PROPAGACIÓNDECattleyarexENCULTIVOINVITRO Henry Manuel Vera Tudela Ramírez

Tarapoto-Perú

“PROPAGACIÓN DE Cattleya rex en CULTIVO IN VITRO”

Henry Manuel Vera Tudela Ramírez Agrónomo

TARAPOTO – PERÚ

2013

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I. INTRODUCCIÓN La actividad agrícola constituye la actividad productiva más importante de una

zona y base de una economía nacional, en un extremo de la agricultura

regional se sitúa la agricultura comercial, generalmente de pequeña y mediana

escala, en el otro extremo la agricultura de subsistencia, esto ha generado

problemas como la tala indiscriminada de los bosques con esto la destrucción

de habitads de especies de orquídeas y su comercialización ilícita.

Existe la necesidad de buscar soluciones rápidas como la introducción de

nuevas tecnologías ajustables a la realidad de la región, razón por la cual

CORPORACION G Y G E.I.R.L a través del laboratorio de CULTIVO DE

TEJIDOS VEGETALES, cuyo fin es multiplicar masivamente orquídeas y otras

plantas ornamentales, manteniendo las características genéticas.

Las técnicas de tejidos vegetales, se representa como una alternativa a las

metodologías convencionales de propagación, permitiendo la multiplicación de

individuos de una especie en periodos cortos sin tener pérdidas ya sea por

semillas u otros órganos; este método permite la propagación de especies

selectas altamente productivas. Así mismo la aplicación de métodos en cultivo

in vitro facilita la conservación de bancos de germoplasma, con la finalidad de

mantener especies con su característica genéticas originales.

Para investigaciones futuras en el campo agronómico la propagación in vitro es

una técnica aplicable en la región San Martín, esta ha servido de base a

muchos países industrializados constituyéndose hoy en una herramienta más

importante para el desarrollo de la agricultura y la floricultura.

El presente trabajo describe las actividades realizadas en el laboratorio de

Cultivo de Tejidos Vegetales de la empresa CORPORACION G Y G E.I.R.L

como parte de prácticas pre-profesionales realizada durante el periodo Junio a

Setiembre del 2013

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II. ANTECEDENTES 2.1 Cultivo de Tejidos in vitro

(Abdelnour, E; et, al. 1994) dice que, se le define como un enfoque

multidisciplinario que involucra varias ciencias (biología, bioquímica,

genética, virología, agronomía, ingeniería, química, medicina y veterinaria

entre otras) cuyo fundamento es el uso de organismos vivos o de

compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de

valor para el hombre. El cultivo de tejidos o propagación in vitro consiste

en cultivar un inóculo con potencialidad de diferenciación bajo condiciones

asépticas en presencia de un medio nutritivo, dicha capacidad de

regenerar un nuevo individuo entero es única de las plantas. Al igual que

en otros métodos de multiplicación vegetativa o asexual, los individuos

descendientes de una planta madre propagada in vitro son clones, es

decir, copias genéticamente idénticas a la planta madre, mientras que en

plantas propagadas por semilla (propagación sexual), la descendencia no

es clónica puesto que cada semilla tiene su propia base genética

resultante de la mezcla de sus progenitores, por tanto cada individuo es

único.

(RUÍZ, 2003) dice, que es un grupo heterogéneo de técnicas, mediante

las cuales un explante (parte separada de un vegetal, célula, tejido,

embriones, etc.) con potencialidad de diferenciación se cultiva bajo

condiciones asépticas, en presencia de un medio de cultivo constituido

por macronutrientes, vitaminas y hormonas que se incuban bajo

condiciones ambientales controladas.

(ROCA Y MROGINSKI, 1991) menciona que las técnicas de cultivo in

vitro han contribuido no solo a un mejor entendimiento de los eventos de

diferenciación celular, si no aún mejor aprovechamiento de tales eventos

en la explotación más eficiente de las plantas. Al igual que otros métodos

de multiplicación vegetativa o asexual, los individuos descendientes de

una planta madre cultivada in vitro son clones, es decir copias

genéticamente iguales entre ellas e idénticas a la madre.

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(Mejia, 1998) menciona que el cultivo de tejidos vegetales es una

importante técnica nueva de propagación de plantas que se halla a

disposición del cultivador, pero aún no es ampliamente usada debido a su

poca difusión. La reproducción vegetativa, si ocurre naturalmente o con la

intervención humana, se inicia a partir de tallos, raíces, hojas; no hay

mesclas de caracteres genéticos, la cual ocurre en la reproducción sexual

a nivel de las flores. El principio de cultivo de tejidos es simple; primero,

es necesario aislar una parte de la planta (explante); segundo, proveer al

explante de un medio ambiente apropiado (medio de cultivo adecuado y

en condiciones físicas propias de la especie) en el cual pueda expresar su

potencial intrínseco o inducido, partiendo de un stock de plantas de

sanidad aprobada. Estas son multiplicadas asépticamente bajo una

cámara de flujo laminar, se seccionan segmentos de tallos u otras partes

de la planta, son transferidos a recipientes de vidrio con medio fresco de

cultivo, los recipientes son sellados con tapas autoclavables y cintas de

parafilm.

(Aceves, J. et. al, 1994) menciona que, WHITE en el año de 1932, logra

el primer cultivo in vitro estable utilizando en sus experimentos ápices de

raíces de jitomate. Los tejidos meristemáticos del ápice radical propiciaron

crecimiento en longitud de los mismos en el medio de cultivo. La falla en

los intentos realizados por varios investigadores entre 1902 y 1932 se

debió, como lo menciona White, a la mala elección del material vegetativo

y a la simplicidad de los medios de cultivo utilizados. El logro de White le

da un buen impulso al desarrollo de las técnicas de cultivo in vitro; sin

embargo en sus trabajos realizados hasta entonces no obtienen

proliferación celular en forma, los ápices de raíz solo crecen en longitud

como lo harían normalmente como parte de la raíz de la planta intacta. No

es así hasta 1934 cuando Gautheret logra proliferación celular in vitro en

tejidos cambiales provenientes de plantas adultas. En 1939 el mismo

Gautheret, Nobecourt (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de

tabaco) publican casi simultáneamente la formación de una masa de

células parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos)

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utilizados en sus experimentos. Este hecho significativo constituye en sí el

despegue de las técnicas de cultivo in vitro.

(Roca, 1991) menciona, que es útil destacar la secuencia de eventos

asociados a la multiplicación de plantas mediante la técnica de cultivo

aséptico, de la siguiente manera:

ETAPA 0

Etapa inicial, que comprende la selección de una modalidad de

pretratamiento para volver funcional la estrategia que se adopte.

ETAPA I Es la etapa de establecimiento, el cual se establece el cultivo inicial o

primario.

ETAPA II Es la etapa de multiplicación de brotes o multiplicación simplemente.

ETAPA III Corresponde al enraizamiento o etapa de pretransplante, tiene como

objetivo producir una planta autótrofa que pueda sobrevivir a las

condiciones de transplante en el medio de cultivo.

ETAPA IV Transferencia final a la etapa de medio ambiente y que este en

condiciones de adaptarse a factores externos no controlados (luz,

humedad, etc.).

Frecuentemente las condiciones específicas del medio o cultivo

aséptico están asociadas con cada una de las etapas mencionadas, y

cuando sea posible conviene establecer una estrategia de

multiplicación basada en la interpretación de dichas condiciones. Sin

embargo, no se debe llegar a la deducción de que estas etapas son

siempre completamente distintas y separables.

2.1.1 El entorno del cultivo

Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que

conforman el biotopo de la planta en la naturaleza es técnicamente

muy complejo. Por esa razón se realiza una simplificación de la

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realidad escogiendo aquellos factores que se pueda mantener

controlado.

En resumen el cultivo in vitro de plantas superiores es una técnica

que exige un control absoluto del ambiente, tanto físico como

químico, en el que se sitúa al explante. Conviene por tanto,

conocer cuáles son los principales factores que conforman el

ambiente del explanto y que deberán ser controlados.

De estas consideraciones surge el establecimiento de los cultivos

de tejidos, es decir, la separación del explante y las operaciones

relacionadas con su incubación in vitro, dependerá en gran medida

del tipo de explante y del sistema de cultivo que se emplee, lo que

a su vez dependerán del objetivo perseguido. En otras palabras,

las técnicas que se emplean para cultivar protoplastos no son

exactamente las mismas que se usan para cultivar meristemas; del

mismo modo, un determinado sistema de cultivo puede ser de gran

utilidad para el logro de un objetivo pero puede no ser útil para otro

(Roca y Mroginski, 1991).

2.1.2 Micropropagacion

Cuando un inoculo con potencialidad de diferenciación se incuba

en condiciones favorables (balance hormonal apropiado) regenera

un nuevo individuo. La micropropagacion es prácticamente una

multiplicación masiva in vitro (Roca y Mroginski, 1991).

2.1.3 Ventajas de la micropropagacion (Mejia, 1998) menciona:

- Es uno de los métodos conocidos más utilizado actualmente para

erradicar patógenos. - Permite uniformidad genética.

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- Manejo de grandes volúmenes de plantas en un área pequeña. - Los materiales pueden ser propagados en cualquier época del

año. - Se propaga masivamente plantas libres de enfermedades en

corto tiempo. - No existe la perdida de las características genéticas del material. - Reduce los costos de labores agronómicas en el mantenimiento

de los explantes en incubación. - El resultado es la obtención de plantas libres de enfermedades. - Se obtiene plantas homogéneas. - Se conservan materiales que están en proceso de extinción. - Propagación de especies de difícil multiplicación por sistemas

tradicionales.

2.1.4 Desventajas de la micropropagacion (Mejia, 1998) menciona:

- Variación de respuesta entre los genotipos.

- Se requiere de personal especializado.

- Requiere de infraestructura y equipamiento.

- Los productos químicos son de elevado costo.

- Contaminación de materiales por inadecuado desarrollo de

asepsia.

- Perdida de materiales por desperfectos de equipos (aire

acondicionado, fluorescentes, ozonizador y otros).

- Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los

cambios ambientales, de manera que el éxito o fracaso de todo el

proceso depende de la aclimatación.

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2.2 Vitropatógenos (García et al., 2007) menciona que, la contaminación microbiana es uno

de los problemas más graves en la propagación in vitro de especies

vegetales en el mundo, ya que produce cuantiosas pérdidas de material

vegetal tanto en la micropropagacion comercial como en los trabajos de

investigación. Los contaminantes más frecuentes in vitro son los hongos,

bacterias y levaduras, que en muchos casos no son patógenos en

condiciones de campo.

2.3 Eliminación de bacterias y hongos (García et al., 2007) menciona que, Se han establecido numerosos

procedimientos tecnológicos para controlar o disminuir la presencia de

contaminantes y el empleo de productos químicos (fungicidas y

antibióticos) ha constituido una vía rápida tanto para atenuar como para

eliminar estos microorganismos (Carrazana et al., 1997). Con el fin de

atenuar el uso de estos compuestos y sus consecuentes efectos

negativos, se buscan nuevas alternativas sobre la base de productos

naturales. Se cree que la producción de aceites esenciales por las plantas

está fundamentalmente justificada como un mecanismo de defensa contra

los patógenos y plagas (Oxenham, 2003) y han mostrado un amplio

espectro de actividad contra microorganismos patógenos de plantas y

humanos (Qamar y Choudhary, 1991). Por ejemplo, el aceite esencial de

Cymbopogon nardus que es extraído de las hojas y el tallo de la planta, es

un aceite volátil con propiedades antisépticas, desodorantes, insecticidas,

tónicas y estimulantes (Shahi y Tava, 1993). Se ha demostrado que

aceites esenciales de plantas del género Cymbopogon, poseen

propiedades antimicrobianas, incluyendo a C. nardus (Saikia et al., 2001), es por eso que este trabajo tuvo como objetivo evaluar la actividad

antimicrobiana del aceite esencial de C. nardus para el control de

microorganismos contaminantes, aislados del cultivo in vitro de especies

vegetales.

9

2.4 La autoclave y su funcionamiento 2.4.1 Esterilización

(Roca, 1991) menciona, el calor es uno de los agentes que se utiliza

con más frecuencia en la esterilización. Se puede usar en forma de

llama directa, calor húmedo (vapor) o como calor seco (aire

caliente); cuando se utiliza en calor húmedo puede ser de forma de

vapor abierto o vapor bajo presión. Ocasionalmente se puede usar

agua caliente pero no hirviendo.

2.4.2 Vapor bajo presión (autoclave) El vapor bajo presión es muy eficiente para destruir todas las formas

de bacterias y hongos y sus esporas, y es el método más utilizado

para esterilizar diferentes materiales incluyendo los medios de

cultivo (siempre y cuando no contengan componentes termolábiles)

(Roca y Mroginski, 1991).

2.4.3 Funcionamiento de la autoclave (Roca y Mroginski, 1991) menciona, al utilizarlo es necesario

extraer todo el aire antes de empezar el proceso de esterilización ya

que, a presiones iguales la temperatura de una mezcla de aire y

vapor no es tan alta como la del vapor puro; la extracción del aire se

logra automáticamente al permitir que el vapor expulse el aire del

aparato antes de cerrar la válvula correspondiente. La temperatura

dentro del autoclave se regula mediante la presión y directamente

proporcional a ésta; la presión se lee en un manómetro que forma

parte del autoclave. Para esterilizar los materiales relacionados con

el cultivo de tejidos se acostumbra a usar una presión de 15 libras

(lb) durante 20 minutos, a esta presión la temperatura del vapor es

aproximadamente 121°C suficiente para matar virtualmente todas

las formas de vida en cinco minutos. La desinfección se limita al

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proceso de destrucción de los microorganismos mediante métodos

químicos; la esterilización se refiere a menudo al método físico para

la destrucción de los microorganismos. Se utiliza la palabra axénico para las preparaciones que están libres de virus, viroides o

micoplasma.

2.5 Medios de cultivo Una vez definido el objetivo perseguido con el cultivo in vitro de un

determinado explante, es necesario elegir un medio apropiado de cultivo,

en el cual hay que considerar no solo sus componentes si no su

preparación. En la actualidad existen innumerables formulaciones cada

una de las cuales contiene entre 15 a 35 compuestos químicos que

suministran carbono, sustancias reguladoras de crecimiento y otras

sustancias, (Roca y Mroginski, 1991). Concentraciones ideales de sustancias químicas necesarias y las

combinaciones apropiadas de nutrientes, así como su forma química

adecuada, ha sido posible establecer cultivos para casi todas las partes

de la planta en diversas especies vegetales. (Ruíz, 2003).

2.6 Consideraciones en la preparación de medos de cultivo Es necesario preparar el medio utilizando agua destilada. Se debe evitar

el almacenamiento prolongado del medio para evitar la acumulación de

contaminantes; todas las sustancias químicas usadas para su preparación

deben ser de un alto grado de pureza. Para la preparación de los medios

dependerá en primera instancia del tipo de medio, de su consistencia y de

la presencia de componentes termolábiles, (Roca y Mroginski, 1991).

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2.7 Sustancias orgánicas complejas usadas en germinación asimbiótica de semillas de orquídeas.

(Padilla, E. 2008) en su tesis hace mención que, un gran número de

aditivos se usan para favorecer la germinación asimbiótica de semillas de

orquídeas y el subsecuente desarrollo y diferenciación de los protocormos

(Arditti, 1967).

Los más frecuentes usados son el endosperma líquido de coco, el jugo de

tomate y el fruto de plátano. Steward and Simmonds (1954) reportaron

que las capas formativas del fruto del plátano poseen sustancias que

estimulan la división en células de zanahoria; con solo esta evidencia

disponible, Khalifah (1966 b) llegó a la conclusión de que estas

sustancias responsables de la división celular eran las citoquininas.

Encontraron que el fruto de plátano contiene pequeñas cantidades de

compuestos inductores de la división celular [zeatina, zeatin-ribosido y 6-

(2-isopentilamino) purina pero que comparados con el endosperma

líquido del coco su actividad era extremadamente baja: 20 ml. de este

aditivo daban una respuesta similar a 500 g de plátano. Sin embargo,

existen evidencias que el efecto del plátano sobre el desarrollo de las

orquídeas puede deberse a la presencia de otros compuestos distintos a

las citoquininas, pues se ha reportado la presencia de compuestos afines

a giberalinas y auxinas en el mismo (Khalifah. 1966a, 1966b).

(Valmayor. 1972), reportó que el endosperma líquido del coco solamente

permite una pobre diferenciación en protocormos de Dendrobium, Vanda

y Cattleya, mientras que su combinación con extractos de plátano resulta

en un buen desarrollo de raíces y tallos.

2.8 Carbón activado

(Padilla, E. 2008) en su tesis hace mención que, el carbón utilizado en el

cultivo de tejidos es el carbón resultante de la combustión de tejidos

vegetales (madera, residuos de madera, papel, lignina, etc.). Actualmente

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es incluido con frecuencia en la formulación de medios de cultivo in vitro

de orquídeas, tanto para la siembra de plántulas como de protocormos

obtenidos a partir de semillas o de meristemas (Yam et. al., 1990).

Algunos solutos de una solución son adsorbidos por el carbón activado

cuando entran en contacto con este, el grado de adsorción depende de la

temperatura, el pH, y la composición química de la sustancia adsorbida,

siendo mayormente adsorbidos los compuestos moderamente polares y

pocos solubles, como fenoles, fitohormonas y vitaminas, en comparación

con los muy polares o los apolares: azucares, sorbitol, manitol, etc. que no

son adsorbidos (Weatherhead et. al., 1979).

Las sales inorgánicas muy disociadas no son adsorbidas por el carbón

activado, pero si son los de muy baja solubilidad como cationes di- o poli-

valentes. Es por ello en estos casos importantes el uso de agentes

quelantes (EDTA) que incrementan la solubilidad de los mismos (Yam et. al., 1990).

Varios mecanismos se han propuesto para explicar el efecto benéfico del

carbón activado en el cultivo de orquídeas (Weatherhead et. al., 1978). En primer lugar la contribución de minerales en forma de impurezas

estaría enriqueciendo el medio de cultivo. Segundo, la capacidad para

adsorber metabolitos fitotóxicos que estarían siendo liberados al medio de

cultivo por los tejidos (fenoles y sus oxidados, hidroxiquinonas, ácido para

– hidro – benzoico). Tercero la adsorción de sustancias producidas

durante la esterilización en el medio de cultivo, como el hidroximetil-

furfural, resultado de la deshidratación de las hexosas que afectan el

crecimiento y desarrollo de las plántulas. Cuarto, la adsorción de etileno

que inhibe el crecimiento y la diferenciación de las plántulas y

protocormos.

Para el cultivo de orquídeas se utiliza carbón activado en medios de

cultivo para germinación de semillas y en medios para desarrollo como

para etapas posteriores (replante) a una concentración de 2 g/l.

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2.9 Experiencias en cultivo in vitro de orquídeas con medios de cultivo casero. 2.9.1 Medios de cultivo para la siembra de semillas y meristemas.

(Padilla, E. 2008) en su tesis dice que (Machado. 2003) menciona, que para un laboratorio casero, se puede preparar

medios con componentes de fácil adquisición y baratos. Estos

medios son tan eficientes y en algunos casos hasta mejores que

los medios usados tradicionalmente en el cultivo in vitro de

orquídeas. Los componentes para la preparación del medio de

cultivo casero se pueden adquirir en cualquier feria libre o mercado

de productos de primera necesidad, la preparación del medio es

tan fácil que quien sabe preparar una vitamina para su consumo

personal, sabrá también con seguridad hacer un excelente medio

para producir orquídeas.

2.9.2 Receta de un medio de cultivo para cultivar semillas.

(Machado. 2003), recomienda que todos los componentes a

usarse en la preparación de un medio de cultivo debe ser orgánico

sin agroquímicos, estos son:

Plátano seda semi maduro sin cascara, aproximadamente 50 g.

Papaya (una cuchara de sopa bien llena) aproximadamente 50

g.

Tomate cereza (cinco pequeños tomates) aproximadamente 50

g.

Agua de coco verde (1 vaso) aproximadamente 120 ml.

Azúcar (una cuchara de sopa) aproximadamente 20 g.

Agar-Agar (una cuchara de sopa) aproximadamente 10 g.

Polvo de carbón (una cuchara de sopa) aproximadamente 01 g.

Agua destilada completar para un litro.

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2.10 Características de la orquídeas 2.10.1 Clasificación taxonómica

(Dresler, 1993) menciona, Clasifica a las orquídeas de la siguiente

manera:

REYNO: Plantae

SUBREINO: Embriofitos

PHYLLIUM: Traqueofitas

SUBPHYLLIUM: Pterópsidos

CLASE: Angiosperma

SUBCLASE: Monocotiledoneas

ORDEN: Microsperma

SUBORDEN: Ginandras

FAMILIA: Orquídeas

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2.10.2 Género Cattleya (Cavero, M. et. al., 1991) menciona, que el género dedicado a

Willian Cattle, eminente horticultor y uno de los primeros

aficionados en tener una colección privada de orquídeas. Este

género es conocida por los cultivadores como “la reina de las

orquídeas”.

Crece en forma epifita o algunas veces sobre rocas; se conoce

unas 65 especies, todas en américa tropical, extendiéndose desde

México hasta Argentina.

Presentan pseudobulbos prominentes, los cuales pueden ser

unifoliados o bifoliados. En la mayoría de las especies los

pedúnculos florales emergen del extremo superior del pseudobulbo

adulto y los botones florales están envueltos en una espata simple

o doble. En casi todos los casos, los sépalos están notoriamente

extendidos y los pétalos son más anchos que los sépalos, el labelo

es grande y vistoso.

Las Cattleyas son las orquídeas más ampliamente

comercializadas. Miles de híbridos han sido producidos cruzando

Cattleyas con géneros aliados o próximos.

Para el Perú se reportan seis especies, distribuidas en Amazonas,

Cajamarca, Huánuco, Junín, Loreto, Piura, San Martín y Tumbes.

(Gutierrez et. al, 1998) menciona, el género Cattleya requiere de

una cantidad de luz del 70 – 80% y en algunos casos de luz solar

directa, mientras otras requieren de menor intensidad luminosa

como es el caso de la Phalaenopsis y Góngora. Las quemaduras

por exceso de luz causan daños irreversibles en la hoja y esta

puede llegar a secarse. Las orquídeas de climas cálidos prefieren

temperaturas mayores a 21°C y los de clima intermedio toleran

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tanto temperaturas altas como bajas. El riego de las orquídeas

debe hacerse por las mañanas para que las plantas tengan tiempo

de secarse en el transcurso del día. Regar en las tardes o en las

noches favorece la aparición de pudriciones y enfermedades

causadas por hongos y bacterias.

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III. ACTIVIDADES DESARROLLADAS 3.1 Organización del laboratorio El laboratorio de Cultivo de Tejidos de la empresa CORPORACION G Y G

E.I.R.L está constituido por 3 ambientes, distribuidos de la siguiente

manera:

3.1.1 Área de Recepción, lavado y preparación de medio de cultivo

Aquí se recepcionan los materiales vegetales para siembra

procedentes del vivero y frascos de vidrio para su lavado, para que

sean reutilizados nuevamente como frascos in vitro (conteniendo el

medio de cultivo) ; cuenta con un lavadero para agua fría, así mismo

un grifo para las actividades de lavado.

Aquí se preparan los medios de cultivo para la siembra del material

vegetal, para ello cuenta con una autoclave el cual es utilizado para

el autoclavado de los medios de cultivo, esterilización de material de

vidrio conteniendo material vegetal contaminado. Cuenta también

con un espacio para almacenar los materiales de vidrio, plástico y

reactivos químicos. Este ambiente cuenta con una mesa de trabajo

para la preparación de los medios de cultivo, así también equipos

como: pH metro, balanza analítica, autoclave, refrigeradora,

microscopio, estufa para los materiales quirúrgicos.

3.1.2 Área de Siembra y Transferencias

En esta área se realiza las siembras, el trabajo de excisión,

inoculación y transferencia de los explantes a los frascos de vidrio

que contienen el medio de cultivo. Este trabajo se realiza con altos

niveles de limpieza ambiental, esta área implementada con una

cámara de flujo laminar horizontal de aire filtrado de baja presión la

cual es útil para realizar la siembra y la transferencia de los

materiales vegetales (Orquídeas).

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3.1.3 Área de incubación

Los cultivos se incuban en un ambiente apropiado donde se

encuentran las estanderias metálicas los cuales sirven para colocar

los frascos tapados herméticamente el cual contiene las semillas de

Cattleyas ya sembradas.; esta área mantiene las condiciones

favorables para el desarrollo de los cultivos. La regulación de la

temperatura se logra por medio de equipos de aire acondicionado

de pared programables, el cual mantiene la temperatura favorable

entre 20 y 28°C. La iluminación se está aprovechando las horas de

luz del día de las 6:00 antes medidiano hasta las 18 horas, a partir

de esta hora se encienden las luces de los tubos de fluorescentes

hasta las 22 horas cumpliendo así las necesidad del cultivo de 16

horas luz y posterior 8 horas de oscuridad; el cuarto de incubación

tiene en las ventanas vidrios transparentes la cual permite la

entrada de las luz del día.

3.2 Uso de materiales y equipo de laboratorio

3.2.1 Lavado y esterilización de materiales de vidrio

Los materiales de vidrio son lavados con agua y detergente en el

lavatorio y enjuagados con agua de caño y posteriormente con agua

destilada y esterilizadas en la autoclave a una presión de 15 lb. Y a

una temperatura de 121°C durante 15 minutos; este proceso se

realiza con la finalidad de eliminar cualquier agente contaminantes

en los materiales.

3.2.2 Preparación soluciones desinfectantes para el material vegetal

Se preparó con la finalidad de desinfectar cápsulas, semillas u otro

material vegetal para que estén libres de agentes contaminantes y

posteriormente sembrarlos utilizando a cámara de flujo laminar en

los frascos conteniendo el medio de cultivo semisólido.

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La solución que se utiliza con más frecuencia en el laboratorio para

la desinfección de materiales vegetales es la lejía comercial que

contiene como ingrediente activo al Hipoclorito de Sodio al 4.9%

(NaOCl), el cual hay que baja la concentración para desinfección de

capsulas al 1% y para semillas al 0.5%. Para bajar la concentración

del Hipoclorito de Sodio se utilizó la siguiente formula:

V1.C1 = V2.C2

Dónde:

V1: volumen inicial V2: volumen final

C1: concentración inicial C2: concentración final

Pasos a seguir:

El volumen inicial (V1 en mililitros), es el volumen requerido

de lejía comercial.

La concentración inicial (C1 en porcentaje), es la

concentración de Hipoclorito de Sodio de la lejía comercial

(4.9% de NaOCl).

El volumen final (V2 en mililitros), es el volumen de agua

requerido.

La concentración final (C2 en porcentaje), es la

concentración esperada.

Para la limpieza de la mesa de trabajo de la cámara de flujo laminar,

material quirúrgico y otros materiales se utiliza alcohol medicinal de

70° y 96° (grados).

3.2.3 Uso de la balanza analítica

La balanza analítica es indispensable para el pesado de los insumos

para el preparado del medio de cultivo, donde cada peso tiene que

ser exacto según como indican la tabla de formulación.

20

La balanza nos permite pesar cantidades pequeñas como

miligramos (mg.) y que es muy imposible pesar en balanzas

convencionales.

3.2.4 Uso del pH metro

El pH metro permite medir exactamente el pH de la preparación de

los medios de cultivo ya que es indispensable para que las plántulas

se desarrollen adecuadamente. Esta constituido básicamente por un

electrodo sensible y un tablero de control el cual nos permite medir y

calibrar el pH del medio de cultivo dependiendo del requerimiento

del cultivo o especie, la calibración se realiza haciendo la aplicación

de Ácido Clorhídrico a 1 Normal (HCl al 1N) en caso de bajar el pH

del medio de cultivo, y Hidróxido de Sodio a 1 Normal (NaOH) en

caso de subir el pH del medio de cultivo, así llegar al rango de pH

requerido.

3.2.5 Uso y mantenimiento de la autoclave

La autoclave proporciona vapor bajo presión y es muy eficiente para

destruir todas las formas de vitropatógenos. Al utilizarlo, se extrae

todo el aire antes de empezar el proceso de esterilización, la

extracción de aire se logra automáticamente al permitir que el vapor

expulse el aire del aparato antes de cerrar la valvula

correspondiente. La temperatura dentro de la autoclave se regula

mediante la presión; la presión se lee en un manómetro que forma

parte de la autoclave. Para esterilizar los materiales se utiliza una

presión de 15 libras (15lb) durante 20 minutos, a esta presión la

temperatura del vapor es aproximadamente 121°C suficiente para

matar todas las formas de vida (Roca y Mroginsk, 1991). El mantenimiento de la autoclave, como la limpieza interior es

importante ya que se almacena de tanto uso desperdicio de

materiales esterilizados, se debe lavar con bastante agua y

detergente y enjugar con agua corriente y posterior con agua

21

destilada; luego llenar con agua destilada hasta su nivel y la

autoclave está listo para ser utilizado nuevamente.

3.2.6 Limpieza y desinfección del área de trabajo, instrumentos, recipientes y del investigador en el laboratorio.

Los contaminadores más comunes son las bacterias y las esporas

de hongos que habitan en el ambiente y el polvo que se filtra por las

ranuras de las puertas. Evitar la contaminación con

microorganismos es un aspecto básico que se debe tener en cuenta

para el éxito en el establecimiento de los cultivos y su manipulación.

Área de trabajo. Los equipos como la balanza analítica, el pH

metro, microondas, mesa de trabajo, cámara de flujo laminar,

etc., deben desinfectarse con alcohol etílico de 70° o 96°antes de

realizar los trabajos en el laboratorio. El piso, las estanderias

metálicas y las paredes impregnadas de polvo se deben limpiar y

utilizar alcohol.

Los instrumentos. Los instrumentos de trabajo se deben

esterilizar antes de utilizarlos. Se debe tener en cuenta que los

instrumentos inicialmente estériles pueden contaminarse con

agentes contaminantes del aire, de superficies vegetales mal

desinfectadas, de las manos del técnico, de la exhalación del

investigador; se debe utilizar varios juegos de las mismas

herramientas y mantener la asepsia de las que se ha usado

colocando los instrumentos en alcohol etílico de 70° o 96° de 3 a

4 minutos, luego flamearlas cuidadosamente en el mechero de

alcohol ( de tres a cuatro flameadas). El exceso de flameo hace

que el metal pierda temple y oxide los instrumentos, hay que

tener mucho cuidado con este procedimiento.

El exterior de los recipientes de cultivo. Existe la posibilidad

que durante el tiempo transcurrido entre la esterilización de los

recipientes con los medios de cultivo y el momento de usarlos, se

localizan en su exterior ciertos contaminadores, de tal manera

22

que se mantenga estéril el interior de los frascos, por lo tanto, se

debe flamear obligatoriamente la boca de cada frasco antes y

después de sembrar el explante.

El investigador o técnico de laboratorio. E el principal

contaminador del ambiente del laboratorio. El investigador al

ingresar al laboratorio debe lavarse las manos con bastante agua

y jabón, usar bata limpia de laboratorio, guantes limpios y

mascarilla de boca y nariz, esto al momento de realizar la

siembra de los explantes en la cámara de flujo laminar. Otro dato

importante es que no se debe manipular los frascos en el cuarto

de incubación con las manos sucias, pueden dejar señales de

focos de contaminación al momento de las transferencias a otros

frascos en la cámara de flujo laminar.

3.3 Preparación de medios de cultivo, fase de siembra y método de

siembra La preparación de los medios de cultivo se realizó siguiendo los

protocolos ya establecidos en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de la

empresa CORPORACION G y G E.I.R.L, solo variando la formulación

para cada fase (germinación, multiplicación, enraizamiento). La

formulación tomada para este trabajo fue de un medio de cultivo casero

con insumos como azúcar, complejo B, Bayfolan (fertilizante foliar),

plátano seda, carbón activado y agar; tomado de (Padilla, E., 2008).

23

3.3.1 Medio de cultivo para germinación

La formulación que se utilizó para la primera fase de iniciación o

germinación de las semillas de Cattleya es la siguiente:

Tabla N° 01

Formulación: Germinación

Volumen: 1 litro

Insumos Unidad Cantidad por Litro

Fertilizante Bayfolan (11 – 08 – 06) ml 7.10

Complejo B + Zn ml 3.00

Azúcar blanca g 20.00

Agar g Depende de la marca

Carbón vegetal molido o activado g 2.00

Plátano seda g 40.00

Agua destilada ml 1000.00

pH ------ 5.1 – 5.4

Fuente: Padilla, E., 2008

Figura N° 1. Insumos para la preparación del medio de cultivo casero

24

Protocolo de preparación de medio de cultivo para germinación de Cattleya sp.

Lavar con agua de caño los frascos de vidrio y dejar escurrir el agua

Enjuagar con agua destilada los frascos de vidrio de dejar escurrir el

agua

En un vaso de precipitado de 1 litro, dispensar 700 ml. de agua

destilada

Colocar los 700 ml. de agua destilada en el vaso de una licuadora

Agregar el plátano seda, azúcar, carbón, bayfolan, complejo B

Utilizando una licuadora, licuar los insumos hasta homogenizar la

solución

Colocar el medio licuado en el vaso de precipitado

Enrazar a un litro con agua destilada

Medir el pH del medio

Ajustar el pH con Ácido Clorhídrico (HCl) si el pH del medio esta alto, o

el Hidróxido de Potasio (KOH) si el pH está bajo

Agregar el agente gelatizante

Agitar y dispensar el medio en cada uno de los frascos de vidrio

Tapar con el papel aluminio y papel reciclado y ajustar con hilo pabilo

Autoclavar los frascos conteniendo el medio de cultivo a 15 libras de

presión por 15 minutos a una temperatura de 121°C

Agitar los frascos autoclavados y dejar enfriar a temperatura ambiente

Almacenar los frascos conteniendo los medios semisólidos

3.4 Recolección de material vegetal y pasos a seguir para su introducción a in vitro

Se recolectaron cápsulas en estado óptimo para su siembra, tanto

cápsulas abiertas (dehiscente) y cápsulas cerradas (indehiscente).

3.4.1 Cápsula cerrada (indehiscente)

El procedimiento a seguir es la siguiente:

25

Lavado de cápsula La cápsula se lava con agua corriente y enjuagada con agua

destilada para eliminar impurezas de la superficie.

Desinfección de la cápsula

Se desinfecta con una solución preparada de Hipoclorito de

Sodio al 1% (NaOCl), se sumerge la cápsula en la solución por

20 minutos y luego enjuagada con agua destilada estéril y se

deja escurrir todo el agua, y la cápsula esta lista para ser abierta

al interior de la cámara de flujo laminar con material quirúrgico

estéril.

Figura N° 3. Desinfección de cápsula en Hipoclorito de Sodio

Figura N° 2. Lavado de la cápsula antes de la desinfección con Hipoclorito de Sodio

26

Extracción de la semilla La cápsula desinfectada es abierta con una pinza y un bisturí

sobre una placa Petri estéril, es expuesta la semilla y

espolvoreada sobre otra placa Petri estéril, la semilla extraída se

le agrega agua destilada estéril en mínima proporción con la

finalidad de diseminar uniformemente la semilla al momento de la

siembra.

Figura N° 4. Enjuague de cápsula en agua destilada estéril

Figura N° 5. Cortes con el bisturí a la cápsula para la extracción de las semillas

27

Figura N° 6. Extracción de semillas de la cápsula

Figura N° 7. Agregando agua destilada estéril para diseminar las semillas

28

Siembra La siembra se realiza con una cucharita estéril el cual nos

permite recoger con facilidad las semillas de la placa Petri, se

siembra a razón de 2 a 3 cucharaditas sobre el medio de cultivo

en frascos de 250 ml de capacidad, se tapa con el papel aluminio

y se sella con el parafilm (cinta plástica), se etiqueta el frasco y

está listo el frasco con la siembra.

Figura N° 8. Diseminación de semillas con agua destilada estéril

Figura N° 9. Siembra de semillas diseminadas en agua destilada estéril

29

Incubación Los frascos se colocan en la sala de incubación a una

temperatura de 26°C, es en este lugar donde las semillas

germinan y las plántulas in vitro se desarrollan hasta la etapa

final donde tienen que salir a aclimatación en vivero.

Figura N° 10. Tapado, sellado y etiquetado de frascos sembrados

Figura N° 11. Frascos con siembras en la sala de incubación

30

3.4.2 Cápsula abierta (dehiscente)

Para el trabajo de desinfección de cápsula abierta donde las

semillas estaban expuestas al medio ambiente se utilizó la

desinfección por el método de la jeringa que detallo a continuación:

Para este método se utilizaron jeringas estériles de 20 centímetros y

nuevas adquiridas en las farmacias.

Se extrae en embolo del cuerpo de la jeringa y se introduce un

trozo de algodón al fondo del cuerpo, luego comprimir el algodón

para que quede seguro y firme.

Figura N° 12. Retiro del embolo del cilindro de la jeringa

Figura N° 13. Trozo de algodón comprimido al interior del cilindro de la jeringa

31

Se introduce las semillas al cuerpo de la jeringa.

Se coloca el embolo de la jeringa.

Figura N° 14. Introducción de semillas al cilindro de la jeringa

Figura N° 15. Introducción de semillas más el embolo al cilindro de la jeringa

32

Se succiona la solución de Hipoclorito de Sodio al 0.5% (NaOCl)

y se realiza la desinfección de las semillas agitando

continuamente la jeringa (se realizó tres lavadas).

Las semillas desinfectadas se enjuagan con agua destilada

estéril. El proceso de desinfección y enjuague debe realizarse por

15 minutos y por tres veces.

Figura N° 17. . Enjuague de semillas

con agua destilada estéril

Figura N° 16. Desinfección con Hipoclorito de Sodio

33

Se quita el embolo del cilindro de la jeringa para extraer las

semillas desinfectadas y enjuagadas.

Se quita la aguja hipodérmica del cilindro y utilizando un alambre

se empuja por la boquilla de la jeringa el algodón y así se extrae

las semillas que son colocadas a una placa Petri estéril.

Figura N° 18. Extracción del embolo del cilindro de la jeringa

Figura N° 19. Extracción de semillas del cilindro de la jeringa

34

Se siembra las semillas en los frascos conteniendo el medio de

cultivo, se flamea la boca del frasco de vidrio, se tapa con el

papel aluminio y sella con la cinta plástica.

Figura N° 20. Siembra de semillas en el frasco con medio de cultivo

Figura N° 21. Flameado de boca de frasco para garantizar la esterilidad de la siembra

35

Se etiqueta y se traslada el frasco con la siembra a la sala de

incubación.

Figura N° 22. Tapado con el papel aluminio y sellado del frasco con la cinta plástica

Figura N° 23. Etiquetado de frascos

36

Se hace mención que durante el periodo de prácticas desarrollada en la

empresa, solo se llevó a cabo una etapa del desarrollo in vitro, que fue la

etapa de iniciación (FASE I) o instalación de siembras de Cattleya sp. La

cual menciono a continuación:

Fase de Iniciación o Fase I

Es la etapa o fase de iniciación o de establecimiento, se sembró las

semillas de la Cattleya sobre la superficie del medio de cultivo (medio de

cultivo casero). Es muy importante la observación continua de los frascos

para verificar que no haya, fenolizacion, vitrificación y contaminación, en

caso de que hubiera contaminación se separa los frascos, se autoclava

para matar el agente contaminante y se lava los frascos de vidrio para ser

reutilizados.

Figura N° 24. Frascos con siembras en la sala de incubación

37

IV. BIBLIOGRAFÍAS

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vegetales, Centro Internacional de Documentación e Información

Agrícola, IICA-CIDIA, Costa Rica.

2. Aceves, J. et. al, 1994 “Propagación comercial de plantas ornamentales por

cultivo in vitro de tejidos vegetales para beneficio social de la

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5. Cavero, M. et al., 1991 “Orquídeas del Perú” Centro de datos para la

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Cymbopogon nardus para el control de microorganismos

contaminantes del cultivo in vitro de plantas” Vol. 7, No. 3: 187 – 190.

8. Gutierrez, León y Collantes, 1998 “Manual de Cultivo de Orquídeas” Perú.

9. Khalifah, R. 1966a. Indole-Acetic Acid Front he Developing Banana Fruit.

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38

10. Machado, D. 2003. Orquídeas. Manual práctico de reproduction. Editorial

Expressao e Cultura. Pp: 5 – 9.

11. Oxenham, SK. 2003 “Classification of an Ocimun basilicum germplasm

collection and examination of the antifungal effects of the essential oil

of basil. Glasgow, (University of Glasgow UK PhD thesis).

12. Padilla, E., 2008 Tesis “Evaluación de medios de cultivo para la

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14. Ruíz. 2003 Tesis “Micropropgación y Determiancion Crmosómica del

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39

20. Weatherhead, J.; E. Burdon and G. Henshaw. 1978. Some Effects of

Charcoal as an Additive to plant Tissue Culture Media. Z.

Pflanzenphysiol. 89: 141 – 147.

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– 265.

40

V. ANEXO

41

Anexo N° 01: Fertilizante utilizado para la preparación de medios de cultivo.

Anexo N° 02: Complejo B, utilizado como fuente de vitamina en la preparación de medios de cultivo

42

Anexo N° 03: Rompimiento de testa y desarrollo de embrión de Cattleya rex

Anexo N° 04: Sala de incubación de frascos sembrados con semillas de Cattleya rex

43

Anexo N° 05: Germinación de semillas de Cattleya rex a las pocas semanas de haberlas sembradas en medio casero

Anexo N° 06: Flor de Cattleya rex

44

GLOSARIO

CÁPSULA Fruto seco, con una o más cavidades que contienen varias

semillas y cuya dehiscencia se efectúan según el plano que

no es perpendicular al eje del fruto.

DEHISCENCIA Acción de abrirse naturalmente las anteras de una flor o el

pericarpio de un fruto, para dar salida al polen o a la semilla.

ENRAZAR Agregar, nivelar con agua u otra solución.

EMBRIÓN En las plantas fanerógamas, embozo de la futura planta,

contenido en la semilla.

IN VÍTRO Cultivo en vidrio.

TESTA Cubierta externa de la semilla, derivada del tegumento y de

consistencia y dureza variables.

MICROPROPAGACIÓN Multiplicación masiva en in vitro.

VITROPATÓGENOS Contaminantes por hongos, bacterias y otros en el proceso in

vitro.