“De la Investigación a la Clínica: Aplicaciones de Citometría de Flujo en la Práctica Clínica”

T.M. MsC Juan Luis Castillo N.Citometría de Flujo

Hospital del Trabajador Concepción,Facultad de Medicina

Universidad de Concepción

Lunes 24 de Abril de 2006

www.oncoinmun.co.cl

0 13 24 71 113223

481 611811940

10771234

15051861

22722413

27462919

35753518

357636273899

4261

48555034

5384

5818

6243

6633

1731

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

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6000

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7000

1976

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1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

Papers

Datos Tomados de PubMed usando las palabras: “flow Cytometry”

AÑOS

Citometría de Flujo: Publicaciones / año(23/04/2006 : 17:00 hrs)

Flow Cell

InjectorTip

FluorescenceFluorescencesignalssignals

FocusedFocused laserlaserbeambeam

Sheathfluid

Citometría de flujo: mediciones

L

M

G

SCATTER FLUORESCENCIA IMAGEN

“GATE”

Parámteros Citoplasmáticos

Parámetros Nucleares

Parámetros Superficie Celular

Parámetros Extracelulares

Enzimas

EnzimasEnzimas

Proteínas

Proteínas

Pared Celular

Proteínas Secretadas

¿Qué se puede analizar por citometría de flujo?

Moléculas Superficie Celular

DNA

CITOMETRIA DE FLUJO:APLICACIONES

• Hematología• Inmunología• Patología• Transplantes• Farmacología• Biología

• Toxicología• Microbiología• Parasitología• Citogenética• Virología• . . . . . . . . . . .

CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes

• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias

• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas

• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular

• Estudio de HLA-B27

• Estudio de Células Progenitoras (CD34)

• Estudio de Citokinas Intracelulares

1996

• 20 a 30% de los leucocitos circulantes• Se originan en médula ósea• Se encuentran

• Sangre• Linfa• Ganglio linfático • Timo• Médula ósea

Linfocitos

Linfocitos

Células NK-TCélulas NKLinfocitos BLinfocitos T

Linfocitos T CD4 Helper

Linfocitos TCD8

Citotóxicos Supresores

Subpoblaciones Linfocitarias y sus funciones

Lisis de células Tumorales y células infectadas por virus.Regulación inmune

Citoxicidad Directa. Destrucción de células

tumorales y células infectadas por

microorganismos

Producción de Anticuerpos

Colaboran y Dirigen la Respuesta Inmune Citotoxicidad celular.

Suprimen la respuesta inmune

Linfocitos

Células NK-TCélulas NKLinfocitos BLinfocitos T

Linfocitos T CD4 Helper

Linfocitos TCD8

Citotóxicos Supresores

Subpoblaciones Linfocitarias y sus Marcadores de Superficie

CD3(+)/CD16(-)/CD56(+)CD3(-)/CD16(+)/CD56(+)CD3(-)/CD19(+)

CD3(+)/CD4(-)/CD8(+)CD3(+)/CD4(+)/CD8(-)

CD3(+)

HLA-DR

• Indicador de activación celular• Expresado en:

• Linfocitos T activados• Células NK activadas• Células NK-T activadas• células presentadoras de antígeno:

• Linfocitos B• Monocitos y Macrófagos

Infección VIH-SIDA

Terapia Inmunosupresora

NNInfección viral (herpes)

NInmunodepresión celular severa(SIDA)

NNNInmunodepresión celular (infección VIH)

NNNSupresión y control de la respuesta inmune celular

Establecimiento de respuesta inmune celular

NK-T

Inicio de respuesta inmune celular (ej.: infección)

LT HLA-DR(+)

NKLBLTCD8LTCD4LT Totales

Situación

: Aumentado: Disminuido

N : Normal

Ejemplo de alteraciones del recuento de Subpoblaciones Linfocitarias

Varón 28 años, Síndrome Disentérico, CEG y Baja de peso (15 -20 kgen 2 meses).Paciente relata haber presentado un cuadro gripal 1 mes antes del comienzo de su cuadro diarreico.

3 Coproparasitológicos (-)

EDB y biopsia compatibles

Test de Elisa para VIH (-)

HospitalizaciónTerapia ATB, corticoides.

El 10º día se reemplaza terapia por sulfasalazina, prednisona oral y nutrición vía oral

CU

Caso Clínico

Paciente sufre de una inmunodepresión severa por tratamiento para CU, y desarrolla infecciones por agentes oportunistas.

Recuento Linfocitos TCD4: 5 mm3

VIH (+) Confirmado por ISP

Evaluación de la Fagocitosis y del metabolismo oxidativo

Estallido Respiratorio

• En la destrucción de microorganismos fagocitados se libera peróxido de hidrógeno (H2O2)

• La prueba de estallido respiratorio mide la producción de H2O2

• Permite determinar:• El grado de activación celular• La respuesta a la estimulación.

• Adulto normal• No estimulado :• Estimulado con PMA :

25.86 %76.98 %

Estallido respiratorio en Fagocitos

Ejemplo de alteraciones del Estallido Respiratorio

NN

NN

>40 >50N>40 >50NTTO antioxidantes / vitaminas / Zn / Se

>25 <50N>25 >50NInfección viral / Herpes / Aftas bucales / Estrés

>25 <50>25 <50Infección Bacteriana leve a moderada

<20<20Sepsis

<20<20E.G.C.

>50NN>50NNNormal

Δ B-EEBΔ B-EEB

MonocitosGranulocitosSituación

: Aumentado: Disminuido

N : Normal

B : BasalE : EstimuladoΔ B-E: Diferencia

Expresión de HLA-DR en Monocitos

Monocitos

CPA

Ag

Procesamiento Ag

Presentación Ag

Molécula MHC ( HLA-DR)

Procesamiento y Presentación de Antígenos

Procesamiento y Presentación de Antígenos

Molécula MHC (HLA-DR)

TCR/CD3

Ag

CPA (monocito)

Procesamiento Ag

Presentación Ag

Linfocito T Respuesta Inmune

74 (68 – 79)76 (56 – 90)≥ 7 %APACHE II score

72 (67-77)83 (64 – 94)≤ 78 %HLA-DR(+) monocytes

Specificity (%)Sensitivity (%)Cut-off point

Predicting organ failure in patients with acute pancreatitis (Values in parentheses are 95% CI)

The Biochemical Society: Clinical Science 2003; 105: 409-417

Expresión de HLA-DR en Monocitos

60

40

20

2 days 5 days

Survivors

Non survivors

HL

A-D

R(%

Exp

ress

ion) Changes in HLA-DR expression on monocytes in

patients with septic shock after admittance to theintensive care unit.

Clinical Chemistry 2002; 48: 1589-92

Inmunodepresión severa, sepsis, compromiso vital de alto riesgo.

Menor a 24

Inmunodepresión severa. Presencia de inflamación sistémica, sepsis.

24 – 62

Inmunodepresión. Presencia de cuadro infeccioso moderado a severo.

62 – 78

Inmunodepresión leve. Cuadro infeccioso leve.78 – 88

Normal88 – 100

Interpretación niños y adultos(**)Rango (%)

Expresión de HLA-DR en Monocitos

Inmunofenotipo de Leucemias y Linfomas

Hematopoiesis

PLURIPOTENTSTEM CELL

COMMITTEDPROGENITOR

CELL

RECOGNIZABLE BONE MARROW

PRECURSOR CELL

MATURE BLOOD CELL

myeloblastmonoblast

pronormoblast red cellneutrophilmonocyte

basophil

platelet

CFU-Baso

CFU-Eos

CFU-GM

BFU-E/CFU-E

eosinophil

pre-T

pre-B

myeloidprogenitor

cell

lymphoidprogenitor

cell

lymphoblast

lymphoblast

T-cell

B-cell& plasma cell

MIXED PROGENITOR

CELL

CFU-Meg megakaryocytepluripotent

stem cell

CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA)

•LLA-B :-BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19.-BII Común : CD10.-BIII Pre B: clg.-BIV Madura : slg

•LLA-T :-TI-proT: CD7-TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8-TIII-Cortical: CD1a-IIV-Madura: CD1a y CD3mb

•LMA :-LMA-M6 : glicoforina A-LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b-LMA-M3 : HLA-DR(-)-LMA-M4 : HLA-DR(+)

Colon normal

Crohn

Crohn

C.U.

ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINALEspectro de presentación.

Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn

Alteración de la inmunoregulaciónde mucosa intestinal

Inflamación persistente y/o recurrente

Congestión ulcerativa Granulomatosa

Cáncer

ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL

Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn

Estudios celulares de mucosa intestinal:

• Células epiteliales Presentadoras de antígenos.

• Macrófagos Moduladores

• Linfocitos: TCD4 Perpetuación

Induction and Modulation of Gastrointestinal InflamationFALK Symposium 104, Amsterdam, 1999.

Mahida YR et al. Gut.1989;30:826-34

Roggler G. et al. In:Innovative Concept in IBD.Kluwer Acad. Publishers 1999 pps.:111-113

Mucosa

• HLA-DR• CD16

• CD54

• CD25

• CD68• CD80, CD86• CD11b

Normal

20-30%Ausente

7%

Ausente

AusenteAusente

5%

EII

PresentePresente

C.U. 70%Crohn 46%

C.U. PresenteCrohn ausente

PresentePresentePresente

Inmunofenotipo de Macrófagos Intestinales (Histológicamente normales)

> 5 %> 30 %Inflamación crónica activa

< 5 %> 30 %Inflamación crónica con escasa actividad

> 5 %< 30 %Inflamación Aguda

< 5 %< 30 %Normalidad

CD16HLA-DRSituación

Ejemplo de alteraciones del Inmunofenotipode Macrófagos Intestinales

Ejemplo de Macrófagos Intestinales

Ploidía de ADN y Ciclo celular

Células cancerosas difieren de las normales

1. Pérdida de funciones diferenciadas.2. Expresión de “neo antígenos” no

típicos del estado diferenciado.3. Capacidad de invadir tejidos no

nativos.4. Metabolismo diferente.5. Inestabilidad genética elevada.6. Morfología anormal.7. Progresión hacia malignidad.

ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR

Bert Vogelstein’s model of colorectal cancer

Teoría de mutaciones acumuladas

Displasia de bajo grado

V/SSin displasiaDisplasia indefinida

0.46

Displasia de alto gradoV/SSin displasiaDisplasia indefinida

Displasia de bajo grado

0.7

Concordancia interobservador (0-1)

Histopathology 2004; 45: 312-334

Definición del Grado de Displasia

Aneuploidía precede a la displasia

Aneuploidía algunos la consideran un marcador prediplásico y/o preneoplásico

“Según la teoría de mutaciones acumuladas, el cáncer es producido por mutaciones de genes específicos,

llamados oncogenes y genes supresores de tumores.”Science 194:23-28 (1976)Nature 289:353-357 (1981)Science 285:210-211 (1999)Science 285:251-254 (1999)

“Diversos estudios han evidenciado que un gen mutado o la combinación de ellos no es suficiente para

transformar una célula normal en neoplásica”Science 267:1407-1408 (1995)Biochem J. 340:621-630 (1999)Cell cycle 3:823-828 (2004)Nature Biotechnol 21:13-14 (2003)Science 284:2089 (1999)Science 297:544-546 (2002)

Teoría de la aneuplodía

“Propone que el cáncer es causado por la dosificación anormal de miles de genes normales”

“Esta dosificación anormal de genes es generada por la ganancia o pérdida de cromososmas específicos o segmentos de cromosomas, alias aneuploidía”

Proc Natl Acad Sci USA 94:14506-11 (1997)Biochem J 340:621-30 (1999)Proc Natl Acad Sci USA 97:3236-4 (2000)Cell Motil Cystoskel 47:81-107 (2000)Cell cycle 2:202-10 (2003)IUBMB life 56:65-81 (2004)Nature Biotechnol 21:13-14 (2003)GENES VII (Lewin B.)

Teoría de la aneuplodía

Hipodiploidía Indice de ADN 0.75 – 1.0

Límite para viabilidad

HiperdiploidíaIndice de ADN mayor a 1.01.5 = triplodía2.0 = tetraploidía

Cytometry 22:307-316 (1995)Biochem J. 340:621-30 (1999)

Teoría de la aneuplodía

La inestabilidad genómica puede ser identificada por citometría de flujo.

Núm

ero

de c

é lu l

as

DNA/Célula

Normal Tetraploide Aneuploide

Diploide

2N 4N 2N 4N 2N> 6%< 6%

Teoría de la aneuplodía

Relevancia Clínica de la Aneuploidía en cáncer:

1. Si el cáncer es causado por la aneuploidía, la malignidad será proporcional al grado de aneuplodía.

2. La aneuploidía precede el cáncer, por lo que este debiera ser prevenible detectando y eliminando aneuploidías precancerosas.

Teoría de la aneuplodía

Cell cycle 3:823-828 (2004)

Teoría de la aneuplodía

• 104 carcinomas de mama• En base a proliferación celular:

• Near diploid baja malignidad• Near diploid alta malignidad

• Tetraploide baja malignidad• Tetraploide alta malignidad

La proliferación celular permite clasificar adenocarcinomas de mama (near diploid, tetraploides y aneuploides) en neoplasias de alta y baja malignidad.

• En la carcinogénesis colorectal y cervical, esta transición es

reflejada por la displasia.

• La inestabilidad genética, medida por la aneuplodía, aumenta

progresivamente con el grado de la displasia hasta el desarrollo

de un carcinoma.

Teoría de la aneuplodía

Teoría de la aneuplodía

Barrett’s EsophagusTetraploidy, Aneuploidy (>2.7N) Predict Cancer

Prob

abili

ty o

f Can

cer

Years

Neither

Aneuploidy

Tetraploidy

Both Tetraploidy & Aneuploidy

Barrett MT, Sanchez CA, Prevo LJ, Wong DJ, Galipeau PC, Paulson TG, Rabinovitch PS, Reid BJ. Evolution of Neoplastic Cell Lineages in Barrett’s Esophagus. Nature Genetics, 22:106-109, 1999

Teoría de la aneuplodía

Tetraploidía predispone a la Aneuploidía en EB

Citometría de flujoNormal

Tetraploide

Progresando a aneuploidía8/74 (11%)

11/16 (69%)

N= 90 pacientes

P < 0.0001

Intervalo promedio entre tetraplodía y aneuploidía: 17 meses

p53/Flow Cytometric Combinations (1995-2002) N = 240 patients

p53 mut and/or LOH, normal flow

normal p53, normal flow

p53 mut and/or LOH andaneuploid and 4N

p53 mut and/or LOHand aneuploid or 4N

ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SÓLIDOS

ANEUPLOIDIA

ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SÓLIDOS

ANEUPLOIDIA• Grado de malignidad

• Pronóstico

InvasiónMetástasisEvolución naturalRespuesta a tratamiento

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

PROLIFERACION CELULAR

• Tiempo libre de enfermedad.

• Sobrevida.

0.95 - 1.05Índice de ADN

%0.78 - 17.34Fase S + Fase G2M

%0.33 - 11.03Fase S (**)

%0.45 - 8.72Fase G2M

%82.66 - 99.21Fase G0G1

Rango Referencia (*)Parámetro

Fases del Ciclo Celular en epitelios (tejido fresco)

(*) Análisis modelando fase S con modelo trapezoidal y tres compartimentos.

Mujer, 64 años.Pólipo colon Yamada II a 25 cm.

Biopsia: Adenoma con atipía moderada a severa.

Ejemplo de alteraciones de plodía y ciclo celular

CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes

• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias

• Estallido Respiratorio en Granulocitos y Monocitos

• HLA-DR en monocitos.

• Inmunofenotipo de macrófagos intestinales

• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas

• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular

• Microbiología

• Estudio de HLA-B27

• Estudio de Células Progenitoras (CD34)

• Estudio de Citokinas Intracelulares

• Cuantificación de moléculas

• Degranulación de basófilos

• Resistencia a drogas.

• Cuantificación de citokinas circulantes

2006

“De la Investigación a la Clínica: Aplicaciones de Citometría de Flujo en la Práctica Clínica”

T.M. MsC Juan Luis Castillo N.Citometría de Flujo

Hospital del Trabajador Concepción,Facultad de Medicina

Universidad de Concepción

Lunes 24 de Abril de 2006

www.oncoinmun.co.cl