Degradación Enzimática de OPs Por Paraoxonasa

DEGRADACIN ENZIMTICA DE XENOBITICOS: el ejemplo de los insecticidas organofosforados

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Divisin Toxicologa

DEGRADACIN ENZIMTICA DE XENOBITICOS:

el ejemplo de los insecticidas organofosforados1RESUMEN

El objetivo general de esta actividad es observar, monitorizar y caracterizar la biodegradacin enzimtica de insecticidas organofosforados en un sistema biolgico modelo. Para ello se estudiar los efectos de cationes divalentes, agentes quelantes y reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo. Se utilizar como substrato modelo el organofosforado paraoxon, que es el metabolito txico del insecticida parathion.

2 FUNDAMENTOS: LOS COMPUESTOS ORGANOFOSFORADOS

(ver guin de prctica sobre hidrlisis qumica de organofosforados)

3FOSFOTRIESTERASAS: LAS ENZIMAS QUE HIDROLIZAN COMPUESTOS ORGANOFOSFORADOS

3.1Las esterasas que hidrolizan organofosforados

Segn la clasificacin actual de la IUB las enzimas que hidrolizan compuestos organofosforados (OPs) se hayan encuadradas en el grupo 3.1.8 que se denomina hidrolasas de tristeres fosfricos o fosfotriesterasas.

Normalmente las fosfotriesterasas se nombran de acuerdo con el substrato que hidrolizan. En la siguiente figura se muestran las reacciones catalizadas por algunas fosfotriesterasas conocidas como son la DFPasa, tabunasa, paraoxonasa y diclorovos (DDVP) hidrolasa. La figura muestra como la hidrlisis del OP da lugar a la liberacin del grupo saliente (F-, CN-, p-nitrofenol y metanol respectivamente) y a la generacin de un residuo fosfrico.

3.2Distribucin de fosfotriesterasas entre especies y tejidos

Las fosfotriesterasas se encuentran ampliamente distribuidas en tejidos animales. La primera demostracin de la existencia de una actividad fosfotriesterasa fue realizada en 1946, se describi la capacidad del suero humano y de conejo de hidrolizar el dialquilfluorofosfato. La hidrlisis del paraoxon fue estudiada en detalle en 1953. Estas primeras observaciones demostraron que los OPs pueden ser hidrolizados por una gran variedad de materiales biolgicos. Es de destacar la gran variabilidad existente entre especies e incluso entre tejidos de la misma especie. No todos los tejidos de una misma especie hidrolizan los mismos OPs ni la misma actividad fosfotriesterasa se presenta en el mismo tejido de todas las especies.

En general los mayores niveles de actividades fosfotriesterasas han sido descritos en mamferos. La actividad fosfotriesterasa mejor estudiada en mamfero corresponde a la paraoxonasa, que en presencia del catin Ca2+ hidroliza el insecticida paraoxon, metabolito txico del parathion. Esta actividad ha sido estudiada principalmente plasma e hgado de mamfero.

La mayora de las aves estudiadas muestran escasa o nula actividad fosfotriesterasa. As, no se detect actividad hidroltica de paraoxon ni de metil pirimifosoxon en: cormorn, ganso, codorniz, frailecillo, alca, pjaro bobo, gaviota, paloma, mirlo, estornino, gorrin y grajo. No obstante en los aos 90 se han detectado actividades hidrolizantes de algunos fosforamidatos y de diisopropilfluorofosfato (DFP) en tejidos de aves.

Adems de mamferos y aves tambin se han descrito fosfotriesterasas en peces como la trucha Salmo trutta y la carpa Cyprinus carpio; en moluscos como el calamar Loligo pealei y Todarodes pacificus steenstrup y el mejilln Mytilus edulis; y en bacterias como Pseudomonas diminuta, Rhizobium y Bradyrhizobium, halfilas, Escherichia coli, Streptomyces lividans, Achromobacter sp. y Tetrahymena thermophila.

3.3 Distribucin subcelular

La actividad hidrolizante de sarin en conejo, cobaya, mono, rata y ratn se encontr fundamentalmente en la fraccin soluble de hgado y rin.

La fraccin soluble del homogeneizado de hgado, rin y cerebro de rata contuvo el 8090% de la actividad DFPasa. Asimismo, tambin se ha descrito en hgado de rata una actividad capaz de hidrolizar sarin, soman, tabun y DFP con un 85% de actividad en la fraccin soluble y el 15% restante en la fraccin particulada. La fraccin soluble de hgado y rin de gallina ha mostrado contener actividad DFPasa. La actividad paraoxonasa ha sido descrita mayoritariamente en la fraccin particulada de hgado de rata.

Aunque no existen muchos datos parece claro que las actividades fosfotriesterasas se reparten en distintas fracciones celulares hepticas, si bien parece que en la fraccin soluble de hgado se localizan preferentemente las actividades hidrolizantes de DFP y compuestos anlogos, y la actividad hidrolizante de paraoxon y compuestos relacionados estructuralmente con l se localiza preferentemente en la fraccin particuladas de hgado.

3.4Estereoselectividad de las fosfotriesterasas

La estereoselectividad en la hidrlisis de los OPs puede ser debida a la hidrlisis de un solo estereoismero o a la hidrlisis ms rpida de uno de ellos que del resto. La hidrlisis estereoespecfica de los ismeros del cianofenfos en ratas es debida a la selectividad de las arilesterasas por el anlogo oxon(). Sin embargo, la hidrlisis estereoespecfica del soman en plasma humano se debe a la diferente velocidad de hidrlisis de sus estereoismeros. Estos ltimos datos contradicen lo publicado por otros autores para hgado de rata, tejido en el cual todos los ismeros del soman son hidrolizados a la misma velocidad. No obstante, numerosos autores han demostrado la hidrlisis estereoespecfica del soman en tejidos de rata, cobaya y marmota.

Se ha encontrado una fosfotriesterasa en Escherichia coli que hidroliz soman. La bacteria present tres isoenzimas, de las cuales una era estereoespecfica y las otras dos no. Se ha tratado de explicar las discrepancias sobre la estereoespecificidad de la degradacin del soman basndose en las diferentes fuentes de tejido utilizadas. Es decir, que la estereoespecificidad dependera de si se utilizaban homogeneizados donde pudieran estar actuando varias isoenzimas o de si se utilizaban protenas ms o menos purificadas.

Otra fosfotriesterasa en la que ha sido descrita estereoespecificidad es la encontrada en Pseudomonas diminuta que slo hidroliz el ismero Sp del Oetil pnitrofenil fenilfosfonotioato (EPN) y 100 veces ms rpido los enantimeros S del acefato y del metamidofos que sus correspondientes enantimeros R.

3.5Activadores e inhibidores de las fosfotriesterasas

Diferentes fosfotriesterasas muestran diferentes respuestas a activadores e inhibidores. As, el patrn de respuesta a stos ha sido empleado frecuentemente para diferenciar entre actividades fosfotriesterasas. Siempre que se ha descrito una actividad nueva se ha intentado establecer su similitud con la actividad paraoxonasa, ya que esta actividad es la ms conocida y estudiada a todos los niveles (bioqumicos, moleculares, genticos etc.).

La actividad de la mayora de las fosfotriesterasas depende en gran medida de la presencia en el medio de reaccin de cationes inorgnicos que pueden actuar como inhibidores o activadores. Algunos cationes juegan el papel de cofactores, lo cual es una diferencia importante respecto a las carboxilesterasas, ya que stas ltimas son menos sensibles a la accin de los iones y no requieren cofactores. El hecho de que las fosfotriesterasas sean sensibles a agentes quelantes y que su actividad, a veces dependa de la concentracin de iones divalentes en el medio de reaccin es compatible con la posibilidad de que se trate de metaloenzimas.

3.6El calcio en las fosfotriesterasas de mamfero

Se ha sugerido que el calcio puede desempear dos papeles en la hidrlisis de paraoxon por paraoxonasa. El Ca2+ sera requerido principalmente para mantener la conformacin del centro activo y, el calcio libre (o dbilmente asociado con la fosfotriesterasa) facilitara la retirada del residuo dietilfosfato del centro activo de la enzima, probablemente a travs de la polarizacin del enlace P=O del paraoxon.

La actividad paraoxonasa de plasma e hgado de rata dependi de la presencia de Ca2+ en el medio. Cuando el catin fue retirado del medio mediante incubacin con cido etilendiaminotetractico (EDTA) la actividad result inhibida. La reactivacin de la enzima por adicin de Ca2+ tras inhibicin por EDTA fue un proceso dependiente de tiempo, los porcentajes de recuperacin de actividad disminuyeron cuando aument el tiempo transcurrido entre la inhibicin y la adicin de Ca2+, lo que sugiere la necesidad del Ca2+ para el mantenimiento de la conformacin de la protena. Resultados similares han sido descritos para la paraoxonasa de hgado humano.

3.7Otros cationes

La fosfotriesterasa de Pseudomonas diminuta posee dos tomos de Zn2+ unidos a su centro activo que resultaron ser necesarios para la actividad cataltica. Estos tomos pudieron ser sustituidos por Mn2+, Co2+, Ni2+, Cd2+ o Mn2+ sin una prdida significativa de actividad. La actividad fosfotriesterasa de esta bacteria result inhibida tras la incubacin con agentes quelantes. La actividad se recuper tras la adicin de hasta 10 equivalentes estequiomtricos metal/protena.

En algunas ocasiones los cationes resultan ser inhibidores de las actividades fosfotriesterasas. En plasma humano, las actividades hidrolizantes de paraoxon y diclorovos (O,Odimetil 2,2diclorovinil fosfato) fueron inhibidas por CdSO4, HgCl2 y AgNO3 y EDTA, aunque dichas actividades fueron restablecidas adicionando concentraciones de Ca2+ equivalentes a las de EDTA. El Cu(SO4) a la concentracin 1 mM fue un fuerte inhibidor (64%) de una parathion hidrolasa de origen bacteriano. El ion Zn2+ a la concentracin de 0.4 mM inhibi hasta un 69% una fosfotriesterasa de bacteria halfila.

La actividad hidrolizante de paraoxon en plasma humano present dos poblaciones fenotpicas bien diferenciadas, la de tipo A (baja actividad) y la de tipo B (alta actividad), cuya distribucin es de aproximadamente un 50% de ambos tipos en raza caucasiana. La actividad tipo A result poco estimulada por NaCl 1 M mientras que la actividad tipo B fue fuertemente estimulada por esta alta concentracin de sal. La actividad paraoxonasa de ambas poblaciones resultaron estimuladas por fosfatidilcolina. Este compuesto aument la Vmax sin alterar la Km de la reaccin.

3.8Reactivos de tioles y otros compuestos orgnicos

Debido a que algunas fosfotriesterasas son inhibidas por reactivos bloqueantes de grupos tioles se ha sugerido que estas protenas podran presentar residuos de cistena en su centro activo.

Tambin se ha descrito el efecto inhibidor de determinadas cetonas como la 2,5hexanodiona o metilvinilcetona y sus homlogos.

El OP mipafox result poseer un efecto inhibidor (7090%) en algunas fosfotriesterasas bacterianas.

3.9Funcin de las fosfotriesterasas

Funcin biolgica de las fosfotriesterasas

A pesar del gran nmero de estudios realizados sobre fosfotriesterasas su funcin biolgica continua desconocida. En ningn caso se ha descrito un sustrato endgeno pero parece clara su funcin en la destoxificacin de xenobiticos organofosforados. Estas actividades no parecen vitales para la salud ya que en un estudio realizado con suero humano se comprob que los individuos que carecan de actividad paraoxonasa no presentaban ningn desorden aparente.

Se ha propuesto que las fosfotriesterasas podran haber evolucionado para metabolizar los OPs y los halometabolitos que existen en la naturaleza, como los anlogos de la alanina, el cido 2aminoetil fosfnico y varios fosfonatos que se encuentran libres en las clulas y se incorporan a los glicerofosfolpodos, esfingofosfolpidos y fosfoprotenas.

La actividad paraoxonasa ha sido detectada en mamferos asociada a la fraccin de lipoprotenas de alta densidad. Esto ha llevado a sugerir la posibilidad de utilizar los niveles de actividad fosfotriesterasa como indicativo de la susceptibilidad al desarrollo de la arteriosclerosis coronaria.

La importancia del descubrimiento de baja actividad fosfotriesterasa en suero de pacientes con la enfermedad del "ojo de pez" (caracterizada por una opacidad corneal muy acusada y por alteraciones en las lipoprotenas plasmticas) es desconocida.

Papel de las fosfotriesterasas en la destoxificacin de organofosforados

Existe una correlacin entre los niveles de actividad fosfotriesterasa y la resistencia a los efectos txicos de los OPs. As, las aves presentan bajos niveles de actividad fosfotriesterasa y son particularmente sensibles a los efectos txicos de los OPs. Sin embargo, los mamferos presentan mayores niveles de actividades hidrolizantes de OPs y son ms resistentes a sus efectos txicos. Ms pruebas de la correlacin entre niveles de fosfotriesterasas y susceptibilidad a efectos txicos de OPs es el hecho de que en estudios morfolgicos con ovejas tratadas con haloxon se observ que aquellos animales con alta actividad fosfotriesterasa no mostraban ningn signo de polineuropata retardada. Adems estas enzimas han sido utilizadas con xito en el laboratorio para la profilaxis de intoxicaciones por OPs.

Se han realizado estudios sobre la posible aplicacin biotecnolgica de fosfotriesterasas purificadas e inmovilizadas en trietil agarosa para la eliminacin de residuos de OPs en agua, para la deteccin de la presencia de stos, e incluso para la destruccin de arsenales de armas qumicas. Aplicando este sistema a la fosfotriesterasa de Pseudomonas diminuta se consigui que la enzima inmovilizada presentara unos parmetros cinticos comparables a los de la enzima en estado soluble aunque la efectividad de la hidrlisis fue menor en la enzima inmovilizada. A pesar de ello, el hecho de que se pudo alcanzar altas concentraciones de enzima disponible aumentando la superficie de nailon permiti que se pudieran hidrolizar altas cantidades de substratos.

4OBJETIVOS

4.1Objetivo general

El alumno estudiar la biodegradacin enzimtica de insecticidas organofosforados en un sistema biolgico modelo caracterizando los efectos de cationes divalentes, agentes quelantes y reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo.

4.2Objetivos especficos

El alumno deber ser capaz de...

Aprender la tcnica de determinacin colorimtrica de la actividad paraoxonasa.

Comprender la necesidad de realizar una recta patrn para el clculo de la actividad enzimtica.

Calcular la actividad enzimtica a partir de las mediciones de absorbancia. Estudiar el efecto de la incubacin con EDTA, Ca2+, Cu2+ y p-hidroximercuriobenzoato sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo.

5FOSFOTRIESTERASA OBJETO DE ESTUDIO

Se estudiar la actividad hidrolizante de paraoxon en suero de conejo. La siguiente figura muestra la reaccin catalizada por la paraoxonasa. En la siguiente figura se observa cmo la fosfotriesterasa hidroliza el paraoxon liberando p-nitrofenol y cido dietilfosfrico:

6PRECAUCIONES

Deben respetarse las normas generales de seguridad aplicables en cualquier laboratorio y puestos de trabajo y las normas especficas indicadas en el laboratorio en donde se realiza la actividad.

En casos de duda debe siempre consultar al profesor o responsable del laboratorio. Debe informar de cualquier anomala que observe, rotura de material o situaciones de peligro para los dems usuarios.

7PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

7.1Determinacin del p-nitrofenol liberado

Como se muestra en la figura anterior, la hidrlisis enzimtica de paraoxon genera p-nitrofenol. La cantidad de p-nitrofenol liberado se utilizar para monitorizar y cuantificar la hidrlisis del paraoxon. Cuando el p-nitrofenol se desprotona forma el ion p-nitrofenolato, que es un compuesto de color amarillo y que, por lo tanto, absorbe a una longitud de onda en torno a 400 nm.

Preparacin de los patrones de la curva de calibrado a partir de una disolucin 100 M de p-nitrofenol en Tris 50 mM pH 8.0Concentracin de p-nitrofenol (M)

Volumen (L)010203040506070

p-nitrofenol 100 M (en H2O)0500100015002000250030003500

Tris 50 mM pH 8.050004500400035003000250020001500

Resultados experimentalesAbsorbancia de los Patrones

Medida N0 M (Blanco)10 M20 M30 M40 M50 M60 M70 M

100,2480,5150,7540,9781,2081,4061,569

Pendiente del modelo lineal (y = ax)Y=0,0235X

Coeficiente regresin de lineal (R2)R2 = 0,9941

Determina la absorbancia a 400 nm de las disoluciones patrn de p-nitrofenol (0 70 M). Se representar la media de la absorbancia de los patrones de p-nitrofenol, tras restar el valor del blanco, frente a la concentracin conocida de dichos patrones, para construir una curva de calibrado. A partir de sta y de las absorbancias de las muestras, se calcular la concentracin de p-nitrofenol generado durante la hidrlisis (ANEXO I).

7.2Reactivacin por Ca2+ de la actividad paraoxonasa de suero de conejo inhibida por EDTA

Se inhibir la actividad paraoxonasa de suero de conejo incubando la enzima con EDTA a diferentes tiempos (0, 5 y 30 min). Tras ello, se tratar de reactivar la enzima adicionando Ca2+ suficiente para neutralizar el EDTA. Inicie el programa de tiempos que se muestra a continuacin en tres tubos (tubo 1, 2 y 3) mantenindolos a 37C.Programa de Tiempos 1 (Temperatura = 37 C), ( = 400 nmTiempo (min)TuboAccin

(1, 2 y 3Aadir 100 L suero conejo (1:10)( Contiene la enzima

(1, 2 y 3Aadir 2000 L Tris 50 mM pH 8.0( Ion cambia de color a pH=8

01Aadir 100 L EDTA 5 mM

0 +1Aadir 800 L Ca2+ 5 mM



72Aadir 800 L Ca2+ 5 mM

101Aadir 1000 L paraoxon 4 mM( Sustrato

111Medir Absorbancia 1

172Aadir 1000 L paraoxon 4 mM




343Aadir 800 L Ca2+ 5 mM

443Aadir 1000 L paraoxon 4 mM



Resumen de Tiempos

Tiempo (min)

AdicinMedida de Absorbancia

TuboEDTACa2+Pxn12

100 +101126

227171833

3434444560

Datos Experimentales

Muestra (Tris 50 mM pH 8.0)Absorbancia

400 nm, T = 37C

12

Tubo 1: 0 min EDTA + Reactivacin Ca2+0,7210,936



7.3Efecto del Cu2+ sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo

Se determinar cmo afecta a la actividad paraoxonasa la incubacin a 37 C de suero de conejo con Cu2+ 1 mM durante 60 minutos.Datos Experimentales


400 nm, T = 37C

12

Cu2+ C (Ca2+ 0.5 mM en Tris 50 mM pH 8.0)0,7811,113

Cu2+ T (Cu2+ 1 mM en Ca2+ 0.5 mM Tris 50 mM pH 8.0)0,7450,914

7.4Efecto de reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo

Se determinar cmo afecta a la actividad paraoxonasa la incubacin a 37 C de suero de conejo con p-hidroximercuriobenzoato 1 mM durante 60 minutos.Datos Experimentales


400 nm, T = 37C

12

MB C (Ca2+ 0.5 mM en Tris 50 mM pH 8.0)0,7641,110

MB T (p-OHMB 1 mM en Ca2+ 0.5 mM Tris 50 mM pH 8.0)0,7670,939

7.5Efecto de agentes quelantes sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejoSe determinar cmo afecta a la actividad paraoxonasa la incubacin a 37 C de suero de conejo con EDTA 1 mM durante 10 minutos.Datos Experimentales


400 nm, T = 37C

12

EDTA C (Tris 50 mM pH 8.0)0,8211,061

EDTA T (EDTA 1 mM en Tris 50 mM pH 8.0)0,7800,767

Programa de Tiempos 2 (Temperatura = 37 C), ( = 400 nmTiempo (min)TuboAccin

(Cu2+ C y TAadir 100 L suero conejo (1:10)

(Cu2+ C y TAadir 2000 L Tris 50 mM pH 8.0

0Cu2+ CAadir 600 L Tris 50 mM pH 8.0

0+Cu2+ CAadir 300 L Ca2+ 5 mM

2Cu2+ TAadir 300 L Ca2+ 5 mM

2+Cu2+ TAadir 600 L Cu2+ 5 mM

(MB C y TAadir 100 L suero conejo (1:10)

(MB C y TAadir 2000 L Tris 50 mM pH 8.0

20MB CAadir 600 L Tris 50 mM pH 8.0

20+MB CAadir 300 L Ca2+ 5 mM

22MB TAadir 300 L Ca2+ 5 mM

22+MB TAadir 600 L p-OHMB 5 mM

(EDTA C y TAadir 100 L suero conejo (1:10)

(EDTA C y TAadir 2000 L Tris 50 mM pH 8.0

30EDTA CAadir 600 L Tris 50 mM pH 8.0

30+EDTA CAadir 300 L Ca2+ 5 mM

32EDTA TAadir 300 L Ca2+ 5 mM

32 +EDTA TAadir 600 L EDTA 5 mM

40EDTA CAadir 1000 L de paraoxon 4 mM

41EDTA CMedir Absorbancia 1

42EDTA TAadir 1000 L de paraoxon 4 mM

43EDTA TMedir Absorbancia 1

56EDTA CMedir Absorbancia 2

58EDTA TMedir Absorbancia 2

60Cu2+ CAadir 1000 L de paraoxon 4 mM

61Cu2+ CMedir Absorbancia 1

62Cu2+ TAadir 1000 L de paraoxon 4 mM

63Cu2+ TMedir Absorbancia 1

76Cu2+ CMedir Absorbancia 2

78Cu2+ TMedir Absorbancia 2

80MB CAadir 1000 L de paraoxon 4 mM

81MB CMedir Absorbancia 1

82MB TAadir 1000 L de paraoxon 4 mM

83MB TMedir Absorbancia 1

96MB CMedir Absorbancia 2

98MB TMedir Absorbancia 2

7.6Efecto de la especie sobre la actividad paraoxonasa

Se comparar la actividad paraoxonasa en suero de conejo y de pollo.

Programa de Tiempos 3 (Temperatura = 37 C), ( = 400 nmTiempo (min)TuboAccin

(PolloAadir 100 L suero pollo (1:10)

(PolloAadir 300 L Ca 5 mM

(PolloAadir 2600 L Tris 50 mM pH 8.0

(ConejoAadir 100 L suero conejo (1:10)

(ConejoAadir 300 L Ca 5 mM

(ConejoAadir 2600 L Tris 50 mM pH 8.0

0PolloAadir 1000 L de paraoxon 4 mM

1PolloMedir Absorbancia

2ConejoAadir 1000 L de paraoxon 4 mM

3ConejoMedir Absorbancia



















Resultados

PolloConejo

Tiempo[p-nitrofenol]Tiempo[p-nitrofenol]

AbsorbanciaC (M)AbsorbanciaC (M)

10,68329,06410,69129,404

60,67028,51160, 81434,638

110,68028,936110,97641,532

160,67528,723161,05544,894

210,65828211,16549,574

260,67328,638261,28854,809

310,71130,255311,41960,383

360,65828361,51564,468

410,74031,489411,59067,659

460,68128,979461,64570

A partir de la curva de calibrado (C = Abs/0,0235) y de las absorbancias de las muestras, se calcular la concentracin de p-nitrofenol generado durante la reaccin de biotransformacin (ANEXO I).8INFORME FINAL

Elabore un informe final sobre el trabajo realizado, incluyendo las respuestas a las cuestiones que se plantean a continuacin. Aada cualquier otro comentario que considere pertinente.

(1)En el experimento de reactivacin por Ca2+, Cul es la razn concentracin de calcio / concentracin de EDTA en el volumen de reaccin enzimtica? Representar en una figura de barras la actividad enzimtica en funcin del tiempo de incubacin en presencia de EDTA. Qu se observa? Cmo podra justificar estos resultados? Ca / EDTA = ((800*5)/4)/((100*5)/4) = 1000/125 = 8 =8/1(2)Represente en una grfica de barras las actividades enzimticas de las muestras control y ensayadas en presencia de Cu2+ 1 mM. Cul es el efecto del Cu2+? Cmo podra justificar estos resultados?

Muestra AbsorbanciaC. (C = Abs/0,0235)

1212

Cu2+ C 0,7811,11333,23447,362

Cu2+ T0,7450,91431,70238,894

Muestra Act enzimticaAct. Relativa

C2-C1C*4/15Act.enz/ 10-2

Cu2+ C 14,1283,767376,7

Cu2+ T7,1921,917191,787

El Cu+2 es un inhibidor competitivo , produciendo una menor actividad.(3)Represente en una grfica de barras las actividades enzimticas de las muestras control y ensayadas en presencia de p-hidroximercuriobenzoato 1 mM. Cul es el efecto del p-hidroximercuriobenzoato? Cmo podra justificar estos resultados? Muestra Absorbancia C. (C = Abs/0,0235)

1212

MB C 0,7641,11032,51147,234

MB T 0,7670,93932,63839,957


C2-C1C*4/15Act.enz/ 10-2

MB C 14,7233,926392,613

MB T7,3191,952195,173

El Mg +2 se une al grupo tiol de la enzima e impide la actividad , deduciendo que hay una cisteina SH. No debera producirse actividad.(4)Represente en una grfica de barras las actividades enzimticas de las muestras control y ensayadas en presencia de EDTA 1 mM. Cul es el efecto del EDTA sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo? Cmo se justifican estos resultados?

Muestra Absorbancia C. (C = Abs/0,0235)

1212

EDTA C 0,8211,06134,93645,149

EDTA T 0,7800,76733,19132,638


C2-C1C*4/15Act.enz/ 10-2

EDTA C 10,2132,723272,346

EDTA T-0,553-0,147-14,746

El EDTA inhibe la enzima, debido a que se une al Ca+2, necesario para unir el sustrato a la enzima. Hay dos tipos de calcio uno de alta afinidad y que facilita la cantividad en el centro activo y que es secuestrado por el EDTA y otro que mantiene la estructura tridimensional de la enzima, si es secuestrado por el EDTA , la enzima se desnaturaliza.

(5)Representa en una misma grfica la concentracin de p-nitrofenol producido como consecuencia de la actividad paraoxonasa cuando se utiliza suero de pollo y conejo. Cmo podra justificar estos resultados? Qu especie ser ms susceptible a la exposicin al organofosforado paraoxon? Explica por qu. En el pollo no se produce tanta hidrolisis del paroxon porque no tiene enzima , por lo que ser ms sensible

ANEXO I

CLCULO DE ACTIVIDAD ENZIMTICA

La actividad enzimtica se expresar utilizando la unidad internacional.

Unidad Internacional (UI o U): cantidad de enzima que transforma 1 micromol (mol) de sustrato por minuto de reaccin en las condiciones de ensayo. En la presente prctica el producto coloreado que se forma es p-nitrofenol que se cuantifica midiendo la absorbancia a 400 nm.

1 UNIDAD = 1 U = 1 mol / min

La actividad enzimtica se define mediante la siguiente expresin:

(Exp. 1)

Donde (n es el incremento en el nmero de moles p-nitrofenol entre el tiempo inicial (t0) y el tiempo i (ti).

Teniendo en cuenta que los datos obtenidos en la prctica son medidas de absorbancia de p-nitrofenoly tiempo, emplearemos la definicin de concentracin y la ley de Lambert-Beer con el fin de obtener una expresin que permita calcular la actividad enzimtica.

En primer lugar, la concentracin se define con la expresin que se muestra a continuacin:

(Exp. 2)

Donde c es la concentracin, n el nmero de moles de p-nitrofenol y V es el volumen de la disolucin. Por lo que se desprende que:

(Exp. 3)

Despejando (n de la definicin de concentracin (Exp. 3) y sustituyendo en la definicin de actividad enzimtica (Exp. 1) obtenemos:

(Exp. 4)

Con el fin de conocer (C para cada muestra, se representar la absorbancia de los patrones de p-nitrofenol frente a la concentracin conocida de dichos patrones, obteniendo un modelo lineal (Exp. 5ab).

(Exp. 5a)

(Exp. 5b)

Donde Abs es la absorbancia, C la concentracin, y tanto a como b dos constantes obtenidas mediante el ajuste lineal.

La absorbancia medida para cada muestra se introducir en el modelo lineal (Exp. 5b) para calcular la concentracin, y a continuacin se calcular el incremento de concentracin ((C = C2 C1) para cada muestra.

Introduciendo el valor calculado (c en la Exp. 4 y sustituyendo el valor del volumen total de reaccin obtenemos la actividad enzimtica a partir de los datos de absorbancia y tiempo obtenidos en el laboratorio.

Con el objeto de calcular la actividad enzimtica relativa al volumen de suero utilizado (medido en mL) emplearemos la expresin:

(Exp. 6)

Donde Vs es el volumen de suero utilizado inicialmente. Sustituyendo la actividad enzimtica (Act) de la Exp. 4 en la Exp. 6 obtenemos:

(Exp. 7)

RESUMEN:

Determinacin de la actividad enzimtica relativa al volumen de suero utilizado

VVolumen de reaccin enzimtica, (4 mL = 4(10-3 L)

CConcentracin (M) calculada a partir de la absorbancia de la muestra (Abs) y del modelo lineal obtenido con los patrones (Exp. 5ab):

(

(C(C = C2 C1; Incremento de concentracin de p-nitrofenol producido por paroxonasa (M)*

VsVolumen de suero inicial (10L = 10-2 mL)**

tiTiempo de medida en el momento i (medida de laboratorio)***

T0Tiempo de medida inicial (medida de laboratorio)***

Actividad enzimtica relativa (Exp. 7)

* (C calculada mediante la curva de calibrado (M).** Las unidades de la actividad enzimtica relativa son mol(min-1(mL-1, y en consecuencia el valor del volumen de suero inicial que se introduce en la Exp. 7 tiene como unidades el mL.

*** Introducir en la Exp. 7 la medida de tiempo en minutos.PATRONES

Absorbancia de los Patrones

Medida N0 M (Blanco)10 M20 M30 M40 M50 M60 M70 M

100,2480,5150,7540,9781,2081,4061,569

Pendiente del modelo lineal (y = ax)

0 M10 M20 M30 M40 M50 M60 M70 M

Media-Bl.010,55321,91432,08541,61751,40459,82966,766

MUESTRAS PROBLEMA

TuboAbsorbancia[p-nitrofenol]Act. Enz. Rel.

12C1 (M)C2 (M)(C (M)(molmin-1mL-1)

Reactivacin por Ca2+ de la actividad paraoxonasa de suero de conejo inhibida por EDTA

0 min0,7210,93630,68139,8299,148243,968

5 min0,7430,93231,6170212839,659574478,042553191214,4680851

30 min0,7280,87630,978723437,276595746,29787234167,9432624

Efecto del Cu2+ sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo

Cu2+ C0,7811,11333,23447,36214,128376,7

Cu2+ T0,7450,91431,70238,8947,192191,787

Efecto de reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo

MB C0,7641,11032,51147,23414,723392,613

MB T0,7670,93932,63839,9577,319195,173

Efecto de agentes quelantes sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo

EDTA C0,8211,06134,93645,14910,213272,346

EDTA T0,7800,76733,19132,638-0,553-14,746

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Degradación Enzimática de OPs Por Paraoxonasa

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