Biotecnologia Vegetal Cultivo in Vitro Nutricion Vegetal

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AGROBIOTECNOLOGÍA Biotecnología Vegeta Programa de Biotecnología para América Latina y el Caribe Universidad de las Naciones Unidas Instituto de Ingeniería Genética y Biolog (INGEBI) Ma. Mercedes Rivero http://www.unesco.org/unuoe/unuesp/centros/biolac.htm

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AGROBIOTECNOLOGABiotecnologa VegetalMa. Mercedes Rivero

Instituto de Ingeniera Gentica y Biologa Molecular (INGEBI)

Programa de Biotecnologa para Amrica Latina y el Caribe Universidad de las Naciones Unidashttp://www.unesco.org/unuoe/unuesp/centros/biolac.htm

Biotecnologa Vegetal Cultivo in vitro de clulas, tejidos y rganos micropropagacin mejoramiento de plantas produccin de compuestos de inters comercial produccin de metabolitos secundarios produccin de protenas produccin de polmeros biodegradables establecimiento de plantas transgnicas plantas resistentes a virus plantas con rutas metablicas modificadas plantas mejoradas en cuanto a composicin de protenas, aceites, etc. fitorremediacin remocin de xenobiticos remocin de metales pesados

Sumario

Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales Micropropagacin vegetal Consideraciones tcnicas de la propagacin clonal masiva de plantas Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores Vas morfogenticas: organognesis y embriognesis Sistemas de micropropagacin vegetal Alcances de la propagacin clonal masiva de plantas Referencias

AgrobiotecnologaCultivo de tejidos vegetales

Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales

AgrobiotecnologaCultivo de tejidos vegetales

Principales conceptos fisiolgicos aplicables a los cultivos in vitro

Existen tres conceptos bsicos que fundamentan el cultivo in vitro de clulas y tejidos vegetales:

- Totipotencialidad celular

- Desdiferenciacin / Rediferenciacin

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- Balance de reguladores del crecimiento vegetal

Fundamentos tericos y prcticos del cultivo de tejidos vegetales

La teora de la totipotencialidad celular, enunciada por Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda clula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de diferenciacin alcanzado. Para ello se requieren condiciones especficas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperodo, etc. La desdiferenciacin consiste en la transformacin y prdida de las caractersticas de especializacin de un tipo celular para dar lugar a clulas de tipo meristemtico. El siguiente paso involucrado en la regeneracin de una planta es la rediferenciacin de las clulas previamente desdiferenciadas. Todo proceso de diferenciacin est regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citocininas.

AgrobiotecnologaCultivo de tejidos vegetales

Tcnicas del cultivo de clulas y tejidos vegetales

Micropropagacin vegetal Regeneracin de plantas (embriognesis y organognesis) Cultivo de meristemos Cultivo de suspensiones de clulas vegetales Cultivo de protoplastos Cultivo de anteras Cultivo de vulos y embriones

AgrobiotecnologaCultivo de tejidos vegetales

Micropropagacin vegetal

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La micropropagacin constituye la principal aplicacin comercial del cultivo de tejidos vegetales

La micropropagacin vegetal, o propagacin clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtencin y cultivo de plantas a gran escala. Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sinttico nutritivo y con control de temperatura, luz y fotoperodo.

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Consideraciones tcnicas de la propagacin clonal masiva de plantas

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La micropropagacin vegetal requiere disponer de una infraestructura mnima especializada y de condiciones controladas de cultivo

Laboratorio- Area de preparacin de medios. - Area de lavado y esterilizacin. - Cuarto estril. - Cmara de cultivo. - Area de rusticacin.

Material vegetal- Plantas madres seleccionadas (pre-acondicionamiento). - Explantes (eleccin, diseccin, esterilizacin, etc.).

Condiciones de cultivoAgrobiotecnologaCultivo de tejidos vegetales

- Asepsia. - Recipientes. - Temperatura. - Luz y fotoperodo.

Medios de cultivo: composicin general

Compuestos inorgnicos Macronutrientes: NO3- , PO43- , K+, Ca2+, Mg2+, SO42Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn+, Mn2+, Mo2+, Co2+, ICarbohidratos Sacarosa, glucosa, mio-inositol Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina Acido nicotnico (C) Biotina Aminocidos Glicina

Reguladores del crecimiento Auxinas Citocininas Giberelinas Soporte inerte (medios semislidos) Agar (0,7 a 1%) Gelrite pH 5,6 5,8 Esterilizacin 1 atmsfera, 15 a 20 minutos en autoclave

Formulacin bsica de un medio de cultivo para tejidos vegetales

Soluciones concentradas de macroelementos (100x) Soluciones concentradas de microelementos (100x) Vitaminas grupo B (500 1000x) Mio-inositol (100 mg/L) Azcares: Generalmente sacarosa o glucosa en concentraciones de aproximadamente 30 g/L. Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso molecular extrado a partir de algas. Se usa entre

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5 y 10 g/L

Propiedades fsicas de los medios de cultivo

Semislido Consistencia del medio Lquido El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las caractersticas del medio de cultivo (lquido o semi-slido). En el caso de un medio slido, la concentracin y calidad del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.). El cultivo en medio lquido resulta imprescindible cuando la propagacin in vitro es desarrollada a travs de las siguientes vas:

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- Induccin de embriognesis*. - Cultivo de protoplastos. - Cultivo de suspensiones celulares.*tambin en medio semislido

Propiedades fsicas de los medios de cultivo

Intercambio gaseoso:Los recipientes de cultivo se tapan con una pelcula de polietieleno (Resinite ) para posibilitar el intercambio de gases. La organognesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado. - La induccin de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente oxgeno. - La acumulacin de etileno puede inhibir la regeneracin de brotes.

pH:- Constituye un factor crtico. - Se ajusta en el rango 5,5 5,8. - Se modifica durante el crecimiento de los cultivos.

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Composicin de medios de cultivo comnmente usados

Composicin de medios de cultivo comnmente usados

Reguladores del crecimiento comnmente usados en los medios de cultivos vegetales

Reguladores del crecimiento

Grupos bsicos de reguladores del crecimiento: - Auxinas - Citocininas - Giberelinas - Acido abscsico - Etileno Generalidades: - Actan a bajas concentraciones - Interactan unos con otros (los resultados estn determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas). - Los reguladores endgenos del crecimiento estn presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentracin flucta. Su concentracin relativa vara en funcin del estado fisiolgico de la planta y en cada uno de los rganos de sta. - Estn involucrados en numerosos procesos fisiolgicos.

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Auxinas: estos compuestos se emplean bsicamente como promotores de la proliferacin celular y la induccin de la morfognesis

O OH N

Acido indol actico (AIA) (auxina endgena)

Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero qumico responsable de la elongacin y de la respuesta fototrpica del coleptilo de gramneas. - Alargamiento y divisin celular - Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formacin de races adventicias - Dominancia apical - Accin herbicida - Estimulacin de la produccin de etileno Se sintetizan en las yemas, las hojas jvenes, los frutos y en el embrin. La concentracin endgena en la planta vara entre 0,001 y 0,1 mgKg-1.

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Su transporte es polar Auxinas sintticas: - Acido indol butrico (IBA) - Acido naftalen actico (ANA) - 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D)

Citocininas: en combinacin con las auxinas, determinan diferentes respuestas morfogenticas

Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la divisin celular in vitro. Estn involucradas en variadas respuestas fisiolgicas: - Promocin de la divisin celular - Promocin de la organognesis (relacin auxinas/citocininas) - Retardo de la senescencia - Sntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos Citocininas endgenas: - Zeatina (Zea) - Isopenteniladenina (2iP) Citocininas sintticas: - Cinetina (Kin) - Benziladenina (BAP)

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Se sintetizan en el embrin y las races; se encuentran en todos los tejidos. La concentracin endgena en plantas vara entre 0,1 y 500 gKg-1. Su transporte es no polar.

Estructura qumica de las principales citocininas

Las giberelinas se utilizan para favorecer el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes de novo

Acido giberlico (GA3)

Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo. El cido giberlico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas. Algunos efectos mediados por las giberelinas son:- Promocin del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales - Crecimiento de yemas latentes - Germinacin de semillas en dormancia - Floracin - Movilizacin de reservas en la semilla.

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Se sintetizan en hojas jvenes, yemas y en el embrin. Su transporte no es polar.

Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores

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Etapas de la micropropagacin vegetal

Iniciacin- Eleccin y fitoacondicionamiento de la planta madre - Eleccin del explante inicial y de la formulacin del medio de cultivo - Desinfeccin superficial de los explantes - Establecimiento del cultivo in vitro

Multiplicacin- Multiplicacin del material stock

Enraizamiento- Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro

Rusticacin- Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones de maceta o a campo

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Existen dos Posibles vas morfogenticas: posibles vas morfogenticas - Organognesis implicadas en la diferenciacin de - Embriognesis novo Diferencias entre las dos posibles vas: de brotes y/o plantas completas - La organognesis es de origen pluricelular. Un grupo ocluster de clulas del explante inicial se desdiferenca inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un rgano vegetal. No se obtienen por esta va plantas completas directamente. - La embriognesis se presupone de origen unicelular. Una clula del explante se asla y constituye el punto de partida para la obtencin de un embrin somtico. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrin cigtico. El resultado es una planta completa.

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Etapas implicadas en el protocolo de micropropagacin de una especie vegetal

Eleccin de una planta madre selecta ExplantesETAPA 1

Desinfeccin superficial Establecimiento en medio de cultivo apropiado Transferencia a un medio de multiplicacinETAPA 2

Formacin de brotes o embrioides Transferencia a un medio para el enraizamiento de los brotes Pasaje a maceta en un invernadero

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ETAPA 3

ETAPA 4

Eleccin del explante inicial

Los explantes deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo

Protocolo tipo de esterilizacin superficial de material vegetal:- Etanol 70%, entre 5 y 10 segundos. - Solucin de hipoclorito de sodio (NaCIO) al 5 a 20%, entre 5 y 30 min Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diludas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%. - Enjuagues con abundante agua estril (4 5 veces).

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- En el caso del HgCl2, el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difcil de eliminar.

Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro

Vas morfogenticas: organognesis y embriognesis

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Propagacin vegetativa por embriognesis somtica

Embriognesis: Obtencin de semillas artificialesSemillas sintticas de orqudea obtenidas por encapsulacin en alginato

Sistemas de micropropagacin vegetal

Sistemas de micropropagacin vegetal Proliferacin de yemas axilares o apicales

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Propagacin vegetativa a partir de yemas preexistentes

Proliferacin de yemas apicales o axilares- Consiste en la multiplicacin de plantas a partir de las yemas axilares preexistentes. Representa la aceleracin in vitro del crecimiento natural de dichos meristemos. - La tasa de multiplicacin (t.m.) se calcula con base en el nmero de brotes o vstagos obtenidos a partir de un explante inicial, entre una resiembra y otra sucesiva. Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestin, entre otras variables. - Por ejemplo, con una t.m. de 5/mes podran obtenerse 10.000.000 plantas en un solo ao, a partir de una nica yema inicial.

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- El cultivo de meristemos es un caso especial del uso de esta tcnica.

Sistemas de micropropagacin vegetal Proliferacin de tejidos desdiferenciados

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Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados in vitro

Consideraciones generales:- Callo: masa de clulas desdiferenciadas obtenidas a partir de un explante cultivado in vitro (disco de hoja, meristemo, clulas en suspensin, etc.) - Es posible regenerar brotes o vstagos a partir de estos callos. - Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagacin clonal a gran escala.

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Sistemas de propagacin vegetativa in vitro directa e indirecta

Regeneracin

Sistemas de propagacin vegetativa in vitro

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Sistemas de micropropagacin vegetal Cultivo de meristemos

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Los meristemos son grupos de clulas indiferenciadas que retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta

Los meristemos determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes rganos

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Posibilitan la micropropagacin de diferentes especies vegetales. Constituyen el explante ideal para liberar de patgenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos y/o bacterias. Son ampliamente utilizados como explantes para la criopreservacin y conservacin de germoplasma.

En el cuerpo de una planta se reconocen diferentes tipos de meristemas

Meristemos apicales- Estn localizados en la porcin terminal o distal del vstago y de la raz. - Sus divisiones dan lugar a las clulas de los tejidos pimarios del tallo y la raz. - Son organognicos. - Determinan el crecimiento en largo de tallos y races.

Meristemos secundarios- Determinan el crecimiento radial de los rganos vegetales. - Dan lugar a los tejidos de conduccin.

Meristemos florales- Derivan de la transformacin de meristemos apicales. - Se limitan a la produccin de rganos florales. AgrobiotecnologaCultivo de tejidos vegetales

Meristemos intercalares- En el curso del desarrollo de la planta, persisten restos de los meristemos apicales intercalados en los tejidos maduros. - Determinan el crecimiento en largo de tallos y races

El empleo de los meristemos como explantes del cultivo in vitro constituye una posible herramienta para el saneamiento de plantas infectadas

Cultivo de meristemas

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El cultivo de meristemos facilita la eliminacin de patgenos

- El domo meristemtico no est vascularizado (muchos patgenos se translocan por los tejidos de conduccin). - El nmero de partculas virales es menor en los meristemos que en otros tejidos (White, 1934). - La velocidad de divisin celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicacin de un virus. - Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemos fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia.

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Aspectos Asp tcnicos del cultivo de meristemas

Equipamiento- Elementos generales para cultivo in vitro. - Lupa estereoscpica. - Instrumental de diseccin.

Etapas del cultivo- Eleccin del explante: escencialmente meristemos apicales de vstago. Domo meristemtico desnudo o acompaado por 2 3 pares de primordios foliares. Tamao aproximado 0,5 mm. - Esterilizacin de la yema o porcin apical del vstago conteniendo al meristemo propiamente dicho. - Diseccin del meristemo bajo lupa. Eliminacin de las primeras hojas. - Transferencia del explante al medio de cultivo semi-slido.AgrobiotecnologaCultivo de tejidos vegetales

- Regeneracin de yemas axilares. Subcultivo a medio sin hormonas para la obtencin de plantas completas. - Propagacin del material (a partir de estacas uninodales, etc.) - Rusticacin.

Consideraciones prcticas sobre el cultivo de meristemos

La eficiencia del cultivo de meristemos como procedimiento para la obtencin de plantas sanas depender del tamao del explante. Existe una situacin de compromiso entre el tamao mnimo posible del meristemo y su capacidad de desarrollar y prosperar durante el cultivo in vitro. Ejemplos prcticos:- Frutilla (Fragaria sp) / patgeno?: Explantes de 0,22 mm; 100% de plantas sanas. - Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus X: Explantes de 0,1 mm (o menor); 10% de plantas sanas. Si el explante incluye 2 pares de primordios el % de plantas sanas es menor.

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- Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus Y o V: Se obtienen altas eficiencias de saneamiento cultivando explantes de no ms de 2 pares de primordios foliares.

Alcances de la micropropagacin vegetal

Propagacin vegetativa rpida y a gran escala Uniformidad seleccionada del material clonado Multiplicacin de plantas recalcitrantes a las tcnicas convencionales Reduccin en el tiempo de multiplicacin y en el espacio requerido para tal fin Mayor control sobre la sanidad del material propagado Introduccin rpida de nuevos cultivares

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Conservacin de germoplasma Facilidades para el intercambio internacional de material vegetal