DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA

Director: Domínguez Juncal, Javier Dirección: Carretera de la Coruña, km 7,5

28040 Madrid Teléfono: 91 347 68 85 FAX: 91 357 31 07 Correo electrónico: secbiotec@inia.es

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PERSONAL DEL CENTRO/DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA

Personal en plantilla

Personal contratado

Domínguez Juncal, Fco. Javier Director (Inv. A2) Arroyo García, Rosa Ramón y Cajal Malpica Romero, Jose Maria Investigador A1 Revilla Calvo, Concepción Ramón y Cajal Coll Morales, Julio Investigador A1 Lorenzo Gilsanz, Mª del Mar Juan de la Cierva Ponz Ascaso, Fernando Investigador A1 Ganges Espinosa, Lilliane Juan de la Cierva Alonso Marti, Covadonga Investigador A2 Abraham Padrón, Zamira Juan de la Cierva Alonso Moreno, Fernando Investigador A2 Escribano Romero, Estela Juan de la Cierva Blasco Lozano, Rafael Investigador A2 Álvarez Vega, Belén Titulado Superior Martínez Escribano, José Ángel Investigador A2 Del Prete, Julieta Titulado Superior Saiz Calahorra, Juan Carlos Investigador A2 Galindo Barreales, Inmaculada Titulado Superior Salinas Muñoz, Julio Investigador A2 Gómez Sebastián, Silvia Titulado Superior Soler Llinares, Consuelo Investigador A2 González Camacho, Fernando Titulado Superior Del Pozo Benito, Juan Carlos Investigador Hernáez de la Plata, Bruno Titulado Superior Ezquerra Martínez, Ángel Investigador López Cobollo, Rosa Mª Titulado Superior Fresno Pérez, Jesús Investigador Lunello Lindow, Pablo Titulado Superior Jarillo Quiroga, José Antonio Investigador Mansilla Mansilla, Carmen Titulado Superior Piñeiro Galvin, Manuel Investigador Moreno López, Sonia Titulado Superior Sánchez Sánchez, Flora Investigador Moreno Mozo, Juan Ignacio Titulado Superior Rojo de la Viesca, Enrique Investigador Pérez Filgueira, Mariano Titulado Superior Medina Alcázar, Joaquín Técnico I+D-I Rodríguez Milla, Miguel Ángel Titulado Superior Casanova Pena, Carlos Especialista I+D+I Touriño Fernández, Ángeles Titulado Superior Martínez de la Riva, Paloma Especialista I+D+I San Martín González David Oficial Investigación Martínez Pérez, Fernando Colaborador I+D+I Carcamo Hernández, Claudia Técnico Superior Miguel Casado, Eugenio José Colaborador I+D+I Diaz Blázquez, Ana Isabel Técnico Superior Pérez Rivera, Gemma Mª Colaborador I+D+I Gómez Hernández, Nuria Técnico Superior Muñoz Plaza, Alfonso Técnico Superior Núñez Serrano, Carmen Técnico Superior Fernández Morales, Victoria Técnico Superior Oliveiro Peppe, Karina Técnico Superior Pais López, Mª Mar Jefe Negociado Ruiz Montejano, Sandra Técnico Superior Calvo Gutiérrez, Margarita Oficial Investigación Sánchez Puig, Juana Mª Técnico Superior Garrido Estepa, Macarena Ayte. Investigación Núñez del Castillo, Carolina Ayte. Investigación Becarios Fernández Cabello, Eulalia Ayte. Investigación Rocha Roso, Ana Postdoctoral Blázquez Martín, Ana Isabel Aux. Investigación Alonso Padilla, Julio Predoctoral Saez de las Heras, David Aux. Investigación Córdoba García, Laura Predoctoral Redondo Moreno, Adela Ayte. Investigación Del Olmo Montoso, Ivan Predoctoral González González, Fermín Ayte. Gest. Ser Gómez Zambrano, Mª Ángeles Predoctoral Hernández Verdeja, Tamara Predoctoral Jiménez de Oya, Nereida Predoctoral Jurado Sánchez, Silvia Predoctoral Lázaro Somoza, Ana Predoctoral López González, Leticia Predoctoral Manzano Fernández, Concha Predoctoral Narro Diego, Laura Predoctoral Perea Resa, Carlos Predoctoral Poderoso García, Mª Teresa Predoctoral Quetglas Más, José Ignacio Predoctoral

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OBJETIVOS GENERALES DEL CENTRO/DEPARTAMENTO El departamento de Biotecnología incluye grupos de investigación que comparten la característica común de la utilización de técnicas genéticas o moleculares para conseguir objetivos innovadores aplicables a la producción agraria o industrial. El Departamento tiene dos grandes ámbitos de actuación, que se agrupan en torno al tipo de organismos usados: animales o vegetales. Así, dentro del ámbito “animal” tenemos líneas de investigación enfocadas al estudio de virus de peces y de peces como biofactorías, líneas de trabajo centradas en virus animales, en vacunas, en la inmunología de especies ganaderas, o en el uso de virus animales como marcadores medioambientales. Dentro del ámbito “vegetal”, contamos con líneas de investigación centradas en la genética del control de la floración y de la resistencia en el estrés ambiental, y líneas de trabajo enfocadas al estudio de la función de la ruta de la ubiquitina o al transporte a vacuolas en plantas; por su parte, otros grupos están centrados en el estudio de virus vegetales y en su aplicación para la producción de proteínas, en estudios de epidemiología y genética de poblaciones o en el posible uso de plantas como biofactorías. De igual manera, contamos con grupos implicados en la mejora genética especies vegetales como la vid, el trigo o de gramíneas silvestres españolas, para poder ser utilizadas en temas de revegetación.

GRUPOS DE INVESTIGACIÓN • RUTA DE LA UBIQUITINA Y CICLO CELULAR EN PLANTAS • UNIDAD DE MEJORA GENÉTICA DE PLANTAS • VIRUS VEGETALES • INMUNOLOGÍA • BIOLOGÍA REPRODUCTIVA DE PLANTAS • TRANSPORTE A VACUOLA EN PLANTAS • ZOONOSIS Y VIROLOGÍA MEDIOAMBIENTAL • BIOTECNOLOGIA DE PECES • EVOLUCIÓN Y EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR • POXVIRUS • MEJORA GENÉTICA DE VID • TOLERANCIA AL ESTRÉS AMBIENTAL EN PLANTAS

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GRUPO DE PECES TRANSGÉNICOS

COMPONENTES Coll Morales, Julio Investigador A1 Pérez Ribera, Gema Técnico Especialista Grado Medio Rocha Roso, Ana Becario postdoctoral Ruiz Montejano, Sandra Técnico Superior Correo electrónico: juliocoll@inia.es

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I • Vectores para vacunación DNA en peces • Transfección y transformación de líneas celulares piscícolas (fusión de

membranas). • Optimización de promotores en peces • Aplicaciones de transposones de peces (SB y Tol2) • Aplicaciones del siRNA en VHSV • Transformación de microalgas

PROYECTOS

Código y título: CPE03-016-C3-1. Tecnologías de peces como Biofactorías: Métodos de selección, transferencia genética en masa, métodos inducibles, y expresión de mucus de defensinas humanas en peces de importancia económica en España. Entidad financiadora: INIA Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Coll Morales, Julio Código y título: AGL2005-00339. Vacunas ADN en Rabdovirosis (VSHV) de peces: seguridad, transposones SB como vectores, siRNAs como neutralizadores y pez cebra como modelo. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2005-2008 Investigador responsable: Coll Morales, Julio Principales resultados Atenuación de la capacidad fusogénica de la proteína G (pG) del VSHV conservando epitopos neutralizantes. Se han terminado de establecer las condiciones de transfección óptimas y reproducibles para células EPC. Se está comenzando a obtener frg11 recombinante para caracterizar los mutantes obtenidos y sueros de trucha. Adaptación del transposon "sleeping beauty" (SB) como vector para células epiteliales de pez EPC. Se está terminando de obtener construcciones de la pG con unos 12 promotores distintos (se caracterizarán el próximo año) y se ha sometido una adición a la patente de vacunación por ultrasonidos.

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Inhibición de la infección por VSHV con siRNA en células epiteliales de pez EPC. Se han diseñado, obtenido y testado 9 siRNA de los que 3 han resultado inhibidores de la infección in vitro del VHSV. Se está terminando una solicitud de patente. Los siRNA inhibidores se están clonando en plásmidos DNA para el próximo año obtener líneas EPC transformadas que pudieran ser constitutivamente resistentes a VHSV. Caracterización de la infección/vacunación VSHV en el pez cebra. Se han confirmado los experimentos preliminares que han demostrado que el pez cebra es susceptible a la infección con VSHV.

PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Jimenez, N., Coll, J., Salguero, F. J., and Tafalla, C. (2006).Co-injection of interleukin 8 with the glycoprotein gene from viral haemorrhagic septicemia virus (VHSV) modulates the cytokine response in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Vaccine 24 (27-28), 5615-26. Mas, V., Falco, A., Brocal, I., Perez, L., Coll, J. M., and Estepa, A. (2006). Identification of selective inhibitors of VHSV from biased combinatorial libraries of N.N'-disubstituted 2,5-piperazinediones. Antiviral Research 72, 107-115. Tafalla, C., Estepa, A., and Coll, J. M. (2006). Fish transposons and their potential use in aquaculture. J Biotechnol 123, 347-412. Brocal, I., Falco, A., Mas, V., Rocha, A., Perez, L., Coll, J. M., and Estepa, A. (2006). Stable expression of bioactive recombinant pleurocidin in a fish cell line. Applied Genetics and Molecular Biotechnology 72, 1217-1228. Coll, J.M. Review. Methodologies for tranferring DNA into eukaryotic microalgae. (2006). Spanish Journal of Agricultural Research. 4, 316-330 Otros artículos Falco, A., Rocha, A., Tafalla, C., Estepa, A., and Coll, J. M. (2006). Posibles aplicaciones de los transposones de peces a la Acuicultura. AquaTic 24 (61-71). Patentes Adición a la patente: Construcción génica, vector y vacuna ADN para la vacunación de animales acuáticos. (Patente nº 200402093). Fecha de prioridad: 27/08/04. Fecha de concesión: en trámite. Pais de prioridad: España, Estados Unidos, Francia. Entidad titular: INIA. Solicitud de patente: Inhibidores siRNA de la replicación del virus de la septicemia hemorrágica de la trucha (VHSV) y aplicaciones. Fecha de solicitud: Septiembre de 2006

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GRUPO DE POXVIRUS

COMPONENTES Blasco Lozano, Rafael Investigador A2 Lorenzo Gilsanz, María del Mar Juan de la Cierva Sánchez Puig, Juana María Titulado Superior Núñez del Castillo, Carolina Ayudante de Investigación Correo electrónico: Blasco@inia.es

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Optimización de vectores vacunales basados en poxvirus • Desarrollo de vectores de expresión de proteínas • Estudio de la morfogénesis de poxvirus

PROYECTOS

Código y título: QLK2-CT-2002-01867. Increasing the potency of vaccinia MVA vaccines. Entidad financiadora Union Europea Duración: 2002-2006 Investigador responsable: Blasco Lozano, Rafael Código y título: CPE03-021-C4-1. El virus vaccinia como sistema de lanzadera de vectores basados en virus RNA. Entidad financiadora: INIA Duración: 2004-2008 Investigador responsable: Blasco Lozano, Rafael Código y título: BFU2005-05124. Funciones de la proteína de la envuelta del virus vaccinia en la salida y entrada del virus. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2005-2008 Investigador responsable: Blasco Lozano, Rafael Código y título: S-0505/TIC/0191 Microsistemas Ópticos Sensores (Microseres) Entidad financiadora: Comunidad de Madrid Duración: 2006-2009 Investigador responsable: Blasco Lozano, Rafael Código y título: CT2006-037536. Host immune activation optimised vaccinia virus vectors for vaccine development (MVACTOR). Entidad financiadora: Unión Europea Duración: 2006-2008 Investigador responsable: Blasco Lozano, Rafael

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Principales resultados: En la actualidad, se están siguiendo diversas estrategias para aumentar la seguridad y efectividad de las vacunas recombinantes. Entre ellas, la que nosotros estamos abordando está relacionada con la modificación del antígeno utilizando métodos de manipulación genética, con el objetivo de hacerlo más inmunogénico. Hemos explorado nuevas estrategias de expresión de antígenos (mediante expresión por replicones), así como la posibilidad de llevar a cabo una presentación más efectiva de los mismos (mediante el anclaje de antígenos en la partícula viral). En cuanto a la expresión de antígenos mediada por replicones, hemos evaluado diferentes construcciones para lograr la correcta expresión de un replicón derivado del alfavirus Semliki Forest en el virus vaccinia. La idea es el “lanzar” el replicón como si fuera un transcrito de vaccinia, para lo que se debe poner el cDNA del replicón bajo el control de la maquinaria de transcripción de vaccinia. Además, hemos caracterizado virus vaccinia recombinantes en los que se combina el replicón, con la expresión de las proteínas estructurales de SFV (insertadas en un locus diferente) con lo que se logra el empaquetamiento del replicón. Así, a partir de células infectadas con éste recombinante se producen partículas de alfavirus que contienen el replicón. Hemos comprobado que los virus vaccinia recombinantes producen partículas de alfavirus de ciclo único, con un gran nivel de seguridad, que pueden mediar la expresión del antígeno a expresar. Por otro lado, hemos explorado cómo afecta la incorporación de antígenos en el virión en el tipo y magnitud de la respuesta inmune inducida por virus vaccinia recombinantes. Una colección de virus recombinantes que expresan antígenos modelo, como la proteína verde fluorescente (GFP) fusionados con proteínas de la superficie del virus intracelular (IMV) o extracelular (EEV). Se ha fusionado el gen GFP con el ectodominio de B5R, con F13L y con H3L, que dirigen el antígeno a distintas localizaciones dentro de la partícula viral. Hemos llevado a cabo experimentos de vacunación en ratón para estudiar el efecto de dichas versiones en la respuesta humoral o celular. Los resultados indican que la posición del antígeno es un factor relevante en determinar el tipo (humoral o celular) y magnitud de la respuesta inducida. Finalmente, hemos estudiado de un modo directo las interacciones entre proteínas de la envuelta tanto en células infectadas como no infectadas por experimentos de inmunofluorescencia o inmunoprecipitación. Este abordaje nos ha permitido identificar tres interacciones entre proteínas de la envuelta (A33R-A36R, A33R-B5R y A34R-B5R). Experimentos posteriores de coinmunoprecipitación con proteínas delecionadas en uno o varios dominios muestran que el dominio transmembrana de B5R está involucrado en la interacción con A33R y F13L, mientras que la interacción B5R:A34R se establece a través de los dominios extracelulares de dichas proteínas. Finalmente, hemos estudiado la influencia de la palmitoilación en la función de B5R, mediante mutagénesis de los residuos de cisteína que a los que se une el palmitato. Sorprendentemente, la mutación de dichos residuos no afecta a la transmisibilidad del virus, ni a la incorporación de B5R a las envueltas virales.

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Perdiguero, B and Blasco, R (2006) Interaction between vaccinia virus extracellular virus envelope A33 and B5 glycoproteins. J. Virol. 80, 8763-8777. Otros artículos Lorenzo MM. Blasco, R. (2006) Disolución de una membrana viral no fusogénica e inducida por ligando. Virología, 11(2), 69-70 Nº Ponencias, comunicaciones y póster presentados/as y publicados en las actas: 1

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GRUPO INMUNOLOGÍA

COMPONENTES Domínguez Juncal, Francisco Javier Investigador A2 Alonso Moreno, Fernando Investigador A2 Ezquerra Martínez, Ángel Investigador Revilla Calvo, Concepción Ramón y Cajal Ganges Espinosa, Lilliane Juan de la Cierva Moreno López, Sonia Titulado Superior Álvarez Vega, Belén Titulado Superior Martínez de la Riva, Paloma Técnico Especialista Grado Medio Poderoso García, Mª Teresa Becario predoctoral Correo electrónico: juncal@inia.es

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

Inmunología porcina

• Caracterización de receptores de leucocitos porcinos • Mecanismos inmunitarios implicados en protección frente infecciones

víricas. • Mecanismos de evasión del patógeno. Inmunopatología • Desarrollo de estrategias que incrementen la inmunogenicidad de las

vacunas. Uso de moléculas coestimuladoras, citoquinas y quimioquinas. Aplicación de receptores y ligandos de APCs para dirigir antígenos

PROYECTOS

Código y título: AGL2004-00945. Estudios sobre la memoria T CD4 en el cerdo: implicaciones para la mejora de vacunas Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Ezquerra Martínez, Angel Código y título: AGL2004-4074. Estudio de las células dendríticas porcinas como dianas vacunales para aumentar la inmunogeneicidad. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Revilla Calvo, Concepción Código y título: CPE03-021-C4-2. Inmunología de vacunas recombinantes. Entidad financiadora: INIA Duración: 2005-2008 Investigador responsable: Domínguez Juncal, Francisco Javier

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Código y título: AGL2005-07073-C02-01. Nuevas estrategias de inmunización frente al virus del Síndrome Reproductivo y respiratorio porcino: Estudios inmunológicos y eficacia de antígenos fusionados a quimioquinas. Entidad financiadora: Plan Nacional de I+D Duración: 2005-2008 Investigador responsable: Domínguez Juncal, Francisco Javier Código y título: CSD2006-0007-1 Consolider-Ingenio 2010. Porcivir. Infecciones víricas porcinas. Entidad financiadora Plan Nacional I+D Duración: 2007-2012 Investigador responsable: Domínguez Juncal, Francisco Javier

CONTRATOS Código y título: CON03-010. Investigación y desarrollo de agentes terapeúticos y de diagnóstico en dos patologías porcinas de gran importancia técnica y económica: 1) Síndrome Respiratorio y Reproductor Porcino (PRRS) y 2) Disentería Porcina. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2003-2006 Investigador responsable: Alonso Moreno, Fernando Código y título: CON04-020. Agreement between INIA and SEROTEC to regulate the production and commercial exploitation of monoclonal antibodies against porcine leukocyte differentiation antigens. Entidad financiadora: INIA, SEROTEC Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Domínguez Juncal, Francisco Javier Principales resultados: Se ha continuado el análisis del potencial de diversos receptores expresados en APC de actuar como dianas para dirigir el antígeno, con el objeto de mejorar la captación y presentación del mismo. De todos los receptores evaluados hasta la fecha, la sialoadhesina y las moléculas de clase II (SLAII) fueron los más efectivos en la captación y en el procesamiento del antígeno empleando MoDc como APC. Se ha evaluado la capacidad de redireccionamiento de antígeno de 3 AcMo anti-SLAIIDR y 2 anti-SLAIIDQ. Todos ellos mejoraron la captación y procesamiento del antígeno, en comparación con un AcMo irrelevante, no observándose diferencias entre los dirigidos a moléculas DR o DQ. Se está evaluando la capacidad de un AcMo anti-sialoadhesina de dirigir el antígeno a las APC “in vivo”. Los resultados, aunque preliminares, muestran la presencia en el suero de los anímales inmunizados con el AcMo anti-sialoadhesina pero no en los controles, de anticuerpos a día 14 post inmunización, cuyos niveles aumentan a los días 28 y 42, observándose un incremento especialmente marcado en el día 56 post segunda inmunización.

Estamos trabajando en la obtención de fragmentos scFv de un AcMo anti-sialoadhesina. Como paso previo hemos clonado los fragmentos de cDNA correspondientes a los segmentos variables de las cadenas pesada y ligera de dicho AcMo. Se están diseñando oligonucleótidos específicos para la obtención de los fragmentos scFv como proteína de fusión con la GFP, para evaluar mediante citometría de flujo su producción en células

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transfectadas y su reactividad frente a la sialoadhesina. Finalmente, se construirá fragmentos scFv fusionados a la proteína N del virus PRRSV con el objeto de valorar su potencial immunomodulador in vivo. Con vistas a evaluar su potencial inmunomodulador se han construido plásmidos con las secuencias de las quimioquinas porcinas MIP-3a y SDF-1 fusionadas a la ORF 7 del virus del Síndrome reproductivo y respiratorio porcino (VSRRP), que codifica la proteina N o nucleoproteína. Se ha confirmado la expresión de las proteínas de fusión correspondientes mediante ensayos de citometría de flujo y western blot, utilizando Acmo específicos para la nucleoproteína del VSRRP. Se han generando líneas transfectadas estables que expresan la quimioquina porcina SLC fusionada a la proteína verde fluorescente (GFP) y se ha confirmado la expresión de la proteina de fusión correspondiente mediante ensayos de citometría de flujo y western blot, utilizando anticuerpos específicos para la GFP. Esta quimioquina es uno de los ligandos de CCR7. La producción de proteína recombinante en cantidades suficientes permitirá la realización de ensayos de unión a PBMC y células dendríticas y caracterizar la expresión de CCR7 en las poblaciones 2E3+ (naive) y 2E3- (memoria) de linfocitos T CD4+ porcinos. Se ha continuado la caracterización del panel de anticuerpos monoclonales generados frente precursores hematopoyéticos porcinos de médula ósea. Con estos anticuerpos hemos identificado varios estadios madurativos en los linajes mielocitico y monocitico y caracterizado la población de precursores tempranos que expresan c-Kit (CD117) pero no marcadores de linaje. Estos anticuerpos pueden ser de gran utilidad en el estudio de la patogenia de diversos procesos infecciosos que afectan al cerdo

PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Álvarez B, Revilla C, Chamorro S, López-Fraga M, Alonso F, Dominguez J, Ezquerra A. Molecular cloning, characterization and tissue expression of porcine Toll-like receptor 4. Dev. Comp. Immunol. 30: 345-355, 2006. Álvarez B, Gómez N, Garrido J, Yerle M, Revilla C, Chamorro S, Alonso F, Domínguez J, Ezquerra A. Molecular cloning characterization and expression of porcine immunoreceptor SIRP-alpha. Dev. Comp. Immunol. 31: 307-318, 2007. E pub 2006 Jul 28. Pérez C, Revilla C, Álvarez B, Chamorro S, Correa C, Doménech N, Alonso F, Ezquerra A, Dominguez J. Phenotypic and functional characterization of porcine granulocyte developmental stages using two new markers. Dev. Comp. Immunol. 31: 296-306, 2007. Epub 2006 Jul 26. Tesis doctorales Pérez Martín, Carlos. Sobresaliente (Junio 2006). Caracterización de precursores mielomonocíticos porcinos. Universidad Complutense de Madrid. Facultad de Ciencias Biológicas. Director: Dominguez Juncal, Francisco Javier/ Calvo Concepción, Revilla.

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Nº Ponencias, comunicaciones y póster presentados/as y publicados en las actas: 4

OTRAS ACTIVIDADES

Cursos/Seminarios Curso de Doctorado (UCM): temas de investigación en inmunología. Fagocitos. Junio 2006 (Domínguez Juncal, Javier) Miembro del Scientific committee del 2º European Veterinary Immunology Workshop, Paris (Francia), Septiembre 4-6, 2006 (Domínguez Juncal, Javier). Chairman of session on “Leukocyte subsets and functions”. 2º European Veterinary Immunology Workshop, Paris (Francia), Septiembre 4-6, 2006 (Domínguez Juncal, Javier)

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GRUPO DE ZOONOSIS Y VIROLOGÍA MEDIOAMBIENTAL

COMPONENTES Saiz Calahorra, Juan Carlos Investigador A2 Escribano Romero, Estela Juan de la Cierva Blázquez Martín, Ana Belén Auxiliar de Investigación Córdoba García, Laura Becario predoctoral Jiménez de Oya, Nereida Becario predoctoral Alonso Padilla, Julio Becario predoctoral correo electrónico: jcsaiz@inia.es

PRINCIPALES LINEAS DE I+D+I

• Estudio, análisis y caracterización de virus zoonóticos emergentes y re-

emergentes (virus de la hepatitis E, VHE, virus del Nilo Occidental, VNO....) y de virus entéricos animales (Enterovirus bovinos, Teschovirus...).

• Desarrollo de sistemas diagnósticos y vacunales. • Estudios de las interacciones virus-hospedador. • Utilización de virus entéricos animales como marcadores de contaminación

medioambiental.

PROYECTOS Código y título: CE-CSD2006-7/2320. Patogenia de las enfermedades víricas porcinas (PORCIVIR) - CONSOLIDER-INGENIO-2010. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2006-2011 Investigador responsable: Mariano Domingo (CReSA) Código y título: COST-929. A European Network for Environmental and Food Virology (ENVIRONET). Entidad financiadora: Unión Europea Duración: 2006-2010 Investigador responsable: N. Cook (CSL, G.B.); INIA:Saiz Calahorra, Juan Carlos Código y título: S-0505/TIC/0191. Microsistemas Ópticos Sensores (Microseres) Entidad financiadora: Comunidad de Madrid Duración: 2006-2010 Investigador responsable: Blasco Lozano, Rafael Código y título: AGL2004-06071. Detección y caracterización molecular de virus de la familia Flaviviridae y del virus de la Hepatitis E (VHE) en muestras animales y medioambientales. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Saiz Calahorra, Juan Carlos

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PARTICIPACIÓN EN PROYECTOS LIDERADOS POR OTRAS INSTITUCIONES Código y título: Providing tools to prevent emergence of enteric viruses (EVENT). Entidad financiadora: Unión Europea Duración: 2004-2008 Investigador responsable: Marion Koopmans (RIVM, Bilthoven, Holanda) Principales resultados: Se están ensayando las condiciones para la aplicación de sistemas de microscopia Raman a la detección de interacciones de ácidos nucleicos en muestras biológicas. Se han diseñado y puesto a punto técnicas de detección molecular, mediante RT-PCR y RT-PCR a tiempo real, para el WNV y el VHE. También se están desarrollando técnicas de detección serológica (ELISA, Western blot,..) del VHE y del VNO. En colaboración con la Dra. O. Gironés (Dpt. Patología Infecciosa y Epidemiología. F. Veterinaria. U. Zaragoza) se está llevando a cabo un estudio de prevalencia del VHE en la cabaña porcina de Aragón. En colaboración con el Dr. A. Garmendia (Pathobiology and Veterinary Sciences, U. of Connecticut, Storrs, USA) se ha realizado un estudio de la patogenicidad del VNO en ratonas preñadas, observándose que en éstas la mortalidad es mucho más elevada que en animales sin preñar. Así mismo, se ha observado que no existen diferencias significativas ni en los títulos de anticuerpos específicos (IgG e IgM), ni en los de RNA-VNO en cerebro, entre animales que sobreviven a la infección y aquellos que sucumben a ella, ni entre los animales preñados y no preñados. Tampoco se ha observado transmisión horizontal de la infección en el modelo murino. Nº Ponencias, comunicaciones y póster presentados/as y publicados en las actas: 2

OTRAS ACTIVIDADES

Cursos Profesor Invitado: Dr. J.C. Saiz, del curso de calidad "Variability and viral emergence" dentro del Programa de 3er ciclo de Biotecnología (U.A.B.) Barcelona. (2006).

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VACUNAS

COMPONENTES Martínez Escribano, José Ángel Investigador A2 Pérez Filgueira, Mariano Titulado Superior Gómez Sebastián, Silvia Titulado Superior Del Prete, Julieta Titulado Superior González Camacho, Fernando Titulado Superior Núñez Serrano Carmen, Técnico Superior Fernández Cabello, Eulalia Ayudante de Investigación Gómez Hernández, Nuria Auxiliar de Laboratorio Correo electrónico: escriban@inia.es

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Vacunas animales • Biofactorías • Peste porcina africana

PROYECTOS Código y título: CPE03-022-C5-1. Desarrollos biotecnológicos para la utilización rentable de plantas como biofactorías. Entidad financiadora: INIA Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Martínez Escribano, José Angel Código y título: AGL2004-07857-C03-03/GAN. Caracterización de los mecanismos inmunológicos relevantes en protección frente al virus de la Peste porcina africana: desarrollo de nuevas estrategias vacunales. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Martínez Escribano, José Angel Código y título: 075813/C/04/Z WELLCOME. Development of African swine fever virus vaccines. Entidad financiadora: Wellcome Trust Foundation Duración: 2005-2009 Investigador responsable: Martínez Escribano, José Angel Código y título: PETRI1995-0930. Producción de una vacuna frente al virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV) mediante tecnología transplastidial y formulación en productos para administración oral e inyectables. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2005-2007 Investigador responsable: Martínez Escribano, José Angel

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Código y título: CSD2006-0007-2. Consolider-Ingenio 2010. Patogenia de enfermedades víricas porcinas Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2006-2010 Investigador responsable: Mariano Domínguez; Martínez Escribano, José Angel

CONVENIOS Código y título: CON03-059/CON06-039. Desarrollo de vacunas y enzimas industriales en plantas transgénicas. Proyecto CENIT y PETRI Entidad financiadora: PlantBioproducts Duración: 2004-2010 Investigador responsable: Martínez Escribano, José Angel Código y título: CON06-002/CON06-003. Desarrollo de vacunas y kits diagnósticos en larvas de insecto como biofactorías. Licencia de las patentes 200302845 (Sistema para producir péptidos y proteínas multiméricos y sus aplicaciones) y 200302958 (Proteína de fusión con direccionamiento de antígenos vacunales a células presentadoras de antígeno y sus aplicaciones). Entidad financiadora: Alternative Gene Expresión Duración: 2006-2016 Investigador responsable: Martínez Escribano, José Angel Principales resultados: Durante el 2006 se ha llevado a cabo una colección de baculovirus recombinantes que expresan diversos genes del virus de la Peste porcina africana relevantes en respuesta inmune para ensayos de protección. Se han llevado a cabo dos experimentos de protección en animales, fruto de los cuales se ha obtenido información relevante sobre los mecanismos inmunes importantes en protección Se han desarrollado las construcciones moleculares adecuadas para obtener virus Aujeszky recombinantes que expresen proteínas del virus de la peste porcina africana. Para generar los Aujeszky recombinantes se han obtenido amplicones capaces de recombinar con el virus una vez transfectados y también expresar las proteínas en el contexto de coinfección. Todos los amplicones generados expresaron las proteínas en presencia del virus, pero por el momento no ha sido posible obtener virus recombinantes estables. En un reciente encuentro dentro de un proyecto de la Wellcome Trust Foundation, celebrado en Montpellier, se llegó a un acuerdo para validar un sistema de diagnóstico sexológico de Peste porcina africana basado en la proteína recombinante p30 expresada en larvas de T. ni. También se distribuyeron entre los representantes de los diferentes laboratorios tiras de immunoblotting con la misma proteína recombinante. En estos laboratorios se probará la eficiencia de ambos kits de screening y confirmatorio. También se comprometieron algunos de estos laboratorios, en concreto los de Madagascar a enviar sueros problemáticos a España para analizarlos en profundidad en caso de existir problemas. Dentro de los estudios encaminados a obtener un reactivo universal y económico que permita hacer frente a campañas de erradicación en estos países en vías de desarrollo, se han secuenciado los genes codificantes para la proteína p30 de diferentes aislados de

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virus, tanto de la costa este como oeste de África y los resultados se han publicado en un artículo científico (Perez-Filguera y col. J. Clin. Microbiol. 44, 3114-3121. 2006) En la búsqueda de sistemas simplificados de diagnóstico serológico, hemos iniciado una investigación para desarrollar un sistema de diagnóstico basado en inmunofluorescencia sin la necesidad de reactivos secundarios (en 1 solo paso) y de alta sensibilidad. Para ello, hemos expresado en larvas de T.ni las proteínas p54 y p30 fusionadas a GFP(verde) y RFP(roja). El rendimiento ha sido extraordinario, pudiendo detectar las larvas infectadas fácilmente. Asimismo, los extractos de proteína soluble mantuvieron una fluorescencia notable. La idea es establecer un sistema de látex u otra partícula que permita capturar anticuerpos específicos frente a la enfermedad a partir de sueros sospechosos. También se ha iniciado el clonaje de un anticuerpo monoclonal frente al virus en forma de ScFv con idea de expresarlo en forma fusionada a GFP y así permitir el desarrollo de un sistema de detección de virus tanto en muestras de sangre como de órganos (esplantes o cortes titulares).

PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Alfonso P, Quetglas JI, Escribano JM, Alonso C. (2006) Protein pE120R of African swine fever virus is post-translationally acetylated as revealed by post-source decay MALDI mass spectrometry. Virus Genes. Gil F, Titarenko E, Terrada E, Arcalis E, Escribano J.M. (2006) Successful oral prime-immunization with VP60 from rabbit haemorrhagic disease virus produced in transgenic plants using different fusion strategies. Plant Biotechnol J. 4:135-43. Perez-Filgueira DM, Gonzalez-Camacho F, Gallardo C, Resino-Talavan P, Blanco E, Gomez-Casado E, Alonso C, Escribano JM. (2006). Optimization and validation of recombinant serological tests for African Swine Fever diagnosis based on detection of the p30 protein produced in Trichoplusia ni larvae. J Clin Microbiol. 44:3114-21. Hernaez B, Escribano JM, Alonso C. (2006). Visualization of the African swine fever virus infection in living cells by incorporation into the virus particle of green fluorescent protein-p54 membrane protein chimera. Virology. 350:1-14.

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EVOLUCION Y EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR

COMPONENTES Malpica Romero, José Mª Investigador A1

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I • Epidemiología y genética de poblaciones: hacia una síntesis.

PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Malpica JM, Sacristan S, Fraile A, Garcia-Arenal F. Association and host selectivity in multi-host pathogens. PLoS ONE. 2006 Dec 20;1:e41. Arroyo-Garcia R, Ruiz-Garcia L, Bolling L, Ocete R, Lopez MA, Arnold C, Ergul A, Soylemezoglu G, Uzun HI, Cabello F, Ibanez J, Aradhya MK, Atanassov A, Atanassov I, Balint S, Cenis JL, Costantini L, Goris-Lavets S, Grando MS, Klein BY, McGovern PE, Merdinoglu D, Pejic I, Pelsy F, Primikirios N, Risovannaya V, Roubelakis-Angelakis KA, Snoussi H, Sotiri P, Tamhankar S, This P, Troshin L, Malpica JM, Lefort F, Martinez-Zapater JM. Related Articles, Links. Multiple origins of cultivated grapevine (Vitis vinifera L. ssp. sativa) based on chloroplast DNA polymorphisms. Mol Ecol. 2006 Oct; 15(12):3707-14. PMID: 17032268 [PubMed - indexed for MEDLINE]

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VIRUS VEGETALES

COMPONENTES Ponz Ascaso, Fernando Investigador A1 Sánchez Sánchez, Flora Investigador A Fresno Pérez, Jesús Investigador A Lunello Lindow, Pablo Titulado Superior Mansilla Mansilla, Carmen Titulado Superior Touriño Fernández, Ángeles Titulado Superior Martínez Pérez, Fernando Técnico Especialista de Grado Medio Calvo Gutiérrez, Margarita Oficial de Investigación Correo electrónico: fponz@inia.es

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Desarrollo de nuevas aplicaciones biotecnológicas para el diagnóstico y la tipificación virales, en su vertiente más aplicada.

• Investigación de los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a los procesos de infección de las plantas por los virus y fenómenos asociados de expresión de enfermedad o resistencia, en la más fundamental.

• Desarrollo de vectores virales para la utilización de plantas como biofactorías y la producción de biomoléculas de interés industrial.

• Prospección viral en determinados cultivos y la caracterización molecular de nuevos virus y aislados virales.

• Desarrollo de aplicaciones automatizadas de los marcadores moleculares en el terreno agroalimentario, tanto en los proyectos de I+D propios del grupo como ofreciendo un servicio a otros grupos de investigación.

PROYECTOS Código y título: AT06-004. Creación de la Unidad de Genómica y Proteómica del INIA Entidad financiadora: INIA Duración: 2006-2008 Investigador responsable: Ponz Ascaso, Fernando Código y título: HU2005-0027. Analysis of cell-to-cell movement and subcellular localization of ORMV-MP, a non-cell autonomous protein. Entidad financiadora: Ministerio Educación y Ciencia (España)/Gobierno austriaco (Austria) Duración: 2006-2007 Investigador responsable: Ponz Ascaso, Fernando; Elizabeth Waigmann (Univ. de Viena)

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Código y título: CPE03-022-C5-5. Desarrollos biotecnológicos para la utilización rentable de plantas como biofactorías Entidad financiadora: INIA Duración: 2004-2008 Investigador responsable: Martínez Escribano, José Ángel Código y título: BIO2003-04516. Caracterización de factores determinantes de la enfermedad causada por potyvirus en el patosistema Arabidopsis thaliana-virus del mosaico del nabo Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2004-2006 Investigador responsable: Sánchez Sánchez, Flora

CONVENIOS Código y título: CPV-6681. Development and evaluation of molecular markers linked to disease resistance genes for tomato DUS testing Entidad financiadora: Oficina Comunitaria de Variedades Vegetales Duración: 2006 Investigador responsable: Ponz Ascaso, Fernando Principales resultados Se expresó transgénicamente la proteína de movimiento del virus del mosaico de la colza en Arabidopsis thaliana. La expresión constitutiva de la proteína indujo efectos fisiológicos moderados. Las plantas de la línea transgénica caracterizada permitían un movimiento sistémico más rápido de un marcador floemático fluorescente, que se descargaba diferencialmente en distintas partes de las flores, poniendo de manifiesto la existencia de efectos diferenciales de la proteína sobre la descarga floemática en distintos órganos sumidero. Las plantas transgénicas no presentaban ningún efecto sobre la distribución de biomasa o la disponibilidad de azúcares, efectos reportados para plantas solanáceas transgénicas para proteínas equivalentes de otro tobamovirus (el virus del mosaico del tabaco). Los resultados ponen de manifiesto la importancia de la especificad del sistema virus-huésped sobre el resultado fisiológico de la interacción. Se llevó a cabo un análisis de la estructura poblacional del hongo Erysiphe necator (mildiu de la vid) para determinar si dicha estructura se puede distribuir en partes según el origen del inóculo primario (ascomata invernante en la corteza de la vid y micelios en las yemas durmientes). La variación genética se estableció utilizando 61 marcadores del tipo AFLP. El análisis de la varianza molecular (AMOVA) determinó que el origen del inóculo primario no era un componente significativo de la variación genética de E. necator.

PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Mansilla, C., Aguilar, I., Martínez-Herrera, D., Sánchez, F., Ponz, F. 2006. Physiological effects of constitutive expression of oilseed rape mosaic tobamovirus (ORMV) movement protein in Arabidopsis thaliana. Transgenic Research 15:761-770.

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Núñez, Y., Gallego, J., Ponz, F., Raposo, R. 2006. Analysis of population structure of Erysiphe necator using AFLP markers. Plant Pathology 55:650-656. Libros y capítulos de libros Ponz, F. 2006. Nuevos sistemas de producción: plantas y animales transgénicos. Bioproducción en plantas. En: Biotecnología en la Medicina del Futuro, pp. 154-158. Ed. Fundación Cotec para la Innovación Tecnológica. Madrid, España. ISBN 84-95336-60-X. Tesis doctorales Carmen Mansilla Mansilla. Especificidad de la interacción con el huésped del virus del mosaico de la colza (ORMV) mediante el estudio de genes virales y vegetales implicados. ETSI Agrónomos. Universidad Politécnica de Madrid. Diciembre 2006. Calificación: Sobresaliente “cum laude”. Director de la Tesis Doctoral: Fernando Ponz Ascaso. OTRAS ACTIVIDADES Cursos Participación como profesores en el XV Curso Internacional teórico-práctico de detección e identificación de virus, viroides y fitoplasmas. INIA, Madrid, noviembre 2006 de varios miembros del grupo.

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UNIDAD DE MEJORA GENÉTICA DE PLANTAS

COMPONENTES Soler Llinares, M. Consuelo Investigador A2 Casanova Pena, Carlos Técnico Muñoz Plaza, Alfonso Técnico Superior San Martín González David Oficial Investigación Correo electrónico: llinares@inia.es

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Obtención de trigos panaderos selectos, mediante métodos convencionales y citogenéticos, utilización de la variación genética extraespecífica y de la androgénesis y mas recientemente de la transformación. Selección asistida por marcadores moleculares. Análisis de la regulación y expresión genética de los caracteres relacionados con la calidad.

• Obtención de triticales hexaploides secundarios mediante métodos convencionales y, especialmente mediante utilización de la androgénesis.

• Obtención de variedades de gramíneas a partir de poblaciones heterogéneas de gramíneas anuales autóctonas, para su utilización como cubiertas vegetales en suelos de cultivos leñosos, preferentemente de olivar, frutales y vid.

• Selección de gramíneas anuales y perennes para su utilización en temas de revegetación y en la recuperación de zonas degradadas y deterioradas.

PROYECTOS Código y título: AGL2003-08128-C02-2. Mejora de la calidad de trigo y triticale por métodos convencionales y transformación. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2003-2006 Investigador responsable: Soler Ll.inares, Consuelo Código y título: AGL2006-09018-C02-2. Optimización de métodos convencionales y de transformación para la mejora genética de cereales y obtención de nuevas variedades de trigo panadero. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2006-2009 Investigador responsable: Soler Ll.inares, Consuelo Código y título: RTA2006-00146-00-00. Obtención de variedades de gramíneas para su utilización como cubiertas vegetales vivas en suelos de olivar Entidad financiadora: INIA Duración: 2006-2009 Investigador responsable: Soler Ll.inares, Consuelo

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Código y título: RF2006-00020-CO3-01. Creación de la colección española de trigo duro Entidad financiadora: INIA Duración: 2006-2009 Investigador responsable: Magdalena Ruiz, Valcárcel PARTICIPACIÓN EN PROYECTOS LIDERADOS POR OTRAS INSTITUCIONES Código y título: CAM_UAH2005/032. Título del proyecto: “Análisis de la influencia de la estructura primaria de las gluteninas en la formación de la red del gluten entrigo blando (Triticun aestivum L.) mediante una combinación de técnicas de mutagénesis y transformación” Entidad financiadora: Comunidad de Madrid Duración: 2006 Investigador responsable: Jouve de la Barreda, Nicolás (Universidad de Alcalá) Código y título: TRT2006-00007-C04-01. Transferencia tecnológica en conservación de suelos en cultivos leñosos Entidad financiadora: INIA Duración: 2006-2008 Investigador responsable: De Luna Armenteros, Elena (IFAPA de Córdoba)

CONVENIOS Código y título: CCO2-024. Desarrollo de cubiertas vegetales a partir de gramíneas seleccionadas Entidad financiadora: AGROSA Semillas selectas S.A. Duración: 2003-2006 Investigador responsable: Soler Ll.inares, Consuelo Código y título: CC06-011. Realización de ensayos en líneas avanzadas de trigos panaderos Entidad financiadora: AGROSA Semillas selectas S.A. Duración: 2006-2009 Investigador responsable: Soler Ll.inares, Consuelo Código y título: CC06-016. Realización de ensayos de variedades de gramíneas de interés para controlar la erosión de los suelos Entidad financiadora: AGROSA Semillas selectas S.A. Duración: 2006-2009 Investigador responsable: Soler Ll.inares, Consuelo Principales resultados Se han utilizado técnicas convencionales de mejora por selección genealógica en campo, el método s.s.d. (“single seed descent”) y técnicas cytogenéticas y biotecnológicas, entre ellas la androgénesis y posterior duplicación cromosómica de los híbridos resultantes, para la obtención de triticales y trigos panaderos de calidad. La selección ha sido asistida mediante la utilización de marcadores bioquímicos, moleculares y FISH. Se poseen en la actualidad varias formas fijadas, tanto de trigos como de triticales, próximas a su envío a registro con vistas a su explotación comercial. Se ha trabajado en el estudio de los principales genes que codifican las proteínas de endospermo y en la determinación de los parámetros que intervienen en las propiedades de la harina y en la formación del gluten. En trigos con translocaciones o sustituciones cromosómicas trigo-centeno, se ha comprobado la relación entre las constituciones cromosómicas y parámetros de calidad y de producción. En colaboración con otro

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grupo, se ha desarrollado un protocolo para la aplicación de la transformación, mediante biolística y Agrobacterium. Miembros de nuestra Unidad han colaborado, principalmente con el grupo de investigación de la Universidad de Alcalá llevando a cabo un análisis de determinados aminoácidos de las Gluteninas del endospermo, de las que depende la calidad harino-panadera en una colección de variedades comerciales y líneas seleccionadas por nosotros de trigo panadero Triticum aestivum L., mediante la aplicación de una serie de técnicas para la caracterización alélica de los principales de los principales genes implicados. Se han cuantificado los tipos de proteínas y se han analizado las propiedades reológicas y la estructura del gluten, llegando a estudiar las modificaciones del mismo con agentes oxidantes, con el fín de conocer los factores determinantes de los principales componentes de la calidad. También hemos realizado experimentos de mutagénesis dirigida en uno de los principales genes de gluteninas HMW, mediante la sustitución de aminoácidos cisteína por serina, para analizar los efectos sobre la formación de los agregados multiprotéicos en plantas transformadas de Arabidopsis. Se ensayaron durante tres años en condiciones de grandes cubiertas en suelo de olivar, 10 líneas de gramíneas previamente obtenidas por el grupo del INIA El resultado al final ha sido la selección de dos de las formas cuya protección se ha solicitado y obtenido de la Oficina Comunitaria de Variedades Vegetales con fines de explotación comercial. De esta explotación se encarga la empresa AGROSA Semillas Selectas S. A., según contrato firmado con INIA y Junta de Andalucía.

PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Peña E, Bernardo A, Soler C, Jouve N. (2006). Do tirosine crosslinks contribute to the formation of the gluten network in common wheat (Triticum aestivum L.) dough?. Journal Cereal Sciences 44: 144-153. Gómez de Nova PJ, de la Cruz M, Monte JV, Soler C. (2006) Genetic relationships withing and among Iberian fescues (Festuca L.) based on PCR amplified markers. Genome 49: 1170-1183 Nº Ponencias, comunicaciones y póster presentados/as y publicados en las actas: 1 Patentes M. Consuelo Soler y Carlos Casanova son los autores intelectuales de dos variedades de la especie Brachypodium distschyon, protegidas por la Oficina Comunitaria Europea de Variedades Vegetales: Variedad 1: Nº expediente solicitud: 2005/2134.Nombre: Bra-7, IBROS Variedad 2: Nº expediente solicitud: 2005/2135. Nombre: Bra-13, ZULEMA Entidad titular de los derechos: INIA, Junta de Andalucía y Agrosa S. A. Licencia de explotación: Agrosa S.A.

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GENÉTICO DEL TIEMPO DE FLORACIÓN

COMPONENTES Jarillo Quiroga, José A. Investigador A Miguel Casado, Eugenio José Especialista Técnico de Grado Medio Sáez de las Heras, David Auxiliar de Investigación Del Olmo Montoro, Iván Becario predoctoral Gómez Zambrano, Maria de los Ángeles Becario predoctoral Lázaro Somoza, Ana Becario predoctoral Oliveiro Peppe, Karina Técnico Superior Correo electrónico: jarillo@inia.es

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I • Control del tiempo de floración en Arabidopsis. • Análisis genético y genómico de las rutas represoras de la floración. • Remodelación de cromatina y desarrollo • Función de proteínas ligadoras de ubiquitina tipo E3 en el control del

tiempo de floración.

PROYECTOS Código y título: BIO2005-00251. Disección genética y genómica de las rutas de la represión floral. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2005-2007 Investigador responsable: Jarillo Quiroga, Jose Antonio Código y título: QLK3-CT2002-01973. Developing Single Nucleotide Polymorphic (SNP) markers for adaptive variation in forest trees (TREESNIPs). Entidad financiadora: Unión Europea Duración: 2002-2006 Investigador responsable: Cervera Goy, María Teresa. PARTICIPACIÓN EN PROYECTOS LIDERADOS POR OTRAS INSTITUCIONES Código y título: GRAPEGEN. A genomic approach to the identification of the genetic and environmental components underlying berry quality in grapevine. Entidad financiadora: Fundación Genoma España. Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Martinez Zapater, Jose Miguel Principales resultados: Hemos caracterizamos a nivel genético y molecular la mutación de floración temprana esd1. Así, hemos demostrado mediante una aproximación de mapeo y clonación posicional que ESD1 codifica ACTIN-RELATED PROTEIN 6 (ARP6), una proteína nuclear que podría estar formando parte de un complejo remodelador de cromatina tipo

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SWR1, similar al descrito en levaduras, si bien en plantas todavía no se ha demostrado su existencia (Martín-Trillo et al., 2006). Mediante estudios de RT-PCR, nosotros hemos demostrado que ARP6 se expresa de manera ubicua en todos los tejidos analizados. ESD1/ARP6 participa en la represión de la floración actuando principalmente a nivel de la regulación de la expresión de FLC y de genes FLC-like. Mediante experimentos de inmunoprecipitación de cromatina hemos determinado que ESD1/ARP6 es requerida para la acetilación y metilación de histonas de la cromatina de FLC en Arabidopsis. ARP6 se ha implicado en el complejo SWR1 de diferentes organismos, el cual cataliza el recambio de la histona H2A por la variante H2A.Z en cromatina reconstituida in vitro. La purificación del complejo SWR1 de levaduras ha revelado que está formado por 12 ó 13 proteínas; una de ellas, SWC6, interacciona físicamente con ARP6, y ambas son necesarias para la asociación con Swc2 y para la unión a nucleosomas. En el genoma de Arabidopsis, nosotros hemos identificado un putativo homólogo a la subunidad SWC6 de levaduras, que se expresa de manera ubicua; esta proteína, At5g37055, de 171 aminoácidos se caracteriza por poseer en su secuencia un dedo de zinc en el extremo C-terminal, posiblemente implicado en la unión a DNA, con 6 residuos de cisteinas que presentan la siguiente estructura C2C7C2C4C3C. Nosotros hemos demostrado mediante ensayos de doble híbrido en levaduras y ensayos de pull-down in vitro que la proteína ESD1/ARP6 interacciona físicamente con la proteína AtSWC6 (Lázaro et al, 2007a, en preparación), lo cual sugiere que ambas proteínas podrían estar formando parte del mismo complejo en plantas. A través del análisis de dos líneas de inserción de T-DNA para el gen SWC6, nosotros hemos demostrado que éste puede funcionar al igual que ESD1/ARP6 como un represor floral en Arabidopsis, dado que alelos de pérdida de función presentan una aceleración del tiempo de floración tanto en condiciones de día largo como de día corto (Lázaro et al, 2007a, en preparación). Hemos llevado a cabo inicialmente una caracterización fenotípica del mutante, analizando las fases del desarrollo que están alteradas y hemos iniciado el abordaje del análisis genético del locus SWC6, mediante la generación de dobles mutantes con mutaciones representativas de las distintas rutas activadoras de la floración. Combinaciones de swc6 con mutaciones de la ruta autónoma sugieren que SWC6 podría funcionar al igual que ESD1, como un regulador negativo de la vía autónoma y podría formar parte de complejos remodeladores de cromatina que activan la expresión de FLC (Lázaro et al, en preparación). Por su parte, dobles mutantes esd1swc6 presentan un tiempo de floración similar al de esd1, lo cual sugiere que ambas proteínas podrían estar formando parte de un mismo complejo. De igual manera, hemos caracterizado a nivel genético y molecular otros dos nuevos loci implicados en las rutas de la represión floral en Arabidopsis: ESD6 y ESD7. El fenotipo de los mutantes esd6 y esd7es bastante pleiotrópico, presentando alteraciones visibles en cuanto al tiempo de floración y al tamaño y morfología de diferente órganos de la planta. Su clonación molecular ha revelado que ESD6 codifica para HOS1, una proteína con un motivo RING-finger que podría funcionar como una ligasa de ubiquitina tipo E3, que regula negativamente la señal de transducción de las bajas temperaturas (Lázaro et al., en preparación). Por otra parte, mediante mapeo y clonación posicional, hemos demostrado que el mutante esd7 está afectado en el gen que codifica la subunidad catalítica de la ADN polimerasa epsilon (AtPOL2A). (Del Olmo et al., en preparación). Conjuntamente a esd7-1, hemos aislado diferentes alelos de inserción de T-DNA para este gen y los homocigotos presentan un fenotipo de letalidad embrionaria al tratarse de alelos de pérdida de función, lo que sugiere que esd7-1 es un alelo hipomórfico.

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Jarillo, J.A., y Piñeiro, M.A. (2006). The molecular basis of photoperiodism. Biological Rhythms Research 37, 353-380 Martin-Trillo, M, A. Lázaro, R. Scott Poethig, C. Gómez-Mena, M.A. Piñeiro, J M. Martinez-Zapater, y J. A. Jarillo (2006). Early in short days 1 (ESD1) encodes actin-related protein 6 (AtARP6), a putative component of chromatin remodelling complexes that positively regulates FLC accumulation in Arabidopsis. Development 133, 1241-1252. Nº Ponencias, comunicaciones y póster presentados/as y publicados en las actas: 5 Diplomas de Estudios Avanzados Leticia López González (2006). Función de la familia EBS-like (EBL) en el control del tiempo de floración. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias. Director de tesis: Manuel A. Piñeiro y Jose A. Jarillo

OTRAS ACTIVIDADES

Cursos Participación como profesor en el curso de Doctorado: “Biología Molecular de Plantas” correspondiente al Programa de doctorado “Biología Vegetal: Aspectos Moleculares, Fisiológicos y Biotecnológicos” impartido por el Dpto. de Biología de la UAM.

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BIOLOGÍA REPRODUCTIVA DE PLANTAS

COMPONENTES Piñeiro Galvín, Manuel Investigador A Miguel Casado, Eugenio Jose Especialista Técnico Grado Medio Sáez de las Heras, David Auxiliar de Investigación López González, Leticia Becario predoctoral Narro Diego, Laura Becario predoctoral Correo electrónico: pineiro@inia.es

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Disección genética y genómica de rutas de control del tiempo de floración. • Identificación de nuevos represores de la transición floral. • Papel de la cromatina en el establecimiento de patrones de expresión génica

implicados en el control del desarrollo vegetal. • Identificación y análisis de la regulación de genes maestros de procesos de

desarrollo con potenciales implicaciones biotecnológicas.

PROYECTOS Código y título: BIO2004-00494. Regulación del desarrollo y cromatina en plantas. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Piñeiro Galvín, Manuel Angel

PARTICIPACIÓN EN PROYECTOS LIDERADOS POR OTRAS INSTITUCIONES

Código y título: GRAPEGEN. A genomic approach to the identification of the genetic and environmental components underlying berry quality in grapevine. Entidad financiadora: Fundación Genoma España. Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Martinez Zapater, Jose Miguel Principales resultados: Los procesos de modificación y reestructuración de la cromatina tienen un papel central en el establecimiento y mantenimiento de los patrones de expresión génica que controlan las transiciones de fase en el desarrollo vegetal. Estamos interesados en comprender los mecanismos epigenéticos que participan en la regulación de procesos de desarrollo como la transición floral y la dormición de la semilla, que tienen gran valor adaptativo para las plantas y repercuten sobre el rendimiento y la calidad de la producción de especies cultivadas. En concreto, estamos caracterizando los mecanismos moleculares que se requieren para mantener la represión del inductor floral FT en condiciones de fotoperíodos no inductivos de la floración. FT es un gen regulador central en el control del tiempo de floración en Arabidopsis y también en especies cultivadas, y, recientemente se ha propuesto que podría ser un componente esencial de

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la señal sistémica inductora de la floración conocida clásicamente como el “florígeno”. En este período hemos abordado la caracterización funcional del locus SHORT LIFE (SHL) de Arabidopsis. SHL pertenece a una familia de proteínas relacionadas con factores remodeladores de cromatina y con una arquitectura modular específica de plantas. Para determinar su función en el control del desarrollo vegetal hemos analizado por primera vez alelos de pérdida de función correspondientes a SHL, y hemos comprobado que este locus está implicado en la represión floral en condiciones de día corto; de hecho, al igual que EBS, otro miembro de esta familia, SHL es necesario para reprimir la expresión de FT en fotoperíodos no inductivos (López-González et al., ms en prep.). Diversos resultados obtenidos por nosotros sugieren que estas dos proteínas tienen funciones parcial pero no totalmente redundantes en el control de la transición floral, y a diferencia de los mutantes ebs, el fenotipo temprano de mutantes shl no se suprime totalmente por mutaciones en FT, lo que sugiere que el efecto de SHL sobre el tiempo de floración está mediado por otros genes además de FT. Además, hemos demostrado que las mutaciones que afectan a EBS producen alteraciones en los niveles de acetilación de histonas en la región de FT, lo que sugiere que la función de EBS se requiere para mantener al locus FT en un estado transcripcionalmente inactivo en condiciones no inductoras de la floración. Por otro lado, a juzgar por el fenotipo de los mutantes shl y dobles mutantes shl ebs, SHL está implicado en la regulación de otros procesos de desarrollo; en concreto, SHL, al igual que EBS, también está implicado en la represión de la germinación durante la dormición de la semilla, confirmando la participación de la cromatina en la regulación de este proceso. Finalmente, siguiendo una estrategia genética hemos aislado diversas mutaciones que producen una aceleración de la floración y un aumento de la expresión de FT en condiciones de día corto, lo que sugiere que los loci afectados en cada uno de esos mutantes podrían estar también implicados en la represión de este integrador floral en condiciones no inductivas de la floración. La caracterización genética y molecular de estos mutantes desvelará nuevos mecanismos necesarios para la regulación del tiempo de floración, lo que facilitará el diseño de estrategias de manipulación de este proceso con potencial biotecnológico.

PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Jarillo, J.A., y Piñeiro, M.A. (2006). The molecular basis of photoperiodism. Biological Rhythms Research 37, 353-380 Martin-Trillo, M.M., Lázaro, A., Poethig, S.,. Gómez-Mena, C., Piñeiro, M., Martinez-Zapater, J.M.y Jarillo, J. A. (2006). Early in short days 1 (ESD1) encodes actin-related protein 6 (AtARP6), a putative component of chromatin remodelling complexes that positively regulates FLC accumulation in Arabidopsis. Development 133, 1241-1252. Nº Ponencias, comunicaciones y póster presentados/as y publicados en las actas: 5

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Diplomas de Estudios Avanzados Leticia López González. (2006) Función de la familia EBS-LIKE (EBL) en el control del tiempo de floración. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias. Directores: Jose A. Jarillo Quiroga y Manuel Piñeiro Galvín.

OTRAS ACTIVIDADES

Cursos Participación como Profesor en el curso de Doctorado de Biología Molecular de Plantas correspondiente al Programa de doctorado “Biología Vegetal: Aspectos Moleculares, Fisiológicos y Biotecnológicos” impartido por el Dpto. de Biología de la UAM.

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RUTA DE LA UBIQUITINA Y CICLO CELULAR EN PLANTAS

COMPONENTES Del Pozo Benito, Juan Carlos Investigador A Abraham Padrón, Zamira Juan de la Cierva Oliveiro Peppe, Karina Técnico Superior Fernández Morales, Victoria Técnico Superior Díaz Blázquez, Ana Isabel Técnico Superior Manzano Fernández, Concepción Becario predoctoral Jurado Sánchez, Silvia Becario predoctoral Correo electrónico: pozo@inia.es

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Ruta de la Ubiquitina en plantas • Desarrollo del sistema radicular • Control de la división celular • Mejora biotecnológica del tomate

PROYECTOS Código y título: BIO2004-01749. La ruta de la ubiquitina en plantas. Análisis proteómico y funcional de los complejos SCF (ATSKP2) Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2004-2007 Investigador responsable: del Pozo Benito, Juan Carlos Principales resultados Durante este año hemos identificado que el factor de transcripción AtDPb se degrada a través de la ruta de la ubiquitina. La estabilidad de DPb está controlada por el complejo SCF-SKP2A. En estos momentos estamos identificando las regiones de interacción entre ambas proteínas y los elementos en DPb que confieren inestabilidad. El gen SKP2A regula la división celular en plantas, controlando la estabilidad de E2FC y DPB. Mediante esta regulación controla el número de raíces laterales desarrolladas en las plantas. Identificación del motivo en promotor del gen SKP2B que controla la expresión en los puntos de iniciación de raíces laterales. Esto nos permitirá desarrollar promotores artificiales que permitan la manipulación del desarrollo del sistema radicular y su adaptación a diferentes ambientes. Esto estaría dentro de una patente solicitada en 2004. Expresión ectópica de genes reguladores de la división celular E2Fb, CICLINA D3;1, en plantas de tomate (variedad microtom). Hemos conseguido plantas transgénicas de tomate que sobreexpresan estos dos genes. En el futuro podremos caracterizar el efecto que causa la sobreexpresión en la planta y en el fruto.

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Identificación mediante una estrategia proteómica de 200 proteínas reguladas por ubiquitinación en plantas.

PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI J.C. del Pozo, S., Díaz-Triviño, N. Cisneros, and C. Gutierrez. (2006). The balance between cell division and endoreplication depends on E2FC-DPB, transcription factors regulated by the ubiquitin-SCFSKP2A pathway. Plant Cell 18: 2224-2235 Alonso-Peral, M., Candela, H., del Pozo, C., Martínez-Laborda, A., Ponce, MR., and Micol, J.L. (2006) The HEMIVENATA gene is required for the early patterning of leaf venation in Arabidopsis thaliana. Development 133: 3755-3766 Nº Ponencias, comunicaciones y póster presentados/as y publicados en las actas: 3 Trabajos Fin de Carrera Emma Martínez Sánchez (2006). Identificación de proteínas dianas de la ruta de la ubiquitina en plantas. Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Biología.

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MEJORA GENETICA DE VID

COMPONENTES Arroyo García, Rosa Titulado Superior Carcamo Hernández, Claudia Técnico Superior Pérez Rivera, Gema Mª Becario predoctoral Correo electrónico: rarroyo@inia.es

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Diversidad genética en poblaciones naturales de Vitis vinifera L. • Desarrollo de herramientas genómicas y estudios de genómica funcional en

poblaciones naturales y variedades cultivadas de vid. • Identificación clonal de la variedad Tempranillo.

PROYECTOS Código y título: PTR1995-0840-OP Análisis de la variabilidad genética de clones antiguos de alta calidad y desarrollo de marcadores específicos para la identificación de clones de la variedad Tempranillo Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2005- 2007 Investigador responsable: Arroyo García, Rosa Código y título: CGL2005-06821-C02-01 Análisis de la diversidad genética en el proceso de domesticación en la vid (Vitis vinifera L) Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2005- 2008 Investigador responsable: Arroyo García, Rosa

PARTICIPACIÓN EN PROYECTOS LIDERADOS POR OTRAS INSTITUCIONES Código y título: GRAPEGEN. A genomic approach to the identification of the genetic and environmental components underlying berry quality in grapevine. Entidad financiadora: Fundación Genoma España. Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Martinez Zapater, Jose Miguel Código y título: Seguimiento de la restauración ecológica del bosque de nieblas de las lomas de Atiquipa. Entidad financiadora: BBVA Duración: 2006-2009 Investigador responsable: Balaguer Núñez, Luis

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Principales resultados: Los resultados de los proyectos correspondientes al análisis de la diversidad genética de la vid Vitis vinifera L en poblaciones silvestres y cultivadas de la cuenca Mediterránea se ha realizado utilizando dos tipos de marcadores moleculares; microsatélites cloroplásticos y microsatélites nucleares. Los resultados obtenidos con microsatélites cloroplásticos indican la existencia de al menos dos focos de domesticación de la vid uno en la región Trascaucásica y otro en el Oeste Europeo que han dado lugar a las variedades de vinificación Europea (Arroyo et al., 2006). Con respecto a los microsatélites nucleares se esta analizando en profundidad la estructura genética de dos poblaciones que los estudios con microsatélites cloroplásticos nos indicaban poblaciones muy diversas que son poblaciones naturales de la P Ibérica y Turquía. Se analizaron 350 que corresponden a 13 poblaciones que se encuentran en distintas cuencas de ribera de la P ibérica. Con respecto a Turquía se analizaron 95 individuos de 3 poblaciones. Los resultados del análisis de 20 microsatélites nucleares han confirmado los resultados previos mostrando las poblaciones Turcas unos índices de diversidad genética muy alto He: 0.85, superior a las poblaciones de la P Ibérica. En el análisis de estas poblaciones con un programa estadístico que permite obtener una agrupación de los individuos de la población y que es independiente del origen de estos individuos resulto que la estructura de estas poblaciones que se ajusta a una mayor probabilidad era de 3 poblaciones en las que se encontraban; Turquía, Norte de la P Ibérica y Sur de la P Ibérica. El objetivo general de este proyecto es el desarrollo y evaluación de herramientas genómicas dirigidas a identificar los genes responsables de la variación fenotípica natural en caracteres de calidad de uva de vinificación en vid, por ello se están desarrollando colecciones nucleares que permitan tener la mayor diversidad alélica con el menor número de individuos. Con respecto a los genotipos silvestres la colección nuclear del análisis inicial de 10 microsatélites nucleares esta representada por 50 individuos de los 350 iniciales. Los resultados correspondiente al análisis de la variabilidad genética de clones antiguos de alta calidad y desarrollo de marcadores específicos para la identificación de clones de la variedad Tempranillo. Se analizaron estos clones con marcadores anónimos tipo AFLPs los cuales mostraron una elevada variabilidad genética en estos clones centenarios que apuntaba las acumulaciones de mutaciones en estos individuos. En la identificación de marcadores específicos utilizando marcadores que van dirigidas a regiones de retrotransposones denominados REMAP hemos identificado un marcador que distingue un clon del resto. Actualmente, estamos en el proceso de analizar la estabilidad de este marcador para identificar el clon de forma específica. Por último, siguiendo en las líneas anteriores pero en otra especie participo en un proyecto de análisis de la diversidad genética de poblaciones de Caesalpinia spinosa es una leguminosa tropical endémica de la región de Atiquipa en Perú. El objetivo de este proyecto es mediante el análisis con marcadores moleculares llevar a cabo un estudio de la estructura genética de distintas poblaciones de Perú que se han recolectado durante el año 2006.

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PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI R. Arroyo-García, L. Ruiz-García, L. Bowling, S. Agaoglu, R. Ocete, F. Cabello, L. Constatini, S. Gorislabets, V.Risovannaya, A. Ergul, S Grando, P. Mc Govern, I. Pejic, N. Primikririos, K. Sefc, P. Sotiri, H. Steinkellner, L. Troshin, L. Zyka, F Lefort and JM Martínez-Zapater. (2006). Multiple origins of cultivated grapevine (Vitis vinifera L .ssp sativa) based on chloroplasts DNA polymorphims. Molecular Ecology 15(2) 3707-3714. E. Lopez- Peredo, MA Revilla and R. Arroyo-García. 2006. Somaclonal variation of in vitro regenerated plants of hop cv Chinook by AFLP and MSAP. Journal of Plant Physiology 163:1071-1079. Nº Ponencias, comunicaciones y póster presentados/as y publicados en las actas: 4

OTRAS ACTIVIDADES

Cursos Conferencia invitada en Instituto de Agrobiología, CSIC, Salamanca, Abril 2006.

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TRÁFICO INTRACELULAR EN PLANTAS

COMPONENTES Rojo de la Viesca, Enrique Investigador A Correo electrónico: erojo@inia.es

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I

• Transporte de proteínas a las vacuolas de reserva • Vacuolas y muerte celular programada • Ubiquitinación y Endocitosis

PARTICIPACIÓN EN PROYECTOS LIDERADOS POR OTRAS INSTITUCIONES Código y título: BMC2003-08039. Disección genética del tráfico de proteínas vacuolares en Arabidopsis. Entidad Financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2003 -2006 Investigador responsable: Rojo de la Viesca, Enrique Código y título: Análisis genómico y proteómico de la respuesta a herida en Arabidopsis Thaliana Entidad Financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2004-2006 Investigador responsable: Sánchez - Serrano, Jose J. Código y título: Study of the Potential Synergistic Role of Reactive Oxygen Species-Polyamines-Jasmonic Acid in the Signalling of Molecular Responses to Abiotic Stresses in Wild and Transgenic Tobacco Plantas for Superoxide Dismutase and Catalase. Entidad Financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2005-2007 Investigador responsable: Sánchez - Serrano, Jose J. Código y título: BIO2006-11150. Tráfico vacuolar en plantas. Entidad Financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2006-2009 Investigador responsable: Sánchez - Serrano, Jose J. Nº Ponencias, comunicaciones y póster presentados/as y publicados en las actas: 2

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INTERACCION VIRUS - CELULA

COMPONENTES Alonso Marti, Covadonga Investigador A Galindo Barreales, Inmaculada Titulado Superior Garrido Estepa, Macarena Ayudante de Investigación Quetglas Mas, José Ignacio Becario predoctoral Correo electrónico: calonso@inia.es

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I • Estudio de los mecanismos moleculares de patogenicidad de virus animales. • Estudios proteómicos de la interacción patógeno-hospedador y sus

aplicaciones biotecnológicas • Caracterización de dianas moleculares para el desarrollo de antivirales • Análisis de los mecanismos de regulación de la apoptosis por virus • Aplicaciones biotecnológicas de los genes víricos. Vías de la apoptosis como

dianas terapeúticas

PROYECTOS Código y título: CT2006-016236 FOOD - EPIZONE. Network of Excellence for Epizootic Disease Diagnosis and Control. Entidad financiadora: Unión Europea Duración 2007-2010 Investigador responsable: Brun Torres, Alejandro Código y título: CSD2006-0007-2. Consolider-Ingenio 2010. Patogenia de enfermedades víricas porcinas Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2006-2010 Investigador responsable: Mariano Domínguez; Martínez Escribano, José Angel Código y título: BIO2006-00651. Identificación de mecanismos moleculares de patogenicidad del virus de la Peste porcina africana (VPPA) mediante el estudio de sus interacciones con dianas celulares. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2005-2008 Investigador principal: Alonso Martí, Covadonga Código y título: 075813/C/04/Z WELLCOME. Development of African swine fever virus vaccines. Entidad financiadora: Wellcome Trust Foundation Duración: 2005-2009 Investigador responsable: Martínez Escribano, José Angel

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CONVENIOS Código y título: CON06-046. Convenio de colaboración para el desarrollo de moléculas antivirales basadas en la interacción de los virus con la dineína celular en su proceso de internalización, de posible uso terapéutico en diversas infecciones por virus animales y humanos. Entidad financiadora: Algenex S.L. Duración: 2006-2010 Investigador responsable: Alonso Martí, Covadonga Principales resultados Hemos analizado las modificaciones post- traduccionales de las proteínas víricas en la infección, utilizando electroforesis bidimensional y espectrometría de masas (MALDI- TOFF). Se ha determinado que la proteína viral pE120R, se acetila en su extremo N- terminal durante la infección. Esta proteína es esencial para el transporte del virus a la superficie de la célula durante la exocitosis que en el caso del virus de la PPA requiere el transporte ligado a microtúbulos. Construcción de un virus expresando la proteína verde fluorescente: Para visualizar partículas víricas individuales se sustituyó en el genoma del virus del gen codificante para la proteína estructural p54 por un gen quimérico p54- GFP por recombinación homóloga. De este modo se pudo observar la formación de la factoría, el seguimiento en vivo, el movimiento del virus ligado a microtúbulos tras su entrada a tiempos muy precoces, y comprobar el efecto de las drogas que alteran los microtúbulos como nocodazol y taxol, y los microfilamentos como citocalasina sobre el movimiento de las partículas víricas. Caracterización del mecanismo de acción reguladora de la apoptosis del homólogo vírico a Bcl2, A179L, interacción e inhibición de la actividad proapoptótica de los inductores rápidos de la apoptosis de tipo “solo BH3”. Caracterización del gen DP71L del VPPA, homólogo al gen supresor de la apoptosis de herpes simple 34,5, determinación de su interacción con la fosfatasa PP1 y el aumento de su actividad. Repercusiones en la actividad del factor eIF2 alpha y en la respuesta celular a la inhibición de la replicación vírica.

PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI Pérez-Filgueira D. M., F. González-Camacho, C. Gallardo, P. Resino, E. Blanco, E. Gómez- Casado, C. Alonso and J. M. Escribano. (2006). Optimization and validation of recombinant serological tests for African swine fever diagnosis based on the p30 protein produced in Trichoplusia ni larvae. Journal of Clinical Microbiology 44 (9): 3114–3121. Alfonso P., J.I. Quetglás, J.M. Escribano and C. Alonso.(2006). Protein pE120R of African swine fever virus is post-translationally acetylated as revealed by post-source decay MALDI mass spectrometry. Virus Genes DOI 10.1007/s11262-006-0015-6.

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Hernaez, B., J. M. Escribano, C. Alonso. (2006). Visualization of the African swine fever virus infection in living cells by incorporation into the virus particle of green fluorescent protein-p54 membrane protein chimera. Virology 350: 1-14. Nº Ponencias, comunicaciones y póster presentados/as y publicados en las actas: 2

OTRAS ACTIVIDADES

Cursos Profesora del curso de doctorado UAM "Sistema inmune y agentes infecciosos" Centro Nacional de Biotecnología, CSIC (2006) Profesora del ciclo de seminarios sobre Investigación en Bioquímica, Fisiología, Genética Molecular y Embriología de la Facultad de Ciencias de la Salud. Campus de Alcorcón Universidad Rey Juan Carlos. (2006)

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TOLERANCIA AL ESTRÉS MEDIOAMBIENTAL

COMPONENTES Salinas Muñoz, Julio Investigador A2 Medina Alcázar, Joaquín Técnico de I+D+I Moreno Mozo, J. Ignacio Titulado Superior Rodríguez Milla, Miguel Ángel Titulado Superior López Cobollo, Rosa María Titulado Superior Hernández Verdeja, Tamara Becario predoctoral Perea Resa, Carlos Becario predoctoral Redondo Moreno, Adela Ayudante de Investigación Correo electrónico: salinas@inia.es

PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I • Estudio de los mecanismos moleculares que controlan la respuesta de las

plantas a situaciones ambientales (abióticas) extremas.

PROYECTOS Código y título: BIO2004-00628. Caracterización molecular y funcional de nuevos intermediarios en la señalización del proceso de aclimatación a las temperaturas bajas implicados en el metabolismo de RNA mensajeros. Entidad financiadora: Plan Nacional I+D Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Salinas Muñoz, Julio Código y título: CPE03-006-C6-1. Cultivos halotolerantes para una agricultura sostenible. Entidad financiadora: INIA Duración: 2004-2008 Investigador responsable: Salinas Muñoz, Julio

CONTRATOS Código y título: CON04-019. Aislamiento y caracterización de proteinas sintetizadas en respuesta a heladas en especies frutales. Entidad financiadora: Agroseguro Duración: 2004-2007 Investigador responsable: Salinas Muñoz, Julio Código y título: CON03-043. Para regular la explotación de la tecnología cbf2. Entidad financiadora: Futuragene Duración: 2003-2006 Investigador responsable: Salinas Muñoz, Julio

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Principales resultados Las proteínas LSM constituyen una familia de 8 componentes principales (LSM1-LSM8), muy conservados evolutivamente, que actúan funcionalmente formando, al menos, dos complejos heptaméricos. El complejo LSM1-LSM7 es de localización citoplásmica y está implicado en la degradación de los mRNAs. El complejo LSM2-LSM8 es de localización nuclear e interviene en el procesamiento de los pre-mRNAs. A pesar de su relevancia, estas proteínas todavía no han sido caracterizadas ni molecular ni funcionalmente en plantas. En nuestro laboratorio identificamos un gen de Arabidopsis, denominado RCI6, cuya expresión se induce en respuesta a las temperaturas bajas y codifica una proteína con alta similaridad a la LSM2 de levaduras y humanos. En base a estos resultados, el proyecto plantea, como objetivo general, el estudio funcional de las proteínas LSM y su implicación en el proceso de aclimatación a las temperaturas bajas y en estreses relacionados. El análisis genómico nos ha permitido demostrar que Arabidopsis contiene 11 genes que codifican proteínas similares a las LSMs de levaduras y humanos. Cinco de ellos codifican las LSM2, 4, 5, 7 y 8, respectivamente. Los 6 restantes codifican dos isoformas (A y B) para cada una de las proteínas LSM1, 3 y 6. La expresión de todos los genes LSM se induce por frío (4º C), alcanzando un máximo entre 24 y 48 horas después del tratamiento. Los niveles de inducción son diferentes en cada caso. Utilizando fusiones con proteínas fluorescentes hemos localizado las proteínas LSM1 y LSM8 en citoplasma y núcleo, respectivamente, lo que parece confirmar que, al igual que ocurre en levaduras y humanos, las LSM también forman dos complejos de diferente localización subcelular en plantas. Con objeto de determinar si estos complejos son también funcionalmente homólogos a los de levaduras y humanos, hemos identificado y caracterizado mutantes nulos para los genes LSM1 y LSM8. Los resultados preliminares obtenidos hasta ahora indican que los mutantes lsm8 tienen bajos niveles de U6 snRNA, lo que sugiere que el complejo LSM2-8 de Arabidopsis también juega un papel en el procesamiento de mensajeros. En la actualidad, estamos analizando la degradación de mRNAs en los mutantes lsm1, asi como la tolerancia de todos estos mutantes a temperaturas de congelación y otras situaciones de estrés abiótico relacionadas. RCI2A es un gen de Arabidopsis cuya expresión se induce en respuesta a estrés salino, a otros estreses relacionados, como las temperaturas bajas y la deshidratación, y al ABA. El análisis del genoma de Arabidopsis nos ha permitido identificar 7 genes homólogos a RCI2A (RCI2B-H). Las proteínas correspondientes a estos genes muestran una similaridad de secuencia muy alta (53 al 95%) con RCI2A, lo que sugiere que pueden ser funcionalmente homólogas. En este sentido, estudiamos si estos genes, al igual que RCI2A, son también capaces de complementar el mutante pmp3 de levadura. Los resultados obtenidos revelaron que únicamente RCI2B, RCI2C y RCI2H complementan el mutante pmp3, lo que indica que no todas las proteínas RCI2 son funcionalmente redundantes. Dado que RCI2A localiza en la membrana plasmática, analizamos la localización del resto de proteínas RCI2, para determinar si existía una relación entre su función y su localización subcelular. Todas están localizadas en la membrana plasmática, sugiriendo que no existe esa relación. Con el fin de determinar la función de RCI2A, hemos abordado el estudio de su interacción genética con otras proteínas. Recientemente, se ha descrito que la proteína homóloga de RCI2A en levadura, PMP3, interacciona genéticamente con proteínas del complejo de la prefoldina que están implicadas en la biogénesis del citoesqueleto celular. Resulta interesante que mutantes de levadura para estas proteínas son sensibles a las temperaturas bajas y al estrés salino,

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lo que sugiere que dichas proteínas podrían jugar un papel importante en la respuesta a estrés abiótico en levaduras. Puesto que RCI2A es capaz de complementar el mutante pmp3 de levadura, hemos asumido que RCI2A también podría interaccionar genéticamente con proteínas del complejo de la prefoldina de Arabidopsis y hemos iniciado la caracterización de algunos genes que codifican subunidades de dicho complejo. Sorprendentemente, el análisis preliminar de un mutante de Arabidopsis para una de las prefoldinas muestra que está afectado en su capacidad para tolerar las temperaturas bajas (4º C) y el estrés salino (100 mM NaCl).

PUBLICACIONES

Artículos en revistas SCI X. Deng, J. Phillips, A. Brautigam, P. Engstrom, H. Johannesson, P. B. F. Ouwerkerk, I. Ruberti, J. Salinas, P. Vera, R. Iannacone, A. H. Meijer and D. Bartels. (2006). A homeodomain leucine zipper gene from Craterostigma plantagineum regulates abscisic acid responsive gene expression and physiological responses. Plant. Mol. Biol. 61: 469-489. A. Ledesma, V. Moral, M. Villalba, J. Salinas and R. Rodriguez. (2006). Ca2+-binding allergens from olive pollen exhibit biochemical and immunological activity when expressed in stable transgenic Arabidopsis. FEBS J. 273: 4425-4434 Otros artículos J. Salinas and J. J. Sanchez-Serrano (2006). (eds). Arabidopsis Protocols (Second Edition). Series on Methods in Molecular Biology, Vol. 323 Humana Press, Totowa, NJ. USA. Nº de ponencias, comunicaciones y póster publicados: 4

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