CULTIVO IN VITRO DE MICROSPORAS DE Passiflora …

CULTIVO IN VITRO DE MICROSPORAS DE Passiflora mollissima (H.B.K.) Bailey

Presentado por:

Mónica Andrea Mc Michen Cuéllar

Dirigido por:

Carmen Cecilia Espíndola

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Octubre de 2000

Resumen

En este trabajo se evaluaron distintos factores para estandarizar la metodología de

cultivo in vitro de microsporas de Passiflora mollissima (H.B.K.) Bailey, especie de

importancia económica a nivel nacional e internacional, comprobándose la

capacidad embriogénica de las microsporas al realizar un pretratamiento en frío

sobre los botones florales por 5 días a 3ºC, cultivándolas en medio Murashige &

Skoog (MS) semisólido, gelificado con agar 3 %, con la adición de sacarosa 6%,

ácido naftanelacético (ANA) 2.69 µM y 2- furfurilaminopurina (Kin) 4.65 µM.

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1. Introducción

El fitomejoramiento genético vegetal se basa en la diversidad genética que busca la

obtención de variedades ó híbridos con características determinadas que se

adapten a las necesidades del agricultor y consumidor, a través de métodos

onvencionales de selección e hibridación. Actualmente, la técnica de cultivo in vitro

se utiliza como herramienta para la obtención de plantas haploides en corto tiempo.

Las plantas haploides expresan todas las características genéticas, fenotípicamente,

por que contienen un solo juego de cromosomas; facilitando de esta manera, la

identificación y selección de caracteres, al eliminarse los efectos dominancia sobre

los alelos recesivos (CHAVEZ, 1993).

La obtención de plantas haploides en condiciones in vitro, se puede lograr al inducir

un desarrollo morfogenético por organogénesis ó embriogénesis, a partir del cultivo

de óvulos, anteras, microsporas aisladas y protoplastos de polen. Dentro de éstas

técnicas, el cultivo de microsporas presenta varias ventajas frente al cultivo de

anteras porque no intervienen factores inhibidores por parte de la pared de la

antera para el desarrollo androgenético de las mismas; además, se cuenta con

varios miles de células en una sola antera en comparación con el número reducido

de óvulos y no se requiere de la remoción de la pared celular por procesos

enzimáticos como en el caso del cultivo in vitro de protoplastos de polen (RASHID,

1988; SUNDERLAND & DUNWELL, 1991). Además, se puede tener un control

visual directo de los procesos morfológicos que intervienen en el desarrollo de las

microsporas.

La inducción de plantas haploides a partir del cultivo in vitro de microsporas no es

tarea sencilla, porque el destino natural de estas células, es el de fecundarse con

otro gameto para formar un cigoto, el cual dará orígen a una nueva planta (vía

gametofítica). Además, se requiere de la intervención e interacción de muchos

factores para crear las condiciones adecuadas e inducir un desarrollo

morfogenético sin la intervención de la fecundación (vía esporofítica).

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Algunos de los principales factores que pueden influir en el cultivo in vitro de

microsporas son; genotipo y condiciones fisiológicas de la planta donadora, estado

de desarrollo de la microspora, composición del medio, fuentes de carbono,

reguladores de crecimiento, pretratamiento en frío y consistencia del medio, entre

otros.

Este trabajo consistió en estandarizar la metodología para el cultivo in vitro de

microsporas de Passiflora mollissima (H.B.K.) Bailey, evaluando los factores de

pretratamiento en frío sobre los botones florales, fuentes de carbono, reguladores de

crecimiento y consistencia del medio, para inducir la organogénesis ó

embriogénesis, en donde, se logró inducir, la formación de embriones globulares,

con un porcentaje de 0.003%. Estos se desarrollaron al realizar un pretratamiento

en frío sobre los botones florales por 5 días a 3°C, en medio Murashige & Skoog

(MS) semisólido, gelificado con agar 3%, con la adición de sacarosa 6%, ácido

naftanelacético (ANA) 2.69 µM y 6 - furfurilaminopurina (Kin) 4.65 µM. También se

logró obtener la formación de microcallos (0.002%) en este mismo medio, pero sin

reguladores de crecimiento. De esta manera se comprobó la capacidad

embriogénica de estas microsporas y el potencial morfogenético, el cual depende de

las condiciones del medio.

Los resultados obtenidos abren camino para en un futuro lograr la obtención de

plantas haploides e introducirlas en programas de mejoramiento en cultivos de

Passiflora mollissima (H.B.K.) Bailey, la cual es una especie de importancia nacional

e internacional.

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2. Revisión de literatura

2.1. Generalidades de Passiflora mollissima (H.B.K.) Bailey.

El nombre de Passiflora es una contracción de dos palabras latinas: Passionis flores

que significa flor de la pasión, llamada así por la semejanza que encontraron los

españoles, entre algunos órganos de la planta y varios instrumentos utilizados en la

pasión y crucificación de Jesucristo (ESCOBAR, 1988).

Passiflora mollissima (H.B.K.) Bailey, conocida vulgarmente, en Colombia como

curuba de castilla, es una angiosperma dicotiledónea perteneciente al orden,

Violales; familia, Passifloraceae; género, Passiflora; subgénero Tacsonia y sección,

Bracteograma (CRONQUIST, 1981).

P. mollissima, es una planta trepadora enredadera robusta con hipanto largo y

cilíndrico; hojas trilobuladas, agúdas en el ápice y acorazonadas en la base;

brácteas ovobadas u oblongas unidas formando un tubo sobre el hipanto; flores

péndulas; sépalos ovobados a oblongos; pétalos subiguales a los sépalos del

mismo color; corona en una serie dentada a tuberculada, blanca a morada; frutos

oblongos u obovoides con pericarpio coriáceo ó blando, amarillo al madurar;

semillas ovobadas con arilo anaranjado, suculento y comestible (ESCOBAR, 1988).

Se ubica geográficamente en los Andes desde Venezuela hasta Bolivia en climas

fríos (10 - 15 °C) entre 2.600 a 3.360 m.s.n.m. (ESCOBAR,1988). En Colombia, la

población de curuba se encuentra localizada sobre las montañas cundiboyacenses

con el 82% y el 18% restante está repartido entre los departamentos de Nariño,

Valle, los Santanderes, Tolima, Risaralda, Caldas, Cauca, Huila y Antioquia

(ACEVEDO,1993).

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La obtención de plantas se realiza a partir de semillas ó acodos y se siembran,

generalmente, 400 plantas por hectárea. Cada planta produce entre 80-100 frutos al

año con un rendimiento de 5 toneladas por hectárea, apróximadamente

(ACEVEDO,1993).

La planta de curuba por ser una planta trepadora requiere de un sistema de soporte

ó espaldera. Se requiere de la renovación de las zonas productivas a través de

podas orientadas de acuerdo con el crecimiento de la planta (SALAZAR, 1988). El

período no productivo comprende, apróximadamente, dos años (SCHROENIGER,

1986).

P. mollissima, se desarrolla en suelos de composición franco - arenosa a franco-

arcillosa con un buen contenido de materia orgánica (10%), buen drenaje interno y

pH de 5.5 a 6.5. La precipitación promedio anual es de 800 mm, apróximadamente

y se desarrolla mejor en zonas de alta luminosidad. El viento ayuda a la polinización,

pero debido al sistema de soporte utilizado se pueden presentar volcamientos en las

líneas de cultivo (SALAZAR, 1988).

El manejo agronómico para el mantenimiento del cultivo en buenas condiciones

depende de una adecuada programación contemplando: selección de la zona

ecológica más apta, en base a los requerimientos de la misma; estado de frutos y

plantas, a partir de las cuales se hacen los semilleros; densidades de siembra;

fertilización y preparación del suelo; actividades de mantenimiento (deshierbe,

podas, etc.); incineración de material infectado en el campo y sistemas de control

fitosanitario, ya que el cultivo es atacado por plagas y enfermedades

(ACEVEDO,1993).

Algunas de las plagas de mayor incidencia en el cutivo de curuba son Acrocerpos

sp. (minador de la hoja y fruto) y Trigona sp. (ACEVEDO,1993) y una de las

enfermedades conocida como Antracnosis causada por el hongo Colletotrichum sp.,

es la principal causante de la mayor pérdida de frutos (SALAZAR,1988).

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También, se pueden encontrar virus asociados a la curuba como el virus del

mosaico del taxo (PTYM) (I.C.A., 1987). Todos estos problemas fitosanitarios

pueden llegar a disminuir la producción comercial hasta en un 60%.

P. mollissima, posee propiedades alimenticias; es ingerida cruda ó utilizada para

hacer jugos, sorbetes, mermeladas, gelatinas, helados y postres. También posee

propiedades medicinales, utilizadas contra la tos, abscesos, tumores, fiebre tifoidea

(BERNAL & CORREA, 1995), insomnio, depresiones y angustias (HOYOS, 1989).

En países desarrollados se utiliza la planta y sus flores para la decoración debido a

su morfología exótica (ZULUAGA,1996). También ha sido utilizada en hibridaciones

artificiales como pariente femenino con P. mixta y P. cumbalensis obteniendo frutos

de mayor tamaño, en períodos de 4-6 años (SCHROENIGER, 1986).

La curuba, a nivel nacional está ubicada entre los primeros 15 productos frutales de

importancia económica y es un producto potencial para la exportación. En el año

1998 la producción fué de 29.752 ton y en 1999 fué de 27.586 ton, por consiguiente,

se presentó una disminución en la producción comercial debido, talvez, en su

mayoría, a problemas fitosanitarios (O.I.E.,1999).

Debido a la disminución en la producción de P. mollissima, ocasionada por

problemas fitosanitarios, se requiere del desarrollo de tecnologías alternas a los

métodos convencionales para el mejoramiento de las especies, con el ánimo de

obtener variedades con características deseadas, en corto tiempo. Una de las

técnicas que se puede aplicar en programas de mejoramiento es la producción de

plantas haploides a partir del cultivo in vitro de microsporas de P. mollissima.

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2.2. Plantas haploides

Las plantas haploides son aquellas que poseen la mitad del número de cromosomas

de la planta original. Se obtienen en condiciones in vivo, por ejemplo, por

partenogénesis (desarrollo del embrión a partir de un huevo no fertilizado) (RASHID,

1988), ó in vitro a través del cultivo de anteras, megasporas, microsporas aisladas y

protoplastos de polen. Al duplicar el número cromosómico de las plantas haploides

se obtienen plantas dihaploides fértiles homocigotas. Estas plantas pueden ser

utilizadas en programas de mejoramiento como progenitor, porque expresan todos

los caracteres fenotípicamente, facilitando de esta manera la identificación y

selección de caracteres determinados (CHAVEZ, 1993).

P. mollissima es una planta diploide (2n=18) y alógama (COPPENS et al., 1997), es

decir, que poseen dos juegos cromosómicos y se reproduce por polinización

cruzada, en donde, los gametos de diferentes plantas se unen para formar el cigoto.

Debido a la forma de reproducción, hay un constante intercambio genético en cada

generación, aumentando la variabilidad genética con un alto grado de

heterocigosis. En consecuencia, la proporción de homocigosis en relación con la

población total es demasiado baja, siendo de esta forma difícil la obtención de un

individuo homocigoto por métodos convencionales (hibridaciones), en donde se

requiere trabajar con altas poblaciones y varias generaciones (CHAVEZ, 1993).

Es por esto que, dentro de las técnicas de obtención in vitro de haploides, el cultivo

de microsporas es importante, ya que en solo una generación se puede conseguir la

homocigocidad buscada. Además, el cultivo in vitro de microsporas aisladas

presenta varias ventajas frente al cultivo de anteras, por ejemplo, no intervienen

factores inhibidores de la pared de la antera, se cuenta con varios miles de células

haploides en una sola antera (SUNDERLAND & DUNWELL, 1991) y no se requiere

de procesos enzimáticos para degradar la pared del polen, como ocurre en el

trabajo con protoplastos de polen (RASHID, 1988).

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2.3. Ontogenia del polen y desarrollo embriogénico.

El polen se desarrolla a través de complejos procesos, que comienzan con la

formación de las células madres de la microspora en el tejido esporogéneo de la

antera (Fig. 1A). Cada célula madre por meiosis forma una tétrada de células

haploides. Recubiertas por una pared de calosa (Fig. 1B). Esta pared de calosa es

desintegrada por la enzima calasa al teminar la meiosis, liberándolas al lóculo de la

antera como células uninucleadas individuales (Fig.1C) (MORDHORST et al., 1997).

Figura 1. Desarrollo de las microsporas de P. mollissima (H.B.K.) Bailey. A.. Célula madre (250X). B. Tétrada (250X). C. Microspora uninucleada (250X).

Estas células uninucleadas están envueltas por una pared externa de esporolenina,

la exina y una interna de pectocelulosa, llamada intina. La vacuola se desarrolla

empujando al núcleo hacia el poro germinativo. Luego, este núcleo migra en sentido

contrario al del poro germinativo, en donde se replica DNA y se sintetiza RNA y

proteínas, aumentando su tamaño, aún más. En este momento se produce la

primera división mitótica, obteniendo dos núcleos, uno de mayor tamaño, llamado

vegetativo y uno de menor tamaño, el generativo. El núcleo vegetativo migra hacia

el poro germinativo formándose la célula vegetativa y el núcleo generativo es

separado del vegetativo por una pared arqueada junto con una porción de

citoplasma ligado a la intina. Al despegarse de la intina se forma la célula

generativa. La segunda mitosis se produce en la célula generativa, a partir de la cual

se producen dos células espermáticas que intervienen en la germinación del polen

y que ocurre en el estigma para la posterior fecundación y formación del cigoto. La

célula vegetativa puede intervenir en la germinación ó desintegrarse

(SUNDERLAND & DUNWELL, 1991). 9

En condiciones naturales este cigoto se divide, transversalmente, de forma simétrica

ó asimétrica, dependiendo de la especie, originando dos células. Una que dará

orígen a la región apical y otra a la región basal. La región apical tras dos

divisiones longitudinales y una transversal, forma un proembrión de ocho células,

que dará orígen al meristemo apical y una región inferior que dará orígen a los

cotiledones y parte de la radícula. La región basal dará orígen al suspensor. Luego

se forma el protodermo por divisiones periclinales, que dará orígen a la epidermis

del embrión. En este momento se puede hablar de un embrión globular, el cual

modifica su patrón radial por uno de simetría bilateral, en donde se diferencian los

cotiledones, hipocótilos y radícula, estado del embrión, conocido como

acorazonado. Este embrión se elonga y expande formando el embrión en estado de

torpedo (MORDHORST et al., 1997). Este embrión se desarrolla formando una

planta completa. A esta ruta de desarrollo en donde interviene la fecundación de los

gametos, se le conoce como vía gametofítica.

En condiciones in vitro, el desarrollo de las microsporas puede presentar diferentes

patrones morfogenéticos. Vía organogénesis directa, en donde se forma un tallo o

raíz a partir de un órgano ó parte de una planta y organogénesis indirecta, en

donde se forma un tallo o raíz a partir la diferenciación de un callo (masa celular

indiferenciada), al cultivar un órgano, tejido u otra parte de la planta. Otra forma de

desarrollo es a través de la embriogénesis directa, en donde se forman embriones a

partir del tejido ó alguna parte de la planta cultivada y embriogénesis indirecta, en

donde se forman embriones, a partir de la diferenciación de un callo (ROCA &

MROGINSKY, 1991). Dentro de estos procesos morfogenéticos, la embriogénesis

directa es la más indicada para la obtención de plantas haploides porque se evitan

posibles mutaciones, producidas durante la formación de una callo en las vías

indirectas.

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El desarrollo de los embriones somáticos en condiciones in vitro se diferencia de los

embriones cigóticos en las primeras etapas de división hasta la formación del

embrión globular. Algunas de las diferencias encontradas son: el patrón de las

divisiones iniciales y definición de la polaridad en la microspora (MORDHORST et

al., 1997).

Los patrones de división pueden ocurrir simétricamente ó asimétricamente, al azar,

por divisiones repetidas del núcleo vegetativo ó generativo y divisiones a partir de la

fusión del núcleo vegetativo y generativo (REINERT & BAJAJ, 1977), hasta formar

el embrión globular con divisiones periclinales (TELMER et al., 1995). A partir de

este momento, el embrión globular se desarrolla de forma similar al embrión cigótico

hasta formar una planta completa. Esta ruta de desarrollo embriogénico sin la

intervención de la fecundación se le conoce como la vía esporofítica (RASHID,

1988) y al formarse embriones ó plantas a partir del cultivo in vitro de microsporas

se le conoce como androgénesis (BAJAJ,1983).

Para lograr inducir un desarrollo morfogenético determinado a partir del cultivo in

vitro de microsporas aisladas, se deben tener en cuenta varios factores que

influyen determinantemente en este proceso. Algunos de estos factores son: el

genotipo y condiciones fisiológicas de la planta donadora, pretratamiento en frío

sobre los botones florales, estado de desarrollo del polen, composición del medio,

fuentes de carbono, reguladores de crecimiento y consistencia del medio (CHEN et

al., 1991).

2.4. Factores que influyen en el cultivo in vitro de microsporas.

2.4.1 Genotipo de la planta donadora

Dentro de los factores que influyen en el cultivo in vitro de microsporas, el genotipo

de la planta donadora es considerado uno de los más importantes, ya que especies

dentro de un mismo género y hasta cultivariedades presentan distintas respuestas

(DUNWELL, 1985).

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Por ejemplo, en el género de Nicotiana, la especie N. tabacum es más sensible a la

embriogénesis que N. sylvestris. También, se observa que la frecuencia de callos y

embriones, la capacidad de los callos para diferenciarse, la proporción de plantas

verdes y albinas y el número cromosómico dependen del genotipo de la planta

donadora (RASHID, 1988).

La razón de las diferentes respuestas no es clara, pero aparentemente la

androgénesis esta determinada por controles genéticos, responsables de estos

procesos (CHEN et al., 1991).

En cuanto a las condiciones de desarrollo de las plantas donadoras se ha citado que

aquellas plantas crecidas bajo condiciones controladas de luz, temperatura y

fotoperíodo, pueden facilitar la inducción de respuestas androgénicas en plantas no

sensibles ó aumentar la frecuencia de callos o embriones en plantas sensibles a la

androgénesis (RASHID, 1988). Por consiguiente, se debe tener en cuenta el

genotipo y condiciones fisiológicas de la planta donadora para realizar un

determinado trabajo.

2.4.2. Estado de desarrollo del polen

El estado de desarrollo del polen en el momento del cultivo, es un factor clave para

obtener una respuesta satisfactoria. La mayoría de las especies responden a la

androgénesis cuando se cultivan en los estados comprendidos entre uninucleado

temprano y antes de que ocurra la primera mitosis. Por ejemplo, el estado de

desarrollo adecuado en microsporas de Nicotiana tabacum es momentos antes de

la primera mitosis, mientras que en Brassica napus el estado de desarrollo

adecuado es el de microspora uninucleada temprana (DUNWELL, 1985).

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2.4.3. Pretratamiento en frío sobre los botones florales

El efecto del pretratamiento en frío sobre los botones florales fue citado, por primera

vez, por NITSCH & NOREEL en 1973, al cultivar anteras de Datura innoxia. A partir

de ese momento se ha corroborado que el pretratamiento en frío induce y aumenta

la respuesta androgénica en varias especies. Este pretratamiento consiste en

colocar los botones florales a bajas temperaturas entre 3 - 8 °C (POWELL, 1990)

por espacio de 3 - 4 días (SUNDERLAND & DUNWELL, 1991). La temperatura y

duración del pretratamiento en frío sobre los botones florales, varían entre especies

y cultivariedades, ya que la respuesta ante un determinado pretratamiento es

geneticodependiente (CHEN et al., 1991). Por ejemplo, el pretratamiento en frío más

apropiado para inducir la formación de callos en el cultivo de anteras de P. edulis es

a 8ºC por 5 días (MALAVER 2000) y en el cultivo de microsporas de Zea mays L. el

pretratamiento en frío más apropiado es a 7ºC por 12 días (GAILLARD, et al., 1991).

Por consiguiente, a cada especie se le debe determinar el pretratamiento en frío

más apropiado para inducir la androgénesis.

2.4.4. Requerimientos nutricionales

El medio de cultivo es importante, ya que es el que aporta los macronutrientes,

micronutriente, vitaminas y hierro, reemplazando las funciones del tejido nutritivo de

la antera para mantener el desarrollo de las microsporas. Un medio más

ampliamente utilizado es el propuesto por MURASHIGE & SKOOG (MS) en 1962.

2.4.4.1. Fuente de carbono

Al cultivar microsporas aisladas se necesita la adición de una fuente de carbono,

porque estas no están provistas de los tejidos somáticos de la antera, los cuales

aportan la fuente de carbono para su desarrollo, producidas por proceso de

fotosíntesis realizada en otras partes de la planta (CLEMENT et al., 1996). El efecto

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producido por determinada fuente de carbono y su concentración, está relacionada

con las diferentes especies, pues algunas reaccionan mejor en sacarosa que en

maltosa y viceversa (ORSHINSKI et al., 1990). También, se ha trabajado con otras

fuentes de carbono como glucosa, fructosa y celobiosa (MAHESHWARI et al.,

1980). Para cada especie se debe determinar la fuente de carbono y concentración

apropiada para inducir la androgénesis en interacción con otros factores.

A pesar de que NITSCH & NOREEL en 1973, indujeron androgénesis al cultivar

anteras de Datura innoxia en un medio simple con sacarosa 2%, la mayoría de

especies requieren de un medio complementado con reguladores de crecimiento

para inducir la androgénesis, por lo tanto se evaluaron diferentes concentraciones y

reguladores de crecimiento en este trabajo (SCHAEFFER, 1989)

2.4.4.2. Reguladores de crecimiento

La forma y función de los organismos depende en gran medida de una eficiente

comunicación entre células para la regulación, coordinación del metabolismo,

crecimiento y morfogénesis. Para la realización de estos procesos se requiere de la

intervención de hormonas, las cuales interaccionan con proteínas específicas

llamadas, receptores, para activar determinados procesos. Las principales

hormonas vegetales son las auxinas, las citocininas y las giberelinas, entre otras. En

la actualidad, las hormonas, se producen artificialmente, conocidas como

reguladores de crecimiento (SALISBURY & ROSS, 1994).

Las auxinas estimulan la elongación celular y la división celular, en presencia de una

citocinina. Otras de las funciones de las auxinas están relacionadas con el

fototropismo, gravitropismo, regulación de la dominancia apical, formación de raíces

laterales o adventicias, regulación del desarrollo de brotes, frutos e inducción de la

diferenciación vascular (TAIZ & ZEIGER, 1998), además en la activación de

enzimas para la deshidrogenación respiratoria en el ciclo de Krebs (ROCA &

MROGINSKI, 1991).

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Algunas de las auxinas son: 3- ácido indolacético (IAA) y α- ácido nafatanelacético

(ANA) (TAIZ & ZEIGER, 1998). Las citocininas inducen la división celular requerida

para el crecimiento, desarrollo y metabolismo en tejidos vegetales, promueven la

formación de brotes y raíces a partir de callos junto con una auxina, retardan la

senescencia de hojas, promueven la expansión de cotiledones, promueven la

dominancia apical e inactivan la dormancia de botones. Algunas de las citocininas

más importantes son la zeatina, ribósido de zeatina y kinetina (Kin) (TAIZ &

ZEIGER, 1998).

Tanto las auxinas como las citocininas en el cultivo in vitro de tejidos vegetales son

necesarias en los procesos de morfogénesis. Por lo general, al mantener una

relación alta de citocinina : auxina, se induce la formación de callos, los cuales se

pueden diferenciar en tallos, yemas y hojas. En cambio, una relación baja de

citocinina: auxina, favorece la formación de raíces (SALISBURY & ROSS, 1994).

Los reguladores de crecimiento y la concentración utilizada para la inducción de la

androgénesis, varía entre especies, por lo tanto la acción es geneticodependiente, al

igual que los demás factores anteriormente mencionados (CHEN et al, 1991).

En los procesos de embriogénesis, los reguladores de crecimiento, no solo inducen

la elongación y división celular, para su crecimiento, sino que también influyen en

los procesos de maduración de los embriones, es decir, en los procesos de

difererenciación, en estados posteriores.

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2.4.4.3. Consistencia del medio

Las características del medio son otro factor importante que influye en la

androgénesis, porque hace disponibles los nutrientes, reguladores de crecimiento y

fuentes de carbono incorporados. En medio líquido, la disponibilidad de los

nutrientes es eficiente y las sustancias tóxicas producidas son fácilmente difundidas,

en comparación con el medio de consistencia semisólida (MAHESHWARI et al.,

1980). En medio semisólido se obtienen buenos resultados, pero en ocasiones el

agente gelificante posee impurezas tóxicas que producen un crecimiento anormal de

los tejidos vegetales (BERUTO et al., 1999).

3. Algunos estudios realizados con P. mollissima

En la línea de cultivo de tejidos se han realizado investigaciones como:

multiplicación vegetativa de yemas axilares (MORAN, 1978), cultivo de meristemos

(FARFAN & HERNANDEZ, 1983), evaluación del requerimiento de cobalto en los

tejidos de curuba (BARTOLO & MACEY, 1989), micropropagación de curuba

(HODSON & CANCINO, 1992) y organogénesis de curuba (OVALLE, 1995).

En la línea de investigación: transformación genética y producción de plantas

haploides, de la Unidad de Biotecnología de la Pontificia Universidad Javeriana,

ESPINDOLA en 1995, cultivó protoplastos de polen de P. mollissima (H.B.K.) Bailey,

en donde identificó los diferentes estados de desarrollo de las microsporas,

determinando, que las brácteas de los botones florales de aproximadamente 17 a 22

mm de longitud contenían microsporas uninucleadas, lo cual sirvió como base para

la selección de los botones florales para el actual trabajo y aisló protoplastos de

polen por métodos enzimáticos obteniendo divisiones de 2, 3 y 4 unidades celulares

al cultivarlos.

En cuanto al cultivo in vitro de microsporas de P. mollissima, hasta el momento no

se encuentran informes en la literatura.

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4. Formulación del problema y justificación

El fitomejoramiento genético realizado por métodos convencionales por hibridación,

por ejemplo, requiere de varios años de investigación para conseguir el estado de

homocigosis deseado para poder implementarlo en programas de mejoramiento

genético, tiempo que puede ser reducido a través del cultivo in vitro de microsporas

a travéz de la obtención de plantas haploides ó dihaploides en tan solo una

generación. Es por esto que en esta investigación se evaluaron distintos factores

para estandarizar la metodología en el cultivo in vitro de microsporas de Passiflora

mollissima (H.B.K.) Bailey, especie de importancia económica a nivel nacional e

internacional, la cual presenta problemas fitosanitarios que disminuyen la

producción comercial hasta en un 60%.

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5. Objetivos

5.1 Objetivo general

Cultivar microsporas de Passiflora mollissima (H.B.K.) Bailey en condiciones in vitro,

evaluando algunos de los factores que podían influir en el desarrollo de las

microsporas.

5.2. Objetivos específicos

Evaluar la temperatura y duración de pretratamiento en frío sobre los botones

florales en el cultivo in vitro de microsporas de P. mollissima (H.B.K.) Bailey.

Evaluar las fuentes de carbono, reguladores de crecimiento y consistencia del medio

en el cultivo in vitro de microsporas de P. mollissima (H.B.K.) Bailey.

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6. Hipótesis

Los factores de pretratamiento en frío sobre los botones florales, fuentes de

carbono, reguladores de crecimiento y consistencia del medio infuyen en el cultivo

in vitro de microsporas de P. mollissima.

De acuerdo con los trabajos de CHEN, et al., 1991; XIE, et al., 1995 y FINNIE, et al.,

1989; en las especies, Oryza sativa y Hordeum vulgare, se encontró que al utilizar

sacarosa al 6%, se obtenía la formación de embriones y de acuerdo con los

trabajos de SCOTT, et al., 1994 y ORSHINSKY, et al., 1990; en la especie de

Tritichum aestivum, la maltosa es eficiente para inducir la embriogénesis. Por lo

tanto, en este trabajo se decidió evaluar estas dos fuentes de carbono, sacarosa al

6% y maltosa al 1.5%. El pretratamiento en f’río sobre los botones florales de

acuerdo con RASHID, 1988; SUNDERLAND & DUNWELL, 1991 y PENG, et al.,

1997; más eficiente en las diferentes especies varía entre los 3-8ºC por duración de

3-10 días. Por lo tanto, se evaluaron las temperaturas extremas, de acuerdo con

estos autores, de 3 y 8ºC, por duración de 3 y 5 días. En cuanto a los reguladores

de crecimiento, los autores, SUNDERLAND & DUNWELL, 1991; MAHESHWARI, et

al., 1980; RASHID, 1988 y CHU,1982; la auxina, ANA, en concentraciones bajas

entre 2.69 µM a 8.05 µM en combinación con la citocinina, Kin, en concentraciones

entre 4.65 µM a 9.29 µM, son las más eficientes en el desarrollo de microsporas.

Por lo tanto se evaluaron las concentraciones extremas citadas por estos autores, la

auxina a 2.69 y 8.05 µM con una citocinina a 4.65 y 9.29 µM. Por último, se

evaluaron consistencias de medio líquido, según LAURAIN, et al., 1997 en Ginkgo

biloba y en medio semisólido, gelificado con agar 3 %, según ESPINDOLA, 1995 en

el cultivo de protoplastos de polen de P. mollissima.

19

7. Materiales y métodos

7.1. Material vegetalSe utilizaron botones florales de P. mollissima de 17 - 22 mm de longitud, que

contenían microsporas en estado uninucleado (ESPINDOLA, 1995) de la finca

“Curubas de Subachoque”, localizada en el municipio de Subachoque a 2,690

m.s.n.m., con temperatura promedio de 8ºC, en la Vereda de Altania,

apróximadamente, a 60 km de Bogotá, (Fig. 2).

Figura 2. Cultivo de P. mollissima (H.B.K.) Bailey en la

finca "Curubas de Subachoque".

7.2. Recolección Los botones florales se recolectaron en bolsas plásticas herméticas y colocadas en

neveras para poder evaluar los distintos pretratamientos en frío sobre los botones

florales (Tabla 1), incluyendo el tratamiento control (*), en donde los botones florales

no se colocaron en neveras sino que fueron sembrados el mismo día de la

recolección.

Tabla 1. Temperatura y duración evaluada en el pretratamiento en frío sobre los botones florales.

20

Temperatura Duración

3°C 3 días3°C 5 días8°C 3 días8°C 5 días

------* O días *

7.3. DesinfecciónLa desinfección de los botones florales, despues de haberlos sometido a los

diferentes pretratamientos en frío, se realizó con hipoclorito de sodio al 2.5% y

Tween 20 al 0.1%, durante 15 minutos en agitación constante y se efectuaron tres

lavados con agua estéril bidestilada, dentro de la cámara de flujo (ESPINDOLA,

1995).

7.4. Análisis citológicoPara realizar el análisis citológico, se disectó una de las cinco anteras de cada botón

floral, presionando cada antera con unas pinzas sobre una lámina, para liberar las

microsporas y facilitar su tinción con una gota de acetocarmín (SUNDERLAND &

DUNWELL, 1991). Con la ayuda de un microscopio de luz se verificó el estado de

desarrollo de las microsporas en cada botón floral. Aquellos botones florales que

contenían microsporas en estado uninucleado fueron seleccionados.

7.5. Aislamiento y cultivo de microsporasSe disectaron las cuatro anteras restantes de cada botón floral, colocándolas en

medio líquido MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), cuya composición se muestra en

la Tabla 2. y cuyo pH se ajustó a 5.8. Las anteras fueron maceradas y se

realizaron enjuagues con el mismo medio para extraer la mayor cantidad de

microsporas posibles. La suspensión de microsporas se filtró en una malla de 50µm

y se centrifugó a 55 gravedades, durante cinco minutos, tres veces.

21

El precipitado se resuspendió en medio MS al cabo de cada centrifugación y con

una cámara de Neubauer se calculó y se ajustó la densidad de cultivo a 5 X 103

microsporas/ml como en el cultivo in vitro de protoplastos de polen de P. mollissima.

Tabla 2. Composición del medio Murashige & Skoog (1962).

Componentes mg/lMacronutrientesNH4 NO3 1650KNO3 1900KH2 PO4 170CaCl2 2H2O 440MgSO4 7H2O 370MicronutrientesH3BO3 6.2MnSO4 4H2O 22.3ZnSO4 4H2 O 8.6Na2MoO4 2H2O 0.25CuSO4 5H2O 0.025CoCl2 6 H2O 0.025Na2 EDTA 37.26VitaminasTiamina - HCl 0.1Piridoxina - HCl 0.5Acido nicotínico 0.5KI 0.83Glicina 2

La suspensión de microsporas se sembró en cajas de Petri, las cuales fueron

selladas con parafilm e incubadas a 28°C en oscuridad. Tras la combinación de

todos los factores se obtuvieron 100 tratamientos (Tabla 4).

Al cabo de una semana y periódicamente se añadieron algunas gotas de medio

fresco líquido a los tratamientos en consistencia semisólida y a aquellos

tratamientos en medio líquido, la suspensión de microsporas, se centrifugó a 28

gravedades, durante cinco minutos, retirando el sobrenadante para reemplazarlo

por medio fresco. El medio fresco utilizado para cada tratamiento conservaba la

misma composición inicial (HANSEN & SVINNSET, 1993).

22

Al cabo de cinco meses, los embriones globulares se subcultivaron en el mismo

medio MS semisólido con sacarosa 6%, pero sin reguladores de crecimiento para

inducir estados posteriores de la embriogénesis.

7.6. Recolección de la informaciónLa toma de datos se realizó cada 15 días, contabilizando, en los diferentes

tratamientos, la cantidad de divisiones primarias, microcolonias, embriones

globulares y microcallos formados. Para determinar el porcentaje de cada respuesta

en cada tratamiento se utilizó el total de divisiones primarias, por ejemplo, en un

solo tratamiento, sobre 5 X 103, todo multiplicado por 100.

7.7. Análisis estadísticoSe realizó un análisis de varianza multifactorial ANOVA y pruebas de rangos

múltiples con el programa Statgraphics versión 2.0 para las variables respuesta de

divisiones primarias y formación de microcolonias, solamente, porque los embriones

y microcallos se obtuvieron en un solo un tratamiento.

7.8. Microscopía electrónicaAunque, no fue uno de los objetivos de este trabajo se efectuó microscopía

electrónica a cuatro embriones globulares, obtenidos a partir del único tratamiento

en donde se logró inducir la formación de embriones (tratamiento No. 41). Para el

procesamiento de las muestras se siguió la metodología propuesta por ARROYO,

et al., 1995.

Se realizaron cortes semifinos, los cuales se tiñeron con azul de Toluina por tres

segundos y los cortes ultrafinos, se tiñeron con acetato de uranilo por cinco minutos,

seguido de citrato de plomo por cinco minutos.

23

7.9. Factores evaluados

Se evaluaron diferentes pretratamientos en frío sobre los botones florales (Tabla. 1);

una fuente de carbono, sacarosa 6% ó maltosa 1,5%; medio de consistencia líquida

ó semisólida, gelificada con agar 3% y diferentes combinaciones de reguladores de

crecimiento (Tabla 3) y los controles (*), los cuales consistieron en la no adición de

reguladores de crecimiento en el medio.

Tabla 3. Reguladores de crecimiento y tratamiento control evaluados.

Auxina (ANA) Citocinina (Kin)ANA 2.69 µM Kin 4.65 µMANA 8.05 µM Kin 4.65 µMANA 2.69 µM Kin 9.29 µMANA 8.05 µM Kin 9.29 µM

ANA 0 µM * Kin 0 µM *

24

Tabla 4. Tratamientos evaluados. Duración T° Fuente de C Consistencia ANA Kin Tratamiento No.

2.69 µM 4.65 µM 1 8.05 µM 4.65 µM 2

Semisólido 2.69 µM 9.29 µM 38.05 µM 9.29 µM 4

Sacarosa 6% 0 µM 0 µM 52.69 µM 4.65 µM 68.05 µM 4.65 µM 7

Líquido 2.69 µM 9.29 µM 88.05 µM 9.29 µM 9

3°C 0 µM 0 µM 102.69 µM 4.65 µM 118.05 µM 4.65 µM 12


Maltosa 1.5% 0 µM 0 µM 152.69 µM 4.65 µM 168.05 µM 4.65 µM 17


3 días 0 µM 0 µM 202.69 µM 4.65 µM 21

8.05 µM 4.65 µM 22Semisólido 2.69 µM 9.29 µM 23

8.05 µM 9.29 µM 24Sacarosa 6% 0 µM 0 µM 25

2.69 µM 4.65 µM 268.05 µM 4.65 µM 27


8 °C 0 µM 0 µM 302.69 µM 4.65 µM 31


8.05 µM 9.29 µM 34Maltosa 1.5% 0 µM 0 µM 35

2.69 µM 4.65 µM 368.05 µM 4.65 µM 37


0 µM 0 µM 40

25

Duración T° Fuente de C Consistencia ANA Kin Tratamiento No.2.69 µM 4.65 µM 41*



2.69 µM 4.65 µM 468.05 µM 4.65 µM 47


3°C 0 µM 0 µM 502.69 µM 4.65 µM 518.05 µM 4.65 µM 52


Maltosa 1.5% 0 µM 0 µM 552.69 µM 4.65 µM 568.05 µM 4.65 µM 57


5 días 0 µM 0 µM 602.69 µM 4.65 µM 61



2.69 µM 4.65 µM 668.05 µM 4.65 µM 67


8 °C 0 µM 0 µM 702.69 µM 4.65 µM 71



2.69 µM 4.65 µM 768.05 µM 4.65 µM 77


0 µM 0 µM 80

26

Fuente de C Consistencia ANA Kin Tratamiento No.2.69 µM 4.65 µM 81



2.69 µM 4.65 µM 868.05 µM 4.65 µM 87


Sin 0 µM 0 µM 90Pretratamiento 2.69 µM 4.65 µM 91

en frío 8.05 µM 4.65 µM 92Semisólido 2.69 µM 9.29 µM 93


2.69 µM 4.65 µM 968.05 µM 4.65 µM 97


0 µM 0 µM 100

27

8. Resultados

Se logró inducir la formación de embriones en estado globular en un 0.003%. Estos

se formaron en el tratamiento No. 41, cuyas características eran: pretratamiento en

frío sobre los botones florales por 5 días a 3°C en medio semisólido, gelificado con

agar 3%, sacarosa 6%, ANA 2.69 µM y Kin 4.65 µM. Algunas microsporas, en este

tratamiento, al cabo de 30 días de cultivo, presentaron un citoplasma muy

condensado y de mayor tamaño que en el momento del cultivo (Fig. 3A). Las

microsporas que presentaron esta morfología fueron las que continuaron su

desarrollo. A los 45 días se observaron microsporas con divisiones internas y de

gran tamaño (Fig. 3B). A los 92 días, se observaron proembriones con un

abultamiento (Fig. 3C). El porcentaje de formación de estos proembriones fué del

0.01%. Muchos proembriones se desintegraron dejando rastro de una pared

gruesa. Al cabo de 125 días, se observaron embriones globulares de morfología

redonda y superficie lisa de forma aislada (Fig 3D) ó en grupos (Fig. 3E).

Posteriormente, tras el subcultivo de los proembriones y embriones globulares en

medio sin reguladores de crecimiento, se comenzaron a formar microcallos

(0.002%), despues de los 186 días de cultivo (Fig 3F).

En los cortes semifinos realizados a algunos embriones globulares obtenidos del

tratamiento No. 41, se observó que los embriones eran semiredondos (Fig 4A).

También se observó que las células internas estaban menos conglomeradas que las

de la periferia (Fig. 4B). En los cortes ultrafinos se observaron células

morfológicamente distintas con una distribución irregular (Fig. 4C). En algunas se

observó posibles divisiones celulares (Fig 4D).

28

Figura 3. Desarrollo de embriones globulares, a partir del cultivo in vitro de microsporas de P. mollissima (H.B.K.) Bailey. A. Microsporas cultivadas por 30 días (100X- microscopio invertido). B. Microspora multinucleada de gran tamaño, a los 45 días de cultivo (50X- microscopio invertido). C. Proembrión, a los 92 días de cultivo (100X- microscopio invertido). D. Embriones globulares aislados, a los 125 días de cultivo (15X- estereoscopio). E. Embriones globulares formados en grupos, a los 125 días de cultivo(15X- estereoscopio). F. Microcallo formado al cabo de 186 días de cultivo (11.25X- estereoscopio).

29

Figura 4. Cortes semifinos y ultrafinos de embrión en estado globular. A. Embrión de estructura semiredonda (250X- microscopio de luz). B. Células de la periferia más conglomeradas que las del centro (1050X- microscopio de luz). C. Corte ultrafino con gran heterogeneidad celular (3000X- microscopio electrónico). D. Célula en posible división (8000X- microscopio electrónico).

Las divisiones primarias y formación de microcolonias presentes en los demás

tratamientos, se observaron entre los 15 y 30 días de cultivo, pero despues de

apróximadamente, 30 días de cultivo no continuaron su desarrollo. En el

tratamiento No. 28 con características de pretratamiento en frío por 3 días a 8°C, en

medio líquido con sacarosa 6%, ANA 2.69 µM y Kin 9.29 µM, se observó el mayor

porcentaje (1.75%) de divisiones primarias (Fig. 5); mientras que al realizar un

pretratamiento en frío por 3 días a 3°C en medio líquido con sacarosa 6%, ANA

2.69 µM y Kin 4.65 µM, composición que corresponde al tratamiento No. 6, se

obtuvo el mayor porcentaje (0.97%) en la formación de microcolonias (Fig. 6).

30

Tabla 5. Tratamientos que indujeron divisiones primarias.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8%

de

Divi

sion

es

1 2 6 8 9 12 16 17 18 23 24 26 28 29 31 32 33 37 38 39 41 43 48 49 51 53 56 57 58 61 63 67 68 69 71 73 74 76 78 79

Tratamientos

Tabla 6. Tratamientos que indujeron la formación de microcolonias.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1%

de

Mic

roco

loni

as

1 6 12 16 17 26 29 37 41 48 49 63 68 71 76

Tratamientos

2

En este tratamiento se observaron divisiones simétricas, a los 15 días de cultivo

(Fig. 7A). A los 25 días, se observó la formación de microcolonias con

aproximadamente 15 células, en ausencia de una exina (Fig 7B) y a los 30 días,

estas microcolonias se desintegraron.

Figura 7. Divisiones primarias y formación de microcolonias. A. División simétrica, a los 15 días de cultivo (100X). B. Microcolonia, a los 25 días de cultivo (50X).

De acuerdo con el análisis de varianza multifactorial ANOVA, los factores de

pretratamiento en frío, fuente de carbono y reguladores de crecimiento, resultaron

ser factores significativos, es decir que P> 0.05, para la indución de divisiones

primarias y microcolonias (ANEXO 1.) y las pruebas de rangos múltiples (ANEXO

2.), identificaron que el pretratamiento en frío por 3 días a 8ºC es el nivel que resultó

ser significativo, es decir, que el valor de P>0.05, para las divisiones primarias. En

cambio, por 3 días a 3ºC, resultó ser el nivel significativo para la formación de

microcolonias. La fuente de carbono sacarosa 6% resultó ser el nivel más eficiente

para inducir divisiones primarias, formación de microcolonias y embriones.

1

La combinación de reguladores de crecimiento ANA 2.69 µM con Kin 9.29 µM,

resultó ser más eficiente en la inducción de divisiones primarias, pero la

combinación de ANA 2.69 µM y Kin 4.65 µM, resultó ser más eficiente para la

formación de microcolonias y embriones.

Los tratamientos control evaluados sin reguladores de crecimiento y sin

pretratamiento en frío no indujeron ninguna respuesta, por lo tanto la interacción de

todos los factores evaluados resultó ser indispensable para la inducción de

divisiones primarias, formación de microcolonias, embriones y microcallos.

2

9. Discusión

La obtención de embriones globulares, tras el cultivo in vitro de microsporas de P.

mollissima, indica que la embriogénesis directa fué posible en determinadas

condiciones de cultivo y los efectos de los diferentes factores evaluados influyeron

no solo en la formación de embriones sino que, también, influyeron en la inducción

de divisiones primarias, formación de microcolonias y microcallos.

9.1. Efecto del pretratamiento en frío

Factores como el pretratamiento en frío sobre los botones florales pueden inducir ó

aumentar el desarrollo de las microsporas cultivadas in vitro para la formación de

plantas. De hecho el pretratamiento en frío es uno de los factores más eficientes.

Fue utilizado, por primera vez, en el cultivo de anteras de Datura innoxia por

NITSCH & NORREEL en 1973. Desde ese momento y hasta la actualidad se ha

comprobado el efecto inductor de la androgénesis en muchas especies (GAILLARD,

et al., 1991; MAHESHWARI, et al., 1980; KIVIHARJU & TAURIAINEN, 1999;

RASHID, 1988; SCHAEFFER, 1989). El efecto de las bajas temperaturas aplicadas

a los botones florales, permite modificar el desarrollo de las microsporas desde la

vía gametofítica a la esporofítica (CUSTERS, et al., 1994; RASHID, 1988), ya que

induce la disolución de micotúbulos y desorganización del huso acromático,

produciendo divisiones de forma simétrica en lugar de asimétrica (PENG, et al.,

1997; ZAKI & DICKINSON, 1991). Estas divisiones simétricas pueden seguir

dividiendose para formar callos ó embriones, como al cultivar microsporas de

Brassica napus, en donde se requiere de este patrón para que las microsporas se

desarrollen por la vía esporofítica. En otras especies, el patrón de división de forma

simétrica ó asimétrica, puede originar tanto callos como embriones dependiendo de

la especie (REINERT & BAJAJ, 1977; SCHAEFFER, 1989; SUNDERLAND &

DUNWELL, 1991). En el cultivo in vitro de microsporas de P. mollissima se

observaron divisiones de forma simétrica en tratamientos como en el No. 6. Estas

fueron las que formaron microcolonias.

3

Estas microcolonias se desintegraron al cabo de 30 días, apróximadamente. En el

tratamiento No 41, en donde se formaron embriones, no se observaron patrones de

división de forma simétrica, como en el tratamiento No. 6, posiblemente debido que

el patrón de división primaria en la formación de estos embriones se dió a nivel

nuclear, desconociendose su procedencia, es decir, no se sabe si las divisiones se

originaron a partir de una división simétrica del núcleo ó a partir de la célula

vegetativa, generativa ó de la fusión de estas dos células.

Se evidenció que el pretratamiento en frío sobre los botones florales para el cultivo

in vitro de microsporas de P. mollissima es necesario, ya que en los tratamientos,

en los cuales no se llevó a cabo pretratamiento en frío, no se presentó ninguna

respuesta.

El pretratamiento a 3°C por 5 días, correspondiente al tratamiento No. 41, resultó

ser el más eficiente. Allí se obtuvieron embriones y microcallos. En el cultivo in vitro

de protoplastos de polen de P. mollissima (ESPINDOLA, 1995) se logró inducir la

formación de divisiones primarias con este mismo régimen de temperatura y

duración. Sin embargo, en el cultivo in vitro de microsporas de P. mollissma, el

pretratamiento a 8ºC por 3 días (tratamiento No. 28) y a 3ºC por 3 días (tratamiento

No. 6), resultaron ser significativos en la inducción de divisiones primarias y

formación de microcolonias. Esto sugiere que, el pretratamiento en frío induce

respuestas de desarrollo de las microsporas por la vía esporofítica y además el

pretratamiento a 3ºC por 5 días en interacción con otros factores (tratamiento No.

41), inducen la androgénesis. Por lo tanto, el pretratamiento en frío en este

tratamiento, posiblemente creó las condiciones adecuadas para el desarrollo

androgenético de las microsporas, ya que se ha encontrado que el frío tiene efectos

sobre la disminución de la actividad metabólica, retardo en la senescencia, aumento

en la viabilidad de las microsporas y prevención en la aborción de las microsporas,

efectos que pueden inducir la activación de genes específicos involucrados en el

desarrollo de las mismas por la vía esporofítica (BAJAJ, 1983; CHEN, et al., 1991;

MAHESHWARI, et al., 1980; RASHID, 1988).

4

El pretratamiento en frío que resultó ser significativo para la formación de

microcolonias (3ºC por 3 días), se diferencia del tratamiento, en donde se indujo la

formación de embriones (3ºC por 5 días), en la duración, lo cual nos puede indicar

que para la formación de embriones se requiere de la implementación de un

pretratamiento en frío más prolongado, ya que a 3ºC por 3 días no se crearon las

condiciones apropiadas para inducir la formación de embriones ó microcallos,

aunque se logró la formación de microcolonias. En el cultivo de microsporas de Zea

mays L. (GAILLARD, et al., 1991), anteras de Papaver somniferum L. (DIEU &

DUNWELL, 1988) y anteras de Passiflora edulis (MALAVER, 2000), también se

evidenció el efecto favorable de la duración en el pretratamiento en frío sobre los

botones florales.

El pretratamiento a 8ºC por 3 días, el cual resultó ser significativo en la inducción de

divisiones primarias, se diferencia del pretratamiento que indujo la formación de

embriones (3ºC por 5 días), tanto en la temperatura como en la duración y en el

pretratamiento a 8ºC por 5 días, no se logró obtener resultados importantes. Por

consiguiente, se puede decir que la temperatura a 8ºC, puede estar ocasionando

efectos que no favorecen el posterior desarrollo de las microsporas, ya que en

comparación con la temperatura a 3ºC bajo cualquier duración se obtuvieron

resultados más favorables..

9.2. Efecto de la fuente de carbono

La fuente de carbono, sacarosa 6%, incorporada al medio de cultivo in vitro de

microsporas de P. mollissima resultó ser más efectiva que la maltosa 1.5% en la

inducción de divisiones primarias, formación de microcolonias, embriones y

microcallos. Aunque, en algunos tratamientos con maltosa 1.5% se observaron

algunas divisiones primarias y formación de microcolonias en baja proporción. En el

cultivo in vitro de microsporas de muchas especies, ha resultado ser más eficiente la

maltosa que la sacarosa en la obtención de callos (KAO, 1993; XIE et al., 1995) y

embriones (SALMENKALLIO, et al., 1995; SATO, et al., 1989; SCOTT & LYNE,

1994), debido, principalmente, a que la maltosa se hidroliza lentamente en sus

5

productos (dos glucosas), manteniendo la viabilidad de las microsporas por más

tiempo que en un medio suplementado con sacarosa, en donde la sacarosa se

hidroliza rápidamente en sus productos (glucosa y fructosa), los cuales inhiben el

desarrollo androgenético de las microsporas de muchas especies (FINNIE, et al.,

1989). Sin embargo, en el cultivo de microsporas de Coffea arabica

(NEUENSCHWANDER & BAUMANN, 1995) y anteras de Passiflora edulis

(MALAVER, 2000), especie de la misma familia y género de P. mollissima, se

observó que el efecto de las fuentes de carbono, sacarosa y maltosa, eran

similares. Por lo tanto, el efecto de estas fuentes de carbono sobre el cultivo in vitro

de microsporas dependen en gran parte del genotipo de la planta donadora

(ORSHINSKY, et al., 1990), el cual, en este trabajo, responde mejor ante el efecto

de la sacarosa, a pesar de los posibles efectos inhibidores que puede ocasionar.

Además, del genotipo de la planta donadora se debe tener en cuenta que tanto la

clase de fuente de carbono utilizada como su concentración, son factores

importantes para obtener determinadas respuestas (RASHID, 1988).En este caso,

sacarosa 6% indujo la formación de embriones, pero posiblemente al reducir dicha

concentración ó al combinar diferentes concentraciones de sacarosa con maltosa,

se puede aumentar la frecuencia de embriones al cultivar microsporas de P.

mollissima, en condiciones in vitro.

De acuerdo con los resultados se puede decir que tanto sacarosa 6% como maltosa

1.5%, pudieron intervenir en procesos metabólicos, pero solo el efecto de la

sacarosa al 6%, logró la inducción de la androgénesis. El efecto favorable de la

sacarosa 6% se puede deber, también, a su condición de azúcar no reductor, es

decir, que no se oxida fácilmente porque no contiene grupos cetonas libres que se

puedan oxidar en presencia de inones reductores como Cu2+ (MONTOYA, 1975),

facilitando la adquisición de los carbohidratos por parte de los tejidos vegetales. De

hecho, la sacarosa, es el azúcar mayormente traslocado en los tejidos vegetales

(TAIZ & ZEIGER, 1998), por lo cual, es la fuente de carbono mayormente utilizada

en el cultivo de tejidos vegetales (ROCA & MROGINSKY, 1991).

6

9.3. Efecto de la consistencia del medio

La adquisición de los nutrientes incorporados en el medio, por parte del explante

cultivado, varía dependiendo de su consistencia del medio (RASHID, 1988), lo cual

influye de forma significativa en las respuestas de cada especie. Por ejemplo, las

microsporas de Gingko biloba L., en condiciones in vitro, responden mejor

androgenéticamente en medio líquido que en medio semisólido para la formación de

embriones (LAURAIN, et al., 1993). En cambio, las microsporas de P. mollissima

respondieron mejor en medio semisólido, gelificado con agar 3%, formando

embriones. Aunque, en medio líquido se formaron en mayor proporción divisiones

primarias y microcolonias que en medio semisólido, estas se desintegraron, debido,

posiblemente, a problemas de anaerobiosis. De acuerdo con el análisis de varianza

multifactotial ANOVA, la consistencia del medio, no resultó ser un factor significativo

para estas respuestas. Por consiguiente, para la induccion de divisiones primarias y

formación de microcolonias los factores como fuentes de carbono, reguladores de

crecimiento y pretratamiento en frío fueron los que influyeron significativamente en

su formación.

Además se debe tener en cuenta que a pesar de que en medio líquido, se produce

un intercambio de nutrientes más eficiente que en medio semisólido y que los

productos tóxicos son fácilmente removibles (CHEN, et al., 1991), se pueden

producir efectos de anaerobiósis debido a la falta de agitación constante; lo cual

puede haber ocasionado la desintegración de las divisiones primarias y

microcolonias en los diferentes tratamientos, al cabo de los 30 días de cultivo;

apróximadamente. Según BERUTO, et al. en 1999, el medio semisólido, gelificado

con agar 3%, puede contener impurezas tóxicas que alteran el desarrollo de las

microsporas, pero en este trabajo no se observó dicho efecto, ya que en el

tratamiento No. 41, en donde se formaron embriones, la consistencia del medio era

semisólida. Por consiguiente, la formación de embriones a partir del cultivo in vitro

de microsporas de P. mollissima se obtiene en medio con consistencia semisólida y

no líquida.

7

9.4. Efecto de los reguladores de crecimiento

Los efectos ocasionados por los reguladores de crecimiento en condiciones in vitro,

varían entre especies y cultivariedades (SUNDERLAND & DUNWELL, 1991),

debido, principalmente, a las condiciones fisiológicas, tipo de explante y genotipo

de la planta donadora (GASPAR, et al., 1996). Por ejemplo, al cultivar microsporas

de Datura innoxia ó NIcotiana tabacum en un medio sin reguladores de crecimiento,

se puede lograr la formación de embriones, pero la mayoría de las especies

requieren de estos reguladores de crecimiento (MAHESHWARI, et al., 1980) para el

desarrollo de las microsporas y procesos morfogenéticos. De acuerdo con los

resultados obtenidos en este trabajo, se puede decir que el genotipo de

P.mollissima es sensible a la adición de reguladores de crecimiento, y por otro lado,

su adición es necesaria, porque en los tratamientos control, en donde no se aplicó

regulador de crecimiento alguno, no se observó respuesta favorable.

Para la obtención de determinada respuesta se debe tener en cuenta la clase de

regulador de crecimiento y su concentración, como también la relación entre dos ó

mas reguladores de crecimiento (CHEN, et al., 1991; SUNDERLAND & DUNWELL,

1991). Por ejemplo, al utilizar Kinetina en el cultivo de anteras de arroz se puede

inducir la formación de callos y al aumentar la concentración de ANA de 8.05 µM a

30.2 µM se puede aumentar la formación de callos, pero se también, se dificulta el

desarrollo posterior de los mismos, lo cual no es lo deseado (CHEN et al., 1991). En

este trabajo se utilizaron tanto auxinas como citocininas en diferentes

concentraciones, en donde la combinación de ANA 2,69 µM con Kin 4.65 µM,

resultó ser eficiente para inducir la formación de microcolonias, como en el

tratamiento No. 6 y embriones, como en el tratamiento No. 41, pero la combinación

de ANA 2.69 µM con Kin 9.29 µM, resultó ser significativa para la inducción de

divisiones primarias, de acuerdo con el análisis estadístico ANOVA y pruebas de

rangos múltiples.

8

Por consiguiente, la utilización de estos dos reguladores de crecimiento influyen en

los resultados, en donde, el regulador de crecimiento ANA 2.69 µM puede estar

creando las condiciones apropiadas para el desarrollo de las microsporas, al igual

que en el cultivo in vitro de microsporas de Coffea arabica (NEUENSCHWANDER &

BAUMANN, 1995) y de Brassica campestris (SATO, et al., 1989), pero la

concentración de la citocinina, kinetina, influyó significativamente en las respuestas

en interacción con ANA 2,69 µM, ya que en combinación con Kin 4.65 µM se

obtuvo la formación de microcolonias y embriones, en cambio, con Kin 9.29 µM se

obtuvieron mayor cantidad de divisiones primarias. Por lo tanto, kinetina puede

estar influyendo significativamente en los resultados, al inducir una actividad

sinérgica con la auxina para la formación de divisiones a una mayor concentración

de Kin.

Al combinar ANA 8.05 µM con Kin 4.65 µM ó con Kin 9.29 µM, no se obtuvieron

resultados favorables, lo cual puede indicar que ANA a esta concentración puede

estar inhibiendo ó suprimiendo efectos de la citocinina para el desarrollo de las

microsporas (GASPAR, et al., 1996), ya que al combinar ANA 2.69 µM con Kin 4.65

µM ó con Kin 9.29 µM se formaron tanto embriones como microcolonias y gran

cantidad de divisiones primarias, respectivamente. Por lo tanto, el efecto de la

auxina, evaluada en este trabajo, también influye significativamente sobre los

resultados. Es decir, que tanto ANA como Kinetina ejercen un efecto importante

sobre la obtención de determinados resultados, en donde, ANA 2.69 µM con Kin

4.65 µM, en interacción con los demás factores del tratamiento No. 41, indujeron la

androgénesis en el cultivo in vitro de microsporas de P. mollissima.

Los reguladores de crecimiento en el medio de cultivo intervienen en procesos de

inducción androgenética y pueden intervenir en procesos morfogenéticos. Al

modificar u omitir los reguladores de crecimiento de la composición del medio se

puede inducir la diferenciación ó regeneración de callos o embriones, dependiendo

de la especie (CHEN et al., 1991; GASPAR, et al., 1996). Por ejemplo, para inducir

la diferenciación de callos en determinadas investigaciones, obtenidos a partir del 9

cultivo in vitro de anteras de Triticum aestivum, se requiere de la omisión de los

reguladores de crecimiento en el medio de subcultivo (CHU, 1982). En este trabajo

se omitieron los reguladores de crecimiento en el medio de subcultivo para los

embriones obtenidos en el tratamiento No. 41. En respuesta al subcultivo de los

embriones se formaron microcallos y no la diferenciación de los embriones. Por lo

tanto, el efecto de los reguladores de crecimiento influye significativamente en la

morfogénesis de las microsporas de P.mollissima cultivadas. Es decir, en este

trabajo, no solamente se comprobó la capacidad embriogénica de las microsporas

de P. mollissima sino que también, se corroboró que los reguladores de crecimiento

son factores críticos para la inducción de la androgénesis y procesos de

morfogénesis.

9.5. Estado de desarrollo del polen

Dentro de los factores que influyen en la androgénesis el estado de desarrollo de las

microsporas es de vital importancia porque dependiendo de este, se puede

modificar la vía gametofítica por la esporofítica. Para inducir la androgénesis,

generalmente, se requiere de un estado anterior a la primera división mitótica

normal (POWELL, 1990, SUNDERLAND & DUNWELL, 1991), en donde se produce

un cambio drástico en la expresión de genes, síntesis de proteínas y mRNA que

pueden inducir un desarrollo por la vía esporofítica, bajo la influencia de

determinados factores (GARRIDO et al., 1993). Al cultivar microsporas en estado

uninucleado de P. mollissima se logró inducir la formación de embriones y

microcallos, en unas condiciones determinadas. Por lo tanto, el estado de desarrollo

utilizado, resultó ser adecuado, pero no se puede desligar de la interacción de

este factor con otros factores como pretratamiento en frío sobre los botones florales,

fuentes de carbono, reguladores de crecimiento y consistencia del medio (CHEN et

al., 1991). Los factores evaluados y el estado de desarrollo cultivado influyeron en

la inducción embriogénica y formación de microcallos de P. mollissima , como

también en la inducción de divisiones primarias y formación de microcolonias.

9.6. Microscopía electrónica

10

De acuerdo con los cortes semifinos realizados a algunos embriones globulares

obtenidos a partir del tratamiento No. 41, se pudo observar que los embriones eran

semiredondos y que las células en la periferia estaban más conglomeradas que las

del centro, debido a que algunas células se encontraban en posibles divisiones

celulares, según los cortes ultrafinos observados. Esta morfología coincide con lo

citado por NAVARRO et al., 1997, en cortes de embriones de Canavendish banana.

Por lo tanto, estas divisiones son un indicio de que el embrión se encontraba en

crecimiento para, probablemente, desarrollarse en estados posteriores de la

embriogénesis.

La gran heterogeneidad morfológica de células se puede atribuir a que la formación

de los embriones en condiciones in vitro se produce por divisiones al azar en forma

desorganizada hasta formar un embrión globular. Además, al no observar las

divisiones periclinales, las cuales dan orígen a la epidermis del embrión, nos puede

indicar que estos embriones, posiblemente, se encontraban en estados tempranos

de desarrollo al realizar los cortes.

11

10. Conclusiones

Se demostró la capacidad embriogénica de las microsporas de P. mollissima,

cultivadas en condiciones in vitro.

El pretratamiento en frío, fuentes de carbono, reguladores de crecimiento influyen y

consistencia del medio, influyen en la inducción de la embriogénesis directa en el

cultivo in vitro de microsporas de P. mollissima.

Los reguladores de crecimiento son indispensables para la inducción de la

embriogénesis e intervienen en procesos morfogenéticos en el cultivo de

microsporas de P. mollissima, en condiciones in vitro.

Para inducir la embriogénesis directa en el cultivo microsporas de P. mollissima en

condiciones in vitro, se debe realizar un pretratamiento en frío sobre los botones

florales por 5 días a 3ºC, cultivarlas en medio Murashige & Skoog (MS) semisólido

gelificado con agar 6%, con la adición de sacarosa 6%, ANA 2.69 µM y Kin 4.65

µM.

12

11. Recomendaciones

Evaluar distintas concentraciones de sacarosa menores al 6% ó combinar diferentes

concentraciones de sacarosa con maltosa.

Evaluar distintas concentraciones de ANA y Kin para inducir la diferenciación de los

embriones globulares en el medio de subcultivo.

Evaluar duraciones más prolongadas para el pretratamiento en frío sobre los

botones florales.

Evaluar el cultivo in vitro de microsporas de P. mollissima en medio líquido sobre

una malla de alginato de potasio.

13

12. Bibliografía

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18

13. ANEXOS

ANEXO 1. Análisis de varianza multifactorial ANOVA y pruebas de rangos múltiples para divisiones primarias.

Análisis de varianza para divisiones

Factores Suma de Cuadrados

Cuadradosmedios

P- Valor

Pretratamiento 995203.0 331734.0 0.0139Carbono 372169.0 372169.0 0.0424Consistencia 164451.0 164451.0 0.1734Reguladores 974136.0 324712.0 0.0153

Pruebas de rangos múltiples.Pretratamiento en fríoMétodo: Scheffe

1= 3 días a 3ºC2= 3 días a 8ºC3= 5 días a 3ºC4= 5 días a 8ºC

Pretratamiento

LS Mean Grupo homogéneo

1 6.5625 X2 215.687 X3 26.1562 X4 6.03125 X

Fuente de carbonoMétodo: Schaeffe

1= Sacarosa 6%2= maltosa 1.5%

Fuente de C LS Mean Grupo homogéneo1 117.531 X2 9.6875 X

19

Reguladores de crecimientoMétodo: Schaeffe

1= ANA 2.69 µM y Kin 4.65 µM2= ANA 8.05 µM y Kin 4.65 µM3= ANA 2.69 µM y Kin 9.29 µM4= ANA 8.05 µM y Kin 9.29 µM

Pretratamiento


1 26.2813 X2 7.59375 X3 214.094 X4 6.46875 X

ANEXO 2. Análisis de varianza multifactorial ANOVA y pruebas de rangos múltiples para microcolonias.

Análisis de varianza para divisiones

Factores Suma de Cuadrados

Cuadradosmedios

P- Valor

Pretratamiento 5727.56 1909.19 0Carbono 5778.12 5778.12 0Consistencia 22.7812 22.7812 0.7361Reguladores 23349.3 7783.1 0

Pruebas de rangos múltiples.Pretratamiento en fríoMétodo: Scheffe

1= 3 días a 3ºC2= 3 días a 8ºC3= 5 días a 3ºC4= 5 días a 8ºC

Pretratamiento


1 52.625 X2 13.25 X3 17.7813 X4 2.03125 X

20

Fuente de carbonoMétodo: Schaeffe

1= Sacarosa 6%2= maltosa 1.5%

Fuente de C LS Mean Grupo homogéneo1 40.5313 X2 2.3125 X

Reguladores de crecimientoMétodo: Schaeffe

1= ANA 2.69 µM y Kin 4.65 µM2= ANA 8.05 µM y Kin 4.65 µM3= ANA 2.69 µM y Kin 9.29 µM4= ANA 8.05 µM y Kin 9.29 µM

Pretratamiento


1 81.9688 X2 1.78125 X3 1.5625 X4 0.0375 X

21

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