/NOMBRE :

TELEFONO PARTICULAR:

MATRICULA:

CLAVE:

/CARRERA :

TRIMESTRE:

LUGAR DE ACTIVIDADES:

FEICHA DE I N I C I O :

FECHA DE TERMINACION:

NOMBRE DEL TUTOR:

TITULO:

LAURA FEIJOO SABORIT,

5 5 4 - 2 7 - 6 9

8 3 2 3 7 7 0 9

BIOLOGIA

8 - 9 - 1 ( C r g d i t o s C o n c l u i d o s )

L a b o r a t o r i o de G e n é t i c a E v o l u t i v a . UAM - I z t a p a l a p a

1 D i c i e m b r e 1 9 8 7

1 5 A b r i l 1 9 8 9

B i o l . A l m a G , A r e l l a n o M. P r o f , A s i s t e n t e " B " , M . T . D e p t o . C ienc ias d e l a S a l u d

A e t e r m i n a c i ó n d e l a d u r a - . . . c i ó n d e l c i c l o c e l u l a r e n

c é l u l a s d e c e b o l l a , A l l i u m . c e p a , - L. It

\

LAURA FEIJOO ~ A B O R I T

BIOL. ALMA G . ARELLANO MENESES

c, B

M é x i c o , D . F . 1 7 a b r i l 1989

M. EN C . BEATRIZ SILVA TORRES

D.C.B. S. P R E S E N T E

.. . S e s . r e t a z U h i c a

P o r m e d i o d e l a p r e s e n t e me p e r m i t o i n f o r m a r

a V d . q u e he. c o n c l u i d o m i S e r v i c i o S o c i a l , p o r l o q u e p r e -

s e n t o u n i n f o r m e s o b r e e l p r o y e c t o t i t u l a d o " D e t e r m i n a c i ó n

d e l a d u r a c i ó n d e l c i c i o c e l u l a r e n c é l u l a s d e c e b o l l a ,

A l l i u m c e p a , L.", q u e se r e a l i z ó e n e l L a b o r a t o r i o d e Ge-

n é t i c a E v o l u t i v a d e l a UAM I z t a p a l a p a .

M i a s e s o r a e n . d i c - h o p r o y e c t o f u e l a B i o l ,

A l m a G. A r e l l a n o M e n e s e s , P r o f . A s i s t e n t e "B", M e d i o

T i e m p o , d e l D e p t o . d e C i e n c i a s - d e l a S a l u d . '

A g r a d e c i e n d o d e a n t e m a n o l a a t e n c i ó n q u e

s e s i r v a p r e s t a r a l a p r e s e n t e , q u e d o d e Ud.

A t e n t a m e n t e

L a u r a F e i j ó o S a b o r i t Mat. : 8 3 2 3 7 7 0 9 Carrera : B i o l o g í a

Méxic0,D.F. 1 7 abril 1 9 8 9

M. EN C. BEATRIZ SILVA TORRES Secretaria Académica D.C. B. s. P R E S E N T E

Por este conducto me permito informarle que el proyecto de mi Servicio Social, titulado "Determinación de la duración del ciclo celular en células de cebolla, Allkum cepa, L.", se realizó en un tiempo mayor que el previsto de- bido a circunstancias fuera de mi control. La fecha de ini- cio fue el 1 de Diciembre de 1 9 8 7 , siendo la fecha prevista de terminación el 2 de Junio de 1 9 8 8 . Sin embargo, hubo una huelga y se remodeló el Laboratorio de Genética Evolutiva de esta Unidad, en el que se realizó el mencionado proyecbo. Por lo tanto, la fecha de terminación fue el 1 5 4e abril de 1989 .

b

. -

Agradeciendo de antemano la atención que se sirva prestar a la presente, quedo de Ud.

Atentamente

Laura Peijóo Saborit Mat.: 8 3 2 3 7 7 0 9 Carrera: Biología

. - "

INT-CION

- - -" _- *"""

La divisifin celular 5e considera -sensu strictom* como el

proceso mediante el cual una celula da lugar a otras dos. Este

proceso incluye tanto la divisibn nuclear (mitosis o

cariocinesis) como la d i v i s i h citoplasmatica. tcitocinesisl.

'Sensu lato', la divisibn celular se identifica con el proceso

completo de proliferacibn celular, incluyendo el crecimiento

durante la interfase y la divisibn en si. tGim&nez-Martin,ef al,

1977) . Para que una celula pueda dividirse, debe haber cumplido una

serie de requerimientos previos, los que estan asociados con la

duplicacibn exacta de la informacibn geneticia de la celula, asi

como una duplicacibn menos precisa de sus otros componentes.

(Gim&nez-M.,& aL,1977). Estos requerimientos premitbticos, junto

con la mitosis en si, conforman un proceso peri6dico que esta .

constituido por cuatru fases principales, denominadas de acuerdo

con una convencibn sugerida en 1953 por Howard y Pelc, de la

siguiente manera: e1 lapso entre el termino de la mitosis y el

comienzo de la replica del acid0 desoxirribonucleico (ADN) es la

fase G l i el periodo de replica del ADN se denomina periodo S; el

lapso que separa el fin de la rPplica del ADN del inicio de la

mitosis es la fase 62; y el tiempo dedicado a la dritosis es la

fase M. Se denomina entonces =inter+asem a 10 5 periodos Gl, S y

62 en conjunto, es decir, al periodo del ciclo en que no hay

mitosis. tAvers,1983).

1

2 Estas cuatro fases constituyen la porcibn nuclear del ciclo

celular. En la mayor parte de los sistemas eucaribticos existe

una divisibn concomitante de la celula, mediante la cual los

nuevos n&cleO5 son incluidos en sus propios limites celulares;

separados. Esta divisibn comienza normalmente durante la etapa de

telofase de la mitosis. Aunque no es una parte iptegral de la

mitosis misma, la citocinesis normalmente esta sincronizada con

los eventos mitbticos. (Gimenez-M.,Ek al,l977).

- .. - - - - - I_ . .

Se ha observado que los nkleos normalmente no entran a la

mitosis a menos que haya habido previamente replicacibn del ADN

cromosbmico, lo que ocurre durante el periodo S de la interfase.

La replicacibn del ADN produce el material genetic0 nuevo para la

siguiente qeneracih 'celular. La mitosis es el mecanismo para

distribuir este material a las cPlulas hijas.

Durante la mitosis se observan cuatro fases,

apreciarse distintivamente en observacibn directa al .-

de luz.

El primer signo evidente de mitosis que seirala el

que pueden

microscopio

comienzo de I

la profase es la condensacibn de los cromosomas (Foto 1) . A

medida que transcurre esta etapa los cromo~omas se hacen mas

cortos y gruesos; hacia el term'ino de la profase 105 cromosomas

contraidos se dirigen al plano ecuatorial del huso, dando

entonces lugar a la metafase (Foto 2) En esta etapa cada

cromosoma es una estructura replicada constituida por dos

cromhtidas cuyos centrtbmeros miran hacia polos opuestos de la

celula. La metafase es seguida por la anafase (Foto 3lS que

comienza cuando las cromatidas de cada cromosoma se separan. Las - .

, ..

cromatidas hermanas se mueven hacia polos opuestos de la celula,

3

Ya W e SUS centremeros se encontraban alineados de esta manera

durante la metafase. Cuando las cromatidas se separan, cada una

de ellas se transforma en un cromosoma integro e independiente.

Una vez que los cromosomas han llegado a sus respectivos polos

comienza la telofase (Foto 4 ) . Durante esta etapa .Cirial, los

cromosomas condensados comienzan a descondensarse y a adquirir

gradualmente la apariencia que. tenian durante la .-interfase. En

esta etapa ocurre la reorganizacibn nuclear, que incluye la

organizacibn de nuevos nucleolos y envoltura nuclear. (Avers,

1983).

" - " "i__ - . ""

..

Los inhibidores de los procesos que ocurren en la cClula

mientras transcurre el ciclo celular han permitido comprender

algunos de los rnecanismcrs de control que operan durante la

mitosis (especialmente en la profase), y el estado de

reorganizacibn nucleolar durante la telofase.

La aplicacibn de inhibidores en la solucibn de problemas

biolbgicos ha conducido a descubrimientos definitivos en cuanto a

la estructura y funcibn de los organismos vivos. El estado vivo

se caracteriza por una serie de reacciones enzimaticas que

ocurren a nivel celular, algunas simultaneamente y otras en

secuencia. Los inhibidores son muy &tiles cuando estas reacciones

resultan diflciles de separar unas de otras. Asl,. los inhibidores

especlficos de un proceso dado, especialmente aquellos cuyos

mecanismos de accibn a nivel molecular son conocidos, son muy

valiosos para establecer el papel que juega cualquier proceso en

particular en la fisiologla celular. ..

-.

"

4

El descubrimiento de que las bases xanticas (corno la cafeina,

por ejemplo) ejercen un efecto inhibitorio sobre la citocinesis,

ha permitido inducir la fornacilrrn de cPlulas binucleadas (Foto 5)

y polinucleadas en meristemos de raiz a voluntad. Este tipo de

c&lulas ofrece grandes posibilidades para el estudip de aquellos

mecanismos que gobiernan la regulacih genetica en cPlulas

."" . .

eucaribticas. En la5 plantas, el U50 de celulas polinucleadaa

parece ser una herramienta adecuada para la comprensibn de

mecanismos de proliferacibn, especialmente aquellos involucrados

en interacciones nacleo-n&cleo y n&cleo-citoplasma.

Bajo condiciones estables, la poblaci&n meristematica de una

ralz esta distribulda uniformemente a lo largo del ciclo celular.

La cafeina inhibe la citocinesis bloqueando 1a.fornacibn de la

pared celular en aquellas calulas espontaneamente sincrbnicas que

se encuentran en la telofase durante el tratamiento, por lo qua

se puede producir de esta manera una poblacibn de cPlulas

binucleadas. Esta constituye entonces una subpobracibn marcada y

puede distinguirse facilmente del resto de las cClulaa

meristematicas usando criterios morfolbgicos. Esta poblacibn

sincrbnica, por tanto, ha sido obtenida por sincronla

seleccionada y no inducida, y muestra un ciclo similar al de las

cClulas mononucleadas.

Para inducir la forrnaciBn de cClulas polinucleadas, la

poblacibn binucleada puede 5er tratada con cafeina una vez mas

durante su siguiente telofase (bi-telofase). Este segundo

tratamiento da lugar a celulas con un complemento cromosbmico 8n

que puede distribuirse en 2, 3 b 4- nbcleos dependiendo del nbmero . -

de fusiones nucleares. Ademas las celulas bi y polinucleadas

i

5

sirven como base para estudiar e1 desarrollo asincrbnico que

ocurre al inicio de la mitosis en diferentes nkleos presentes en

el mismo citoplasma de cglulas animales. En chlulas de cebolla se " - " - ".""

observ& que los n&cleos rodeados por un citoplasma mayor entran a

prof ase antes.

En cuanto a la divisihn celular de estas celulas bi y

polinucleadas, hay evidencia de la iniciacihn sincrhica de la

replicacih del ADN en los diferentes n&cleos que comparten el

mismo citoplasma, lo que apoya la hipbtesis de que existe un

factor citoplasmatico que controla el paso de G1 a S.'

Ya iniciada la replicacibn del ADN, 5e ha observado asinrronia

en la tasa de replicacibn del mismo en dos nacleos compartiendo

el mismo citoplasma en rPlulas binucleadas .de cebolla. Se

detectaron tambien diferencias en la tasa de replicacihn del ADN

durante el periodo S, con una disminucihn de la tasa

aproximadamente a la mitad del periodo.

En varias especies vegetales se ha observado un patrhn

especlfico para la replicacibn del ADN en cromosomas individuales

y en diferentes segmentos tromosbmicos, lo que indica, que el

tiempo ocupado por el periodo S no es otra cosa que la suma del

tiempo de replicacih de la5 diferentes porciones del genoma.

Evidencias experimentales muestran que la terminacibn del periodo

S en los diferentes n&cleos de una celula polinucleada no es

necesariamente un evento sincrbnico, y que los n&cleos no

interacttian de forma aparente entre ellos. (Girenez-tl.,eL a l r

1977) .

-

6

I Existen factores internos que modifican el tiempo necesario I

1

1 ! par a que se satisfagan los diferentes requerimientos

prenitbticos. Por ejemplo, 5e ha reportado una mutacibn que

elimina el requerimiento de replicacibn cromosbmica para que se

presente la mitosis. Esto confirma que la duplicacibn del genoma

y la mitosis pueden ser eventos independientes. Se ha mostrado

tambiPn que cuanto mayor sea el contenido de ADN, mayor sera la

duracian del ciclo celular. Estudios sobre el tiempo de interfase

en cPlulas polinucleadas confirman que el ciclo es mas largo

cuando la ploidia o el ndmero de ndcleos en la cPlula aumentan.

Ademas, el grado en el qua el ciclo mit&tico se alarga al

aumentar el contenido de ADN e5 menor en cPlulas poliploides que

.. - " - - __ "~ ",

.

. . en diploides..

Hay tambiPn

requerimientos

frecuentemente

pueden crecer

factores externos que modifican el tiempo para lor

premitaticos. Las ce!tulas vegetales se -ven

influenciadas por la temperatura, a pesar de que

a cualquier temperatura desde O hasta 3 5 O C. La i

progresien del ciclo completo es dependiente de este factor, lo

cual es de esperarse, ya que este tipo de .c&lulas - .. pueden

considerarse como 'poiquilotermas'. (L&per-Saer,& aL,1966).

I ! !

El estudio de la mitosis en celulas polinucleadas muestra que

al comienzo de la misma todas las profases son asincrbnicas,

mientras que la frecuencia de asincronla' disminuye

progresivamente en el tiempo. A partir de la retafase, todos IDS

nrlcleos son invariablemente sincrbnicos,

Se observa tambih un aumento en-el tiempo de sincronizacibn

al aumentar el ndmero de ndcleos por celula, lo que puede deberse

7

a que los nacleos =lentosm produzcan un inhibidor que evite que

los 'rapidos' entren en metafase. En .una calula nononucleada, la

importancia biolbgica de este mecanismo puede 5er que explica el

hecho de que todos los cromosomas terminen la profase

simultheamente, a pesar de que la duplicacibn firevia haya sido

asincrbnica, e incluso si se presenta una condensacibn

asincrbnica de cromo soma^ durante la profass.

- " I_ " ~

Durante una telofase normal, la reconstruccibn nuclear se

lleva a cabo gracias a un proceso que puede considerarse el

.reversoD de la profase. Se pueden observar dos eventos

morfolbgicos principales:

1 ) Fornacibn de membrana nuclear.

2) Descondensacibn cromosbmica.

Se piensa que son la base estructural para recomenzar los

patrones de transcripcih y replicacibn del ciclo, ya que en

Pstos se basa el que la celula recien formada entre de lleno en

la condicibn de interfase activa.

La descondensacit3n cromos&mica que ocurre durante la telofase

es el punto de partida para la iniciacibn de nueva actividad en

la nueva celula. En general, se piensa que la transcripcih de

genes no es compatible con la condensacih cromoshmica, aunque el

tPrmino del ciclo de descondensacibn cromosbmica no es en si

mismo el estlmulo inicial de la transcripcibn.

En una forma similar a la interfase, el tiempo mitbtico esta

claramente influenciado por factores externos e internos.

Estudios sobre la relacih entre la duracibn del ciclo y el I

contenido de.ADN sugiere que existe una correlacibn linear entre

8

ellos, siendo modificadas proporcionalmente todas las fases

Todo proceso biolbgico presenta una velocidad maxima de

desarrollo, asi como una 'temperatura bptina, , sobre la cual y

debajo de la cual el proceso es mas lento. El ciclo de divisien

celular es lauy complejo, conformado por toda una serie de

reacciones diferentes, y cada una de estas fases tiene su propia

temperatura eptima. (Lbpez-SAez,ek &,1966). El tiempo en que se

lleva a cabo el ciclo celular aumenta al disminuir la

temperatura, pero la duracibn relativa de las fases se mantiene a '

todas la5 temperaturas. (Gim&nez-tl.,rrf. &,19775 Lbpez-S&ez,rrf. al, 1966). Otro factor del que depende la duracibn del ciclo es la

tensi-bn de oxlgeno, aumentando la tasa del ciclo celular al r

aumentar la concentracibn de oxageno burbujeante hasta un 20%. .

Varios autores (Brown,l95l; Evans y Savage,l959; Van't Hoff y

Sparrow,l963; y Van't Hoff y Ying,lP64) Ran mostrado por

<'

diferentes nrPtodos que en vegetales la velocidad del ciclo de

divisian celular aumenta con ia temperatura hasta alcanzar su

maxim0 a los 25'C o 3OOC. Por otro lado, 5e ha demostrado tarnbien -. .-

la influencia de una temperatura especi+ica en ciertas etapas del

proceso, la cual modifica su velocidad relativa dentro de todo el

ciclo. (L&pez-SAez,rrf. al,1966). Evans y Savage (1959) mostraron

en el caso de Yicia que la metafase es la etapa de la

mitosis mas sensible a los cambios de temperatura- Sin embargo,

Lepez-Saez al mostraron en 1966 que los indices de fases

permanecen constantes a todas las.temperaturas, por lo que los

resultados obtenidos por Evans y Savage pueden deberse al mPtodo

. .

9

que utilizaron para determinar la frecuencia de fases, ya que la

modificacihn relativa de la metafase que ellos encontraron es muy

pequeña, y probablemente se deba a factores aleatorios. --. .. - “ _ _ ~ _L ””

Los diferentes metodos utilizados para medir la d9racih del

ciclo celular en cblulas meristematicas involucran trabajo I

experimental largo y laborioso que hace- dificil repetir el i

proceso cada vez para diferentes condiciones, por ejemplo,

diferentes temperaturas. Por tanto, es recomendable elegir una

fraccihn del ciclo de facil estudio pero que a la vez arroje 4

resultados que no varien considerablemente de un experimento a

otro en condiciones similares. Este es el caso de la B-interfase.

La B-interfase es el periodo que abarca desde la hora O (fin

dol tratamiento con cafejna) hasta ia aparicibn de las primeras

cPlulas binucleadas en biprafase (Foto 61. Su duracibn se calcula

tornando muestras de las raices cada hora y uniendo con una linea

recta las dos primeras lecturas positivas, de forma que corte el

eje de las abscisas. Este punto marca e1 periodo tebrico en que

todas las cblulas binucleadas estaban en interfase. El periodo

representa de hecho la interfase de aquellas cPlulas binucleadar -.

que recorrieron el ciclo mas rapidamente, y es una fraccibn mas

largo que la mitad del ciclo celular completo. Si su duracihn

relativa, como una parte proporcional del ciclo completo, es

constante a diferentes temperaturas, se tendrt un rnPtodo simple y

rapid0 para calcular la duracibn del ciclo bajo condiciones

dadas.

La duracien de la B-interfase est-& fuertemente influenciada

por las diferentes temperaturas de crecimiento. Dentro del amplio

10

rango de temperatura entre 0"C y 40°C, la temperatura bptima ! I

no muestran crecimiento significativo, aunque a ninguna de las

dos temperaturas es fatal el tratamiento.

La proliferacibn de celulas a las que da lugar el crecimiento

de las raices se lleva a cabo sin ningan cambio en el ndmero de

celulas neristematicas, que permanece practicamente constante por

varios dias despuk de la gerninaci6nl Mas adelante, cuando el

experimento se alarga de 4 a 6 dias a 25OC, el nbmero comienza a

decrecer poco a poco. Bajo estas condiciones, el niimero de

cPlulas meristematicas no aumenta .logarltmicamente como resultado

del ciclo de divisibri celular; ya que aunque' el nihuero de

celulas, maternaticamente hablando, sl aumenta a este ritmo, en

cada . ciclo de divisibn celular que da lugar .a' dos celulas hijas,

5blO una de ellas permanece como celula meristemktica, mientras

que la otra sufre diferenciacibn. Por lo tanto, el Indico

mitbtico parcial, definido 'como el porcentaje de cielulas

meristematicas en divisibn en un momento dado, e5 directamente

proporcional a la duracihn de la mitosis en relaci&n a la del

ciclo. Asi, el indice se mantiene constante para cada una de las

temperaturas a las que 5e realice el experimento. Lo mismo sucede

con los indices de fases, tomados como el porcentaje de C&lUlaS

en proceso de divisibn que se encuentran en las diferentes fases

de la mitosis. Como el indice mit&tico, el indice de fases

permanece constante a las diferentes temperaturas estudiadas.

1

-,

!

11

Se puede decir que el lndice sitbtico parcial expresa la

duracibn relativa de la mitosis en el ciclo. Por lo tanto, esa

duracih 5e puede expresar como un porcentaje, sin importar la. -:"

temperatura, siendo la intcrrfase el porcentaje restante para

completar el l O O X , es decir, el ciclo completo. Lo mismo se puede

aplicar para el indice de cada una de las fases, pudiendo

calcularse de esta manera la duracien de todo el ciclo, asi cono

la de cada fase. tL&pez-Saez,et u, 1966) . Existen otras tOcnicas para determinar la duracibn del ciclo.

Una de ellas es la cuantificacih del fujo celular, ya que Pste y

la duracibn del ciclo son inversamente proporcionales. (De la

Torre,l971). Sin embargo, este metodo involucra el conocimiento

de¡ porcentaje de cPlulas que pasa a traves de .cualquier fase del t

ciclo en un tiempo determinado, lo que implica el uso de tknicas

de autorradioqraf la, que son muy caras y complicadas.

Otro de estos metodos es el propuesto por Pincu ek al (1986) , que, trabajb con linfocitos humanos, pero puede ser efectivo

tambien en el caso de celulas vegetales. Esta tPcnica se basa en

la utilizacien de altas concentraciones de brornodeoxiuridina

(BrdU) seguida por la tecnica de tinciBn propuesta por Perry y

-,

. ,

Uolff (19741, que tiRe diferencialmente 10s ndcleos de las

celulas que se encuentran en diferentes estados de.proliferaci&n-

De esta forma es posible determinar las frecuencias relativas de

las celulas en mitosis. Como es evidente, este metodo involucra

trabajo laborioso, asi como la utilizacihn de sustancias caras y

de manejo delicado. "

12

Asi, el matodo de marcado con cafeina presenta muchas

ventajas, ya que es relativamente rapid0 y simple, proporciona u n ' .

alto grado de reproducibilidad, no es C O ~ ~ O I O y no involucra la .. .. - " ~ ".

utilizacian de sustancias para marcado radiactivo.

13

FOTOORAFIAS

.-

FOTO l. PROFASE

0

FOTO 2. METAFASE

14

. .

FOTO 3. A W A S E

FOTO 4. TELOFASE

15

FOTO J. CELULA BINUCLEADA

FOTO 6. CELULA EN BIRPOFASE

16

OBJETIVOS

- " - . _" . . . ."

Con base en los antecedentes e informaa'ih sobre el ciclo

celular, particularmente la mitosis en celulas vegetales, se

plantea el siguiente m -:

- Determinar la duracih del ciclo celular, y de cada una de

5us fases, en c+lulas neristematicas'de raiz de Eetbolla,

-, L., bajo las condiciones de trabajo en el Laboratorio de

Genatica Evolutiva de la UAM-Irtapalapa.

. . Para lograr el cumplimiento efectivo dei objetivo anterior, se

plantean los siguientes aid i v p q -ref:

1 ) Determinar la duraci&n de la B-interfase, segh la tecnica 7

propuesta P por Lbpez-Saez (19661, utilizando una temperatura de

crecimiento de 25OC. "

'e' ,

2) Determinar los indices mitbtiios y de fase &.meristemos de

cebo1 la (tratados con caf eina) . 3) Determinar la duracibn. relativa de cada fase (interfase y

mitosis), por medio de los lndices de fases.

4) Determinar la duracih absoluta de cada fase con base en la

duracih de la B-interfase y en las duraciones relativas de la5

fases. ' .

5 ) Determinar la duracihn total del ciclo a 25*CC$.:

MATERIAL Y METODO

17

"_.___

Se pusieron a germinar -¡¡ bulbos de c e ~ l ~ ~ c o m d n Allfun -, en dos lotes, y se controlaron los parhetros para su

crecimeinto. La temperatura 5e mantuvo a 25OC. Para esto, se

colocaron los bulbos del primer lote (cebollas NO. 1 1 , 12, 13,

14, 15 y 161, dentro de una estufa de germinacien, y esta a SU

vez dentro de un cuarto fr¶o. Esto se hizo con la finalidad de

que la temperatura del laboratorio, generalmente mayor de 2 5 O C,

no afectara la temperatura de crecirniento.de los bulbos. En el

caso del segundo lote (cebol.las No. 17, 18, 19, 24 y 211, no fue

necesario utilizar el cuarto fria, ya que la temperatura se

mantuvo constante dentro de la estufa' a 25% por haberse tratado

estos bulbos en invierno y ser la tewperatura dei laboratorio

menor de 25%. Las cebollas se compraron siempre en el mismo

?

puesto del mercado de Iztapalapa, esperando que de esta manera no

variaran significativamente sus condiciones de cultivo y

crecimiento antes del experimento. Se comenzb a numerar las

2' ;

cebollas =,partir del No. ' 11 y no del No. 1 debid0.a que ya se

habia iniciado este estudio, y se considera adecuado continuar la

rturneracibn ya existente.

La tensibn de oxigeno se mantuvo con un burbujeo constante

de aire de aproximadamente una burbuja por segundo. Ademas, 5e

cambib diariamente el agua de I 0 5 recipientes eh que germinaban

los bulbos. La germinacibn durb 5 dias en el caso del primer lote

y 3 dlas en el caso del segundo. Transcurrido este tiempo, las

raices ya tenlan un tamaño adecuado para su tratamiento (entre 15

y 20 mm. .de longitud).

- .

18

Las raices fueron entonces tratadas con cafeina al 0.1%

durante una hora, reincubandose despu&s en a w i e n t e con

aire burbujeante. Finalizado el tratamiento con cafeina se

tomaron muestras de las raices a intervalos de una hora; desde la

- ” I_ ”, ”

hora 7 hasta la hora 10 en el caso del primer lote, y desde la

hora 8 hasta la hora 10 en el caso del segundo, ya que los

resultados obtenidos con el primer lote, asi comd‘los arrojados

por la primera etapa del estudio (cebollas 1 a 101, mostraron que

en la hora 7 no habia todavia ninguna clSlula que se presentara en

biprofase. Se tomb como hora 0 el fin del tratamiento con la

cafeina. Se obtuvieron entre 3 y 5 raices por bulbo cada hora,

fijandolas en una solucibn de acido aceticrr’y- etanol absoluto

1:3. (Segdn Lbpez-SAez,& &,1966).

Se’ procedib entonces a elaborar preparaciones.de las raices

por el rnPtodo convencional de aplastado con orceina

acetoclorhidrica. Este rnetodo consiste en colocar las raices en

un vidrio de reloj, cubrihdolas con orceina acetoclorhidrica. Se

calientan despues sobre el mechero de alcohol, agitando levemente

el vidrio de reloj hasta observar vapor evitando la ebullician, y

dejando enfriar. Este procedimiento se repite tres veces, dejando

enfriar bien despuds del dltirno calentamiento. Enseguida se hacen

cortes de aproximadamente 1 mm. de largo de los meristemos de las

ralces, colocando el tejido sobre un portaobjetos limpio (una

raiz por cada portaobjetos), y cubriCndolo can una o dos gotas de .

orceina. DespuQs se coloca el . - cubreobjetos, realizando el I I

aplastado inicial con la punta de un lBpiz en movimientos

espirales de izquierda a derecha, y dejando girar libremente el

I

19

cubreobjetos sobre e1 tejido. El aplastado final se realiza con 1

I

el pulgar, ejerciendo presibn vertical de arriba .a. abajo. De esta

forma se'hicieron preparaciones de tres raices por bulbo por hora

i ~- . i - " __ ", - - 1

I Í

en el caso del primer lote, y de una r a i z por bulbo por hora en !

el caso del segundo. Las repeticiones en el primer caso se i

hicieron con el fin de afinar la tecnica, asi como obtener una !

mayor practica en la diferenciacibn morfolbgica de las diversas

fases de la mitosis. Asmimismo, los conteos se hicieron en ciego,

es decir, sin saber de antemano a que hora correspondia cada

preparacibn, de forma que los resultados obtenidos fueran

I

I

I

i ?

I

totalmente confiables y no se vieran influenciados por un

conocimiento previo de los valores esperados. i

. . j Una vez tratadas todas las raíces corno se indica arriba, se 4

procedi& a revisar las preparaciones en el microscapio de .luz, I registrando el nbmero de c&lulas que se encontraban en cada fase

del ciclo celular, asi como el de celulas binucleadas y en

biprofase. (Gim&ne~-Martin,l984).

*-

.

20

RESULTADOS

La Tabla I muestra los indices mitbticos parciales y los 1

Estos indices indican el porcentaje de celulas en.el meristemo que

se encontraban en cada una de las fases de la mitosis (o

simplemente en mitosis, en el caso del indice mit&tico parcial)

en el momento de la *f i.jaci&n de las ralces para la elaboracibn de

las subsecuentes preparaciones en las que 5ie llevb a cabo el

conteo celular. Estos indices fueron obtenidos. segbn lars

indices de fases obtenidos para cada uno de los bulbos estudiados. : !I

i/

:I

siguientes fbrmulas:

' No. de celulas en mitosis Indice mitCltico = x '100

Total de celulas .

. .

No. de celulas en cada fase

Total de celulas en mitosis Indice de fases = x 100

No. de celulas binucleadas

Total de cClulas Indice binucleadas = x 100

No. de celulas eib biprofase

Total de celulas binucleadas Indice biprofasico = x 100

I

21

Las figuras I, 2 y 3 muestran los indices de fases por cebolla

esta linea hasta cortar el eje del abscisas, se obtiene un punto

que indica la duracien en horas de la B-interfase, Este calculo l

.~ se realiz& de forma gr8fica y utilizando las fhrmulas

correspondientes de la Geometria Analitica para hacer la

extrapolacibn y obtener asi resultados mas precisos. Los

resultados obtenidos se encuentran concentrados en la Tabla If.

Con el promedio de estos valores, 5e obtuvo un valor de 7.82

horas para la duracihn de la B-interfase (es decir, el periodo en

que todas las c+lulas binucleadas se encontraban en . . interfase).

La Tabla I1 muestra tambi.&n los valores promedio para el indice

mitbtico parcial y las indices de fases por cebolla, los que se

obtuvieron promediando los valores obtenidos para cada cebolla

cada hora. Estos valores promedio .,se encuentran tambien

ilustrados en la figura 7, y representan la parte proporcional

de la mitosis ocupada por cada una de las fases. En la .Figura 8

se ilustran los valores promedio para el lndice mitbtico, que

representan la parte proporcional del ciclo celular completo

ocupada por la mitosis.

El promedio global de los indices mitbticos representa la

parte proporcional del ciclo ocupada por la mitosis, es decir, el

19.19% del tiempo de duracibn total del ciclo celular. Por 10

tanto, las 7.82 horas que dura la interfase representan el

-.

22

porcentaje restante para completar el loo%, .es decir, el 84.81%

del ciclo completo, y el valor en horas representa el tiempo de .

duracibn del ciclo celular ocupado por Ea interfase. Asi,

" .. - " " ".

utilizando una simple regla de tres, se obtiene un valor de 1.4

horas para la duracibn de la mitosis. De la misma manera se

obtuvieron los valores en horas para la duracibn de cada fase de

la mitosis, tomando en este caso el valor. de 1.4 horas como el

100%, (es decir, la mitosis completa), y los promedios de los

lndices- de fases como l.as duraciones proporcionales de cada una

de ellas dentro de la mitosis. La Tabla I11 muestra la desviacian

estandar de la duracibn de la B-interfase (en horas), para la

que se obtuvo un valor de 0.15, es decir, la duracibn de la B-

interfase es de 7.82k0.15 horae. En la Tabla I V se'observan las

desviaciones estandar de los promedios de los indices mitbticos

(por cebolla), las que se encuentran representadas graf icamente

en la figura 9.

Los valores promedio totales de los indices de fases y el del

indice mitbtico se encuentran concentrados en la Tabla V , donde

tambiPn se incluye el valor promedio 'de'la duracidn en horas de

la B-interfase, considerando su desviacibn estandar. Finalmente,

las valores en horas para la duracibn de cada fase de la mitosis,

a53 como de la interfase y de la mitosis completa, se muestran en

la Tabla.VI. En esta se incluye tambiPn el valor en horas del

ciclo celular completo, considerando la desviacien estandar

calculada para la interfase. Estos valores se ilustran en las

figuras 10, 11 y 12. En la figura 12 se muestran los valores

proporcionales de la interfase y de la5 fases de la mitosis "" -

referidos al ciclo celular completo.

23

Tabla I. INDICE IIITOTICO PARCIAL E INDICE DE FASES (POR CEBOLLA/HORA)

Hora 8

Cebolla

11 12 13 15 17 18 19 20 21

Cebolla #

11 12 13 15 17 18 19 20 21

Cebolla #

11 12 13 15 17 18 19 20 21

I m i t

13.03 17.79 14.77 31 . 69 14.11 3.92

17.50 17.86 18.77

I rnit

10.61 14.21 19.22 16.67 14.71 8,47 9.15

17.70 14.39

I m i t

15.42 22.65 21.18 36-70 8.53

16.84 8.21 9.43

16.76

I prof

95.11 37.03 35.55 28-78 45.58 41.37 47.90 49.93 49 . 3s

X- prof

50.61 46.25 42.76 50.34 63.15 73.10 50.39 52 . 99 60.86

I prof

42.73 39.75 42.71 42.79 50.51 41 . 55 67.04 48.10 41.53

I meta I anaf

14.41 16.49 12.08 8.08

17.87 12.64 16.04 14.49 15.16

9.76 5.38 8.33 3.88 7-42 4-89 9.30 7.68 7. 11

Hora 9

I meta I anaf

11.60 10.78 17.94 f2.M 11.96 9.69

10.62 13.69 13.04

8.02 7.86 8.82 5.01 3.34 1.37 4.33 7.18 4.74

Hora 10

I meta I ana+

19.61 15.47 11.45 16.95 10.58 16.26 11.93 13.70 18.00

10.6% 8.66 5.69 7.55 5-11 9.52 2.84 6.70 8.00

I te lo

20.69 41 . 07 44.02 16.70 29.11 64.36 26.74 27.88 28.36

I telo

29 . 7s 40 . 95 30 ...46 32. S6 21 . 53 15.86 34.64 27-12 21 . 34

I te lo

24 . 78 36.10 40.13 32.68 33.78 32.65 18.18 31 . 40 32.45

I binuc

3.33 4.5s 5.43 3.44 1.21 4.23 5.65 3.36 3.55

I binuc

3.27

.. .. 6.09 5.18 3.94 3.09 4.79 3.48 4.32

. 4.96-

I binuc

2.96 7.39 6.22 9.77 4.54 6.35 6.53 4.81 9.67

I bipro

19-09 14.47 3.39 1.44 1.52 1.05 5.75

2.26 1.97

I bipro

10.40 16.75 1-7.13 16.00 19.64 18.86 17.29 16.89 22.36

I bipro

24 I34 21 . 47 26.30 25.22 30.12 29.96 30.71 29.71 26.75

F

24

Cebolla #

Indice mitótico Indice profiisico Indice metafbsico Indice anafásico Indice telofásico

B-inter+ase (Hrs. 1

Cebolla #I

Indice mitótico Indice profásico Indice metafásico Indice anaf ásic0 Indice telofásico

B- i nterf ase (Hrs. 1

c 11

13.02 49.48 15.20 9.48

26.70

10. 19

C 19

11.62 55.11 12.86 5.49

26 52

7.50

c 12

18.21 41.01 14.24 7.30

39 . 37

1.65

c 20 14.99 50.00 13.96 7.18

28 . 82

7.86

TABLA 111. DESVIACION ESTANDAR DE LA (Por Cebol la1

Cebol la 13 Cebol la 1S Cebol la 17 Cebol la 18 Cebol la 19 Cebol la 20 Cebol la 21

Val or pormed i o

C 13 C 15

18.39 21 . 68 40.34 40.63 13.82 12.36 7-61 5.48

38.20 27.31

7.75 7.90

c 21

16.64 50 . 58 15.40 6.61

27.38 -

7.88 . . _ .

C 17

12.45 53.08 13.47 5.29

28.14

7.91

. .

DURACION DE LA B-INTERFASE

Duración en boras

7.75 7.90 .

7.91 7.94 7.50 7.86 7.88

-,

7.82

C 18

9.74 52-00 12.85 5.92

37.62

7.94

c

Y '

Desviación estandar ( S ) O. 15

"" -

25 I

I f i

TABLA iif;--%ESW€t%3~ ESTANDAR DE LOS PRO!IEDIOS.Dg LOS INDICES MITOTICOS (Por Cebol la)

Cebolla 11 Cebol la 12 Cebol la 13 Cebol la 15 Cebolla 17 Cebol la 18 Cebol la 19 Cebol la 20 Cebol la 2 1

Indice mitótico Desviación estandar promedio

13.02 18.21 18-39 21.68 12.45 9.74

11.62 14.99 16.64

TABLA V. VALORES PROMEDIO TOTALES

Indice mitotic0 Indice profasico Indice metafasico Indice anafasico Indice telofasico

2-40 4.23 3.28 7.08 1-41 6.55 5.11 4.82 2.19

.

INTERFASE PROFASE METAFASE ANAFASE

7.82 2 0.15, 0. 67 0.19 0.09

B-inter+ase tHr5.1 7.82 3 0.15;

TELOFASE 0. 43

MITOSIS COMPLETA 1-40

CICLO CELULAR COMPLETO 9.22 2 0.15

. . . . .

. .

26

l

T 1

8

8

I I .

x

, . 4 . / /

f

L

j_- -t"+

e .

FIG. 2

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

-.

27

0.89330 1 i

28

. '. )-"" t"" A

- , c-

lf 12 13 14 15 16 I? 18 19 20 21 ).la. da Cebolla

!

" -

.. 7 3

29

30

FIG. 5

i 1

I> I

,

31 i I I I ! : I

i

I

f I+

t : I < i..

. .

32

t

53i- *

I

I i

1 I 1

26 t t

i 8 t

. . . . . . .

!

€ €

. , .

. .

. .. ".

I i

7

.- I

I

1 I i

FIG. 7

34

:I; "

35

FIG. 10

INTERFASE

MITOSIS

36 ,:

TELOFASE

. . .

:1 'AFASE

ANAFASE

...

37 i/

. . ..

FIG. 12

INTERFASE

!

5% PROFASE

:f.@ METAFASE 8 ANAFASE

""

38

DISCUSION ""

Se esperaria que la represcntaci& grafica de 10s indices de

fases por cebolla y por hora (figuras 1, 2 y 3 ) fueran lineas

rectas paralelas al eje de las abscisar;, es decir, que todas las

cebollas presentaran indices iguales al encontrarse en igualdad

de condiciones. Sin embargo, pequeñas variaciones son de

esperarse entre una cebolla y otra, como siempre que se trabaja

'con organismos vivos. Como se observa en las figuras, la fase con t I

un 3ndice mayor +ue en todas los casos la profase, seguida de la

telofase, luego la metafase, y por dltimo la anafase. Se observa i

i tambiPn que la profase y la telofase presentan .variaciones

mayores, entre una y atra cebolla, que la metafase y la anafase.

La au~&ekia de' datos 'para las cdollas 14 y 16 se.;debe a que ,las . ..

* . ' rajces 'se perdieron accidentalmente.

En el caso de las cebollas 12, 13 y 18, .en la hora 8 , .en las

que los Indices telofasicos son mayores que los profksicos, puede

pensarse en un error de apreciacih al hacer el contea, aunque es

posible que' en estos casos realmente hubierada' telofases que

profases en la poblacih mononucleada total. A pesar de esto, se-

observa que en los promedios de los indices de fases por cebolla

(figura 71, las proporciones esperadas se mantienen, siendo los

Indices prof&sico5 s'iempre mayores que los telofasicos.

LOS indices bipro+&sicos presentan valores muy semejantes en

todas las cebollas, a axcepcian de los bulbos 11 y 12. En estos

dos casos, la gran diferencia entre los valores obtenidas y los

esperados se debe a un grave error de apreciacibn de las

I " . " .... ._ .. "_ " . -. ..~ ~.. " " . " .~ ". -

1

!

i

39

7.50 y las 8.00 horas. La desviacihn estandar encontrada de 0.15, -. .. :-cis decir '. 9 minutos, es realmente, pequeza s'i se considera el ., 1

tamaño de la muestra, ya que este tipo de estudios generalmente

se hace con tres bulbos (Lbpez-SAez,& aL,1966), y en este caso

se utilizaron 11, de 105 cuales 7 (cebollas 13, 15, 17, 18, 19,

20 y 21) arrojaron resultados muy parecidos a los esperados. La ?

I

muestra can la que se trabajtr representa por lo tanto un total

aproximado de 160,000 elulas. ,Considerando qua todo5 10s

calculos utilizados se hicieron con base en el ndmero de calulas

de cada preparacih, se puede considerar que las diferencias

encontr.adas entre los valores. son debidas al azar.

c

-.

. . . .

, El promedio de los lndices mitbticos por cebolla (figuras 8 y

9) muestra algunas varíaciones aparentemente significativas entre

uno y otro bulbo. Sin embargo, como se observa en la figura 9 ,

las desviaciones estandar para cada valor de la grafica (que a su

vez corresponde al promedio de los indices mitbticos de cada

hora) 5e traslapan, por lo que se puede concluir que las

diferencias son debidas al azar (Tabla I V ) , En esta figura se

utilizb una escala mayor en e1 eje de las ordenadas que en la

40 I

I I

+igura 8, para poder apreciar m i i s claramente los valores de las

desviaciones estandar. " ~ ?_.-

El promedio total de los indices mitbticos, de 15.19Xs es un

valor bastante cercano al reportado en la literatura, de 1 3 s

iL&pet-S&ez,& aL,19661. De la misma forma, los promedios totales

?Ga? 105 indices de fases son tambiPn normales segbn las reportados .

, El valor de la duraci&n. total del ciclos de 9.22kO.lJ horass

dif iere sigqif icativamente del reportado. por L&paz-Saez

(19661, de 13.5 horas, aunque el valor de la duracibn del periodo

mitbtico, . ,de 1.4 horass no difiere tanto d,el reportado por el

.-ni.smo -autor, de 1.75 haras. Por lo tantos . la diferencia r

I

-&gni$icatiua se: huentra en la duracih de la B-interfase, 'de

' . . 7."82,C0.1S horas en e,l . c a s o de este estudio, y 9.78)10.1 horas an

- . el caso del estudio rea.ii.r;ado par el .autor antes mencianado. Esta

a diferencia puedo deberse a que la variedad de las cebollas

utilizadas fuera 'distinta -.a pesar de tratarCe-.:*de .'la misma . .

especie, Allium -, L. Las condiciones ambientales generales

(altitud, latitud, humedad, etc.) pudieron tambiBn variar, a

pesar de que la temperatura se mantuvo constante en ambos

estudios, *e

L o s ' resultados obtenidos en el presente estudio son muy

similares a los que se reportaron en la primera fase del mismo

(cebollas 1 a 101, por lo que puede pensarse que las condiciones

se han mantenido estables, y que los resultados obtenidos hasta -- "

ahora son conf iablee.

41

La importancia del proceso nitthtico deriva del hecho de que de

61 depende el crecimiento y desarrollo de los organismos:

mientras que se lleve a cabo normalmente, el crecimiento y

desarrallo seran normales. Por tanto, debe 5er posible encontrar

claves sobre problemas de desarrollo y crecimiento a partir del

patrbn del ciclo mitbtico.

. - .. - - "

ASS, es importante establecer el patran del c i c l o mitetico

para cada especie de importancia econdmica. En 'este caso, el

. ciclo de.. . &l&hm cepa puede ser un htil punto .inicial que sirva

para hacer comparaciones o como alguna forma de control. En el

hombre puede incluso 5er &til el establecinieñto de patrones

mitbticos para los tejidos de los varios tirganos susceptibles de

,crecimiento canceroso o de alguna forma anormal, con. 1a.esperanza

de encontrar en el proceso alguna clave para su cura y control.

! sParece ser entonces *-e el estudio del ciclo; .celular de los

Y

C .

. 7rrrgan.Emncas presenta un futuro inpartanbe, 4

Por otra parte, el conocimiento de la duraci&n de las

diferentes fases que componen el ciclo celular puede qer de gran

Utilidad en estudios sobre la accidn de diferentes agentes

mutaghicos, que posiblemente afecten a la celula de manera

distinta dependiendo de la fase del ciclo en la que acttien.

.~

. * 4. * .

. .

. .

.

CONCLUSIONES

ciclo celular en cPlulas de meristeono de cebolla com?ln, Allium

-, L-# bajo las condiciones de trabajo en el Laboratorio de

GenCt.ica Evolutiva de la UAM Izapalapa.

De la misma manera, ~.~.obtuvo. un valor de 7.8220.15 horas para

1 . a duracim de la B-interfa-4 0467 .:haras para la profase; 0.19

horas para la metafase;. 0.09 horas para la anafasei y 0.43 horae

para la.te€ofase. La mitosis completa dura 1.4 horas, -,es decir,

ialrededor del 15% del tiempo total de duracih del ciclo celular.

2. El uso de la B-interfase es &til para establecer un metodo

rapid0 y confiable par.+ calcular la duracibn del ciclo ce.luIar en i . e .

I

l

una pohlacian l~?l_ulas meristembticas que se encuentren en un

estado de equilibrio dinbnica. . % I'

3. El conocimiento de 3a duracidn del ciclo celular y de cada .. I una de su5 fases en pob.lacianes de celulas meristematicas

.en, equilibrio din&mico-,: - ..permite elegir adecuadhente las %. condi.ci.an*s para cu,alquie,r experimento en particular-. '

. .. " . ". "-

43

i i

RESUtlEN

- - " " "- Se utiliza el marcado cpn cafeina para producir una poblacidn

de cClulas binucleadas altamente.sincronizadas en meristemos de

raiz de cebolla coman, -, y se realizaron preparaciones

utilizando el mbtodo convencional de tincibn con orceina

i

1 I

i acetoclorhldrica. De esta forma, fue posible hacer conteos al I

mkroscopio de:. Quz del ntlmere- de c&l,ulas que se encontraban en

cada fase. del .cicPa,- cefulsr,'-..tmto anmo como binucleadas,

calculando asl la duracien de 'la B-inter#ase, que es el periodo

[

i !

que abarca desde la hora O (fin del tratamiento con cafeina)

hasta la aparicibn de las primeras celulas binucleadas en . i

biprofase. La durac9-h d'e las fases mit&ticas se calculb a partir j

de sus frecuencias -:relativas en la poblacibn aeristematica.

I !

I

:I ? I

.. ).

1 .. 1 : ' ? . S - e ~ observb que el. c.iclo '&.lul?r completo en ALLUm tiene

una :. durtac.tbn de 9.22ifI.iS horas, ocupando la mi*tosis alrededor

. . del 15% 'da este tiempo, 'es. dec.ir, :1.4 horas. Lar 'fases mitbticas

muestran . siempre un patr&n .en a.1 que la profase es la fase que

ocupa un *apso mayor, ' seguida por la telofase, luego. la 'metafase,

y finalmente la anafase.

c

1 . . .

.

Se sugiere la utilizacibn de los valores obtenidos para el

estudio del efecto de agentes mutagPnicos en las diferentes fases

de la mito~is, as1 como estudios posteriores del ciclo nitbtico,

en la cebolla y otras especies de importancia comercial, ya que

estos pueden servir como base para comprender mejor los procesos

de crecimiento anormal en ibrganos de otros organismos. -

LITERAlURA CITADA

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