síntesis de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 al activarse

las células Th2 (células T helper tipo 2)41. En los modelos

animales de fibrosis pulmonar donde se ha inhibido la

respuesta Th1 se observa un predominio en los productos

moleculares de la respuesta Th2 y mayor depósito de

colágeno.

1.2.2. Farmacología de la fibrosis pulmonar

idiopática

Actualmente no existe ningún tratamiento eficaz ni

específico aprobado por la EMA (Agencia Europea de

Medicamentos) o la FDA (Food and Drug Administration) para

la fibrosis pulmonar idiopática. Sí existe un tratamiento

específico aprobado recientemente en Japón42-44.

Como se ha comentado anteriormente, la teoría

patogénica inicial consideraba la FPI como consecuencia de

una agresión inicial no identificada que iniciaba el ciclo de una

inflamación crónica que se traducía en fibrosis. La presunción

de que la interrupción de la cascada inflamatoria antes de la

presencia de una lesión parenquimatosa irreversible podría

aliviar la fibrosis, propició que el tratamiento con

antiinflamatorios pareciera razonable. Tradicionalmente se han

usado corticosteroides, inmunosupresores o citotóxicos. No

Introducción

32

obstante, en la actualidad se ha aclarado que estas opciones

de tratamiento no confieren un beneficio demostrado y

producen efectos adversos potencialmente graves.

Hoy por hoy se están llevando a cabo 32 ensayos

clínicos en todo el mundo para la FPI con intervención

farmacológica45,46, y continúan aumentando los conocimientos

sobre la patogenia e historia natural de la enfermedad, que

condicionan las estrategias terapéuticas nuevas. Todo ello

hace pensar que nos encontramos en un momento decisivo en

el estudio y tratamiento de la FPI.

A continuación, se resumen las propiedades de los

tratamientos que se han utilizado hasta el momento como

opción terapéutica para la FPI. Desde los medicamentos más

convencionales como es el uso de corticoides y citotóxicos

hasta tratamientos más actuales.

1.2.2.1. Corticoides

A pesar de que los corticosteroides se han

considerado la base principal del tratamiento durante

décadas, no hay disponibles ensayos controlados que hayan

usado estos agentes solos para el tratamiento de la FPI. En

una revisión de estudios no controlados, los autores

revelaron que la mejora a corto plazo de la función pulmonar

no afectó a la supervivencia a los 3-5 años47 y el hecho de

que estos estudios sean anteriores al consenso de

Introducción

33

diagnóstico para las enfermedades intersticiales de la

ATS/ERS, no genera pruebas concluyentes que respalden

su uso para la FPI.

La terapia con corticoides produce reacciones

adversas significativas. Entre ellas, úlcera péptica, cataratas,

aumento de la presión ocular, hipertensión, alteraciones

metabólicas, complicaciones musculoesqueléticas,

osteoporosis y miopatías, así como efectos psicológicos tipo

depresión, euforia y psicosis. Por ello, la evaluación del

paciente durante y después del tratamiento es muy

importante.

El informe de consenso publicado por la ATS/ERS,

recomienda un tratamiento combinado con corticoides y

azatioprina o ciclofosfamida (inmunosupresores)4.

1.2.2.2. Agentes inmunomoduladores

La azatioprina y la ciclofosfamida son los fármacos

de segunda línea utilizados con más frecuencia,

habitualmente en combinación con corticosteroides. Apenas

se dispone de información de buena calidad relativa a la

eficacia de estos agentes en la FPI, y no se justifica el uso

sistemático de estos fármacos en el tratamiento de estos

procesos48.

Introducción

34

� Ciclofosfamida

Antineoplásico de tipo fosforamida, del grupo de

las mostazas nitrogenadas. Se absorbe por via oral

y en el hígado se activa por biotransformación a

varios compuestos citotóxicos que inhiben la

función linfocitaria3.

� Azatioprina

Es un análogo de purina que es convertido a

mercaptopurina en los tejidos del organismo. Este

inhibe la adenina desaminasa, que perjudica la

proliferación de células, sobre todo leucocitos y

linfocitos. Es menos tóxico que la ciclofosfamida.

No induce lesión en la vejiga y presenta discreto

potencial oncogénico discreto3.

1.2.2.3. Tratamientos alternativos

� INF-γ

Es una citoquina que regula la función de los

macrófagos e inhibe la fibrogénesis. Combinada con

un glucocorticoide mejora la estabilización de la

enfermedad en pacientes en estadios poco

avanzados de FPI49. En cambio, en pacientes más

graves no parece que beneficie ni mejore la

supervivencia50.

Introducción

35

� Antagonistas de la endotelina 1

La endotelina 1 ha mostrado ser una molécula

con fuertes efectos fibrogénicos, como la inducción

de proliferación de fibroblastos y su diferenciación a

miofibroblastos e incremento de la síntesis de

moléculas de la matriz extracelular. Se encuentra

incrementada en los pulmones de pacientes con FPI,

donde la expresan sobre todo las células del epitelio

alveolar. Experimentalmente se ha demostrado que

la inyección percutánea de un plásmido que expresa

endotelina en pulmones de rata induce cambios

fibróticos que se localizan específicamente en las

regiones donde se expresa este gen51,52. Asimismo,

ratones transgénicos que sobrexpresan la pre-

proendotelina 1 humana desarrollan fibrosis

pulmonar difusa y progresiva sin ninguna agresión

desencadenante53. Sobre la base de estos hallazgos

se ha intentado su bloqueo en modelos

experimentales y así se ha demostrado que la

administración oral de bosentán, un antagonista no

selectivo del receptor de la endotelina 1, protege

contra la fibrosis inducida por bleomicina en ratas54.

El bosentán se utiliza actualmente para el

tratamiento de la hipertensión arterial pulmonar y es

bien tolerado por esta población de pacientes55. Se

sugiere que el bosentan pueda mejorar la disnea y la

Introducción

36

calidad de vida56. Actualmente se están llevando a

cabo 5 ensayos clínicos que aportaran más

información en el futuro.

� Pirfenidona

Es un componente piridínico que en modelos

animales ha demostrado un amplio rango de efectos,

como son antifibrótico, antiinflamatorio y antioxidante;

sin embargo, su mecanismo de acción concreto se

desconoce. Tras varios ensayos clínicos de fase II y

III realizados en Japón, que concluían que la

pirfenidona podía disminuir la progresión de la

enfermedad, en 2008 se comercializó en el mercado

de Japón, siendo así el primer medicamento

aprobado para la FPI en un gran mercado50.

� N-acetilcisteína (NAC)

Es el derivado n-acetilado del aminoácido natural

cisteína. Reduce la viscosidad de las secreciones

bronquiales, favoreciendo su eliminación. Debido a la

presencia de un grupo tiólico libre, es capaz de

romper los puentes disulfuro que mantienen la

estructura tridimensional de las mucoproteínas, lo

que da lugar a la fluidificación de la secreción. Posee

propiedades antioxidantes, y como tal, previene del

daño celular epitelial mediado por radicales libres. La

n-acetilcisteína (NAC) aumenta la síntesis de

Introducción

37

glutatión, un potente mediador antioxidante tanto in

vitro como in vivo, y su administración por vía oral

disminuye la respuesta fibrótica en ratones

expuestos a bleomicina57-60. Estudios llevados a cabo

en humanos durante un año, concluyen que los

pacientes que toman NAC a dosis elevadas, sufren

menos deterioro en la DLCO y FCV61. Esto sumado a

la ausencia de efectos secundarios, hace que este

fármaco se esté añadiendo a la combinación

terapéutica convencional.

� Etanercep

Es un antagonista de los receptores solubles de

TNF (factor de necrosis tumoral), que se utiliza para

el tratamiento de la artritis reumatoide. El TNF es una

citocina multifuncional que parece tener algunas

actividades profibróticas3.

� Mesilato de imatinib

El imatinib es un inhibidor de la tirosincinasa c-

Abl, que también inhibe la activación del receptor del

factor de crecimiento derivado de las plaquetas,

(PDGF). Disminuye sustancialmente la fibrosis de la

médula ósea en seres humanos. Se han registrado 6

casos de neumonitis inducida por este fármaco, y

uno de ellos era en un paciente afectado de FPI62.

Introducción

38

� Anticoagulantes

Es una terapia en investigación. Se sabe que

durante los procesos alveolíticos o fibróticos se

produce trombosis. La anticoagulación combinada

con prednisolona parece tener efecto beneficioso en

la supervivencia de pacientes con FPI63.

� Relaxina

Es también una terapia en investigación. Se trata

de una hormona peptídica de la superfamilia de la

insulina, y está involucrada en el remodelado de la

matriz extracelular. Ha demostrado eficacia en

modelos animales de fibrosis: reduce el contenido de

colágeno y el espesor alveolar. Concretamente se ha

visto que reduce la expresión de colágeno tipo I y III,

y de fibronectina en el pulmón como respuesta a Tgf-

β (agente fibrogénico). Además inicia la degradación

de la matriz extracelular aumentando los niveles de

metaloproteinasas de matriz64.

� Trasplante pulmonar

Se debe considerar para aquellos pacientes que

presenten un progresivo deterioro a pesar del

tratamiento farmacológico, y siempre que cumplan

los criterios de inclusión para su realización.

Introducción

39

La escasa disponibilidad de órganos válidos para

el trasplante deriva de dos factores principales65-67: a)

la extraordinaria sensibilidad de los pulmones a la

infección y a la lesión producida por la ventilación

mecánica durante el período de ingreso en UCI, y b)

los donantes de órganos están desplazándose hacia

las bandas de mayor edad, por lo que queda excluida

la donación de pulmón en muchos casos. En 2005 la

media de edad de los donantes multiorgánicos en

España se situó en 51,4 años, frente a los 34,5 del

año 1992.

A la carencia de órganos disponibles hay que

sumar la mortalidad en lista de espera de trasplante

de pulmón (el 5,3% en 2006) y la restrictiva entrada

de candidatos.

En la mayoría de los casos se realiza trasplante

unipulmonar. La supervivencia a los 5 años después

del trasplante es del 50-60%.

Probablemente la terapia efectiva pase por la

combinación de varios de estos fármacos

antifibróticos y de otros en estudio, actuando a

diferentes niveles del proceso fibrogénico pulmonar.

Se ha sugerido que el recambio del epitelio alveolar

dañado por células sanas de la misma estirpe, podría

ser un tratamiento eficaz en la FPI. Estos estudios

con utilización de células madre todavía deben

Introducción

40

resolver algunos problemas básicos pero esenciales,

como son el número total de células necesarias,

rechazo inmunológico, vía de administración

adecuada, y el control de su diferenciación una vez

llegado al tejido pulmonar68, por lo que sigue siendo

una opción a largo plazo. No obstante, es importante

recalcar que los últimos resultados en este sentido

con experimentación animal son bastante

satisfactorios69.

Introducción

41

1.2.3. Modelos experimentales

En los últimos años, los modelos experimentales de

fibrosis pulmonar han aportado información muy relevante

sobre su fisiopatología, lo que ha permitido avanzar en el

conocimiento de su evolución. Además son una herramienta

indispensable para evaluar la seguridad y acción de nuevos

fármacos antifibróticos (Figura 5).

Figura 5. Investigación traslacional: los estudios experimentales son una herramienta indispensable para la investigación básica de las enfermedades respiratorias.

• Modelos experimentales in vitro

Los modelos experimentales in vitro comprenden

una amplia serie de métodos cuyo objetivo es evaluar

una respuesta celular o molecular determinada. Los

Introducción

42

estudios morfológicos aportan información relevante

sobre el desarrollo y la progresión de la fibrosis. Sin

embargo, estos modelos sólo permiten evaluar la

expresión de una determinada molécula y comparar sus

características respecto al tejido sano. Para evaluar si

estos hallazgos tienen una implicación activa en el

proceso fibrótico y determinar su papel, es

indispensable trabajar con modelos que permitan la

funcionalidad del tejido o la actividad de las células que

intervienen. Suelen utilizarse explantes de tejido

pulmonar o cultivos de células inflamatorias y

mesenquimales, obtenidas de modelos animales y de

pacientes con fibrosis pulmonar.

• Modelos experimentales in vivo

Se utilizan modelos animales en la investigación de

los mecanismos fibrogénicos por las similitudes

estructurales, bioquímicas y moleculares entre la

reacción fibrótica en humanos y animales.

La experimentación animal es el único

procedimiento que permite valorar en tiempo real el

efecto de las interacciones genéticas, bioquímicas y

medioambientales que provocan fibrosis pulmonar.

Estos modelos se utilizan para investigar un amplio

abanico de eventos:

Introducción

43

� El control de la muerte celular fisiológica

(apoptosis) tanto del epitelio alveolar como de

fibroblastos y miofibroblastos.

� Síntesis, mecanismo de acción y regulación de

mediadores fibrogénicos o antifibrogénicos.

Dependiendo del mecanismo que se desea

estudiar, se puede utilizar tanto la manipulación

génica como la inducción externa del proceso

fibrótico.

� Ensayo de nuevos fármacos antifibróticos o

intervenciones que frenen la fibrogenia.

No hay ningún modelo animal que reproduzca

exactamente todos los aspectos de la fibrosis pulmonar

en humanos70. Por este motivo la utilidad y elección del

modelo animal a utilizar estarán condicionadas por las

características del evento fibrótico determinado que se

quiere estudiar, las hipótesis y los objetivos de la

investigación, así como las consideraciones logísticas

experimentales de las que se dispone71.

El animal de experimentación más utilizado es el

ratón (Mus musculus) debido a que presenta ventajas

sobre otras especies; entre las más importantes:

genoma bien caracterizado, ciclo de reproducción corto,

camadas grandes, tamaño pequeño, fácil manipulación

y menor coste. No obstante, se ha estudiado un amplio

Introducción

44

grupo de animales. Los métodos convencionales para

inducir reacciones pulmonares fibróticas incluyen la

instilación directa de agentes fibrogénicos y la

exposición a irradiación torácica 72-74.

AGENTE INDUCTOR ESPECIE ANIMAL UTILIZADA

Bleomicina Ratón, rata, hámster, conejo, perro, mono, faisán

Amiodarona Ratón, rata, hámster

Partículas inorgánicas (sílice,

asbesto) Ratón, rata, hámster, conejo, cabra

Irradiación Ratón, rata, hámster, conejo, perro, mono, cabra

Isocianato de fluoresceína Ratón

Pentóxido de vanadio Ratón, rata

Antígenos apténicos (trinitrobenceno) Ratón, hámster

Cobalto inhalado Rata

Tabla 1. Modelos animales de fibrosis pulmonar

Entre los agentes fibrogénicos, el más utilizado es

la bleomicina, un potente agente antineoplásico que

actúa mediante un efecto oxidante, escindiendo el ADN

Introducción

45

y aumentando los mediadores fibrogénicos. Se puede

administrar de forma intratraqueal, intraperitoneal o

intravenosa, y raramente por vía intramuscular o

subcutánea. Las primeras observaciones del efecto

profibrótico de este agente antineoplásico fueron en

perros75. Posteriormente se estandarizó la instilación

intratraqueal en dosis única en ratas y ratones, hasta

determinar la dosis requerida para provocar cambios

pulmonares fibróticos uniformes, muy similares a los

observados en la FPI76,77.

Las lesiones inducidas por este agente incluyen

inflamación parcheada y variable, lesión epitelial con

hiperplasia reactiva y apoptosis, alteración de la

membrana basal, fibrosis de distribución heterogénea

(intraalveolar, subpleural o bronquiolocéntrica), así

como focos de células mesenquimales en forma de

huso de apariencia similar a los focos de miofibroblastos

observados en la neumonía intersticial usual78.

En los últimos años el modelo de bleomicina se ha

utilizado para:

a) Estudiar los mecanismos de acción de factores

de crecimiento y de diversas citocinas, así como el

efecto terapéutico de su inhibición54,59,79-83.

b) Valorar la modulación transgénica en la

respuesta fibrótica e identificar posibles loci

Introducción

46

reguladores en la predisposición genética a la

fibrosis pulmonar80,84

c) Estudiar la alteración celular epitelial,

fibroblástica y de la matriz extracelular85-87.

Aunque el modelo de bleomicina instilada es

fácilmente reproducible, cabe recordar que es un modelo

de lesión de rápida instauración y duración determinada.

Para estudiar eventos iniciales, donde predomina la

inflamación, se toman muestras de los animales entre el

tercer y el séptimo día. Por el contrario, si lo que se

pretende es estudiar la fase fibrótica de la lesión, lo

ideal es que los animales se evalúen las semanas 2 y 3,

dado que el daño provocado revierte espontáneamente

a partir de la tercera semana77. Los modelos de

administración continua de bleomicina que se han

ensayado hasta la actualidad no acaban de reproducir

con exactitud la cronicidad de la fibrosis pulmonar88.

La inducción de fibrosis con amiodarona es otro

modelo bien estandarizado en rata, ratón y hámster. Se

utiliza para el estudio de su toxicidad y administrada por

vía endotraqueal y oral se ha observado que el efecto

profibrótico deriva tanto de este compuesto como de su

metabolito, la desetilamiodarona89-91.

La inhalación de partículas como el asbesto o sílice

induce lesiones pulmonares similares en humanos y

roedores: provoca fibrosis de forma progresiva,

Introducción

47

acompañada de reacción inflamatoria granulomatosa.

Estos modelos son especialmente útiles para el estudio

de macrófagos y otros fagocitos92,93.

Otros elementos pueden inducir fibrosis en

animales, como la inhalación de cobalto y cloruro de

cadmio, paraquat o diquat vía sistémica, isocianatos y

nitrosoureas, o pentóxido de vanadio, aunque su uso

para el estudio de este proceso no ha sido

estandarizado. La irradiación como inductor de fibrosis

es también un sistema muy utilizado. Las dosis

empleadas son variables y los efectos fibróticos pueden

persistir varios meses tras la radiación94-96. El

inconveniente principal es el equipamiento, que

comporta la necesidad de grandes espacios, así como

una rigurosa utilización y mantenimiento del sistema.

1.3. Estrés oxidativo y fibrosis pulmonar

idiopática.

La clínica y el diagnóstico de la FPI está bien

consensuado y establecido4,5. Por el contrario, se desconocen

las causas precisas que la provocan, pero se sabe que la

lesión pulmonar y la depósito excesivo de tejido fibrótico tienen

un papel clave en la patogénesis de la enfermedad.

Introducción

48

Las especies reactivas de oxígeno (ERO) desempeñan

un papel fisiológico en el organismo, pero pueden dar lugar a

reacciones de oxidación indeseadas contra las cuales los

organismos han tenido que desarrollar defensas

antioxidantes97. Como respuesta a la lesión tisular se desarrolla

la inflamación cuyo objetivo es la destrucción y eliminación de

los agentes nocivos y la reparación del tejido. Cuando esta

respuesta ocurre de una manera incontrolada se produce un

daño tisular excesivo que resulta en inflamación crónica y

destrucción del tejido normal.

El estrés oxidativo se define como una alteración del

equilibrio entre las especies prooxidantes y las antioxidantes

provocándose un daño en las moléculas por la acción de estas

ERO. Así pues, el estrés oxidativo puede originarse por un

exceso de sustancias prooxidantes, una deficiencia de agentes

antioxidantes, o por ambas a la vez. Las ERO, como el anión

superóxido (02-), son liberados por los fagocitos reclutados en

los sitios de inflamación y son una de las principales causas de

daño celular y tisular.

Las células pulmonares, en particular las epiteliales tipo

II, son susceptibles de ser lesionadas por agentes oxidantes.

Se ha visto que estas células, como respuesta al estrés

oxidativo, son capaces de liberar mediadores inflamatorios

como TNF-α, IL-1 e IL-8. La liberación de estos mediadores

provoca el reclutamiento de neutrófilos y la activación de

factores de transcripción como el factor nuclear kβ (NF-kβ) y el

Introducción

49

activador de proteína-1 (AP-1), provocándose el aumento de la

respuesta inflamatoria y del daño tisular. Esta respuesta

inflamatoria, tanto alveolar como bronquial es fundamental en

la patogénesis de diferentes enfermedades pulmonares como

el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC),

el síndrome de distrés respiratorio del adulto (SDRA) y la FPI.

Las características específicas de esta respuesta inflamatoria

difieren de unas enfermedades a otras, pero todas ellas están

caracterizadas por el reclutamiento y activación de células

inflamatorias en el pulmón provocando un desequilibrio entre

las especies oxidantes y antioxidantes. Existe una notable y

profunda relación entre los procesos de daño oxidativo en el

pulmón y la patología asociada a la fibrosis pulmonar.

En la fibrosis pulmonar hay un incremento de especies

oxidantes debido al acúmulo de células inflamatorias

incluyendo macrófagos alveolares activados y neutrófilos que

dan lugar a una gran generación de ERO97,98. Se ha

demostrado la presencia de niveles menores de glutation, de

hasta cuatro veces, en el LBA y fluido epitelial de pacientes con

fibrosis pulmonar respecto al de individuos sanos. También en

la fibrogénesis por BL, se ha destacado claramente el papel de

la generación de ERO. Las radicales libres de oxígeno son

altamente reactivos y cuando se generan cerca de las células

de la membrana deplecionan el glutation reducido (GSH)

intracelular produciendo fenómenos de peroxidación lipídica y

generando una reacción en cadena. De esta manera un radical

Introducción

50

hidroxilo (OH-) puede formar varias moléculas de hidroperóxido

lipídico en las células de la membrana que modifican

severamente su función y pueden llevar a la muerte celular o

dañar el DNA en las células alveolares epiteliales. Las ERO en

las enfermedades inflamatorias también pueden actuar sobre

ciertos aminoácidos como la metionina, la tirosina y la cisteína,

alterando su función98.

El tracto respiratorio humano, como se ha descrito

anteriormente, comprende desde las cavidades nasal y oral

hasta los alvéolos pulmonares, lo que supone una importante

superficie que está directamente expuesta al ambiente externo.

La atmósfera es de naturaleza oxidante. A ello contribuyen

sustancias presentes en el aire como ozono (03), óxido de

nitrógeno o agentes contaminantes como el humo del tabaco.

Además se asocian los mecanismos oxidantes del sistema

inmune que se activan ante la presencia de cualquier tipo de

microorganismo que pasa de la atmósfera al sistema

respiratorio. De manera que este sistema está expuesto de

forma continua a situaciones de desequilibrio entre las

especies oxidantes y las reductoras a favor de las primeras.

Introducción

51

1.4. Tetrahidrobiopterina y sepiapterina

La tetrahidrobiopterina (BH4) es un coenzima no proteico,

con estructura de imina heterocíclica. Fue descubierta por

Seymour Kaufman99 en 1963 como cofactor de la conversión

de fenilalanina a tirosina.

Se sintetiza en el citoplasma de las células animales por

la vía de recuperación de purinas y por la vía de síntesis de

novo. La enzima que cataliza el primer paso de la síntesis de

novo de BH4 es la guanosina trifosfato ciclohidrolasa I (GTPCH

I)100. La piruvoil tetrahidropterina sintasa (PTPS) y la

sepiapterina reductasa (SR) son dos enzimas adicionales

necesarias para la producción final de BH4 (figura 6). La BH4

se oxida a BH2 y en la vía de recuperación, puede

reconvertirse en BH4 por la actividad de la dihidrofolato

reductasa (DHFR).

Figura 6. Biosíntesis de BH4 por las vías de síntesis de novo y recuperación. La neopterina es un producto directo y estable de la síntesis de BH4 que puede servir como indicador de la actividad de GTPCH.

Introducción

52

La BH4 es altamente inestable, a temperatura ambiente y

en solución es fácilmente oxidable, termolábil, fotosensible y

posee baja permeabilidad en membranas celulares. Puede

reaccionar con oxígeno molecular, anión superóxido, peróxido

de hidrógeno y peroxinitrito101,102. Por ello, se ha sugerido que

la BH4 protege las células contra el daño oxidativo102. La

velocidad de oxidación de la BH4 en solución depende de

diversos factores, incluyendo el pH, la temperatura, la fuerza

iónica y la concentración de reactantes.

La oxidación de la BH4 en primer lugar genera quininido-

BH2 (qBH2), el cual tautomeriza rápidamente a su forma más

estable BH2 ó productos de pterina que han perdido su cadena

lateral dependiendo de las condiciones de reacción.

Las pteridinas son cofactores ampliamente distribuidos en

las células de mamíferos103,104 y en formas de vida inferiores99

donde generalmente funcionan como co-sustratos o moléculas

reguladoras alostéricas. La tetrahidrobiopterina en concreto es

cofactor de varias enzimas: fenilalanina hidroxilasa, triptófano

hidroxilasa, tirosina hidroxilasa y óxido nítrico sintasa (NOS) en

sus 3 isoformas. En este último caso, actúa modificando la

estructua de la NOS virando su grupo hemo férrico a un estado

de spín más alto. Así, a nivel del endotelio (eNOS) se

desencadena un aumento de la unión a la l-arginina y se

estabiliza la forma dimérica activa de la enzima. Si la

disponibilidad de BH4 es baja, se produce un desacoplamiento

de NOS, y se inhibe la producción de óxido nítrico (NO) al

Introducción

53

mismo tiempo que se producen especies reactivas de oxígeno

(ROS), como son: anión superóxido (O2-), peróxido de

hidrogeno (H2O2) y anión peróxinitrito (ONOO-) (Figura 7).

La tetrahidrobiopterina endógena es esencial para varios

procesos biológicos tales como el metabolismo, la función

cerebral, la respuesta inmune, la proliferación celular y la

homeostasis vascular.

Durante la última década, numerosos estudios han

demostrado que la inactivación química de BH4 por estrés

oxidativo causa desacoplamiento de eNOS y disfunción

endotelial105.

La BH4 además es un medicamento (Kuvan®),

desarrollado sintéticamente (sapropterina o dihidrocloruro de

tetrahidrobiopterina) y comercializado por BioMarin

Pharmaceutical Inc. En 2007 fue aprobado y declarado por la

FDA (Food and Drug Administration) y la EMA (Agencia

Europea del Medicamento) como medicamento huérfano, con

la indicación terapéutica única de hiperfenilalaninemias (PKU).

Un defecto en la síntesis y/o regeneración de

tetrahidrobiopterina causa fenilcetonuria tipo IV y deficiencia de

neurotransmisores (dopamina y serotonina). La elevación

prolongada de los niveles de fenilalanina en sangre, en

pacientes con fenilcetonuria, puede causar graves daños

neurológicos, incluyendo el retraso mental grave, microcefalia,

retraso del habla, convulsiones y alteraciones del

comportamiento.

Introducción

54

Figura 7. Representación esquemática del desacoplam iento de la óxido nítrico sintasa endotelial. En condiciones fisiológicas (arriba), la BH4 se une al dominio oxidasa de la NOS, esta se activa y a partir de l-arginina y O2 genera NO y citrulina. El NO difunde rápidamente a la célula muscular subyacente para producir relajación mediante el aumento de los niveles de cGMP. En condiciones patológicas (abajo) la bioactividad de la BH4 está disminuida y la NOS genera NO y también anión superóxido (O2

-). Se forma peróxido de hidrógeno (H2O2) a partir de O2-, y peroxinitrito

(ONOO-) a partir de O2- y NO. En estas condiciones la suplementación con BH4

restablece la actividad inicial de la NOS y aumenta la producción de NO.

Introducción

55

El desarrollo de análogos de BH4 con biodisponibilidad

oral, mejora el acceso al espacio intracelular, la duración de la

acción y la potencia, facilitando el éxito terapeútico.

Recientemente hay disponibles dos nuevos análogos, 6-acetil-

7,7-dimetil-5,6,7,8-tetrahidropterin (ADDP) y el 6-hidroximetil

pterin (HMP), que son componentes más estables, capaces de

difundir a través de membranas celulares y de mejorar la

actividad de la NOS106.

La suplementación con BH4 mejora la disfunción

endotelial en varias condiciones como hipercolesterolemia,

diabetes, hipertensión, enfermedad arterial coronaria y fallo

cardíaco. También mejora la función endotelial en fumadores y

en sujetos de edad avanzada103. La concentración plasmática

de BH4 aumenta con la administración oral103.

La administración de BH4 reduce significativamente los

niveles plasmáticos de 8-F2 isoprostano, marcador de estrés

oxidativo107.

Las citoquinas proinflamatorias, como el factor de

necrosis tumoral alfa (TNF-α), el interferón gamma (INF- γ) y la

interleuquina-1 (IL-1β), son potentes estimuladores de la

expresión y de la actividad de la GTPCH-I en el endotelio

humano, aumentando la síntesis de BH4. De modo paralelo,

las citoquinas antiinflamatorias, como IL-4, IL-10 y Tgf-β,

disminuyen la síntesis de BH4 en células endoteliales102.

En células endoteliales humanas cultivadas y en

animales de experimentación, la disponibilidad de BH4 se ve

Introducción

56

aumentada por otros fármacos, como el ácido ascórbico, las

estatinas, el enalapril, el captopril, el telmisartan, el eplerenone,

el cilostazol, la insulina y la eritropoyetina, ya que estimulan la

síntesis de BH4 o le protegen de su oxidación103.

Se desconoce si el incremento de BH4 plasmático

aumenta la concentración en el endotelio. De hecho, en

pacientes con aterosclerosis coronaria, niveles elevados de

BH4 en plasma se asocian con niveles disminuidos en el

endotelio108. Se ha demostrado que en algunos tipos celulares,

incluido las células endoteliales, la BH4 no difunde

libremente109.

La sepiapterina, precursor de la BH4, ha demostrado que

aumenta los niveles de BH4 in vitro e in vivo109, mejora la

función endotelial y reduce la producción de superóxido110.

2. OBJETIVOS

Objetivos

58

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI), cómo se ha

comentado en el capítulo de introducción, es la enfermedad

pulmonar intersticial de peor pronóstico, ya que no existe

ningún tratamiento específico. Últimamente se apuesta por el

uso de antioxidantes, que evitan la producción de especies

reactivas de óxigeno (ERO). Dentro de esta línea de

investigación, este trabajo propone una nueva estrategia

antioxidante, mediante el mecanismo de acoplamiento de la

enzima óxido nitrico sintasa endotelial (eNOS) que produce

óxido nítrico (NO) y cuyo cofactor esencial es la

tetrahidrobiopterina (BH4).

El déficit de BH4 provoca un desacoplamiento de la

eNOS, con disminución de la síntesis de NO y mayor

producción de ERO. Esto genera estrés oxidativo y disfunción

endotelial, que podría afectar a nivel de los capilares

alveoloares, con pérdida de función alveolar y reducción de la

transferencia de oxígeno a la sangre. En consecuencia,

empeora el proceso fibrótico.

Para estudiar el papel que desempeña la BH4 en la

fibrosis pulmonar, el primer requisito fue establecer un modelo

animal que nos permitiera la generación del proceso fibrótico

del modo más similar a la patogénesis humana. El modelo

seleccionado para el estudio fue la administración intratraqueal

de bleomicina en murinos, descrito como el principal agente

fibrótico en modelos experimentales, tal como se ha explicado

en el capítulo de introducción.

Objetivos

59

Como segundo propósito se planteó la puesta a punto de

la técnica para el análisis de BH4 en muestras biológicas

mediante cromatografía líquida de alta resolución.

Con las técnicas animales e instrumentales establecidas

se pretendieron los siguientes objetivos:

1. Estudiar de forma comparativa los niveles fisiólogicos

y patológicos de BH4 en rata, ratón y humanos, con el

fin de proponer la BH4 como biomarcador de fibrosis

pulmonar.

2. Estudiar el efecto farmacológico de la BH4 vía oral, en

la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratón.

3. Estudiar el efecto farmacológico de la sepiapterina vía

oral, en la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en

ratón.

4. Estudiar el efecto farmacológico de la BH4 vía

intratraqueal, en la fibrosis pulmonar inducida por

bleomicina en rata.

5. Estudiar el efecto farmacológico del roflumilast y su

eficacia en recuperar los niveles de BH4.

3. MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y métodos

62

3.1. Material

3.1.1. Fármacos ensayados

Los fármacos utilizados para la realización de este

trabajo de investigación han sido: la bleomicina, como agente

inductor de fibrosis pulmonar, y la tetrahidrobiopterina, la

sepiapterina y el roflumilast, que se ensayan como fármacos

antifibróticos.

La bleomicina pertenece al grupo de antibióticos dentro

de los agentes quimioterápicos, y se utiliza en el tratamiento

inicial de linfomas, tumores testiculares y carcinomas de células

escamosas. Fue identificada por primera vez por Umezawa y

cois en 1966111 mientras investigaban nuevos antibióticos

antitumorales. Se obtiene de la fermentación de Streptomyces

veticilis. Es un glucopéptido citotóxico con un peso molecular

de 1415.55 g/mol .

Su acción antineoplásica se debe a la inducción de la

muerte de células tumorales, y a la inhibición de la

angiogénesis. La bleomicina tiene un efecto sobre el ion ferroso

(Fe+2) que se une al DNA. Existen dos lugares funcionales, el

dominio de unión al DNA y el dominio de unión al metal. La

unión del complejo bleomicina-Fe+2 reduce el oxígeno

molecular (O2) del medio ambiente. Se crean radicales libres de

O2 que romperán el DNA por el C4' de la desoxirribosa.


63

Produce un síndrome de toxicidad pulmonar

caracterizado por fibrosis pulmonar en un 10% de los casos 111.

La toxicidad se relaciona con la dosis acumulativa.

Figura 8: Estructura molecular de la bleomicina.


64

La tetrahidrobiopterina, BH4; 6R-BH4; Sapropterina;

Dadropterina; (6R-L-erythro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin), es un

miembro de la familia de las pterinas, con una estructura

química central de anillos pirimidínicos102. Es muy higroscópica

y reacciona fácilmente con el oxígeno, especialmente en

soluciones neutras y alcalinas.

Tal como se explica en el apartado 1.4 de la

introducción, está comercializada como Kuvan® e indicado

para hiperfenilalaninenemias. En este trabajo se estudian sus

efectos como antifibrótico.

Figura 9: Estructura molecular de la tetrahidrobiopterina (BH4).


65

La sepiapterina (SP), S(-)-2-Amino-7,8-dihydro-6-(2-

hydroxy-1-oxopropyl)-4(1H)-pteridinone, es un precursor

intracelular de la tetrahidrobiopterina109. Es higroscópica,

sensible a la luz y poco soluble en agua (0.17 g por 100 g de

agua a 22°C). Reacciona con el oxígeno, especialmen te en

solución. En este trabajo se estudian sus efectos como

antifibrótico.

Figura 10: Estructura molecular de la sepiapterina.


66

El roflumilast, con un peso molecular de 403.207 g/mol,

es un inhibidor selectivo de la fosfodiesterasa 4 (PDE4). Ha

sido recientemente aprobado por la EMA para el tratamiento de

la EPOC y se ha comercializado con el nombre de Daxas®.

En ensayos in vivo ha demostrado efecto antifibrótico en

el modelo animal de fibrosis pulmonar inducida con

bleomicina112 tanto en el modelo preventivo como en el modelo

terapéutico.

Figura 11: Estructura molecular del roflumilast.


67

3.1.2. Reactivos utilizados

� Acetonitrilo. Sharlab. Ref. AC03712500.

� Ácido ascórbico. Sigma. Ref. A5960.

� Ácido clorhídrico. Panreac. Ref.131029.

� Ácido Fosfórico. Fluka. Ref. 79626.

� Ácido tricloroacético (cloroformo). Panreac.

Ref. 151067.

� Agua Dietilpirocarbonato (DEPC). Applied

Byosistems. Ref. AM9906.

� Biopterina. Fluka. Ref. 14390.

� Bleomicina sulfato 15UI (Sol. Inyectable).

Merck. C.N:656759.

� Cóctel inhibidor de proteasa. Sigma. P8340.

� DTE (1,4-Dithioerythritol). Sigma. Ref. D9680.

� EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). Sigma.

Ref. ED2SC.

� EGTA (ácido etilenglicol tetraacético). Sigma.

Ref. E3889.

� Eosina amarillenta. Panreac. Ref. 251299.

� Etanol absoluto. Panreac. Ref. 361086.

� Formol 10%. Panreac. Ref. 143091.


68

� Fosfato potásico dibásico anhidro. Fluka. Ref.

17835.

� Glicerol. Sigma. Ref. G7403.

� Glicógeno . Calbiochem. Ref. 361507.

� Hematoxilina de Harris. Panreac. Ref. 253949.

� HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazino

etanosulfónico). Sigma, Ref. H4034.

� Hidróxido de sodio. Panreac. Ref. 131687

� Ioduro potásico. Fluka. Ref. 57660.

� Isoflorano. Esteve veterinaria.

� Isopropranol. Sigma. Ref. I9516.

� Kit BCA para cuantificación de proteínas.

Pierce. Ref. 23227

� Kit de tinción panóptica . Panreac. Ref.

254807.0922.

� Metanol. Sharlab. Ref. ME03262500

� Methocel. Fluka. Ref. 64632.

� Nonidet P 40. Sigma. Ref. 74385.

� Parafina. Panreac. Ref. PPPLUS

� Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma.

Ref. P7626.

� Polietilenglicol 400. Panreac. Ref. 162436.


69

� Rhamnopterin. Fluka. Ref. 83644

� Sepiapterina. Schircks. Ref. 11225.

� Sondas TaqMan ® para ensayos de expresión

génica. Applied Biosystems. Las referencias de

cada sonda estan indicadas en las tablas 3 y 4 del

apartado 3.2.8.

� Tampón salino fosfato (PBS). Sigma. Ref.

P4417.

� Tetrahidrobiopterina. Schircks. Ref. 11212.

� Trizol. Roche Diagnostics. Ref. 11667157001.

� Xileno. Merck. Ref. 481769.

� Yodo. Fluka. Ref. 57660.

3.1.3. Animales de experimentación

Los procedimientos realizados fueron previamente

aprobados por el Comité de Ética y Bienestar Animal de la

Comisión de Ética de la Universidad de Valencia y por el

Comité Ético para la Experimentación Animal (CEEA) de la

Fundación de Investigación del Hospital General de Valencia.

Se emplearon ratones macho C57B1/6J (Charles

River®) de 9 semanas de edad y de un peso aproximado de

entre 18-23 g, y ratas macho Wistar (Harlan Iberica®) de 10-12

semanas de edad de peso alrededor de 250 g. Los animales


70

permanecieron en el estabulario desde siete días antes del

inicio del experimento (periodo de aclimatación) hasta el final

del estudio con comida (dieta Harlan® Ref. 2014) y agua ad

libitum. Se repartieron de forma aleatoria en jaulas y estas a su

vez en grupos experimentales distintos. Para realizar un

seguimiento individualizado de cada animal, se identificó al

animal mediante rayas pintadas en la cola. Las condiciones

estándar del animalario fueron:

� Humedad relativa 55 ± 10%.

� Temperatura 22 ± 3ºC.

� Renovación del aire a 15 ciclos por hora.

� Ciclo luz/oscuridad 12/12 horas.

3.1.4. Pacientes

El estudio se realizó en colaboración con el Servicio de

Neumología del Hospital Universitario La Fe de Valencia.

Se incluyeron seis individuos control, dos hombres y

cuatro mujeres de entre 28 y 65 años de edad y catorce

pacientes de ambos sexos, siete hombres y siete mujeres, de

edades comprendidas entre 45 y 90 años, que acudían a su

visita médica de control por afección de fibrosis pulmonar

idiopática (FPI).


71

La FPI se diagnosticó por la clínica que presentaba el

paciente, por radiología, mediante tomografía axial

computerizada (TAC), y en los casos que fue posible, por

biopsia transbronquial.

A los pacientes y a los voluntarios sanos que aceptaron

la participación en el estudio, tras cumplimentar correctamente

el consentimiento informado, se les realizó una extracción de 3

ml de sangre en un tubo con EDTA-K2 que contenía

ditioeritritiol (DTE) al 0,1%.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de

Investigación Clínica (CEIC) del Hospital Universitario La Fe de

Valencia y se redactó de acuerdo con la Declaración de

Helsinki.


72

3.2. Métodos

3.2.1. Modelo animal

La fibrosis pulmonar en ratón se indujo mediante

traqueotomía, realizando una pequeña incisión para retirar la

piel y dejar al descubierto una porción de la tráquea donde se

instiló un volumen de 50 µl de solución salina de sulfato de

bleomicina (BL), en dosis única de 3,75 UI/Kg (Figura 12). Se

utilizaron jeringas estériles de insulina (BD Micro-Fine + 0,33

mm (29 G) x 12,7 mm). Tras la administración se cosió por

capas la incisión de forma aséptica.

La fibrosis pulmonar en rata se provocó mediante

intubación intratraqueal. Se administraron 220 µl de solución

salina de sulfato de bleomicina (BL), en dosis única de 7,5

UI/Kg. Los animales del grupo control recibieron el mismo

volumen de solución salina libre de bleomicina (Figura 12).

La inducción de fibrosis en este trabajo de investigación

se realizó siempre el día 1 del experimento, coincidiendo con el

inicio del tratamiento farmacológico (modelo preventivo)112. El

tratamiento se administró diariamente hasta el día 7 o hasta el

día 14, según el grupo experimental.


73

A.

B.

Figura 12. Imágenes de las formas de administración de bleomicina utilizadas para inducir fibrosis pulmonar. En ratón C57B1/6J (A), mediante traqueotomia y administración intratraqueal de 3.75 UI/Kg de bleomicina, y en rata wistar (B), mediante intubación y administración intratraqueal de 7.5 UI/Kg de bleomicina.


74

3.2.2. Protocolo experimental

Este trabajo de investigación se dividió en 5 estudios. El

estudio 1, como se detalla a continuación, es una comparativa

entre especies, en el cual se incluye un ensayo preliminar en

humanos. Los estudios 2 y 3 se llevaron a cabo en ratón

C57B1/6J, mientras que los estudios 4 y 5 se realizaron en rata

Wistar.

El número inicial de animales en cada grupo fue

superior a 10 para disminuir la variabilidad interindividual

intraespecie, y porque el modelo animal de fibrosis con

bleomicina ofrece aproximadamente un 75 % de supervivencia

para los grupos afectados de fibrosis pulmonar. En cualquier

caso, los grupos cuyo n final fue menor de cinco se

desestimaron. Los animales se pesaron de forma periódica

durante todos los experimento. Los grupos control se

sometieron al mismo procedimiento experimental, pero se les

administró suero salino en todos los casos. A continuación se

detallan los grupos experimentales realizados en cada estudio.


75

�� Determinación de los niveles de

tetrahidrobiopterina en modelos experimentales de

fibrosis pulmonar (ratón C57B1/6J , rata wistar) y en

pacientes diagnosticados de fibrosis pulmonar

idiopática.

Para el estudio se requiere un grupo control sano y

un grupo con fibrosis pulmonar de cada especie.

En el caso de los pacientes, se realizó un estudio

preliminar que consistió en una comparación simple de

los niveles de tetrahidrobiopterina en voluntarios sanos

(n=6) y en pacientes diagnosticados de fibrosis

pulmonar idiopática (n=14).

En el caso de los animales de experimentación, se

estudio la evolución temporal de los niveles de BH4 en

plasma, pulmón e hígado, a día 7, 14, y en el caso de

los ratones a día 21, desde la inducción de fibrosis

pulmonar con bleomicina tal como se representa a

continuación.


76

�� Efecto farmacológico de la tetrahidrobiopterina

(BH4) 20 mg/Kg/día via oral en ratón a día 7 y a dí a

14 de la inducción de fibrosis pulmonar.

Se estudiaron cuatro grupos experimentales:

(i) Salino i.t + vehículo v.o (n=12).

(ii) Bleomicina i.t + vehículo v.o (n=24).

(iii) Salino i.t + BH4 20 mg/Kg/día (n=24).

(iv) Bleomicina i.t + BH4 20 mg/Kg/día (n=24).

Los grupos experimentales (ii), (iii) y (iv), a su vez,

se dividieron en dos grupos de 12 animales cada uno, el

primer grupo se sacrificó a día 7 desde la inducción de

fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina y el otro a día 14.


77

�� Efecto farmacológico de la sepiapterina 10

mg/Kg/día via oral en la fibrosis pulmonar inducida

con bleomicina en ratón a día 7 y a día 14.

Se estudiaron cuatro grupos experimentales:

(i) Salino i.t + vehículo v.o (n=12).

(ii) Bleomicina i.t + vehículo v.o (n=24).

(iii) Salino i.t + sepiapterina 10 mg/Kg/día (n=24).

(iv) Bleomicina i.t + sepiapterina 10 mg/Kg/día (n=24).

Los grupos experimentales (ii), (iii) y (iv), a su vez,

se dividieron en dos grupos de 12 animales cada uno, el

primer grupo se sacrificó a día 7 y el otro a día 14.


78

�� Efecto farmacológico de la BH4 5mg/Kg/día via

intratraqueal, en la fibrosis pulmonar inducida con

bleomicina en rata wistar a día 14.

Para llevar a cabo este estudio se emplearon ratas

wistar, ya que facilitan la canulación intratraqueal diaria

necesaria para la administración del tratamiento con el

MicroSprayer.

En este estudio todos los grupos experimentales se

llevaron a catorce días como punto final.

(i) Salino i.t + vehículo i.t (n=10).

(ii) Bleomicina i.t + vehículo i.t (n=10).

(iii) Salino i.t + BH4 5 mg/Kg/día i.t (n=10).

(iv) Bleomicina i.t + BH4 5 mg/Kg/día i.t (n=10).


79

�� Efecto farmacológico del roflumilast 1mg/Kg/día

via oral, en la fibrosis pulmonar inducida con

bleomicina en rata wistar a día 14.

Para llevar a cabo este estudio se emplearon ratas

wistar, ya que se pretendió comparar los resultados con

aquellos obtenidos en el estudio 4.

En este estudio todos los grupos experimentales se

llevaron a catorce días como punto final.

(i) Salino i.t + vehículo i.t (n=10).

(ii) Bleomicina i.t + vehículo i.t (n=10).

(iii) Salino i.t + roflumilast 1 mg/Kg/día v.o (n=10).

(iv) Bleomicina i.t + roflumilast 1 mg/Kg/día v.o (n=10).


80

3.2.3. Preparación y administración de fármacos

� Bleomicina: se preparó en solución con suero

fisiológico y se administró por vía intratraqueal.

� Tetrahidrobiopterina (BH4): para la administración

oral se preparó en solución acuosa con ácido

ascórbico al 0,05% en el momento de la

administración debido a que es muy sensible al

oxígeno. Para la administración intratraqueal, la

BH4 se preparó en tampón bicarbonato, que

asegura que el pH no sea excesivamente bajo y

como consecuencia tóxico para el pulmón. Un pH

de 4,5 - 5 se consideró adecuado.

� Sepiapterina (SP): se prepara en suspensión con

methocel al 0,4 %, ácido ascórbico al 0,05 % y

protegido de la luz. La formulación se somete a

ultrasonidos y se administra vía oral agitándose

inmediatamente antes de administrar.

� Roflumilast: se preparó en suspensión con Tween

20, methocel al 0,4% y se sometió a ultrasonidos

hasta completa homogenización. Se administró

por via oral, agitándose inmediatamente antes de

administrar.


81

La administración oral diaria de medicamento en ratón

se realizó con cánula intraesofágica.

Debido a la dificultad que supone la canulación

intratraqueal diaria, para los ensayos que conllevaron

administración intrapulmonar se eligió la especie murina de

mayor tamaño.

La forma tecnológica del MicroSprayer® garantiza que

el fármaco alcance las vías respiratorias por completo. Para la

administración diaria, cada rata se anestesió por via inhalatoria

con isoflorano; tras cerciorarse de que el animal ha perdido los

reflejos, se colocó sobre una superficie con una inclinación de

45º, y con ayuda de una luz fría externa a la altura del cuello se

llevó a cabo la intubación intratraqueal. Una vez canulada, al

catéter de 18G utilizado se le acopló una llave de 3 pasos y se

procedió a administrar el fármaco correspondiente. Se utilizó el

MicroSprayer® que consiste en una jeringa de presión dotada

de una aguja que posee en la punta un atomizador en

miniatura. Éste permite la nebulización del fármaco para que

alcance todas las vías respiratorias (Figura 13). Dicha jeringa

se acopló a la llave de 3 pasos a la que también se conecta

una jeringa cargada con aire. Primero se insuflaron 2.9 ml de

aire, a continuación se nebulizaron 200 µl del fármaco y por

último se inyectaron 1.3 ml más de aire para facilitar el arrastre

del producto (Figura 14). Se mantuvo la cánula hasta que la

rata recuperó los reflejos, ya que en caso de parada


82

respiratoria, la cánula facilita la maniobra de reanimación (VPP,

ventilación con presión positiva).

Figura 13. Imágenes del dispositivo MicroSprayer para administración de fármacos por vía intratraqueal. De izquierda a derecha: jeringa y aguja; spray generado; radiografía a los 30 segundos de la administración de un fármaco marcado.

Figura 14. En la primera imagen se observa la cámara de inhalación con el depósito de isoflorano al fondo, y la posición en la que se debe colocar a la rata para la correcta canulación, con una la inclinación de 45ºC. En la segunda imagen se muestra la rata canulada intratraquealmente, con la llave de tres pasos acoplada al catéter.


83

3.2.4. Extracción de muestras

Los animales se sacrificaron después de 20-24 horas de

la última dosis del periodo de experimento con una inyección

letal intraperitoneal de pentobarbital sódico (200 mg/kg). Se

realizó la extracción de sangre de la vena cava inferior,

aproximadamente 0,3 ml en el caso de ratones y 5 ml en el

caso de ratas. La sangre se recogió en tubos protegidos de la

luz y preparados con anticoagulante y una concentración final

de 0,1% de DTE para evitar la oxidación de la

tetrahidrobiopterina. Las muestras se mantuvieron a 4ºC, para

la posterior separación del plasma (2.000 g, 20 min). El plasma

se almacenó a -80ºC hasta el día del análisis. A continuación

se tomó una alícuota de tejido hepático que se sumergió en

nitrógeno líquido inmediatamente, y después se conservó a -

80ºC hasta el día del análisis. Tanto las muestras de plasma

como las de hígado se utilizaron para medir niveles de BH4.

Se llevó a cabo una toracotomía para extraer el corazón

y los pulmones. El corazón se dejó en suero para vaciarlo y

posteriormente se separó el ventrículo derecho (VD) del resto

del corazón. Se pesaron ambos ventrículos por separado para

obtener la relación VD/VI+septo cómo índice de hipertrofia

ventricular derecha. Los pulmones y la tráquea se extrajeron en

bloque y se pesó el conjunto; a continuación se separó el

pulmón derecho atando la tráquea; éste se dividió en tres

alicuotas en viales de 2 ml que se ultracongelaron con

nitrógeno líquido inmediatamente, para posteriormente ser


84

almacenadas a -80ºC hasta el día del análisis de BH4, de

expresión génica y de proteínas. El pulmón izquierdo se

sometió a un doble lavado broncoalveolar. Se tomo una

muestra del mismo para hacer ensayos de recuento y

diferenciación celular y otra se almacenó para la cuantificación

de proteínas totales extravasadas a la luz alveolar. Para el

estudio histológico se seleccionaron dos animales de cada

grupo, a los que, en lugar de lavado broncoalveolar se les

perfundió el pulmón izquierdo con una solución fijadora de

formaldehído al 10% a una presión de 25-30 cm de agua. La

pieza se conservó suspendida en la misma solución fijadora,

evitando el contacto con las paredes del envase.

3.2.5. Ensayos de inflamación pulmonar

Para determinar la respuesta inflamatoria pulmonar que

genera la bleomicina se procedió al recuento de células totales

extravasadas, y a la caracterización de las distintas

poblaciones celulares.

�� Recuento de células totales en el lavado

broncoalveolar (LBA) de rata.

Se lavaron ambos pulmones por duplicado con 5 ml

de suero fisiológico. De los 10 ml de lavado

broncoalveolar se separó una alícuota para la


85

diferenciación celular y el resto se centrifugó durante 20

minutos a 1200 rpm para separar las células

sanguíneas. El pellet con las células se resuspendió en

1 ml de suero fisiológico. Para el recuento de células

totales se utilizó un hemocitómetro (Nihon Kohden,

Celltac Mek 5105 k) (Figura 15).

Figura 15. Imágenes del proceso de lavado broncoalveolar de un pulmón de

rata wistar y del hemocitómetro utilizado para el contaje de células totales.

�� Diferenciación celular

Se tomó una alícuota de LBA bien homogeinizado

para fijar las células sobre un portaobjetos, utilizando

una citocentrífuga (Shandon Cytospin 4, Thermo

Electron Corporation) durante 5 minutos a 500 rpm. Se

realizó una tinción panóptica (Panreac) de las células

fijadas para cuantificar el porcentaje de cada tipo celular

mediante microscopia óptica (Eclipse E200, Nikon).


86

�� Proteínas totales en LBA

El contenido total de proteínas se obtuvo en el

sobrenadante del LBA mediante el kit del método del

ácido bicincónico (BCA). Este sistema de cuantificación

de proteínas combina la reacción de Biuret por proteína

en un medio alcalino. La reacción de Biuret se basa en

la adición de un reactivo alcalino al Cu+2 que reacciona

con enlaces peptídicos de las proteínas reduciéndose a

Cu+1. El BCA es un compuesto capaz de formar en un

entorno alcalino un complejo púrpura con el ión Cu+1. El

color producido por esta reacción es estable y aumenta

de manera proporcional al aumento de la concentración

de proteínas. Este complejo púrpura se detecta entre

540-590 nm. Las concentraciones de proteína son

referidas a estándares de proteína común como es la

albúmina sérica bovina (ASB) con la que se elabora la

recta patrón del ensayo.

�� Proteínas totales en pulmón: extracción y

cuantificación.

Se pesaron 25 mg de tejido pulmonar congelado a -

80ºC, al que se le añadió 1 ml de tampón de lisis con la

siguiente composición:

• 20 mM HEPES

• 400 mM NaCl


87

• 1 mM EDTA

• 1 mM EGTA

• 2,75 M de glicerol (25,3%)

• 61,6 % de agua, calidad MilliQ®

• 2 µM PMSF

• 12 µL de coctel inhibidor de proteasas

Se lisó el tejido en el sistema Tissuelyser II

(Qiagen®) a una frecuencia de 30 s-1 durante 2 min. A

continuación se centrifugó a 10.000 rpm durante 20 min.

El sobrenadante se sometió a tres ciclos de

congelación-descongelación con N2 líquido y con

agitación a 37 ºC, respectivamente. A continuación se le

adicionó NP40 al 1% y durante 15 minutos se mantuvo

en hielo con agitación énergica cada 5 minutos.

Finalmente se centrifugó a 10.000 rpm durante 20

minutos a 4ºC y se recogió el sobrenadante para

determinar la concentración de proteína total mediante

el método de BCA detallado anteriormente (apartado

3.10).


88

3.2.6. Histología

De la muestra fijada con formaldehido e incluida en

parafina se obtuvieron cortes seriados de 5 µm de grosor con

un microtomo tipo Minot (Leica® RM 2135) para tinción con

hematoxilina-eosina e identificación al microscopio de las

estructuras pulmonares anormales y patológicas, como pueden

ser masas de colágeno en el intersticio pulmonar y celularidad

aumentada. Se tomaron fotos con una cámara (Leica® DFC

350FX) incorporada al microscopio (Leica® CTR6000).

3.2.7. Método analítico para la determinación de

BH4 en muestras biológicas

Se desarrolló un método analítico para plasma y para

tejidos, que utiliza la cromatografía líquida de alta resolución

(HPLC), con detección por fluorescencia113-115.

El fundamento del método consiste en que la biopterina,

cuantificable por ser fluorescente, representa la suma de BH4,

7,8-dihidrobiopterina (BH2) y la biopterina completamente

oxidada. Una oxidación diferencial con iodina permite medir

ambas, biopterina total y BH4. Bajo condiciones ácidas, BH4 y

BH2 se oxidan a biopterina, mientras que bajo condiciones

alcalinas, sólo BH2 se oxida a biopterina, y BH4 se degrada a

otra pterina distinta. Por tanto, la diferencia en la cantidad de

biopterina entre ambas oxidaciones representa el nivels de

BH4.


89

oxidación oxidación

BiopterinaNaOH /I2

7,8-DBHCl / I2

Biopterina

BiopterinaNaOH /I2

BiopterinaHCl / I2

Biopterina

PterinaNaOH /I2

BH4HCl / I2

Biopterina

�� Procesado de las muestras

Las muestras de sangre se recogieron en tubos con

presencia de anticoagulante y antioxidante. Se utilizó

EDTA-K2 como anticoagulante y ditioeritritiol (DTE)

0,1% como antioxidante. El plasma se puede congelar a

-80ºC durante varios meses. De de cada muestra se

obtuvieron tres alicuotas (A, B y C), que se procesaron

de la siguiente manera113:

A) Reacción ácida : 90 µl muestra + 10 µl de patrón

interno + 20 µl HCl 1M + 50 µl de solución de iodina

(1 % (p/v) I2 + 2 % (p/v) IK) + agitar + incubar (1h a

Tª ambiente en oscuridad) + 10 µl ác. ascórbico 5

% (p/v) + 20 µl H2OMQ. Diluir 1/5.

Al valorar esta muestra se obtiene la biopterina

total, que corresponde a la suma de las tres

especies: 7,8-DB + BH4 + biopterina.


90

B) Reacción alcalina : 90 µl muestra + 10 µl de

patrón interno + 20 µl NaOH 1M + 50 µl de solución

de iodina (1 % (p/v) I2 + 2 % (p/v) IK) + agitar +

incubar (1h a Tª ambiente en oscuridad) + 10µl ác.

ascórbico 5 % (p/v) + 20 µl HCl 2M. Diluir 1/5.

Al valorar esta muestra se obtiene la 7,8-DB y la

biopterina oxidada.

C) Sin reacción : 90 µl muestra + 10 µl de patrón

interno + 100 µl de H2OMQ.

Las muestras de tejido pulmonar y hepático se

recogieron en tubos de 2ml, e inmediatamente se

sumergieron en nitrógeno líquido. Se mantuvieron a -

80ºC hasta el día del análisis. La extracción se realizó

pesando 0,05 g de pulmón (o hígado) en 1mL de una

solución acuosa de ácido fosfórico 0,1N con 0,1% de

ditioeritritiol (DTE). El tejido se lisó en el sistema

Tissuelyser II (Qiagen). durante 2 min. a una frecuencia

de 30 s-1. El homogenizado se centrifugó a 10.000 rpm

durante 20 min a 4ºC. Se tomaron 3 alícuaotas del

sobrenadante que se procesaron de la misma forma que

el plasma, a excepción de que en el caso de tejido, la

cantidad de I2/IK necesaria para que se dé la reacción

alcalina es tres veces superior a la ácida114. En este

caso no es necesario diluir la muestra.


91

Antes de inyectar la muestra en el cromatógrafo es

necesario desproteinizar. En este caso se realizó por

ultrafiltración, para lo cual se centrifuga a 3000g, 60 min

y 10 ºC con un filtro de 10.000 MW (Multiscreen®

Millipore), que deja pasar moléculas de PM<10.000. Las

muestras plasmáticas se diluyen 1/5 para evitar la

saturación del filtro.

�� Equipo de cromatografía líquida

El equipo de cromatografía líquida de alta

resolución (HPLC) está compuesto de cuatro módulos:

bomba isocrática Shimadzu LC-10ADvp, inyector

automático Shimadzu SIL-10ADvp, detector de

fluorescencia Shimadzu RF10Avp y controlador

Shimadzu SCL-10Avp que integra todos los módulos

con el programa informático Shimadzu LCMSolutions.


92

Figura 16. Equipo de cromatografía líquida de alta resolución (Shimadzu).

�� Fase móvil y estacionaria

La fase móvil utilizada fue una mezcla de tampón

fosfato K2HPO4 1,5 mmol/L ajustado a pH 4,6, y metanol

(calidad HPLC, Scharlau) en proporción 92:8 (V/V).

Como fase estacionaria se empleó una columna Waters

Sherisorb® 5 µm (4,6 x 250mm).

�� Condiciones de análisis

Se tomaron 10 µl de cada muestra como volumen

de inyección. El flujo seleccionado fue de 1 ml/min, la

longitud de onda de excitación fue 350nm, mientras que


93

la de emisión fue 450nm, ya que fueron éstas las que

generaron la máxima intensidad de señal en la fase

móvil seleccionada. El análisis se realizó a temperatura

ambiente y las muestras se mantuvieron a 10ºC. El

tiempo de retención de la biopterina en estas

condiciones es de 8 minutos aproximadamente113.

Mientras que el tiempo de retención de la

rhamnopterina, compuesto utilizado como patrón interno

fue de 6 minutos aproximadamente.

Los valores de concentración de las distintas

muestras se obtienen mediante interpolación en una

curva de calibración construida a partir de una solución

patrón de biopterina en agua. Se utilizaron siete

diluciones de 1, 5, 10, 25, 50, 75 y 100 ng/ml.

3.2.7.1. Validación del método analítico

Las áreas obtenidas en los cromatogramas se

representaron frente a las concentraciones y se ajustaron

linealmente por mínimos cuadrados, según la siguiente

ecuación:

y = b·x + a

donde y es el área del pico de biopterina que

proporciona el cromatograma, x la concentración, b la

pendiente de la recta y a la ordenada en el origen. Para los


94

cálculos matemáticos se utilizó el programa

GraphPadPrism5®.

La linealidad se ha expresado mediante el coeficiente

de correlación (r2) de cada recta, que representa la

dependencia lineal entre áreas y concentraciones.

La sensibilidad se puede definir como “la capacidad

para distinguir (análisis cuantitativo) pequeñas variaciones

en las concentraciones de analito en la muestra”. Se ha

calculado como b ± sb, siendo sb la desviación estándar de

la pendiente.

El límite de detección es la concentración de analito

que origina una señal que puede diferenciarse

estadísticamente del blanco. Se ha cuantificado como 3

sy/x/b, donde sy es la desviación estándar de la

concentración, x es la concentración y b la pendiente de la

recta.

La precisión se expresa a través del coeficiente de

variación (CV%) de la media de las áreas obtenidas de

varias concentraciones de biopterina.

La exactitud se expresa a través del error relativo de

distintas concentraciones de biopterina.

Los dos últimos parámetros se calculan preparando

cuatro curvas de al menos cuatro patrones por curva,

durante un mismo ensayo (análisis intraensayo o intradía) o

en ensayos distintos (interensayo o interdía).


95

3.2.8. Análisis de la expresión génica. RT-PCR

3.2.8.1. Extracción de ARN total

Para la extracción del ARN total se escogió el

reactivo TriPure Isolation Reagent (Roche Diagnostics), que

es una solución monofásica de fenol y tiocianato de

guanidina (Trizol), que permite separar ARN, ADN y

proteínas. Se tomaron 20 mg de pulmón conservado a -

80ºC, se añadió 1 ml de reactivo Tripure y se lisó con el

sistema Tissuelyser II (Qiagen). A continuación, se

separaron las fases con cloroformo y se precipitó el ARN

total de la muestra con isopropanol. A fin de facilitar dicha

precipitación se le añadió a la fase acuosa 1 µl de

glucógeno. Tras una centrifugación de 5 minutos a 7500 g,

se resuspendió el ARN en 20 µl de agua DEPC.

Tras resuspender el ARN extraído, se procedió a

determinar la integridad y concentración del mismo, para lo

cual se utilizó un sistema electroforético capilar 2100

Bioanalyzer (Agilent Technologies) y el ARN 6000 LabChip®

kit (Agilent Technologies) siguiendo las instrucciones del

fabricante. Se añadió 1 µl de muestra al ARN 6000

LabChip® y se obtuvo el electroferograma. Se calculó la

concentración total de ARN y el ratio entre el área de los

picos de ARN ribosómico 28S/18S. Los ratios comprendidos

entre 1,5 y 2 indican un ARN íntegro.


96

3.2.8.2. Transcripción inversa (RT)

Consiste en la obtención de un ADN complementario

(ADNc) a partir del ARN, por ello se denomina transcripción

inversa. Para el proceso se requieren unas ADN

polimerasas particulares, las transcriptasas inversas o

retrotranscriptasas, en nuestro caso particular se utilizó la

MultiScribe™ Reverse Transcriptase (Applied Biosystems).

Para la síntesis de ADNc a partir de ARN se utilizó el

TaqMan® Reverse Transcription Reagents kit (Applied

Biosystems), cuyos componentes se utilizaron en la

proporción que se indica en la tabla 2.


97

Componentes Volumen para

20 µL

Concentración

Final

Tampón de RT (10X) 1,5 µl 1X

MgCl2 25 mM 3.3 µl 5.5 mM

“Random Hexamer” 0.75 µl 2.5 µM

Mezcla dNTP 3 µL 500 µM de cada

dNTP

Inhibidor RNasa 0.3 µL 0.4 U/µL

“MultiScribe Reverse

Transcriptase” (50

U/µL)

0.375 µL 1.25 U/µL

RNA 5 µL 0.06 µg/µL

Agua DEPC- RNA 5.77 µL

Tabla 2. Componentes TaqMan® Reverse Transcription Reagents kit (Applied Biosystems)

El proceso de transcripción inversa se lleva a cabo

en un termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Applied

Biosystems), con las siguientes condiciones experimentales:

incubación de 25ºC durante 10 minutos, seguida de un ciclo

a 48ºC durante 30 minutos. Finalmente la transcriptasa

reversa se inactiva mediante una incubación a 95ºC durante

5 minutos.


98

Figura 17. Termociclador 9800 Fast Termal Cycler utilizado para la

retrotranscripción de ARN a ADNc.

El ADNc sintetizado se mantiene a -20ºC hasta la

realización de la siguiente etapa.


99

3.2.8.3. RT-PCR a tiempo real

La reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real

(RT-PCR) es actualmente el método más sensible y preciso

en la detección de los niveles de ARNm. El método nos

permite la detección directa del producto de amplificación

durante la fase exponencial de la reacción, a través del

empleo de compuestos con propiedades fluorescentes, de

modo que determinando el incremento de fluorescencia se

puede determinar la cantidad de producto formado.

Se amplificaron de forma selectiva los TaqMan®

assays (Applied Biosystems), que son secuencias

específicas del ADNc, mediante la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR), la cual usa dos fragmentos cortos de

ADN, denominados oligonucleótidos, como cebadores de la

síntesis. Estos cebadores se unen específicamente a

secuencias que flanquean la región a amplificar, cada uno

en cada una de las cadenas del ADN. El proceso básico se

desarrolla en tres pasos que se repiten sucesivas veces:

1. Desnaturalización: separación de las cadenas

complementarias de ADN.

2. Unión: unión de los cebadores específicos a sus

secuencias complementarias.

3. Extensión: síntesis de la hebra complementaria a

partir del cebador respectivo.


100

La repetición de este ciclo un determinado número

de veces produce un aumento exponencial de la cantidad de

la región diana del ADN, que viene dado por la expresión 2n

(siendo n el número de ciclos), hasta que se llega a un punto

en que disminuye la eficiencia de la enzima y la reacción

deja de ser exponencial.

La composición para cada reacción de PCR fue la

siguiente:

Componentes Volumen (10 µl) Concentración

Final

FluoCycle™ II, Mix

for probe RT-PCR

(2X)

5 µl 1X

Taq Man Gene

Expression Assays

(20X)

0,5 µl 1X

cDNA 1 µl

Agua DEPC 3,5 µl

Las mezclas se introducen en el termociclador ABI

Prism 7900 Sequence Detection System® (Applied

Biosystems) con las siguientes condiciones de amplificación:

1 ciclo a 95º C de 10 minutos, y 40 ciclos a 95º C de 15

segundos seguidos de 60º C durante 1 minuto.


101

Figura 18. Termociclador ABI Prism 7900 Sequence Detection System®.

En este termociclador se realiza tanto la

amplificación como la detección del producto amplificado, ya

que el sistema incorpora un lector de fluorescencia y está

diseñado para poder medir, en cualquier momento la

fluorescencia emitida en cada uno de los pocillos donde se

realiza la amplificación. En el presente trabajo, el sistema de

detección por fluorescencia empleado en la PCR a tiempo

real utiliza cebadores y sondas específicas marcadas con

fluorocromos diseñados de manera especial Assays-on-

Demand Gene Expression probes (Applied Biosystems). En

la tabla 3 se exponen las características de los genes

estudiados y del amplicón (cebadores más sondas) que se

utilizaron según las instrucciones del fabricante para la

detección de los niveles de expresión génica en la especie

de ratón, mientras que en la tabla 4 se exponen para rata.


102

Nombre del gen Símbolo del

gen Alias Referencia

Long.

amplicon (pb)

collagen, type I, alpha 1 Col1a1

Col1a-1

Mm00801666_g1 89

Cola-1

Cola1

Mov-13

Mov13

RP23-112C19.9

mucin 5, subtypes A and C,

tracheobronchial/gastric Muc5ac

2210005L13Rik Mm01276725_g1 69

MGM

endothelin 1 Edn1 ET-1

Mm00438656_m1 67

preproET

transforming growth factor

beta Tgf-β

TGF-beta1

Mm00441724_m1 99 TGFbeta1

Tgfb

Tgfb-1

connective tissue growth

factor Ctgf

Ccn2

Mm01192931_g1 84 Fisp12

Hcs24

fisp-12

GTP cyclohydrolase 1 Gch1

GTP-CH

Mm01322971_m1 122 GTPCH

Gch

glyceraldehyde 3-phosphate

dehydrogenase GAPD GAPD 4352339 107

Tabla 3. Sondas TaqMan® utilizadas en RT-PCR para ratón (Mm, Mus musculus).


103

Nombre del gen Símbolo del gen Alias Referencia

Long. amplicon

(pb)

collagen, type I, alpha 1 Col1a1 Col1a-1 Rn01463848_m1 115

mucin 5AC, oligomeric mucus/gel-forming

Muc5ac Muc5ac Rn01451262_g1 82

endothelin 1 end1 Et1 Rn00561129_m1 88

transforming growth factor, beta 1

Tgf-β1 Tgfb1 Rn01475963_m1 78

connective tissue growth factor Ctgf CTGRP Rn00573960_g1 82

GTP cyclohydrolase 1 Gch1 Gch Rn00577450_m1 106

tumor necrosis factor Tnf TNF-alpha

Tnfa Rn00562055_m1 82

glyceraldehyde 3-phosphate

dehydrogenase GAPD GAPD 4352339 107

Tabla 4. Sondas TaqMan® utilizadas en RT-PCR para rata (Rn, Rattus norvegicus).


104

Las sondas son oligonucleótidos marcados con un

fluorocromo donante en 5´ que emite fluorescencia al ser

excitado y un aceptor en el extremo 3´ que absorbe la

fluorescencia liberada por el donante. Para que esto ocurra,

las moléculas donante y aceptora deben estar

especialmente próximas. Además, el espectro de emisión de

la primera se ha de solapar con el espectro de absorción de

la segunda. Mientras la sonda está intacta, la fluorescencia

emitida por el donante es absorbida por el aceptor. Sin

embargo, durante la amplificación del ADN diana, la sonda

hibrida con su cadena complementaria. Al desplazarse a lo

largo de la cadena, en su acción de síntesis, la ADN

polimerasa, mediante su actividad 5´ exonucleasa, hidroliza

el extremo libre 5´ de la sonda, produciéndose la liberación

del fluorocromo donante 116. Como donante y aceptor están

ahora alejados, la fluorescencia emitida por el primero es

captada por el lector. Este proceso ocurre en cada ciclo y no

interfiere con la acumulación exponencial del producto de

amplificación.

Se tomó como control interno al ARN de la proteína

gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenada (GAPDH), dado

que este ARN se expresa de forma constante en muchos

tejidos en diferentes condiciones fisiológicas y

fisiopatológicas.

El programa informático construye estas curvas de

amplificación a partir de los datos de emisión de


105

fluorescencia recogidos durante la reacción en tiempo real.

De este modo, al final se obtiene una representación en la

que el eje de ordenadas es el logaritmo de la intensidad de

la fluorescencia y el eje de abscisas es el número de ciclos

transcurridos.

El parámetro de medida de la expresión de un

determinado gen es el ciclo que alcanza el nivel prefijado de

fluorescencia. Este ciclo se denomina ciclo umbral

(thereshold cycle, Ct), a partir del cual la intensidad de

fluorescencia empieza a ser apreciable. De este modo, los

valores del ciclo umbral decrecerán linealmente conforme

aumenta la cantidad de ADNc de partida. Cuantas más

copias de ARNm de partida del gen estudiado, más ADNc

se obtendrá en la transcripción inversa, y antes comenzará

la amplificación a ser exponencial.

El método para determinar la expresión a partir de

las curvas de amplificación obtenidas consiste en la

comparación de Ct. La expresión del gen problema se

normaliza a la expresión del gen de referencia, GAPDH.


106

3.2.9. Análisis estadístico de los resultados

Todos los datos experimentales generados se

procesaron con la ayuda de los programas informáticos

Microsoft Office Excel 2007 y GraphPad Prism 5.03. Los datos

descriptivos de las variables estudiadas se presentan como

medias acompañadas de su error estándar. Las diferencias

entre los grupos estudiados se analizaron mediante análisis de

variable ANOVA con test de ajuste de corrección de Bonferroni

y, en algunos casos la t de Student para datos no pareados. La

clasificación establecida para el nivel de significación

estadística fue de p<0,05 (significativo), p<0,01 (muy

significativo) o bien p<0,001 (extremadamente significativo). En

todas las gráficas, los símbolos de almohadilla (#) y asterisco

(*) representan diferencias frente al control y frente al grupo de

bleomicina (control positivo), respectivamente. Las diferencias

aumentan con el número de símbolos, de manera que un

símbolo corresponde a *p<0,05 (significativo), dos a **p<0,01

(muy significativo) o bien tres simbolos, ***p<0,001

(extremadamente significativo).

4. RESULTADOS

Resultados

108

4.1. Validación del modelo murino de fibrosis

pulmonar inducida con bleomicina.

El modelo experimental de inducción de fibrosis con

bleomicina, ha sido correctamente estandarizado en nuestro

laboratorio a las dosis de 3.75 y 7.5 U.Kg-1, para ratón y rata

respectivamente112.

Nuestro grupo de investigación ha publicado varios

trabajos científicos con este modelo animal tanto en rata como

en ratón57,58,60,112, lo que avala la metodología empleada en

este trabajo de investigación. No obstante, para cada ensayo

se comprobó que se alcanzaba el estado de fibrosis en el

grupo de bleomicina y que existían diferencias significativas

respecto al grupo control, tomando como referencia los

siguientes indicadores: pérdida de peso corporal, hipertrofia

ventricular derecha, aumento del peso del pulmón, aumento de

células extravasadas en lavado broncoalveolar, aumento de

zonas fibróticas y células inflamatorias en pulmón, y depósitos

de colágeno. A continuación se muestran algunos resultados

típicos del modelo de fibrosis pulmonar con bleomicina en

murinos.

El primer y principal resultado en el modelo de fibrosis

pulmonar inducida por bleomicina es la observación visual por

parte del experimentador de la instauración de la lesión

pulmonar. En la Figura 19 se pueden observar las diferencias

entre un pulmón sano y un pulmón afectado de fibrosis

Resultados

109

pulmonar en la fase inflamatoria, hasta el día 7, y en la fase de

fibrosis, a partir del día 11.

Figura 19. Imagen de los pulmones extraídos de una rata control (A) y de una rata afectada, tras siete días (B) y catorce días (C) desde la inducción de fibrosis con una dosis intratraqueal de 7,5UI.Kg-1 de bleomicina.

En los cortes histológicos teñidos con hematoxilina

eosina, se observa una marcada desestructuración del

parénquima, con lesiones fibróticas, infiltración y

engrosamiento septal que reducen de forma importante el

espacio aéreo alveolar (Figura 20).

Resultados

110

Figura 20. Cambios histológicos observados en el pulmón de rata debidos a la bleomicina: A) pulmón de rata control (10x), B) infiltrado de células inflamatorias y fibroblastos en los espacios alveolares tras siete días de la inducción de fibrosis con bleomicina (5x), C) foco de fibrosis alternando con zonas de parénquima normal tras catorce días de la inducción de fibrosis con bleomicina (5x). D) engrosamiento de las paredes vasculares con restricción de la luz alveolar tras catorce días de la inducción de fibrosis con bleomicina (40x). Tinción hematoxilina eosina.

Figura 21. Medidas de colágeno en pulmón de rata tras catorce días desde la inducción de fibrosis (n=10) frente a control (n=6). A. Contenido de hidroxiprolina en parénquima pulmonar. B. Expresión relativa del ARN de colágeno tipo 1 (Col1a1). ##p valor <0,01 frente a control.

0

1000

2000

3000

4000

5000 ##

Hid

roxi

polin

a (

µµ µµg

por

pulm

ón)

0

1

2

3

4

5 ##ControlBleomicina

Exp

resi

ón r

ela

tiva

del A

RN

m d

e C

OL1

A1

A B

Resultados

111

Entre los resultados que nos aportan mayor información

del proceso fibrótico, y tal como ilustran las Figura 21 y Figura

22, se encuentran: la evolución del peso corporal, con una

pérdida del 20 % para el grupo de bleomicina; la hipertrofia

ventricular derecha causada por la hipoxia permanente del

pulmón; las células extravasadas, dónde la bleomicina hace

que abunden principalmente los neutrófilos; el peso del pulmón

y las proteínas en lavado broncoalveolar que se observan

aumentadas ante la inflamación que genera la exposición a

bleomicina; y por último, pero no menos importante, el aumento

de los depósitos de colágeno en el pulmón (Figura 21).

Resultados

112

0 5 10 15100

150

200

250

300

350

A.- Evolución del peso corporal

Días

Pes

o (g

)

B.- Hipertrofia ventricular derecha

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

##

Pes

o V

D/

peso

VI

C.- Células totales en LBA

0.0

0.5

1.0

1.5

##

Millo

nes

de c

élul

as (

x10

6 )

Control Bleomicina0.0

0.2

0.4

0.6

0.8Neutrofilos

Linfocitos

Eosinófilos

Macrófagos

D.- Tipos celulares

nº c

elul

as (

x10

6 )

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

F.- Concentración deproteínas en LBA

###

Con

c. p

rote

inas

en

LBA

(m

g/m

l)

BleomicinaControlA, B, C, E, F:

0.000

0.005

0.010

0.015

E.- Peso del pulmón

###

Pes

o pu

lmón

/Pes

o ra

ta

Figura 22. Representación gráfica de algunos de los parámetros más representativos de la fibrosis pulmonar inducida po r bleomicina en rata, a los catorce días de la instilación de 7,5 UI.Kg -1 de bleomicina (barra roja, n=10) frente al grupo control (barra verde, n=6) . A. Evolución del peso corporal del animal. B. Índice de hipertrofia ventricular derecha (ventrículo derecho/ ventrículo izquierdo x septo) C. Células totales en lavado broncoalveolar (LBA). D. Tipos de células inflamatorias en LBA. E. Peso pulmón/ peso animal. F. Concentración de proteínas en LBA.

Resultados

113

4.2. Validación del método analítico para la

determinación de BH4 en muestras

biológicas.

La valoración de la BH4 en las muestras se llevó a cabo

por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa

(HPLC) según el método indirecto descrito en el apartado 2.11

de materiales y métodos. Un cromatograma tipo se representa

en la Figura 23. La relación entre áreas y concentraciones es

lineal en el intervalo de 0,1-100ng/ml.

Se prepararon curvas de calibración cada día, siendo en

todos los casos lineales a juzgar por los coeficiente de

correlación (r2) obtenidos, siempre superiores a 0.998. El límite

de detección de la técnica es de 0,1 ng/mL, mientras que límite

de cuantificación es de 0,5 ng/mL, ambos se obtuvieron

aplicando la normativa de validación de métodos bioanaliticos

de la FDA117.

La precisión del método, medida a través del coeficiente

de variación (CV) se presenta en las Tabla 5 y Tabla 6. El

coeficiente de variación (%) fue en todos los casos inferior al

10%, lo que indica que el método es suficientemente preciso.

La exactitud se evaluó a partir del error relativo, como se

detalla en el epígrafe 3.2.7.1 del capítulo de materiales y

métodos. Los errores relativos también son en todos los casos

inferiores al 10%, por lo que se encuentra dentro de los límites

habituales aceptados. Los resultados se muestran en las Tabla

Resultados

114

5 y 6. Es posible, asimismo, verificar que no existe relación

alguna entre la concentración y la exactitud.

Concentración

ensayada

(ng/mL)

Concentración

experimental media

(ng/mL)

CV (%)

Error

relativo

(%)

5 5,34 ± 0,17 3,13 6,81

25 25,39 ± 0,12 0,49 1,56

75 75,16 ± 0,61 0,80 0,22

100 101,37 ± 0,56 0,55 1,37

Tabla 5. Valores de concentración obtenidos en un m ismo ensayo (n=4).

Concentración

ensayada

(ng/mL)

Concentración

experimental media

(ng/mL)

CV (%)

Error

relativo

(%)

5 5,38 ± 0,21 3,84 7,52

25 25,49 ± 0,36 1,4 1,97

75 75,19 ± 1,22 1,62 0,25

100 96,73 ± 4,08 4,22 -3,27

Tabla 6. Valores de concentración obtenidos en ensa yos distintos (n=5).

Resultados

115

Figura 23. A. Cromatograma de fluorescencia típico de separación de un patrón de biopterina en las condiciones de análisis. B. El ejemplo muestra el fundamento del método analítico mediante la superposición de cromatogramas de una misma muestra de plasma de rata, procesada en condiciones de oxidación acidas (línea negra) y básicas (línea rosa).

2.

5.

7.5 10.

12.

15.

Biopterina

Biopterina 5 ng/ml

t ret=7.6

Area=1.645.950

Resultados

116

4.3. Cuantificación de niveles sanguíneos y

tisulares de tetrahidrobiopterina en modelos

experimentales de fibrosis (ratón C57BL/6J,

rata wistar) y en enfermos diagnosticados de

fibrosis pulmonar idiopática.

Como primer paso para el estudio del comportamiento de

la BH4 en el organismo afectado de fibrosis pulmonar, se

determinaron las concentraciones plasmáticas, pulmonares y

hepáticas obtenidas en una población sana y en una población

afectada de fibrosis pulmonar en las especies de ratón

C57BL/6J y rata wistar. A continuación se determinaron las

concentraciones plasmáticas en una población sana y en una

población afectada de fibrosis pulmonar idiopática en la

especie humana.

En la especie de ratón, tal como se puede observar en la

Tabla 7, se produce una disminución aguda en los niveles

plasmáticos de BH4 a los siete días de la administración de

bleomicina con diferencias extremadamente significativas,

mientras que las diferencias se reducen en el día 14 y día 21

aun siendo significativas.

Tal como se muestra en la Tabla 7, en cuanto a la rata,

no se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas

entre el grupo control y el grupo de bleomicina a día 14, ni en

Resultados

117

plasma, ni en pulmón, ni en hígado. No obstante, la tendencia

es similar a la observada en ratón.

En humanos, se valoraron únicamente los niveles de BH4

plasmáticos. Las concentraciones plasmáticas de los pacientes

afectados de fibrosis pulmonar son significativamente menores

que las de los voluntarios sanos que participaron en el estudio.

Los niveles basales de BH4 encontrados en los distintos

tejidos en animales de investigación coinciden con los

publicados hasta el momento por otros autores114,118. Las

concentraciones obtenidas en sangre humana también

coinciden con las encontradas por otros investigadores113,119.

En conjunto, estos resultados sugieren que ante una

situación de estrés, por la aplicación de bleomicina o por la

fibrosis pulmonar idiopática, los niveles plasmáticos de BH4 se

encuentran disminuidos respecto al grupo control. Esto podría

deberse al consumo de especies antioxidantes que se produce

a nivel sistémico en la fibrosis pulmonar debido al aumento de

especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno por estrés

oxidativo. Simultáneamente en pulmón los niveles de BH4

podrían estar aumentados por una mayor actividad enzimática

en pulmón debido a la oxidación, lo que aumentaría la

producción de antioxidantes e incluso el consumo de

antioxidantes sanguíneos.

Resultados

118

Especie Grupo

n = 26 n = 22 n = 16

p = 26 p = 22 p = 16

57,39 ± 4,92 0,13 ± 0,02 0,82 ± 0,02

n = 9 n = 8 n = 9

p = 9 p = 8 p = 9

15,18 ± 2,14 ### 0,32 ± 0,05 0,64 ± 0,03

n = 7 n = 7 n = 7

p = 7 p = 7 p = 7

35,94 ± 4,13 ## 0,23 ± 0,03 0,61 ± 0,11

n = 18 n = 9 n = 6

p = 18 p = 9 p = 6

38,48 ± 2,93 ## 0,21 ± 0,03 0,75 ± 0,04

n = 6 n = 6 n = 6

p = 6 p = 6 p = 6

32,73 ± 3,22 0,14 ± 0,04 0,81 ± 0,08

n = 10 n = 10 n = 10

p = 10 p = 10 p = 10

23,70 ± 2,79 0,23 ± 0,03 0,67 ± 0,06

n = 6

p = 6

2,53 ± 0,24

n = 14

p = 14

1,52 ± 0,15 #

RATA

Control

Fibrosis día 14

HUMANOS

Control

Fibrosis

pulmonar

idiopática

Conc. en Plasma

(ng/ml)

Conc. en Pulmón

(µg/g)

Conc. en Hígado

(µg/g)

RATÓN

Control

Fibrosis día 7

Fibrosis día 14

Fibrosis día 21

Tabla 7. Concentraciones de BH4 obtenidas en ratón C57Bl/6J, rata wistar y

humanos, en varios tejidos: plasma, pulmón e hígado . Se muestran resultados de

una población control y de una población afectada de fibrosis pulmonar. En el ratón se

estudiaron los niveles de BH4 con la evolución de la enfermedad, durante la fase

inflamatoria (día 7) y la fase fibrótica (día 14 y 21) del proceso de fibrosis inducida con

bleomicina. ##p< 0,01 frente a control. ###p< 0,001 frente a control.

Resultados

119

4.4. Efecto farmacológico de la

tetrahidrobiopterina (BH4) 20 mg/Kg/día via

oral en ratón a día 7 y a día 14 de la inducción

de fibrosis pulmonar.

El estudio farmacológico de BH4 se realizó a dos dosis,

10 y 20 mg/Kg/día. Los resultados obtenidos muestran que sólo

hay una ligera mejoría para la dosis de 20 mg/Kg/día, por lo

que se omiten los correspondientes a la dosis inferior.

En este estudio, al igual que el resto de estudios

farmacológicos realizados, se ensayó un grupo de animales

sanos que recibieron la misma dosis diaria de BH4. No se

observaron modificaciones significativas en los parámetros a

estudiar respecto al grupo control. Esto demuestra que la BH4

no ejerce efecto per se. Por ello, este grupo no se representa

en los gráficos.

4.4.1. Evolución del peso corporal

En primer lugar, como indicador del bienestar animal y

de la influencia de las dificultades respiratorias y alimenticias

que sufren los animales como consecuencia de la lesión

pulmonar producida por la bleomicina, se controló durante el

ensayo la evolución del peso corporal en función del tiempo.

Resultados

120

Como se muestra en la Figura 24, el grupo tratado con

BH4 aumenta en un 25% el peso corporal respecto al grupo de

bleomicina a punto final, día 14.

Figura 24. Representación gráfica de la evolución del peso corporal de los ratones. Se pesaron de forma periódica desde el día de la inducción de fibrosis pulmonar con bleomicina hasta el día 14 del experimento. Se representan los tres grupos principales del estudio: grupo control (color verde, n=12), grupo de bleomicina (color rojo, n=10) y grupo de bleomicina con BH4 20 mg/Kg/día (color azul, n=16).

4.4.2. Peso del pulmón, proteínas en pulmón e

índice de hipertrofia ventricular derecha.

Se estudió el efecto antifibrótico de la BH4 en la fase de

inflamación del proceso de fibrosis con bleomicina, a día 7 de la

inducción de fibrosis, y en la fase de la enfermedad en la que

predomina el estado fibrótico, a día 14. En la Figura 25 se

exponen de forma comparativa los resultados obtenidos al

determinar los parámetros de peso pulmonar, hipertrofia

0 5 10 1512

14

16

18

20

22SF i.t + vehículo v.oBL i.t + vehículo v.o

BL i.t + BH4 20 mg/kg/día v.o

Tiempo (dias)

Pes

o (g

)

Resultados

121

ventricular derecha, y proteínas totales en pulmón en ambas

fases. Tal como muestra la figura, la BH4 no revierte ninguno

de estos tres parámetros a día siete frente al daño producido

por la bleomicina.

El índice de hipertrofia ventricular derecha (Peso

ventrículo derecho / peso ventrículo izquierdo con septum) es

un indicador del esfuerzo al que se ha sometido el corazón

debido a la situación de hipoxia. Después de catorce días de

dificultad respiratoria se observaron diferencias

estadísticamente significativas en la hipertrofía ventricular

desarrollada por los animales expuestos a bleomicina sin

tratamiento y los no expuestos. La suplementación con BH4

disminuyó la hipertrofía ventricular derecha generada tras

catorce días de la lesión pulmonar producida por la bleomicina.

Resultados

122

Inflamación Fibrosis Día7 Día14

Peso del pulmón

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

######

Pe

so p

ulm

ón/ p

eso

rat

ón

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

Pes

o pu

lmó

n/ p

eso

rat

ón

###

Concentración de proteínas en pulmón

0

10

20

30

40

50###

Co

nc. p

rote

ínas

(m

g/g

)

0

10

20

30

40

50###

Co

nc.

pro

teín

as (

mg

/g)

Índice de hipertrofia ventricular derecha

0.0

0.1

0.2

0.3

Peso

VD

/ (Pe

so V

I + se

ptum)

0.0

0.1

0.2

0.3 ###

*

Peso

VD

/ (Pe

so V

I + se

ptum)

Control (n=12) Bleomicina (n=8) BL i.t + BH4 20mg v.o (n=8)

Figura 25. Representación gráfica comparativa de los parámetros: peso del pulmón, concentración de proteínas en pulmón e hipertrófia ventricular derecha (VD/(VI+septo)), en la fase inflamatoria (día 7) y en la fase crónica o fibrótica (día 14) del proceso de fibrosis inducida con 3,75 UI de bleomicina en ratón. Se representan tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul). ###p<0,001 frente a control. *p<0,05 frente a bleomicina. La n es indicatoría del mínimo número de ratones utilizados para el cálculo de la media y del error de todos los parámetros mostrados.

Resultados

123

4.4.3. Expresión génica

�� Expresión génica de colágeno tipo I (Col1a1)

Los resultados se reflejan en la Figura 26. La

expresión génica de colágeno tipo I se ve aumentada

con bleomicina. La administración de BH4 durante siete

días no disminuye este aumento. En cambio, tras

catorce días de tratamiento se observa una disminución

de la expresión de Col1a1.

0

2

4

6

8

SF i.t + vehículo v.o (n=35)

BL i.t + vehículo v.o (n=8)

BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=8)

###

Exp

resi

ón r

ela

tiva

del A

RN

m d

e C

OL1

A1

0

2

4

6

8



BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=7)

###E

xpre

sión

re

lativ

ade

l AR

Nm

de

CO

L1A1 *

Día 7 Día 14

Figura 26. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Col1a1 en tejido pulmonar a los días 7 y 14 de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul). ###p<0,001 frente a control.

Resultados

124

�� Expresión génica del factor transformador del

crecimiento beta (Tgf- β)

La expresión de Tgf-β se ve significamente

aumentada a los siete y catorce días de la

administración de bleomicina con respecto al grupo

control. La suplementación con BH4 disminuye

significativamente la expresión de Tgf-β con respecto al

grupo de bleomicina, reestableciendo los niveles

basales de expresión. Esto ocurre tanto en el grupo

tratado durante una semana como en el grupo que se

trató durante catorce días.

Figura 27. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Tgf-β en tejido pulmonar a los días 7 y 14 de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul).###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina; ***p<0,001 frente a bleomicina.

0

2

4

6

SF i.t + vehículo v.o (n=35)BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=8)

###

***

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

TGF-

ββ ββ

0

1

2

3

4

5

SF i.t + vehículo v.o (n=35)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + BH4 20mg v.o (n=7)

###

*

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

TGF-

ββ ββ

Día 7 Día 14

Resultados

125

�� Expresión génica del factor de crecimiento del

tejido conectivo (Ctgf).

La expresión del Ctgf a los siete y catorce días de la

administración de bleomicina se ve aumentada de forma

estadísticamente significativa respecto al grupo control.

La suplementación con BH4 durante siete o catorce días

disminuye el aumento producido por la bleomicina de

forma significativa.

0

2

4

6

8


###

*

Exp

resi

ón r

elat

iva

del A

RN

m d

e C

TGF

0

2

4

6


###

Exp

resi

ón r

elat

iva

del A

RN

m d

e C

TGF

Día 7 Día 14

*

Figura 28. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Ctgf en tejido pulmonar a los siete y catorce días de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul). ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.

Resultados

126

�� Expresión génica de la mucina 5AC ( Muc5ac).

La expresión de la mucina Muc5ac en pulmón a día

7 y a día 14 se ve aumentada por la lesión que produce

la bleomicina. La suplementación con BH4 revierte este

aumento, de forma extremadamente significativa tras

catorce días de tratamiento.

0

1

2

3

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

Muc

5ac

0

1

2

3 ##

***E

xpre

sión

rel

ativ

a de

lAR

Nm

de

muc

5ac



Día 7 Día 14

Figura 29. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Muc5ac en tejido pulmonar a los días siete y 14 de la inducción de fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul). No existen diferencias significativas entre los grupos experimentales a día 7. ##p<0,01 frente a control; ***p<0,001 frente a bleomicina.

Resultados

127

�� Expresión génica de endotelina 1 (End1).

La expresión de mRNA del gen End1, según se

muestra en la Figura 30, se vió aumentada en los

pulmones afectados por la bleomicina de forma

significativa. La administración oral de BH4 20

mg/Kg/día revirtió significativamente este efecto tanto a

los siete como a los catorce días de tratamiento.

0

1

2

3

4 ##

**

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

endo

telin

a-1

0

1

2

3

4

##

*

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

endo

telin

a-1



Día 7 Día 14

Figura 30. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen End1 en tejido pulmonar a los siete y catorce días de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul). ##p<0,05 frente a control; **p<0,01 frente a bleomicina; *p<0,05 frente a bleomicina.

Resultados

128

�� Expresión génica de guanosina trifosfato

ciclohidrolasa I (Gch1).

En la Figura 31 se puede observar el aumento de

expresión de Gch1 que generó en el pulmón la

instilación de bleomicina. La Gch1 o GTPCH-1 es la

enzima principal de la síntesis de BH4 endógena. La

administración durante siete y catorce dias de BH4 a los

ratones fibróticos no disminuyó la expresión de la

enzima que la sintetiza.

0

1

2

3

4

5

#

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

GT

PC

H-I

0

1

2

3

4

5

##

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

GT

PC

H-I



Día 7 Día 14

Figura 31. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Gch1 en tejido pulmonar a los siete y catorce días de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul). #p<0,05 frente a control; ##p<0,01 frente a control.

Resultados

129

4.4.4. Determinación de la concentración de

tetrahidrobiopterina

Como se ha comentado previamente, en nuestro

organismo existe un equilibrio de tres especies pterinas:

biopterina, 7,8- dihidrobiopterina (BH2) y tetrahidrobiopterina

(BH4), de las cuales sólo la BH4 es activa. Ésta tiene un papel

importante en la regulación de la función del endotelio vascular

y protege del estrés oxidativo. Los estudios que se han

realizado hasta el momento parecen indicar que una

disminución de los niveles de BH4 produce el desacoplamiento

de la óxido nítrico sintasa endotelial y la generación de anión

superóxido.

Durante el estudio se analizaron los niveles de BH4

sistémicos, locales, y hepáticos. La técnica utilizada fue la

cromatografía líquida con detección por fluorescencia.

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 32.

Se observó una disminución aguda de los niveles de

BH4 plasmáticos tras siete días de afectación pulmonar por

bleomicina. Esta caída se ve revertida de forma significativa por

el tratamiento oral con 20 mg/Kg/día de BH4.

La disminución de los niveles plasmáticos de BH4 a los

catorce días desde la bleomicina, siendo significativa, es

menos pronunciada que a los siete días. También la

administración de BH4 durante catorce días recupera los

Resultados

130

niveles plasmáticos incluso ligeramente por encima del grupo

control.

En homogenizado de pulmón ocurre de manera inversa.

La concentración de BH4 en los grupos expuestos a bleomicina

aumenta de forma significativa con respecto al grupo control y

este aumento es ligeramente mayor a los siete días de

exposición que a los catorce días de exposición.

Esta correlación inversa entre plasma y tejido ya ha sido

mencionada anteriormente por otros autores108.

En el pulmón, la suplementación oral de 20 mg/Kg/día

de BH4 no modifica los niveles, ni siquiera tras catorce días de

tratamiento.

El perfil de la bleomicina en el tejido hepático se

correlaciona con el observado en el sistémico. La bleomicina

disminuye los niveles de BH4 en hígado, pero en este caso la

administración oral de BH4 no recupera los niveles del grupo

control.

Resultados

131

Figura 32. Concentraciones de BH4 alcanzadas a día 7 y a día 1 4 de la inducción de fibrosis en los tejidos de ratón estudiados. A. Plasma; B. Pulmón; C. Hígado. En cada gráfica quedan representados los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 20 mg/Kg/día vía oral (azul). #p<0,05 frente a control; ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.

0

20

40

60

80


###

*

Con

cent

ració

n pl

asm

ática

de

BH

4 (n

g/m

l)0

20

40

60

80


*

#

Con

cent

ració

n pl

asm

ática

de

BH

4 (n

g/m

l)

InflamaciónDía 7

FibrosisDía 14

A.

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4


###

Con

cent

ració

n de

BH

4en

pul

món

(µµ µµg

/g)

0.0

0.1

0.2

0.3


#

Con

cent

ració

n de

BH

4en

pul

món

(ug

/g)

B.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

SF i.t + vehículo v.o (n=16)BL i.t + vehículo v.o (n=8BL i.t + BH4 20 mg v.o (n=9)

Con

cent

ració

n de

BH

4 e

n hí

gado

(µµ µµg

/g)

C.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


Con

cent

ració

n de

BH

4 e

n hí

gado

(ug/

g)

Resultados

132

4.5. Efecto farmacológico de la sepiapterina

10 mg/Kg/día via oral en la fibrosis pulmonar

inducida con bleomicina en ratón a día 7 y a

día 14.

Tras los resultados obtenidos con la administración oral

de BH4, se propone la administración de su precursor, la

sepiapterina (SP). Con ello, se pretende lograr más efectividad

en elevar los niveles de BH4 tisulares109,118.

Se estudia el efecto que produce la administración oral de

sepiapterina 10 mg/Kg/día120 tal como se realizó para la BH4. A

nivel macroscópico, se midió la evolución del peso corporal, el

peso del pulmón y el peso del corazón. Se cuantificaron las

proteínas totales en pulmón. A nivel molecular, se determinó la

expresión de genes implicados en el proceso fibrótico y se

determinaron los niveles de BH4 alcanzados en plasma,

pulmón e hígado. Todos estos análisis se realizaron al final de

la fase inflamatoria, a los siete días de la inducción de fibrosis,

y en la fase fibrótica o crónica, a los catorce días de la

inducción de fibrosis.

Resultados

133


La sepiapterina, aumenta en un 30% el peso corporal

de los animales con respecto al grupo de bleomicina a partir del

octavo día de tratamiento. En la Figura 33 se representa la

evolución del peso corporal de los tres grupos experimentales

en función del tiempo.

0 5 10 1510

12

14

16

18

20

22SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + SP 10mg/Kg v.o (n=16)

Tiempo (dias)

Pes

o (g

)

Figura 33. Evolución del peso corporal de los ratones desde la inducción de fibrosis con 0,075UI de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día vía oral (color rosa)

Resultados

134



El tratamiento con sepiapterina, al igual que ocurría con

la BH4, tal como se muestra en la Figura 34, no atenuó el

aumento del peso pulmón y de la cantidad proteínas totales en

pulmón ni a los siete ni a los catorce días desde la inducción de

fibrosis con bleomicina.

El índice de hipertrofia ventricular derecha, igual que

ocurrió en el estudio de BH4, se vió significativamente

aumentado a los catorce días de dificultad respiratoria. Se

observaron diferencias estadísticamente significativas en la

hipertrofía ventricular desarrollada por los animales expuestos

a bleomicina y los no expuestos. El tratamiento con

sepiapterina mejoró muy significativamente la hipertrofía

ventricular derecha generada tras catorce días de lesión

pulmonar causada por la bleomicina.

Resultados

135

Figura 34. Representación gráfica comparativa de lo s parámetros: peso del pulmón, concentración de proteínas en pulmón e hipe rtrofia ventricular derecha (VD/(VI+septo)), en la fase inflamatoria (día 7) y en la fase crónica o fibrótica (día 14) del proceso de fibrosis inducida con 3,75 UI de bleomicina en ratón . Se ensayaron tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día vía oral (rosa). ###p<0,001 frente a control. ##p<0,01 frente a control **p<0,01 frente a bleomicina. La n es indicativa de mínimo número de resultados utilizados para el cálculo de la media y del error de los parámetros mostrados.

0

10

20

30

40

50

Pro

tein

as to

tale

s en

pulm

ón (

mg/

g)

##

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

Pes

o pu

lmón

/ pes

o ra

tón

###

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

Pe

so p

ulm

ón/ p

eso

rat

ón

###

0

20

40

60

###

Pro

teín

as to

tale

s en

pulm

ón (

mg/

g)

0.15

0.20

0.25

0.30

Pes

o V

D /

(Pes

o V

I + s

eptu

m)

0.15

0.20

0.25

0.30 ##

**

Pes

o V

D /

(Pes

o V

I + s

eptu

m)

InflamaciónDía 7

FibrosisDía 14

Peso del pulmón

Proteínas en pulmón

Índice de hipertrofia ventricular derecha

SF i.t + vehículo v.o (n=15)BL i.t + vehículo v.o (n=7)BL i.t + SP 10mg v.o (n=7)

Resultados

136



La bleomicina, como buen modelo de remodelado

pulmonar, produjo un incremento en la expresión de colágeno

tipo 1. El tratamiento con sepiapterina 10 mg/Kg/día disminuyó

los niveles de expresión de colágeno, tanto a día 7 como a día

14 (Figura 35).

0

2

4

6

8 ###

SF i.t + vehículo v.o (n=37)BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + SP 10 mg v.o (n=6)

*

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

Col

1a1

0

2

4

6


###

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

Col

1a1

Día 7 Día 14

Figura 35 Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Col1a1 en tejido pulmonar tras siete y catorce días desde la inducción de fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo) y fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día (rosa). ###p<0,001 frente a control, *p<0,05 frente a bleomicina.

Resultados

137



La expresión del Tgf-β se vió aumentada en el

grupo de animales expuestos a bleomicina. La

sepiapterina por vía oral revirtió de forma significativa el

aumento de expresión que se produce a día 7. A día 14,

la sepiapterina también atenuó significativamente este

aumento de expresión respecto al grupo de bleomicina.

(ver Figura 36).

0

2

4

6


BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + Spt 10 mg v.o (n=6)

##

*

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

TGF-

ββ ββ

0

2

4

6

8

10

SF i.t + vehículo v.o (n=37)BL i.t + vehículo v.o (n=30)BL i.t + Spt 10 mg v.o (n=7)

###

*

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

TGF-

ββ ββDía 7 Día 14

Figura 36. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Tgf-β en tejido pulmonar a los siete y catorce días de la inducción de fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo) y fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día (rosa). ##p<0,01 frente a control, ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.

Resultados

138

�� Expresión génica del factor de crecimiento de


Tanto a los siete como a los catorce días de la

inducción de fibrosis con bleomicina, la expresión de

Ctgf se ve significativamente aumentada respecto al

grupo control. La administración de sepiapterina

disminuye este aumento significativamente a día 14,

pero en cambio, no lo hace a día 7 (Figura 37).

0

2

4

6

8


###

***Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

CT

GF

0

2

4

6

8


##

Exp

resi

ón r

elat

iva

del A

RN

m d

e C

TG

F

Día 7 Día 14

Figura 37. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Ctgf en tejido pulmonar tras siete y catorce días de la inducción de fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo) y fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día (rosa). ###p<0,001 frente a control, ##p<0,01 frente a control, ***p<0,001 frente a bleomicina.

Resultados

139

�� Expresión génica de la mucina 5AC ( Muc5ac).

La lesión pulmonar producida por la bleomicina

aumentó de forma significativa la expresión de Muc5ac

a día 7 y a día 14 del proceso fibrótico.

El tratamiento con sepiapterina 10 mg/Kg/día vía

oral durante catorce días revirtió este aumento (Figura

38).

0

2

4

6


#

*

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

muc

5ac

0

2

4

6


#

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

muc

5ac

Día 7 Día 14

Figura 38. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Muc5ac en tejido pulmonar tras siete y catorce días de la inducción de fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo) y fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día (rosa). #p<0,05 frente a control, *p<0,05 frente a bleomicina.

Resultados

140

�� Expresión génica de endotelina-1 (End1).

La expresión de endotelina-1 incrementa

significativamente en los ratones expuestos a

bleomicina, tal como se muestra en la Figura 39. La

sepiapterina disminuyó este incremento de forma

significativa, tanto a los siete como a los catorce días de

tratamiento (Figura 39).

Los resultados obtenidos con la administración oral

del precursor de BH4, coinciden por completo con los

obtenidos al administrar la propia BH4 en el estudio

anterior (Figura 30).

0

1

2

3

4

5


BL i.t + vehículo v.o (n=8)BL i.t + SP 10 mg v.o (n=6)

##

*

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

endo

telin

a-1

0

1

2

3

4

5


###

*

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

endo

telin

a-1

Día 7 Día 14

Figura 39. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen End1 en tejido pulmonar tras siete y catorce días de la inducción de fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo) y fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día (rosa). ##p<0,01 frente a control; ##p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.

Resultados

141



La expresión génica de la enzima GTPCH-I,

encargada de la síntesis de BH4, aumentó en ratones

con fibrosis pulmonar respecto al grupo control. Por otra

parte, la administración de sepiapterina via oral, no

disminuye la expresión producida por la bleomicina.

Estos resultados coincidieron con los obtenidos en

el estudio anterior al administrar BH4 oral (Figura 40).

0

1

2

3

4


#

Exp

resi

ón re

lativ

a A

RN

m G

TP

CH

-I

0

1

2

3

4



##

Exp

resi

ón re

lativ

a A

RN

m G

TP

CH

-I

Figura 40. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Gch1 en tejido pulmonar a los siete y catorce días de la inducción de fibrosis con 3.75 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo) y fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día (rosa). #p<0,05 frente a control. ##p<0,01 frente a control.

Resultados

142

4.5.4. Determinación de la concentración de

tetrahidrobiopterina.

Los resultados del análisis cuantitativo de BH4 en

los tejidos estudiados, a los siete y catorce días del

proceso fibrótico, durante el estudio farmacológico de la

sepiapterina por via oral se muestran en la Figura 41.

Se confirmó por tercera vez una disminución aguda

de los niveles de BH4 plasmáticos tras la afectación

pulmonar por bleomicina. Es más significativa a día

siete que a día catorce del proceso.

Sin embargo, la administración de sepiapterina 10

mg/Kg/día por vía oral no recupera los niveles

sistémicos de BH4, a diferencia de lo que ocurría al

administrar directamente BH4.

En el parénquima pulmonar, se confirma también

que, de manera inversa al plasma, la concentración de

BH4 en los grupos expuestos a bleomicina aumenta de

forma significativa con respecto al grupo control. Este

aumento es ligeramente superior a los siete días de

exposición que a los catorce días de exposición.

La suplementación oral con 10 mg/Kg/día de

sepiapterina no modifica los niveles pulmonares, ni

siquiera tras catorce días de tratamiento.

Las concentraciones en hígado se correlacionan

una vez más con el perfil observado en el sistémico.

Resultados

143

En este caso la administración oral de sepiapterina

durante siete días recupera los niveles del grupo control.

En cambio, tras catorce días de tratamiento no se

observan diferencias significativas entre el grupo de

bleomicina y el grupo de bleomicina con tratamiento.

Resultados

144

0

20

40

60

80



##

Con

cent

raci

ones

pla

smát

icas

de

BH

4 (

ng/m

l)

0

20

40

60

80


###

Con

cent

raci

ón p

lasm

átic

a d

e B

H4

(ng/

ml)

InflamaciónDía 7

FibrosisDía 14

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4


###

Con

cent

raci

ón d

e B

H4

en

pulm

ón (

µµ µµg/g

)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4



#

Con

cent

raci

ón d

e B

H4

en p

ulm

ón (

ug/g

)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0


##

**

Con

cent

raci

ón d

e B

H4

en h

ígad

o (u

g/g)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=7)BL i.t + Spt 10 mg v.o (n=7)

Con

cent

raci

ón d

e B

H4

en

híga

do (

ug/g

)

Figura 41. Concentraciones de BH4 alcanzadas a día 7 y a día 1 4 de la inducción de fibrosis en los tejidos de ratón estudiados. A. Plasma; B. Pulmón; C. Hígado. En cada gráfica quedan representados los tres grupos experimentales: control (verde), fibrosis (rojo), fibrosis con tratamiento de sepiapterina 10 mg/Kg/día vía oral (rosa). La administración de sepiapterina 10 mg/Kg/día a un grupo de animales sanos no varió los niveles de BH4 en plasma y en pulmón respecto al grupo control de forma significativa, por ello no se muestra en los gráficos. #p<0,05 frente a control; ##p<0,01 frente a control; ###p<0,001 frente a control;

**p<0,01 frente a bleomicina.

Resultados

145

4.5.5. Estudio farmacocinético de la sepiapterina vía

oral.

Tras los resultados obtenidos en el estudio

farmacológico de la sepiapterina, donde se observa, a

diferencia de lo que ocurre en otros tejidos, que la

administración de sepiapterina no aumenta los niveles

pulmonares de BH4 se planteó la posibilidad de que hubiera

baja disponibilidad de BH4 en pulmón y no se alcanzarán las

concentraciones suficientes para producir efecto.

Así, se realizó el estudio farmacocinético de la

sepiapterina a las dosis de 10 y 30 mg/Kg por vía oral. Las

concentraciones plasmáticas y pulmonares alcanzadas en

función del tiempo se describen en Tabla 8 y Tabla 9, y se

representan en Figura 42 y Figura 43.

Resultados

146

Plasma Dosis oral 30mg/Kg

Dosis oral 10mg/Kg

t (h) n Conc. (ng/ml) ± SEM Conc.

(ng/ml) ± SEM

0 2 24,05 ± 0,20 24,05 ± 0,20

0,5 3 14,02 ± 1,26 90,39 ± 15,27

1 3 249,96 ± 67,80 131,56 ± 21,92

2 2 717,43 ± 41,23 228,42 ± 29,64

4 2 396,42 ± 38,48 146,53 ± 48,44

6 2 110,08 ± 49,79 63,28 ± 3,08

Tabla 8. Concentración plasmática de BH4 obtenidas a distintos tiempos, tras una administración oral de 10 y 30 mg/Kg de Sepiapterina. n= nº de animales utilizados para cada punto; SEM es la media del error estándar.

0 0,5 1 2 4 60

200

400

600

80030 mg/Kg/día10 mg/Kg/día

t (h)

Co

nce

ntr

acio

ne

s p

lasm

átic

as d

e B

H4

(ng

/ml)

Figura 42 . Concentraciones plasmática de BH4 obtenidas a distintos tiempos, tras una administración oral de 10 y 30 mg/Kg de Sepiapterina. n*= nº de animales utilizados para cada punto. (Ver Tabla 8).

Resultados

147

Pulmón Dosis oral 30mg/Kg

Dosis oral 10mg/Kg

t(h) n Conc. (ug/g) ± SEM Conc.

(ug/g) ± SEM

0 2 0,12 ± 0,03 0,12 ± 0,03

0,5 3 0,15 ± 0,03 0,21 ± 0,02

1 3 0,15 ± 0,02 0,22 ± 0,04

2 2 0,19 ± 0,04 0,12 ± 0,04

4 2 0,25 ± 0,04 0,11 ± 0,03

6 2 0,09 ± 0,01 0,09 ± 0,01

Tabla 9. Concentración en tejido pulmonar de BH4 frente al tiempo, tras una administración oral de 10 y 30 mg/Kg de Sepiapterina. n= nº de animales utilizados para cada punto; SEM es la media del error estándar.

0 0,5 1 2 4 60.0

0.1

0.2

0.3

0.430 mg/Kg/día10 mg/Kg/día

t (h)

Co

nc. B

H4

(ug/

g)

en

pu

lmó

n

Figura 43 . Concentración de BH4 alcanzadas en pulmón frente al tiempo, tras la administración oral única de 10 y 30 mg/Kg de sepiapterina. (Ver Tabla 9).

Resultados

148

4.6. Efecto farmacológico de la BH4

5mg/Kg/día vía intratraqueal, en la fibrosis

pulmonar inducida con bleomicina en rata

wistar a día 14.

Como consecuencia de los resultados obtenidos en los

estudios previos con respecto a la biodisponibilidad oral de

BH4 en ratón, se pretende mejorar la biodisponibilidad

pulmonar mediante la administración local del fármaco. Para

ello, tal como se explica en el apartado 3.7 de Materiales y

métodos, se puso a punto la técnica de administración

intratraqueal con MicroSprayer® en rata wistar.

Resultados

149


Durante el seguimiento periódico del peso de las ratas

se obtuvo el perfil que se representa en la Figura 44.

La administración de BH4 por vía intratraqueal no

mejora la pérdida de peso producida por la bleomicina.

Figura 44. Evolución del peso corporal de las ratas desde la inducción de fibrosis con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul).

0 5 10 15150

200

250

300

350 SF i.t + vehículo i.t (n=9)

BL i.t + vehículo i.t (n=20)

BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=12)

Tiempo (días)

Pes

o (g

)

Resultados

150

4.6.2. Peso de pulmón, proteínas en pulmón e


Se pesaron los pulmones y ambos ventrículos del

corazón, a punto final, el día catorce del experimento. Se

calcularon las relaciones existentes entre peso pulmón/peso

animal y ventrículo derecho/ ventrículo izquierdo. La

administración de BH4 por vía intratraqueal no mejoró ninguno

de los cocientes caculados. Estos resultados discrepan de los

obtenidos por vía oral, donde se observaba una tendencia a la

disminución del peso pulmonar y sobre todo un efecto a nivel

vascular, ya que la hipertrofía ventricular derecha disminuyó

con la administración de BH4 por vía oral.

En cuanto al parámetro de proteínas totales en

parénquima pulmonar, se observa que la BH4 tiende a

disminuir el aumento de proteínas totales producido por la

bleomicina en el tejido, si bien no es capaz de revertirlo

significativamente.

Resultados

151

Figura 45. Representación gráfica del peso del pulmón de las ratas y del índice de hipertrofía ventricular derecha a los catorce días de la inducción de fibrosis pulmonar con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). n, es el mínimo número de animales utilizados para el cálculo de la media y su SEM. #p<0,05 frente a control; ###p<0,001 frente a control.

0.000

0.005

0.010

0.015###

Peso pulmón

Pes

o pu

lmón

/Pes

o ra

ta

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + vehículo i.t (n=10)BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)

#

Índice de HVD

Pes

o V

D/ p

eso

VI

0

100

200

300

400

500

##

Proteínas en pulmón

Con

c. p

rote

ínas

(m

g/g)

Resultados

152

4.6.3. Células extravasadas en lavado

broncoalveolar.

Dada la importancia de la extravasación celular como

medida de la respuesta inflamatoria, se cuantificaron las células

totales y diferenciadas tal como se explica en el apartado 3.9

de Materiales y métodos.

Se observó un incremento significativo de células totales

en el grupo de bleomicina respecto al grupo control. El grupo

tratado con BH4 aumentó la extravasación celular en lavado

broncoalveolar respecto al grupo de bleomicina. A su vez, el

aumento de los cuatro tipos celulares en el grupo de bleomicina

no fue remitido al tratar el pulmón con BH4. Estos resultados

hacen pensar que la administración diaria intratraqueal de BH4

empeora la lesión pulmonar con más inflamación que la

administración única de bleomicina.

Resultados

153

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + Vehículo i.t (n=7)BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)

##C

élul

as to

tale

s (x

106 )

Neutrofilos Linfocitos Eosinófilos Macrófagos0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Tip

os c

elul

ares

(x1

06 )

A.

B.

Figura 46. Células totales (A) y contaje diferencial (B) en lavado broncoalveolar a los catorce días de la inducción de fibrosis pulmonar con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). ##p<0,01 frente a control.

Resultados

154

4.6.4. Concentración de proteínas en lavado

broncoalveolar (LBA).

La determinación de proteínas totales en lavado

broncoalveolar se utilizó, al igual que en estudios anteriores

para medir la respuesta inflamatoria pulmonar a la bleomicina.

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 47.

El aumento extremadamente significativo que se produjo en la

concentración de proteínas en LBA del grupo de bleomicina

respecto al grupo control, no fue revertido con el tratamiento

intratraqueal de BH4.

0.0

0.1

0.2

0.3


###

Con

c. p

rote

inas

(mg/

ml)

Figura 47. Representación gráfica de la concentración de proteínas en LBA de rata a los catorce días de la inducción de fibrosis pulmonar con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). ###p<0,001 frente a control.

Resultados

155



La expresión génica de colágeno tipo 1 se vió

aumentada de forma significativa en el grupo de

bleomicina (3,9 ± 0,6) respecto al grupo control (1,1 ±

0,2), al igual que ocurrió en los experimentos anteriores

con ratones.

La administración de BH4 disminuye la expresión

(2,1 ± 0,4) respecto al grupo de bleomicina de manera

no significativa.

0

1

2

3

4

5SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + Vehículo i.t (n=7)


#

Exp

resi

ón r

elat

iva

del A

RN

m d

e C

OL1

A1

Figura 48. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de Col1a1 en tejido pulmonar tras catorce días de tratamiento desde la inducción de fibrosis con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). #p<0,05 frente a control.

Resultados

156



La expresión génica de Tgf-β aumentó en el grupo

expuesto a bleomicina, y la administración local de BH4

5 mg/Kg/día durante catorce días revirtió este aumento

de forma significativa.

0.0

0.5

1.0

1.5


#

*

Exp

resi

ón r

elat

iva

del A

RN

m d

e T

GF

-ββ ββ

Figura 49. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Tgf-β en tejido pulmonar a los catorce días de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). #p<0,05 frente a control, *p<0,05 frente a bleomicina.

Resultados

157



El factor de crecimiento de tejido conectivo se vió

ligeramente aumentado tras la inducción de fibrosis con

bleomicina. Este aumento fue disminuido con el

tratamiento intratraqueal de BH4 5mg/Kg/día (Figura

50).

0

1

2

3SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + vehículo i.t (n=7)BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)

Exp

resi

ón r

elat

iva

del A

RN

m d

e C

TG

F

Figura 50. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Ctgf en tejido pulmonar tras catorce días de tratamiento con sepiapterina desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). No se dió significación estadística.

Resultados

158

�� Expresión génica de la mucina 5AC (Muc5ac).

Se observó un aumento de la expresión de Muc5ac,

indicativo de hipersecreción mucosa en condiciones

patológicas, y la suplementación intratraqueal con

bleomicina no mejora la expresión respecto al grupo de

bleomicina.

0

2

4

6

8SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + vehículo i.t (n=7)BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

muc

5ac

#

Figura 51. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Muc5ac en tejido pulmonar a los catorce días de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). #p<0,05 frente a control.

Resultados

159

�� Expresión génica del factor de necrosis tumoral

alfa (Tnf- α).

La expresión de Tnf-α se vio significativamente

aumentada en el grupo de bleomicina, pero la

administración de BH4 5 mg/Kg/día durante catorce días

no revirtió este aumento.

0

2

4

6SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + vehículo i.t (n=7)

BL i.t + BH4 5mg/Kg i.t (n=7)#

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

TNF-

αα αα

Figura 52. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Tnf en tejido pulmonar a los catorce días de la inducción de fibrosis en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). #p<0,05 frente a control.

Resultados

160


Los niveles de expresión de ARNm de End1

incrementan con respecto al grupo control.

La administración de BH4 5 mg/Kg/día por via

intratraqueal durante catorce días provocó un aumento

extremadamente significativo con respecto al grupo de

bleomicina. Lo que indica que la expresión de End1

aumentó en respuesta a la administración de BH4.

0

5

10

15SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + vehículo i.t (n=7)


***

#

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

endo

telin

a-1

Figura 53. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen End1 en tejido pulmonar tras catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul). #p<0,05 frente a control. ***p<0,001 frente a bleomicina.

Resultados

161



No se observaron cambios significativos en los

niveles de expresión del ARNm del gen Gch1 tras la

administración de bleomicina. Se observó una ligera

disminución de la expresión tras la administración BH4

intratraqueal.

0.0

0.5

1.0

1.5SF i.t + vehículo i.t (n=6)BL i.t + vehículo i.t (n=7)


Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

GT

PC

H-I

Figura 54. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm del gen Gch1 en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul).

Resultados

162

4.6.6. Determinación de los niveles de BH4.

Se determinaron los niveles plasmáticos, pulmonares y

hepáticos de BH4 tal y como se describe en el apartado 3.11

de materiales y métodos mediante cromatografía líquida.

Coincidiendo con los resultados obtenidos para la rata

en el primer estudio, las concentraciones plasmáticas y

hepáticas diminuyen en presencia de bleomicina respecto al

grupo control, mientras que en el tejido pulmonar la

concentración de BH4 aumentó en el grupo de bleomicina con

respecto al grupo control.

La administración de BH4 intrapulmonar demostró una

clara absorción sistémica del fármaco, ya que sus niveles

plasmáticos incrementaron tras catorce días de tratamiento.

Esto ocurrió tanto en el grupo expuesto a bleomicina como en

el grupo que fue tratado únicamente con el medicamento

(Figura 56 A).

A nivel hepático y pulmonar, el fármaco no fue capaz de

restablecer los niveles del grupo control (Figura 56 B y C).

Resultados

163

0.0

0.1

0.2

0.3


Con

c. p

ulm

ón B

H4

(µµ µµg

/g)

Figura 55. Niveles de BH4 en plasma (A), pulmón (B) e hígado (C) tras catorce días de la inducción de fibrosis en los cuatro grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de BH4 5 mg/Kg/día vía intratraqueal (color azul), control fármaco (azul claro). #p<0,05 frente a control; ***p<0,001 frente a bleomicina.

0

50

100

150

******

#

Con

cent

raci

ones

pla

smát

icas

de

BH

4 (n

g/m

l)

A.

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Con

cent

raci

ones

de

BH

4 e

n pu

lmón

(µµ µµg

/g)

B.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Con

cent

raci

ón d

e B

H4

en h

ígad

o (

µµ µµg/g

)

C.

SF i.t + vehículo i.t (n=6)

BL i.t + vehículo i.t (n=7)

SF i.t + BH4 i.t 5 mg/Kg (n=6)

BL i.t + BH4 i.t 5 mg/Kg (n=7)

Resultados

164

4.7. Efecto farmacológico del roflumilast 1

mg/Kg/día vía oral en la fibrosis pulmonar

inducida con bleomicina.

El roflumilast se ensayó a la dosis de 1 mg/Kg/día por vía

oral, en el protocolo preventivo durante catorce días.

Al igual que en el estudio farmacológico de la BH4 por vía

intratraqueal, y tal como se describe en el apartado de

Materiales y métodos se utilizó la especie de rata para este

estudio. Estos mismos resultados se confirmaron en la especie

de ratón

Resultados

165


El grupo de bleomicina sufre un descenso en el peso

corporal a punto final del 35%, lo que demuestra una

importante pérdida de la calidad de vida en los animales con

afectación pulmonar. El tratamiento con roflumilast 1 mg/Kg/día

mejora en un 50% el peso de los animales fibróticos a punto

final.

0 2 4 7 11 14150

200

250

300

350SF i.t + vehículo v.o (n=10)

BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=10)

Tiempo (días)

Pes

o ra

ta (

g)

Figura 56. Evolución del peso corporal de las ratas desde la inducción de fibrosis con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo).

Resultados

166



En concordancia con los estudios anteriores, el grupo

expuesto a bleomicina presentó un aumento de estos tres

parámetros, a consecuencia de la inflamación y la hipoxia a la

que se ven sometidos los pulmones, con respecto al grupo

control.

La administración de roflumilast 1 mg/Kg/día por vía

oral, presentó una tendencia a mejorar el perfil de la bleomicina

en los tres parámetros estudiados (Figura 57).

Así, el peso pulmonar, aumentado debido a la

inflamación y al engrosamiento de las paredes alveolares que

se produce en la fibrosis, disminuyó significativamente con la

administración de roflumilast oral 1 mg/Kg/día.

En cuanto a las proteínas totales en pulmón seco

incrementan como respuesta a la bleomicina y revierten

parcialmente tras la administración de roflumilast 1 mg/Kg/día,

aunque sin significación estadística.

Un mayor índice de hipertrofia ventricular debido a la

hipoxia que sufren los ratones con afectación pulmonar se

observó en el grupo de bleomicina. El tratamiento oral con

roflumilast 1 mg/Kg/día mejoró ligeramente la hipertrofia

ventricular derecha.

Resultados

167

Figura 57 . Peso del pulmón, proteínas totales en pulmón e índice de hipertrofía ventricular derecha a los catorce días de la inducción de fibrosis pulmonar con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). n, es el mínimo número de animales utilizados para el cálculo de la media y su SEM. #p<0,05 frente a control; ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicna.

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

###

*

Pes

o pu

lmón

/pes

o ra

ta

0

100

200

300

400

500

##

Con

cent

raci

ón d

e pr

oteí

nas

tota

les

en p

ulm

ón (

mg/

g)

0.2

0.3

0.4

VD

/(VI+

sept

o) #

SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)

Peso pulmón

Proteinas en pulmón

Hipertrofiaventricular derecha

Resultados

168

4.7.3. Células extravasadas en lavado


El roflumilast disminuye de forma significativa el

aumento en el número de células totales extravasadas en

pulmón producido por la bleomicina. Concretamente, se

observa una disminución en los cuatro tipos celulares:

neutrófilos, linfocitos, eosinófilos y macrófagos.

0.0

0.5

1.0

1.5

###



BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)

*

Tot

al c

ells

(x1

06 )

Neutrofilos Linfocitos Eosinófilos Macrófagos0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

nº c

elul

as x

106 (

valo

r ab

solu

to)

A.

B.

Figura 58. Células totales (A) y contaje diferencial (B) de células extravasadas en lavado broncoalveolar a los catorce días de la inducción de fibrosis pulmonar con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). ###p<0,01 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.

Resultados

169

4.7.4. Concentración de proteínas en lavado


Las proteínas totales medidas en el lavado

broncoalveolar libre de células, tal como se expone en el

capítulo de Materiales y métodos, apartado 3.9, aumentaron de

manera muy significativa tras la exposición a bleomicina;

mientras que el tratamiento oral con roflumilast revirtió

parcialmente, pero de forma significativa, este aumento.

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)

###

*

Con

cent

raci

ón d

e pr

otei

nas

en L

BA

(m

g/m

l)

Figura 59. Concentración de proteínas en LBA de rata a los catorce días de la inducción de fibrosis pulmonar con 7.5 UI/Kg de bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.

Resultados

170


�� Expresión génica de colágeno tipo I (Col1a1).

La expresión de colágeno tipo 1 incrementa debido

a la bleomicina casi en cuatro veces la del control. El

tratamiento con roflumilast via oral 1 mg/Kg/día atenuó

de forma significativa este incremento.

0

1

2

3

4

5

###

*


Exp

resi

ón r

elat

iva

del A

RN

m d

e C

OL1

A1

Figura 60. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de Col1a1 en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.

Resultados

171


crecimiento beta (Tgf- β).

Se observó un aumento de ARNm de Tgf-β

extremadamente significativo para el grupo de

bleomicina. La administración de roflumilast oral 1

mg/kg/día redujo este aumento de forma significativa

(Figura 61).

0

2

4

6

8###

*


Exp

resi

ón r

elat

iva

de

AR

Nm

del

TG

F-

ββ ββ

Figura 61. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de Tgf-β en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.

Resultados

172



La expresión de Ctgf, como reflejo del efecto que

produce el TGF- β, aumentó muy significativamente en

presencia de bleomicina. Además, el tratamiento con

roflumilast 1 mg/Kg/día, en este caso también atenuó

este incremento.

0

2

4

6

###

*

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

CT

GF


Figura 62. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de Ctgf en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.

Resultados

173

�� Expresión génica del factor de necrosis tumoral

alfa (Tnf).

La expresión de Tnf se vió significativamente

aumentada en el grupo expuesto a bleomicina, y la

administración de roflumilast 1 mg/Kg/día via oral remitió

este aumento de forma significativa.

0

1

2

3

4

5SF i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + vehículo v.o (n=10)BL i.t + RF 1 mg/Kg v.o (n=10)

*

#

Exp

resi

ón r

elat

iva

de

AR

Nm

del

TN

F-

αα αα

Figura 63. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de Tnf-α en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). #p<0,05 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.

Resultados

174

�� Expresión génica de la mucina 5AC (Muc5ac).

Se observó un aumento muy significativo de la

expresión de Muc5ac en el grupo de bleomicina. La

administración de roflumilast 1 mg/Kg/día atenuó este

aumento significativamente.

0

1

2

3

4

5

###

*


Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

Muc

5ac

Figura 64. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de Muc5ac en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). ###p<0,001 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.

Resultados

175


La lesión pulmonar producida por la bleomicina

aumentó de forma significativa la expresión de End1. La

administración de roflumilast 1 mg/Kg/día durante

catorce días revirtió por completo este aumento.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0


*

#

Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

endo

telin

a-1

Figura 65. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de End1 en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). #p<0,05 frente a control; *p<0,05 frente a bleomicina.

Resultados

176



No se observó cambio en la expresión del ARNm

del enzima encargado de la síntesis de BH4 en el grupo

de bleomicina respecto al grupo control.

La administración de roflumilast 1 mg/Kg/día

produjo una disminución no significativa de la expresión

con respecto a los grupos control y bleomicina.

0.0

0.5

1.0


Exp

resi

ón r

elat

iva

del

AR

Nm

de

GT

PC

H-I

Figura 66. Cuantificación relativa de los niveles de ARNm de Gch1 en tejido pulmonar a los catorce días desde la inducción de fibrosis con bleomicina en los tres grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo). No se dió significación estadística.

Resultados

177

4.7.6. Determinación de los niveles de BH4.

Se pretendió investigar si uno de los mecanismos de

acción antifibrótica del roflumilast se encuentraba a nivel de la

regulación sistémica y endotelial de la tetrahidrobiopterina.

Como hemos visto en todos los estudios anteriores y

más detalladamente en el primero, los niveles de BH4

plasmáticos se detectaron disminuidos en los individuos

afectados de fibrosis pulmonar. Mientras que los niveles

pulmonares se suelen encontrar elevados.

Se midieron los niveles de BH4 en plasma, pulmón e

hígado.

Tal como nos muestra la Figura 67, se cumplió la

relación inversa en cuanto a niveles de BH4 entre plasma y

pulmón. Aunque, como se ha visto anteriormente, en la especie

de rata, los niveles de expresión génica entre control y

bleomicina no presentaron diferencias estadísticas.

Resultados

178

0

20

40

60

80

Con

cent

raci

ón p

lasm

átic

asde

BH

4 (n

g/m

l)

0.0

0.1

0.2

0.3

Con

cent

raci

ón d

e B

H4

en

pulm

ón (

ug/g

)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Con

cent

raci

ón d

e B

H4

en h

ígad

o (

µµ µµg/g

)


A.

B.

C.

Figura 67. Niveles de BH4 en plasma (A), pulmón (B) e hígado (C) tras catorce días de la inducción de fibrosis en los cuatro grupos experimentales estudiados: control (color verde), fibrosis (color rojo), fibrosis con tratamiento de roflumilast 1 mg/Kg/día vía oral (color amarillo), control fármaco (azul claro). No se dió significación estadística.

Resultados

179

4.8. Tabla resumen resultados

≅≅≅≅≅≅≅≅ ≅≅≅≅

≅≅≅≅ ≅≅≅≅≅≅≅≅ ≅≅≅≅

Col1a1 ≅≅≅≅Tgf-β

Ctgf

Tnf-α ≅≅≅≅Muc5ac ≅≅≅≅

End-1

Gch1 ≅≅≅≅ ≅≅≅≅Plasma

Pulmón

Hígado

Niv

ele

s d

e B

H4

Peso corporal

Peso pulmón

Proteínas totales

pulmón

Hipertrofia ventricular

derecha

Células totales LBA

=

=

=

=

=

=

=

Bleomicina

7 ó 14

TABLA R

ESUM

EN

RESULT

ADOS

Días desde bleomicina

Proteínas totales LBA

Exp

resi

ón

gé

nic

a

14

Ratones C57Bl/6J Rata Wistar

BH4 v.o

20 mg/Kg/día

Vs

Bleomicina

Vs

Bleomicina

Sepiapterina v.o

7 14 7 14 14

10 mg/Kg/día

BH4 i.t

5 mg/Kg/día

Vs

Bleomicina

Vs

Bleomicina

RF v.o

1 mg/Kg/día

=

=

=

=

=

=

=

=

=

=

=

=

=

=

=

=

=

=

=

= =

=

=

=

Tabla 10. Resumen de los resultados expuestos anter iormente. Abreviaturas: RF, roflumilast; LBA lavado broncoalveolar. En color azul, resultados nuevos de esta

memoria; en color morado, resultados ya descritos anteriormente.

5. DISCUSIÓN

Discusión

182

El objetivo de la presente Memoria es estudiar la

implicación de la tetrahidrobiopterina en la fibrosis pulmonar.

Para ello se diseñó el estudio en varias etapas. En la primera,

se investigó cómo se modifican los niveles de BH4 en

condiciones patológicas, en tres especies distintas: ratón, rata y

humanos. Se estudió un grupo control y un grupo afectado de

fibrosis pulmonar de cada especie.

La cepa de ratón empleada fue la C57BL/6J por su

validez en trabajos previos, ya que su genoma está bien

caracterizado, posee un ciclo de reproducción corto, es de

tamaño pequeño, fácil manipulación y menor coste. En rata se

eligió la cepa wistar, también muy utilizada en este y otros tipos

de estudios científicos. El ensayo en humanos, es poco

invasivo y sencillo para el paciente.

Para rata y ratón se escogió el modelo experimental de

fibrosis pulmonar inducido por bleomicina, ampliamente

utilizado por la comunidad científica a las dosis establecidas de

7.5 y 3.75 UI.Kg-1. Este modelo se caracteriza por presentar

una fase inflamatoria desde el día de la administración de

bleomicina intratraqueal hasta el día 7, y una fase de fibrosis

pulmonar que comprende desde el día 7 al día 21. El día 14 es

el más útil para valorar la fibrosis, ya que presenta gran fibrosis,

menor variabilidad en la respuesta fibrótica y menor mortalidad

que a día 21.

Los niveles plasmáticos y tisulares obtenidos en los

grupos control para cada especie (Tabla 7), coinciden con los

Discusión

183

obtenidos en otros trabajos publicados114,121,122, siendo

alrededor de 60, 30 y 3 ng/ml en plasma para las especies de

ratón, rata y humanos respectivamente; alrededor de 0,2 µg/g

en pulmón de rata y ratón, y 0,8 µg/g en hígado de rata y ratón.

En la primera especie ensayada, ratón C57Bl/6J, se

planteó estudiar la evolución de los niveles de BH4 en plasma,

pulmón e hígado en función del tiempo, durante el proceso de

fibrosis pulmonar inducida con bleomicina. Teniendo en cuenta

que la fase aguda e inflamatoria del proceso se estima hasta el

día 7 y que la fase fibrótica se da en la segunda y tercera

semana77, se midieron los niveles a día 7, 14 y 21 desde la

inducción de fibrosis.

Se observó que la fase aguda del proceso coincide con

niveles sistémicos de BH4 muy disminuidos, lo que podrían

indicar que existe inflamación crónica, que induce la producción

de especies reactivas de oxígeno (ERO) y de especies

reactivas de nitrogéno (RNS), que deberán neutralizarse por los

mecanismos de defensa antioxidantes, y si estos no son

suficientemente efectivos, se genera una situación de estrés

oxidativo97, con depleción de componentes celulares123 y de

antioxidantes plasmáticos, entre ellos, la BH4. Existen varios

estudios realizados en otras enfermedades crónicas que

registran una correlación positiva entre disminución plásmatica

de BH4 y funcionalidad reducida124-126.

Por lo mismo, el estrés oxidativo convierte a la BH4,

cofactor esencial de la eNOS, en su forma oxidada 7,8-

Discusión

184

dihidrobiopterina en el endotelio. La deficiencia de BH4

resultante causa un desacoplamiento de la eNOS,

produciéndose disfunción endotelial, frecuente en muchas

enfermedades cardiovasculares y particularmente en la

hipertensión pulmonar que contribuye a la fibrosis pulmonar127.

Incluso se ha propuesto recientemente la BH4 plasmática,

concretamente la relación BH4/BH2, como marcador de

disfunción endotelial124 y como nueva diana terapéutica para su

tratamiento128.

En la línea de la búsqueda de un biomarcador de fibrosis

pulmonar, y continuando con el primer estudio, se empleo la

rata wistar. Los resultados muestran una tendencia similar a los

obtenidos en ratón.

También se realizó un estudio preliminar en pacientes

afectados de fibrosis pulmonar idiopática, en el que a pesar de

que sólo participaron 14 pacientes, se reprodujeron los

resultados del estudio con ratones. Presentaron

concentraciones plasmáticas disminuidas con respecto al grupo

de 6 voluntarios sanos. Como limitación de este estudio, cabe

indicar que 3 de los pacientes reclutados toman medicación

para la fibrosis que podría modificar la función endotelial y el

estrés oxidativo.

En el tejido pulmonar la BH4 se comporta de manera

inversa. Los animales que fueron expuestos a bleomicina

presentan niveles elevados con respecto al grupo control.

Discusión

185

Estos niveles también se encuentran ligeramente más elevados

en la fase aguda del proceso que en la crónica o fibrótica.

Todo pulmón, como defensa al estrés oxidativo genera

moléculas antioxidantes; éstas, al igual que los mecanismos

oxidantes, varían en función de la enfermedad intersticial97. La

BH4 podría ser una de estas moléculas en la fibrosis inducida

por bleomicina en ratón. Su abundancia, debido a la extensa

superfice de endotelio capilar pulmonar y a la formación de

nuevos vasos como respuesta a la hipoxia generada por la

lesión pulmonar, podría explicar que no se produzca depleción

como ocurre en el plasma.

Estudios preclínicos han demostrado que la

suplementación farmacológica o genética con BH4 previene la

generación de anión superóxido y la disfunción endotelial en

modelos experimentales de enfermedades cardiovasculares103.

Además se ha observado que el tratamiento con BH4 tiene

efecto beneficioso en la disfunción endotelial en humanos;

mejora la relajación de los vasos sanguíneos en pacientes con

enfermedad arterial coronaria, diabetes tipo II, fumadores y

aterosclerosis100,129-131.

Actualmente se están realizando veintidós ensayos

clínicos en todo el mundo para testar su eficacia y seguridad en

diversas enfermedades45. No existen publicaciones que

relacionen directamente las enfermedades intersticiales con la

tetrahidrobiopterina, pero sí existen estudios que demuestran

efecto farmacológico de BH4 en aterosclerosis132, fibrosis e

Discusión

186

hipertrofia cardíaca115, vasoconstricción pulmonar hipóxica133, y

con la hipertensión pulmonar128,133,134, frecuente esta última en

FPI.

Tras los resultados obtenidos se planteó la administración

de BH4 como tratamiento farmacológico para la fibrosis

pulmonar, proponiéndose el estrés oxidativo y el endotelio

capilar pulmonar como dianas terapéuticas. Con la

administración de BH4 se estudiaron los parámetros más

frecuentes del proceso fibrótico, tanto en la fase inflamatoria

como en la fibrótica.

Se emplearon dosis de 20 mg/Kg/día, ya que se ha visto

en algunos estudios que la dosis efectiva se encuentra entre 5-

20 mg/Kg/día. Dosis superiores, concretamente 50 mg/Kg/día,

conllevan una pérdida de peso como reacción adversa132.

La BH4 20 mg/Kg/día por vía oral, mejoró el peso de los

animales en un 25% respecto al grupo de bleomicina a punto

final, día 14. En el estadio inflamatorio no mostró mejoría frente

al aumento del peso pulmonar, ni frente al aumento de las

proteínas totales en pulmón. En cambio, a nivel molecular

regula a la baja la sobreexpresión producida por la bleomicina

de los genes implicados en el proceso fibrótico, como son, el

colágeno tipo 1 (Col1a1), la mucina (Muc5ac), el factor

transformador del crecimiento (Tgf-β1) y el factor de

crecimiento de tejido conectivo (Ctgf). La administración de

BH4 también disminuye el aumento de endotelina-1 (End1),

seguramente vía oxido nítrico sintasa a nivel endotelial, con

Discusión

187

predominio de los receptores de ET-B y disminución de los

receptores de ET-A. En cambio, la suplementación con BH4 no

disminuyó la expresión del enzima de su síntesis, la guanosina

trifosfato ciclohidrolasa I (Gch1).

Al administrar BH4, los ratones expuestos a bleomicina,

que tal como se ha descrito en el primer estudio ofrecían una

disminución aguda de los niveles de BH4 plasmáticos,

recuperaron los niveles por completo. Por otro lado, el aumento

de los niveles de BH4 a nivel pulmonar y la disminución a nivel

hepático no fueron revertidos al administrar BH4 durante siete

días.

El estadío fibrótico se caracterizó por un aumento de la

hipertrofia ventricular derecha, que se compensó con la

suplementación de BH4. Ahora sí, tras catorce días de

tratamiento, la BH4 contrarresta el aumento del peso del

pulmón inducido por la bleomicina. Las proteínas pulmonares

no se ven afectadas en este estadio de la enfermedad. El

aumento en la expresión de colágeno tipo 1, Muc5ac, End1,

Ctgf y Tgf-β1 producido por la bleomicina fue disminuido con la

suplementación con BH4 de forma significativa. La expresión

de Gch1 se mantiene elevada aún con la suplementación de

BH4. En otro estudio también se observó una reducción

significativa en los niveles de colágeno tipo 4, tras 12 semanas

de tratamiento con BH4 en ratones ApoE-KO (con

aterosclerosis)132.

Discusión

188

La administración de BH4 durante catorce días recuperó

la bajada de los niveles plasmáticos de BH4 que se produce en

los ratones expuestos a bleomicina; mientras que en el pulmón

se mantuvieron como en la bleomicina. En hígado, los niveles

de BH4 siguen el mismo perfil que en plasma para el grupo de

bleomicina, mientras que la administración de BH4 no recupera

los niveles basales.

Además de la BH4, también se probó su precursor

endógeno, la sepiapterina, ya que algunos estudios le

adjudican un mejor alcance tisular109.

La sepiapterina consiguió un aumento de peso del 30%

con respecto al grupo de bleomicina, siendo un 5% más

efectiva que la BH4. En la fase inflamatoria revirtió

parcialmente el aumento del peso de los pulmones instilados

con bleomicina, pero no revirtió el aumento de proteínas totales

acumuladas en pulmón como consecuencia del proceso

inflamatorio. La sepiapterina disminuyó el aumento de la

expresión de Col1a1, Muc5ac, End1, Ctgf y Tgf-β1; mientras, la

expresión de Gch1 no se revierte con la administración de

sepiapterina, al igual que ocurría con BH4.

La disminución de los niveles plasmáticos de BH4 no se

recupera significativamente con la administración de

sepiapterina a diferencia de lo que ocurría cuando se

administraba BH4; la misma situación pero a la inversa ocurre

en el pulmón. En hígado sí se recupera la ligera disminución de

Discusión

189

los niveles de BH4 que sufren los animales tras siete días de la

inducción de bleomicina.

En el estado crónico, tras 14 dias de tratamiento con

sepiapterina se revierte la sobreexpresión de col1a1, Tgf-β,

Ctgf, Muc5ac y End1, mientras que no es efectiva para reducir

la expresión de Gch1.

Después del tratamiento con sepiapterina durante catorce

días no se alcanzan las concentraciones plasmáticas del grupo

control, tampoco se consigue atenuar el aumento de la

concentración en pulmón causada por la bleomicina. En hígado

la sepiapterina no alcanza a modificar los niveles ligeramente

disminuidos debido a la bleomicina.

Tras los resultados poco significativos que se obtuvieron

con la administración de sepiapterina vía oral, y para sacar

conclusiones del efecto farmacológico de la sepiapterina en la

fibrosis pulmonar, se comprobó el perfil farmacocinético y la

correcta biotransformación en BH4.

Tras una dosis única de 10 mg/Kg de sepiapterina por vía

oral, se alcanzó una concentración plasmática máxima (C max)

de BH4 de 228,4 ng/ml a las 2h (T max) de la administración.

En tejido pulmonar la C max fue de 0,22 µg/g a la hora desde la

administración, similar a la del grupo control. Estos resultados

reflejan la baja biodisponibilidad pulmonar que se obtiene con

la administración de sepiapterina 10 mg/Kg por vía oral.

Discusión

190

Con todos estos resultados se llegó a la conclusión de

que la administración oral de BH4 beneficiaba más que su

precursor el conjunto de alteraciones producidas en la fibrosis

pulmonar, notándose más la diferencia a día 14.

La administración de medicamentos por vía intrapulmonar

ha sido propuesta por varios autores como una novedosa vía

para la absorción sistémica de fármacos135. La BH4 presenta

características físico-quimícas adecuadas para esta vía de

administración. Así, se seleccionó la via de administración

intrapulmonar para llevar a cabo el estudio del efecto

farmacológico de BH4 a la dosis de 5 mg/Kg/día.

Este estudio generó resultados poco prometedores a

nivel macroscópico y de inflamación, mientras que a nivel

molecular disminuía claramente la expresión génica de Tgf-β y

ligeramente la de colágeno, Ctgf y Gch1. La administración

intratraqueal aumentó significativamente los niveles

plasmáticos de BH4, demostrando que la BH4 por via

intrapulmonar presenta absorción sistémica.

Esto podría explicarse si existe una elevada

vasodilatación por el aumento de NO en exceso, o bien un

proceso angiogénico, que hace que la End1 suba de manera

desproporcionada, incluso por encima del control, para

contrarestarlo, ya que se ha descrito su efecto como regulador

del flujo vascular a nivel local. Champion HC et al., en 1999,

demostraron que los ratones expuestos a bleomicina presentan

Discusión

191

la presión arterial pulmonar elevada y resistencia vascular

pulmonar, y que se ve atenuado al administrar eNOS136.

Finalmente se empleó roflumilast, un inhibidor selectivo

de la fosfodiesterasa 4 (iPD4) en desarrollo para la enfermedad

pulmonar obstructiva crónica, y cuyos resultados en

farmacología preclínica han sido publicados recientemente137.

El roflumilast ha demostrado eficacia al disminuir la inflamación

pulmonar inducida por tabaco, el mal funcionamiento

mucociliar, el estrés oxidativo, el remodelado vascular

pulmonar, la hipertensión pulmonar, el remodelado

enfisematoso y, por último, tal como se expone en el apartado

de resultados, la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina que

nos ocupa112,137.

El roflumilast, en un estudio pendiente de publicar por

nuestro grupo de investigación, durante el protocolo preventivo

de la fibrosis inducida por bleomicina en ratón; demostró que

los ratones expuestos a bleomicina presentaron una

disminución de los niveles sistémicos de BH4, y estos se

revertían tras tratamiento farmacológico con roflumilast, de

manera dosis dependiente.

Durante el estudio farmacológico de roflumilast 1

mg/Kg/día durante catorce días los animales mejoraron su

calidad de vida, medida como aumento del peso corporal, en

un 50 % respecto al grupo de bleomicina. El aumento del peso

del pulmón por la bleomicina fue revertido significativamente

Discusión

192

por el roflumilast, y la hipertrofia ventricular generada fue

ligeramente atenuada.

El roflumilast por via oral revertió la inflamación de forma

significativa, disminuyendo las células totales y diferenciadas

extravasadas, y el aumento de proteínas totales en LBA.

En lo referente a genes implicados en el proceso

inflamatorio y fibrótico, el roflumilast revierte la sobreexpresión

de todos ellos generada por la bleomicina, coincidiendo con los

trabajos publicados hasta el momento112,137. El enzima

encargado de la síntesis de BH4 no se vió afectado en el grupo

de bleomicina respecto al control, y la administración de

roflumilast tiende a disminuir ligeramente esta expresión basal.

Respecto a las concentraciones de BH4 en plasma, se

observó una disminución de la concentración en el grupo de

bleomicina pero no se encontraron diferencias significativas con

respecto al control como ocurre en las especies de ratón y

humana. Aún así, el roflumilast demuestra su eficacia

aumentando las concentraciones plasmáticas por encima de

las basales, y disminuyendo las concentraciones pulmonares

que se encuentran elevadas en el grupo expuesto a

bleomicina.

6. CONCLUSIONES

Conclusiones

194

En resumen, para el estudio de la tetrahidrobiopterina

(BH4) en la fibrosis pulmonar, en primer lugar, se estandarizó el

modelo animal de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en

las dos especies animales ensayadas y se puso a punto la

técnica para el análisis de BH4 en muestras biológicas. En

segundo lugar, se realizó un estudio comparativo de los niveles

fisiólogicos y patológicos de BH4, en rata, en ratón y en

humano. Finalmente, tras el ajuste previo de la dosis para cada

vía de administración se realizó el estudio farmacológico de la

BH4 vía oral y via intratraqueal, de su precursor, la

sepiapterina, via oral, y por último del roflumilast via oral.

Con todo ello, en un modelo de fibrosis pulmonar

inducida por la administración intratraqueal de bleomicina en

animales de experimentación, se puede concluir que:

1. La BH4 es un posible biomarcador plasmático de

fibrosis pulmonar, ya que se encuentra disminuido en

animales afectados de fibrosis por bleomicina, e incluso

en humanos con fibrosis pulmonar idiopática.

2. La administración exógena de 20 mg/Kg/día de BH4

revierte las concentraciones plasmáticas y mejora

parámetros indicativos de fibrosis pulmonar, sobre todo a

nivel vascular.

3. La administración exógena de 10 mg/Kg/día de

sepiapterina no mejora, en general, los parámetros

Conclusiones

195

indicativos de fibrosis pulmonar. Posiblemente por la

corta semivida de eliminación que presenta y por la baja

biodisponibilidad pulmonar demostrada.

4. La administración intratraqueal de BH4 5 mg/Kg/día no

mejora el proceso fibrótico.

5. La administración de roflumilast 1 mg/Kg/día por vía

oral mejora la lesión pulmonar producida por la

bleomicina proporcionando cambios en los niveles de

BH4.

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8. ABREVIATURAS

Abreviaturas

214

� ADN: Ácido Desoxirribonucleico.

� ADNc : Ácido Desoxirribonucleico complementario.

� AMP: Adenosina monofosfato.

� AMPc : Adenosina monofosfato cíclica.

� ARNm : Ácido Ribonucleico mensajero.

� ARNm : Ácido Ribonucleico mensajero.

� BCA: Ácido bicincónico.

� BH4: Tetrahidrobiopterina.

� BL : Bleomicina

� C57BL/6J : cepa de ratón C57BLACK6, también

abreviada cómo black 6.

� CEEA: Comité Ético de Experimentación Animal.

� CEIC: Comité de Ética de Investigación Clínica.

� Col1a1: Colágeno tipo I.

� Ct: Threshold cycle. Ciclo umbral.

� Ctgf : Factor de crecimiento del tejido conectivo.

� CV: Coeficiente de variación.

� DLCO: Capacidad de transferencia de CO

� DTE: Ditioeritritiol.

� EDTA: Etylen diamine tetraacetil acid. Ácido

etilendiaminotetraacético.

� EEUU: Estados Unidos.

� ELISA: Enzyme-Linked Inmuno Sorbent Assay. Ensayo

inmunosorbente ligado a enzima.

� EMA: Agencia Europea del Medicamento.

� eNOS: Óxido nítrico sintasa endotelial.

� EPOC: Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica.

Abreviaturas

215

� ERO: Especies reactivas de oxígeno.

� Et-I: Endotelina I.

� FCV: Capacidad vital forzada

� FDA: Food and Drug administration.

� FPI: Fibrosis Pulmonar Idiopática.

� GSH: Glutation reducido.

� GTPCH-I: Guanosina trifosfato ciclohidrolasa-I.

� HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución.

� IFN: Interferon.

� iPD4: Inhibidores de la fosfodiesterasa 4

� LBA : Lavado broncoalveolar.

� NAC: N- acetil cisteína.

� NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato, forma

reducida.

� NO: óxido nítrico.

� NOS: óxido nítrico sintasa.

� PDE4: Fosfodiesterasa 4.

� PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo

� RF: Roflumilast.

� RT: Retrotranscripción.

� RT-PCR: Real-Time Polymerase Chain Reaction.

Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real.

� SOD: Superóxido dismutasa.

� SP: Sepiaterina.

� TAC: Tomografía axial computerizada.

� TGF: Transforming growth factor. Factor transformador

del crecimiento.

Abreviaturas

216

� TNF: Tumor necrosis factor. Factor de necrosis tumoral.

� UI: Unidades internacionales.

� VD: Ventrículo derecho.

� VI: Ventrículo izquierdo.

� VPP: Ventilación con presión positiva.

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