Cromatografia Papel- Capa Fina[1]

UNIVERSIDAD DE LOS ANDESFACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE QUIMICACOORDINACIÓN LABORATORIOS QUÍMICA ORGÁNICA

LABORATORIO DE QUÍMICA ORGÁNICA I - A

Prof: Jorge Uzcátegui Nava

CROMATOGRAFIA SOBRE PAPEL

1.- INTRODUCCIÓN. PRINCIPIOS GENERALES.

La cromatografía puede definirse como la técnica de separación de una mezcla de solutos en solución,

basándose en las diferentes velocidades con que se mueven cada uno de los componentes de la mezcla a

través de un medio sólido poroso insoluble, inorgánico u orgánico, mas o menos finamente repartido,

arrastrados por un disolvente en movimiento.

Como mecanismos fundamentales han de tenerse en cuenta el reparto entre dos fases líquidas, así como la

unión reversible de los distintos solutos que se desplazan sobre la superficie de un adsorbente. Si en el último

caso se trata principalmente de interacciones superficiales físicas, se habla de cromatografía de adsorción.

2.- CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL.

La cromatografía sobre papel es una de las técnicas cromatográficas más simples y de las más antiguas. Como

su nombre lo indica, la separación se realiza sobre tiras u hojas de papel de filtro especialmente elaborado para

fines cromatográficos.

La cromatografía sobre papel es bastante similar a la cromatografía de capa fina (TLC), respecto a la aplicación

de las técnicas experimentales. La fase estacionaria en este tipo de cromatografía es una capa de agua

absorbida entre las fibras del papel.

Los principios teóricos de la cromatografía sobre papel, están estrechamente relacionados con los de la

extracción. La cromatografía sobre papel es en realidad una técnica de partición líquido - líquido, antes que una

técnica de partición sólido - líquido, en la cual la separación de una mezcla de sustancias está basada en el

reparto o distribución de los diferentes componentes entre la fase móvil (disolvente) y la fase estacionaria

(agua, en este caso), soportada sobre un sólido adecuado.

A pesar de que el papel, consiste principalmente de celulosa, ésta no funciona como fase estacionaria. La

celulosa es un producto natural obtenido generalmente a partir del algodón. Es un polímero de glucosa, por lo

que posee una gran cantidad de grupos hidroxilo y además, una microestructura muy complicada.

En el caso de la cromatografía sobre papel, la fase estacionaria tal como se mencionó anteriormente, es el

agua, la cual se encuentra siempre presente ( 20 % en peso) entre las fibras del papel, que actúan como

soporte de la fase estacionaria.

Para asegurarse que la celulosa esté siempre saturada con agua es frecuente usar como solventes de

desarrollo (fase móvil), aquellos que contengan entre sus componentes el agua, es decir, un disolvente

inmiscible con el agua, generalmente un disolvente orgánico saturado con agua.

¿Qué sucede exactamente en una cromatografía sobre papel ?

Laboratorio de Química Orgánica I-A. Cromatografía sobre papel y capa fina 1

11




¿Por qué razón(es) un número determinado de componentes de una mezcla que han sido aplicados en

principio en el mismo punto, se mueven a diferentes distancias a lo largo de la distancia del papel, originando

manchas discretas coloreadas o no en el cromatograma final ?

A medida que el solvente se mueve y arrastra consigo las sustancias aplicadas, comienzan a operar dos

conjuntos de fuerzas opuestas; las fuerzas propulsoras y las fuerzas retardantes.

Las fuerzas propulsoras actúan para hacer mover las sustancias desde su punto de origen y desplazarlas en la

dirección del flujo del solvente. Las fuerzas retardantes actúan para impedir el movimiento de las sustancias

arrastrándolas fuera del solvente de flujo y de regreso al papel. La distancia desde el origen que realmente

viaja una sustancia en un tiempo determinado es la resultante de estos dos conjuntos de fuerzas.

2.1.- FUERZAS PROPULSORAS.-

A medida que se corre un cromatograma, comienzan a funcionar las dos principales fuerzas propulsoras a

saber: el flujo del solvente y la solubilidad de cada sustancia en el solvente.

2.1.1.- FLUJO DEL SOLVENTE:

Excluyendo otros factores, cuando un solvente fluye sobre la aplicación de una mezcla determinada, tiene la

propiedad de arrastrar consigo todos los solutos presentes. Si una sustancia que está siendo cromatografiada

es completa e instantáneamente soluble en el solvente en movimiento, por ejemplo: azúcar en agua, y además

de este factor no actuarán fuerzas retardantes, esta se moverá con el frente del solvente hasta el punto más

lejano que pueda alcanzar el solvente.

En forma alternativa, si la sustancia es completamente insoluble en el solvente, por ejemplo: azúcar en acetato

de etilo, esta permanecerá en el origen. El flujo de solvente, es el mismo para todas las sustancias en el

cromatograma. Obviamente entonces, si el solvente es uno en el cual se disuelven todos los componentes de la

mezcla aplicada en forma completa e instantánea, estos se moverán juntos con el frente del solvente y

finalizarán como empezaron: aún mezclados. El resultado neto es que no habrá separación, siempre y cuando

este factor actuará sólo y separado del resto de las fuerzas en juego.

2.1.2.- SOLUBILIDAD:

La solubilidad de una sustancia en un solvente determinado, es una propiedad intrínseca de su estructura

química. Por lo tanto, se puede afirmar que muy pocas sustancias presentan idénticas solubilidades en un

solvente particular. La solubilidad de cualquier sustancia en el solvente de flujo es la fuerza propulsora que

tiende a desplazar la sustancia sobre la superficie del papel y mantenerla moviéndose a lo largo de este con el

solvente.


22




Si se mantienen constantes todas las demás variables, tendremos entonces que, mientras más soluble sea una

sustancia en el solvente de flujo, más rápidamente se moverá esta a lo largo del papel.

De esta manera, los componentes más solubles de una mezcla aplicada sobre un papel, tenderán a alejarse de

las menos solubles y separarse de acuerdo a las diferencias de solubilidades en el solvente particular. Por lo

tanto, los solventes deben escogerse de tal manera que induzcan la mayor diferencia de solubilidad entre los

componentes de una mezcla a ser separada.

2.2.- FUERZAS RETARDANTES.

Existen dos fuerzas principales de este tipo a saber: adsorción y partición.

2.2.1.- ADSORCIÓN:

La celulosa, posee propiedades adsortivas. Las sustancias aplicadas sobre el papel de cromatografía pueden

ser más o menos adsorbidas por este. La adsorción es una propiedad reversible y la celulosa gradualmente

liberará más sustancia hacia el solvente a medida que este fluya sobre la aplicación. La adsorción es una

fuerza diferencial, es decir, algunas sustancias serán más fuertemente adsorbidas que otras, permitiendo de

esta manera que la liberación de sustancias desde el punto de aplicación varíe de una sustancia a la otra.

A medida que el cromatograma se desarrolla, las sustancias que se adsorben más fuertemente se retienen

más, mientras que aquellas que se adsorben menos se moverán una distancia mayor que las primeras.

2.2.2.- PARTICIÓN:

Superficialmente la cromatografía sobre papel parece involucrar el paso de un solvente (líquido) sobre un

sólido compuesto de fibras de celulosa. De hecho, la cromatografía sobre papel depende en una gran medida

de la presencia de dos fases líquidas inmiscibles entre sí. Una, es obviamente, la fase móvil.

La otra, la fase acuosa presente en el papel de cromatografía. Cuando una sustancia que es soluble en dos

solventes no miscibles, se pone en contacto simultáneamente con ambos, esta se repartirá entre ellos. La

cantidad que se encuentra en cada solvente dependerá de la solubilidad relativa del soluto en cada solvente. El

grado de reparto o partición en el equilibrio se conoce como el coeficiente de reparto o relación de distribución.

En la auténtica cromatografía de partición, el único factor que influye en la migración de un compuesto a lo

largo del papel es la solubilidad relativa de éste en la fase móvil y en la fase estacionaria.

A medida que el solvente de desarrollo asciende sobre el papel, los componentes de una mezcla a separar que

son solubles sólo en la fase móvil (el disolvente) emigrarán a la misma velocidad que la parte frontal de ésta,

mientras las que son solamente solubles en la fase estacionaria (agua) permanecerán en el punto de origen de

la cromatografía.


33




Es muy importante recordar que el reparto de una sustancia entre dos fases inmiscibles no se afecta por la

presencia de otras sustancias disueltas, si se asume un comportamiento ideal.

Las sustancias que exhiben alta solubilidad en agua o en su defecto, aquellas que poseen la más alta

capacidad para enlazarse mediante la formación de puentes de hidrógeno, son las que se retienen más

fuertemente y por lo tanto se mueven más lentamente.

La cromatografía sobre papel se aplica para separar mezclas de compuestos altamente polares o para aquellos

que presentan múltiples grupos funcionales en su estructura, tales como por ejemplo: azúcares, amino-ácidos

y, pigmentos naturales entre otros.

2.3.- PROCESO DE PARTICIÓN LIQUÍDO-LÍQUIDO.

En su forma básica, un sistema de partición y las fuerzas que gobiernan su operación son mucho más

simples que las de un sistema de adsorción. Está constituido por dos líquidos que son parcialmente miscibles

uno en el otro. Debido al requisito de inmiscibilidad, uno de los líquidos tenderá a ser mucho más polar que el

otro.

Cualquiera de los dos líquidos puede ser un solvente puro o una mezcla de complejidad considerable. Los

factores que dictan si un soluto permanece en la fase estacionaria o si se mueve conjuntamente con la fase

móvil, estarán supeditados a las diferencias de solubilidad del soluto en las dos fases.

La extensión a la cual un soluto se distribuye entre dos líquidos puede medirse en un embudo de separación.

Tales mediciones, producen constantes conocidas como coeficientes de partición o reparto. Si un soluto A se

disuelve en dos disolventes B y C, se distribuye entre ellos de acuerdo con la siguiente ley:

Por ende, entonces, podemos decir en forma general que los materiales que tienen diferentes

coeficientes pueden ser separados. Aquellos solutos que son más solubles en la fase móvil se moverán más

rápido que aquellos que son menos solubles y los solutos que son más solubles en la fase estacionaria

tenderán a moverse más lentamente que aquellos que son menos solubles.

Consideraremos como ejemplo típico la separación de una mezcla de sustancias sobre una tira de papel de

filtro. Se sabe que el papel de filtro está formado por numerosas fibras de celulosa que portan un cierto

porcentaje de humedad. Podemos considerar que las partes individuales de cada fibra, junto con su humedad

asociada, constituyen hipotéticas “células” elementales.

La separación se lleva a cabo al repartirse las sustancias entre la humedad de las células y el flujo de disolvente

entre ellas. El agua de las células permanece estacionaria, mientras que el disolvente circula sobre ellas.

Debido a esto, a las células se las llama fase estacionaria, mientras que al disolvente se le denomina fase

móvil.

Podemos ilustrar mejor estos principios haciendo referencia a un ejemplo. Consideremos que una mezcla de

dos compuestos, A y B (cuyo coeficiente de reparto entre las fases estacionaria y móvil son 2:1 y 1:2,


44




respectivamente, es decir, A es relativamente más soluble en agua), que se aplican en el origen de una

cromatografía de papel.

La figura 1 representa un diagrama del corte longitudinal del papel, que contiene la mezcla disuelta en el agua

de una célula en el origen. Por conveniencia se puede considerar que el reparto tiene lugar entre volúmenes

iguales de la fase en movimiento y estacionaria. En la figura, las moléculas del compuesto A están

representadas por círculos negros, y las de B, por cruces.

FIGURA 1

Cuando el disolvente penetra en la célula (esto ocurre cuando comienza la separación), las dos

sustancias se repartirán de acuerdo con la ley de reparto, especificada anteriormente.


55




El disolvente conteniendo una cierta cantidad de mezcla correrá a lo largo del papel y encontrará otra célula

que contiene sólo agua, mientras que el disolvente puro se pone en contacto con la primera célula (figura 1,c) y

tendrá lugar en ella un nuevo reparto (fig. 1,d).

Este proceso se conoce como distribución en contracorriente continua, en tanto que el disolvente avance a lo

largo del papel. La figura 1e representa la distribución de A y B en el papel después de haber tenido lugar la

separación. Es obvio que los dos componentes ya han comenzado a separarse. En la práctica este proceso se

repite múltiples veces, dando, eventualmente, una separación eficaz. Haciendo una similitud con el proceso de

extracción líquido - líquido, podemos afirmar que en la multitud de pequeñas celdas formadas por las micelas

del papel, la separación tiene lugar igualmente como si se dispusiera de extracciones sucesivas. La

cromatografía que resultará de la anterior separación se representa en la figura 2.

A se encontrará a un tercio de la distancia entre el origen y el frente del disolvente, mientras que B estará a dos

tercios de esta distancia.

Uno de los aspectos más importantes de la cromatografía es que, en un sistema cromatográfico dado, el

movimiento relativo de un compuesto con respecto al frente del disolvente es una propiedad característica y

reproducible. En el caso de las cromatografías de papel y capa fina se expresa el movimiento de un compuesto

como un valor de Rf.

Este valor, es una constante característica y constante de cualquier sustancia para un sistema

cromatográfico dado. En la cromatografía sobre papel y capa fina los valores de R f se expresan mediante la

ecuación:


66




Para el caso estudiado tendremos:

Rf(A) = a/x , Rf(B) = b/x

a.- distancia recorrida por la sustancia A, la cual se mide desde el punto de aplicación al centro de la mancha.

b.- distancia recorrida por la sustancia B, la cual se mide desde el punto de aplicación al centro de la mancha.

x.- distancia recorrida por el frente del solvente.

2.2.- PROCEDIMIENTO GENERAL

El papel de filtro comúnmente utilizado (Whatman N 1), está formado por celulosa con un 22%

aproximadamente de agua absorbida (unida por puente de hidrógeno; unas dos moléculas aproximadamente

por cada unidad C6H1005).

La técnica es simple: un volumen pequeño ( 1 l) de solución de la mezcla a separar se aplica sobre el papel

(hoja, tira o disco), en un lugar próximo a un extremo (o al centro si es un disco), y se seca. Una vez que la

aplicación éste seca, se introduce el papel en un recipiente que contenga un solvente adecuado que ha de

usarse como fase móvil. En este punto, el nivel del solvente en el recipiente no deberá cubrir el punto aplicado.

El solvente recorrerá el papel por capilaridad (ascendente, descendente u horizontal). A medida que el solvente

se desplaza, los componentes de la mezcla se separan en manchas individuales en la dirección del flujo de

acuerdo al grado de interacción que tendrá cada componente con la fase estacionaria. Cuando el solvente

alcance el otro extremo del papel, se saca el cromatograma, se marca con lápiz el frente del solvente y se

seca.

Los componentes de la mezcla que se separan pueden ser detectados mediante el uso de procedimientos

químicos (reactivos especialmente preparados) o físicos (luz U.V), dependiendo de la naturaleza de las

sustancias separadas, los cuales a continuación se delinean con un lápiz. El cromatograma así desarrollado

está en condiciones de ser analizado.

Las figuras que se muestran a continuación representan :

a.- una tira de papel en la que se aplicó la muestra.

b.- el desarrollo del cromatograma.

c.- el cromatograma obtenido.

2.3.- ETAPAS PARA REALIZAR UNA CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPELLaboratorio de Química Orgánica I-A. Cromatografía sobre papel y capa fina 7

77




2.3.1.MUESTRAS PARA CROMATOGRAFÍA:

Las muestras se aplican siempre sobre el papel en forma de solución. Para esto, los sólidos se disuelven en

una pequeña cantidad de un solvente adecuado. Las soluciones puras pueden aplicarse directamente, pero los

extractos preparados de tejidos biológicos requieren frecuentemente una purificación preliminar con el objeto

de eliminar las proteínas y sales presentes en el extracto, las cuales interfieren en el proceso de separación

Existen varios métodos para eliminar sustancias que pueden considerarse indeseables.

Los lípidos pueden extraerse con disolventes orgánicos; las proteínas pueden precipitarse con alcohol y, las

sales se eliminan con resinas de intercambio iónico o por métodos electrolíticos.

Las cantidades de sustancias requeridas son del orden de 0,1 a 50 g para la mayoría de los compuestos.

2.3.2.APLICACIÓN DE LAS MUESTRAS SOBRE EL PAPEL.

Antes de proceder a la aplicación de las muestras, se selecciona el tamaño y la calidad del papel a ser

usado. A continuación se deberá determinar la orientación de la fibra del papel escogido, lo que se logra,

colocando una gota de agua en un extremo del papel y notando la dirección hacia donde se dirige la curvatura

más ancha de la elipse.

Seguidamente se traza una línea paralela con un lápiz de grafito por el lado que se iniciará la cromatografía, la

cual resultará perpendicular al eje de orientación de la fibra.

A intervalos de 1,5 a 2 cm aproximadamente se marca sobre la línea un número de cruces pequeñas

correspondientes a cada una de las muestras que se han de aplicar sobre el papel y, se señala cada muestra

para poder identificarla.

Las muestras se aplican sobre el papel mediante una micropipeta, un capilar muy fino o un hilo de platino. Las

manchas de las muestras aplicadas sobre el papel deben tener un diámetro máximo de 5 mm, puesto que,

manchas de diámetro mayores conducen a separaciones de peor resolución. La aplicación del capilar en un

solo punto del papel conduce a la obtención de manchas de un tamaño pequeño.

Cuando la solución a cromatografiar se encuentra muy diluida, se deberá hacer varias aplicaciones, secando la

mancha después de cada aplicación.

Esta misma operación se realiza cada vez que estemos interesados en que existan varias muestras en una

sola mancha. La mejor manera de secar las manchas es con un secador de pelo.

Cuando se desea separar una cantidad apreciable de compuestos de una mezcla determinada (cromatografía

preparativa), las muestras deberán aplicarse varias veces en forma de raya continua.

Una vez que las manchas sobre el papel se han secado, ya estará preparado el cromatograma para su

desarrollo. Se puede definir desarrollo al proceso físico mediante el cual un disolvente fluye a través del papel

produciendo la separación.


88




2.3.3.ELECCIÓN DEL SOLVENTE.

El solvente a usar depende de las sustancias que se han de separar. La elección proviene de la experiencia.

Los solventes para la cromatografía de reparto sobre papel se pueden preparar por simple saturación con agua

de un solvente orgánico, tal como el n-butanol.

Comúnmente se adicionan pequeñas cantidades de ácidos, bases o agentes acomplejantes, como por

ejemplo: ácido acético o fórmico, piridina y solución de amoníaco, los cuales permiten aumentar la solubilidad

de algunos compuestos en la fase móvil y disminuir la de otros. Los disolventes ternarios se utilizan muy

ampliamente algunos de estos solventes son: n-butanol : etanol : amoníaco en las proporciones 3:1:1, agua

destilada: etanol: solución acuosa saturada de sulfato de amonio (15:3:2); acetona : agua destilada: ácido

clorhídrico concentrado (17:1:2)

2.3.4.- DESARROLLO DEL CROMATOGRAMA.

El desarrollo se puede realizar por alguna de las siguientes técnicas:

a.- Ascendente: si el solvente sube por el papel,

b.- Descendente: si el solvente desciende por el papel,

c.- Horizontal: si el solvente se desplaza sobre el papel colocado en forma horizontal.

La elección de una de éstas técnicas es cuestión de decisión personal, ya que, los resultados que se obtienen

son similares.

En caso de compuestos que tienen muy poco recorrido sobre el papel, se recomienda usar la técnica

descendente con el fin de que el solvente corra fuera del papel debido a la gravedad, con lo que es posible

aumentar considerablemente la longitud del recorrido y, de ésta manera conseguir mejores separaciones.


99




2.3.4.1.- TÉCNICA ASCENDENTE:

En ésta técnica, el solvente se coloca en el fondo de la cubeta cromatográfica que puede ser un recipiente

especialmente diseñado o en su defecto un vaso de precipitados, o un cilindro graduado de tamaño adecuado

y el papel se suspende mediante algún artefacto colocado en la parte superior del recipiente escogido, tal como

un gancho o un clip (ver figura), teniendo el cuidado de que el nivel del solvente en el recipiente cromatográfico

toque la parte inferior del papel, pero que sin embargo, no esté por encima del nivel de las manchas aplicadas

sobre el papel. También se puede enrollar el papel en forma de cilindro juntando los extremos mediante hilo o

grapas.

En el caso de que se trate de un cilindro de papel, éste deberá ser colocado en el fondo de la cubeta

cromatográfica, teniendo precaución de que el nivel del solvente en la cubeta no sobrepase la altura de las

manchas aplicadas. La cuba cromatográfica deberá cerrarse lo más herméticamente posible, haciendo uso de

una tapa especialmente diseñada para la cubeta cromatográfica o con un vidrio de reloj de un diámetro

superior al de la boca del vaso de precipitado usado como la cuba cromatográfica.

2.3.4.2. TÉCNICA DESCENDENTE.

En este tipo de técnica el depósito del solvente se coloca en la parte superior de la cubeta y se llena con el

solvente adecuado. En el fondo de la cubeta se coloca también un poco de solvente para asegurarse que la

atmósfera del interior se encuentre saturada con los vapores del mismo. El papel preparado como se indicó

anteriormente, se suspende en el solvente y se tapa herméticamente la cubeta. El papel se sujeta al fondo del

depósito mediante una varilla de vidrio y a continuación se pasa sobre otra varilla que esté a una altura

ligeramente superior al nivel del líquido, para evitar que éste sifone.

2.3.4.3.- TÉCNICA HORIZONTAL.

Se usa papel cortado en forma de disco. La cubeta cromatográfica la constituye dos cápsulas de petri. El

solvente se coloca en un recipiente ubicado en el centro de una cápsula de petri. El disco de papel se apoya en

el recipiente que contiene el solvente y, éste se hace llegar al papel mediante una mecha de papel, un hilo o un

tubo capilar. El disolvente fluirá entonces en forma radial.


1010




2.3.5- SECADO DEL PAPEL.

Cuando el solvente ha recorrido más de dos tercios de la longitud del papel o la longitud requerida de acuerdo

a las premisas del procedimiento, se procede a sacar el papel de la cubeta cromatográfica, se marca el

frente del solvente con un lápiz. El papel se seca colocando el cromatograma en una estufa a 100C, o con

un secador de pelo eléctrico. Una vez seco ya está el papel listo para la localización (revelado) de los

productos.

2.3.6.- LOCALIZACIÓN O REVELADO DE LAS SUSTANCIAS EN EL

CROMATOGRAMA.

Cuando el papel está seco, es necesario localizar la posición de las manchas sobre el papel. Si las sustancias

son coloreadas, esto no representa mayor dificultad pues pueden detallarse visualmente muy fácilmente. Sin

embargo, la gran mayoría de los compuestos son incoloros y por consiguientes invisibles a la vista humana. La

visualización de las manchas puede realizarse por dos métodos generales;

2.3.6.1. Métodos Físicos: utilizan propiedades particulares de los compuestos, tales como la

fluorescencia y la radiactividad. Son de aplicabilidad limitada y tienen la ventaja de que las sustancias no sufren

transformaciones y pueden recuperarse para estudios posteriores. El método más generalmente usado es

hacer reaccionar las sustancias a revelar con algún agente químico con el que formen un compuesto

coloreado.

2.3.6.2.- Fluorescencia: muchos compuestos orgánicos no saturados presentan fluorescencia debido

a la propiedad de absorber las radiaciones ultravioletas y emitir radiaciones de mayor longitud de onda (región

visible del espectro). Estos compuestos, aunque invisibles en el cromatograma a la luz ordinaria pueden

detectarse con una lámpara de luz ultravioleta. La longitud de onda emitida, y por consiguiente, el color que

presenta, es característica del compuesto y se usa como método de identificación.

2.3.6.3.- Radioactividad: Hoy día es posible trabajar con compuestos radioactivos; la localización de

las manchas de compuestos radioactivos puede hacerse mediante un contador especial. Las manchas

localizadas se delinean con un lápiz de grafito, para disponer de una localización permanente sobre el papel.

2.3.6.4.- Métodos Químicos: los compuestos incoloros sobre papel pueden visualizarse

haciéndolos reaccionar con algún reactivo específico para formar compuestos coloreados. El reactivo se

denomina revelador. Este puede ser gaseoso (H2S para revelar iones metálicos), liquido o sólido (se emplean

en forma de soluciones diluidas).


1111




Las soluciones del revelador se pueden rociar sobre el papel (técnica del rociado) o se puede sumergir el

cromatograma en un baño de la solución reveladora (técnica de bañado). En algunos casos es necesario usar

varios reveladores, para lo cual se deberá secar el papel antes de la aplicación de cada revelador.

2.3.6.5.- Técnica del rociado. Esta técnica consiste en rociar uniformemente el revelador sobre

la superficie del cromatograma por medio de un rociador que puede ser una botella de rociado especial para

cromatografía (ver figura), a la cual se le puede adaptar una pera o una bomba, mediante la cual se insufla aire

a presión que obliga al revelador salir de la botella y bañar toda la superficie del papel.

Este procedimiento debe efectuarse en un campana extractora de gases debido a la toxicidad de los reactivos

químicos empleados para preparar las soluciones de los reveladores.

2.3.6.6.- Técnica de bañado. El material que se requiere para la aplicación de esta técnica, es una

bandeja poco profunda, fabricada de material inerte, en donde se coloca la solución reveladora y se sumerge el

cromatograma, teniendo cuidado de que éste no toque las paredes laterales de la bandeja, tal como se indica

en la figura.


1212




Es esencial que el compuesto coloreado formado al revelar sea insoluble en el disolvente elegido, de lo

contrario, las manchas aparecerán difusas o desaparecerán completamente. El agente más empleado para

detectar aminoácidos es la ninhidrina.

Esta se aplica sobre el papel en forma de solución de 0,1% a 0,25% en acetona o n-butanol. La reacción con

los aminoácidos puede representarse en forma sencilla como:

aminoácidos + ninhidrina ------------------ producto coloreado (incoloro) (incoloro) calor (violeta)

Las reacciones involucradas en la producción del color son:

O

O

OH

OH

H2O-

O

O

O NH2CHCOOH

R

(H2O)-

O

O

NCHC OH

O

R

Base

(CO2)-

O

O

N CHRH2O N

O

O

H2 + H C R

O

H2

O

O

N +

O

O

O(H2O)-

N

O

O O

O

AZUL

Ninhidrina


1313




Unos pocos aminoácidos producen un color diferente, por ejemplo la prolina genera un color amarillo pálido con

ninhidrina.

El papel se introduce en la solución de acetona, se saca y se lleva a una estufa donde se evapora el solvente a

100ºC durante 5 a 10 minutos, tiempo suficiente para que aparezca el color. La técnica de bañado no puede

emplearse si alguno de los compuestos del cromatograma, o el producto coloreado del revelado, son solubles

en el disolvente del revelador. En estos casos se emplea la técnica del rociado.

2.3.7.- IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS.

Para cada sustancia, su recorrido relativo respecto al recorrido del solvente en un sistema

cromatográfico dado, es constante y característico de la sustancia. Esta constante se denomina Rf.

Actualmente, están tabulados los valores de Rf de casi todos los compuestos conocidos que pueden separarse

por cromatografía sobre papel.

En consecuencia, si se conoce la naturaleza del compuesto, el valor de su Rf y el sistema cromatográfico

usado, es posible identificar por comparación con los valores de Rf tabulados para la clase de compuestos con

los estamos trabajando, cada una de las sustancias integrantes de una mezcla determinada.

Generalmente la identificación se realiza aplicando en el papel muestras de soluciones de compuestos

conocidos (patrones). Se desarrolla y revela el cromatograma y, se determinan los valores de R f para cada una

de las muestras separadas. Estos valores se comparan con los obtenidos para las muestras patrones, con el

objetivo de identificar cada componente particular de una mezcla determinada. Si los Rf son iguales, podemos

concluir que la sustancia particular en la mezcla es la misma que la correspondiente al patrón, y son diferentes

entonces, las sustancias patrón y la sustancia particular de la mezcla también serán diferentes.

2.3.8.- CROMATOGRAFIA SOBRE PAPEL BIDIMENSIONAL.

En algunos casos como por ejemplo en el hidrolizado de proteínas, no se consigue una buena separación de

las manchas por cromatografía sobre papel en una sola dirección para lograr la separación de los componentes

de una mezcla de sustancias. En estos casos, se realiza otra cromatografía sobre el mismo cromatograma

anterior pero sin revelar, usando ésta vez otro solvente y desarrollando el cromatograma en otra dirección

perpendicular a la primera.

Se obtiene un cromatograma en el cual las manchas están mejor separadas. Una cromatografía desarrollada

de esta manera, en dos direcciones perpendiculares entre sí, se le conoce con el nombre de

CROMATOGRAFIA BIDIMENSIONAL.

En este caso, se emplea una hoja cuadrada de papel de dimensiones adecuadas al requerimiento

experimental. La muestra deberá ser colocada cerca de una esquina del papel y se somete al proceso de

cromatografía ascendente o descendente.


1414




Seguidamente, se saca el papel de la cubeta cromatográfica, se seca, se gira 90 y se desarrolla el

cromatograma con un solvente distinto al utilizado en primera instancia. Después que el segundo desarrollo ha

finalizado, se retira el papel de la cubeta, se seca y se revela. El conjunto de figuras muestra una separación

bidimensional.

CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

1.- FUNDAMENTO TEÓRICO:

La cromatografía de capa fina es una técnica de adsorción sólido - líquido. El fenómeno responsable de la

separación es la adsorción, la cual implica la distribución de un soluto entre dos fases inmiscibles de acuerdo a

la mayor o menor adsorción del soluto en la superficie de una fase sólida. La fase estacionaria es sólida y la

fase móvil es líquida (disolvente).

La adsorción es un fenómeno de superficie, que se manifiesta por un aumento de concentración en la interfase

que rodea el medio estacionario. No se debe confundir la adsorción con la absorción, que consiste en la

penetración de una sustancia en el seno de otra. Por ejemplo, al escribir, el papel adsorbe tinta, mientras que

una esponja absorbe agua.

La teoría de la cromatografía de capa fina aún no ha podido aclararse en todos sus detalles y es complicada

por varias razones.

1.1.- La velocidad de flujo del solvente no es constante, sino que varia a medida que el frente del solvente

avanza a lo largo de la capa de adsorbente. La velocidad depende de las características físicas del solvente

empleado. El solvente se mueve constantemente hacia áreas de adsorbente seco, lo cual tiende a involucrar

calores de y consecuentemente distorsiona el equilibrio.

1.2. Las manchas que se separan pueden sufrir una difusión lateral y probablemente no estarán

uniformemente depositadas sobre el adsorbente.


1515




Probablemente, la conclusión más importante, de toda la teoría desarrollada para la cromatografía de capa

fina, es que el mayor grado de resolución en una capa fina ocurre en el área alrededor de los valores de Rf

entre 0,3 y 0,4.

2.- COMPARACIÓN CON LA CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL:

La cromatografía sobre papel es una técnica muy valiosa. Haciendo uso de ella se pueden separar en forma

fácil y rápida, sustancias químicas relacionadas estrechamente en estructura, bien sean iones inorgánicos, así

como también, compuestos orgánicos polifuncionales o muy polares, tales como: amino-ácidos, azucares o

pigmentos de plantas. ¿entonces porqué usar otros métodos, los cuales, aparentemente, a primera vista,

hacen exactamente la misma cosa ?

La respuesta a esta interrogante es bastante sencilla. Existen un gran número de familias de compuestos,

principalmente en el campo de los lípidos, donde la cromatografía de papel no ha producido los resultados

deseados. Por lo tanto, se necesita una técnica alternativa que sea capaz de separar, por ejemplo, los ácidos

grasos de estructura muy parecida, de una manera tan simple y fácil como la cromatografía de papel separa los

amino-ácidos estrechamente relacionados en su estructura química. La cromatografía de capa fina (TLC: Thin

Layer Cromatography, en idioma ingles), es la técnica que cubre estas expectativas.

Podemos comparar la cromatografía sobre papel con la cromatografía de capa fina (TLC) respecto a las

similitudes de los principios teóricos y las técnicas experimentales empleadas. En cuanto al fundamento

teórico, la cromatografía sobre papel es una técnica de partición líquido - líquido, mientras que la de capa fina

es una técnica de adsorción sólido - líquido.

Las ventajas de la TLC son : mayor velocidad, mejor resolución, (en general las manchas separadas se

presentan más compactas), mayor sensibilidad, (se pueden separar y recuperar con mayor facilidad cantidades

extremadamente pequeñas de compuestos, en el orden de los microgramos) y más amplia posibilidad en la

selección de reactivos de detección, (se puede esparcir sobre las placas de sílica y alúmina, reactivos

reveladores altamente corrosivos como el ácido sulfúrico, sin afectar la capa de adsorbente).

La cromatografía de capa fina tiene otras ventajas comparada con la de papel. Mientras que la cromatografía

sobre papel se desarrolla sobre una película de pequeño espesor de celulosa soportada sobre el papel mismo,

la de capa fina puede desarrollarse sobre capas finas de una gran variedad de materiales inorgánicos

pulverizados, tales como: silica gel (óxido de silicio: SiO2.H2O), celita, alúmina (óxido de aluminio: Al2O3), tierra

de diatomeas (kieselguhr) y sobre sustancias orgánicas como: alcohol polivinílico, celulosa y celulosas

modificadas químicamente. Es posible entonces, escoger el material particular más adecuado para resolver la

separación del grupo de compuestos en estudio.

El tiempo requerido para lograr una separación satisfactoria es considerablemente más corto en TLC; y por

último, la capa de adsorbente puede ser fácilmente retirada con una espátula fina para recuperar por elución el

contenido de una mancha o banda presente en un espacio determinado de la placa.


1616




Adicionalmente, la TLC puede usarse para separar sustancias hidrofóbicas tales como: lípidos e hidrocarburos

que son difíciles de manejar sobre el papel cromatográfico. Las desventajas de la TLC comparadas con la

cromatografía sobre papel son: mayor dificultad para preservar resultados en TLC, los valores de Rf no son

fácilmente reproducibles en TLC y, los platos para la TLC son más costosos que las hojas de papel.

3.- PRINCIPIOS GENERALES DE LA CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

La cromatografía de capa fina se lleva a cabo sobre una capa delgada uniforme de un adsorbente adecuado

extendida sobre una lámina de vidrio o de algún otro material y activada por calentamiento en un horno (100 a

250ºC). Las muestras de mezclas a separar se disuelven en un solvente adecuado (aproximadamente al 1%) y

se aplican, mediante el uso micropipetas, a lo largo de un borde de la placa, alrededor de 1 cm del final.

Después de evaporado el solvente, las placas se colocan verticalmente en un recipiente de vidrio cerrado,

denominadas cámaras de desarrollo, que contiene una capa de solvente adecuado en el fondo. Antes, se ha

debido procurar que la atmósfera de la cámara de desarrollo esté saturada con vapor del eluyente. El eluyente,

avanza sobrepasando la mancha de origen. Al cabo de unos pocos minutos los componentes de la mezcla son

separados por el solvente que irá ascendiendo a través de la capa fina del adsorbente, transportando las

manchas a localizaciones diferentes sobre el adsorbente, por una combinación de adsorción y distribuciones

variables del sistema del solvente. Un ejemplo de separación empleando la cromatografía de capa fina se

indica en la serie de figuras que se muestra a continuación.

Las placas se extraen, procediéndose a marcar rápidamente el frente del solvente antes que el disolvente se

evapore, se secan y se revela con diversos agentes que permiten visualizar los componentes de la mezcla. La

presencia de las sustancias separadas, se comprueban entonces por algún método de visualización. las

sustancias coloreadas se pueden observar inmediatamente, algunas fluorescen o absorben luz U.V., y otras se

hacen visibles rociándolas con reactivos específicos.


1717




Como medida de la velocidad de desplazamiento de cualquier sustancia en un eluyente determinada, se usa,

como en la cromatografía de papel, el valor del Rf, es decir, la relación de la distancia que una sustancia se ha

movido con la distancia que ha viajado el frente del solvente de desarrollo. Los valores de R f, pueden ayudar en

la identificación de sustancias, cuando las mediciones se realizan bajo las mismas condiciones, esto significa

que se deben desarrollar cromatogramas comparativos al mismo tiempo.

La cromatografía de capa fina se usa para determinar el número de componentes en una mezcla, para detectar

un compuesto particular en una mezcla de reacción, y como un ensayo preliminar, para determinar las

condiciones óptimas para realizar una cromatografía de columna. El uso de la cromatografía de capa fina está

limitado a la aplicación de sustancias relativamente poco volátiles, ya que las pequeñas cantidades de las

mismas se encuentran expuestas en una superficie abierta.

3.1.- PROCESOS DE ADSORCIÓN:

Dos factores están involucrados en la cromatografía de adsorción: las fuerzas de atracción entre los solutos y

adsorbentes y las fuerzas que tienden a apartar los solutos de los adsorbentes, de tal manera que puedan

desplazarse con la fase móvil y puedan ser separados. A estos dos factores se les denomina respectivamente

adsorción y desorción.

De esta manera, la separación de componentes de una mezcla por cromatografía de adsorción depende del

equilibrio adsorción - desorción entre los compuestos adsorbidos en la superficie de la fase sólida estacionaria

y la fase líquida móvil.

La fuerza con la que se adsorbe un componente aislado depende de la polaridad de la molécula, de la actividad

del adsorbente, y de la polaridad de la fase líquida móvil. Por lo tanto, la separación de los componentes de

una mezcla depende de los valores relativos del equilibrio de adsorción - desorción para cada uno de ellos. Por


1818




lo general, cuanto más polar es un compuesto, más fuertemente será adsorbido en la superficie de la fase

sólida.

El proceso de adsorción es un fenómeno de superficie En el sentido cromatográfico el término adsorción se

limita a las interacciones que implican enlaces por puente de hidrógeno, fuerzas de Van der Walls o fuerzas de

atracción electrostáticas (cuando las interacciones son iónicas el proceso se denomina intercambio iónico),

entre el o los solutos a separar y los centros activos del adsorbente.

Los centros activos del adsorbente provienen principalmente de los defectos (grietas, filos, etc.) de la red

cristalina del adsorbente donde las fuerzas electrostáticas están proyectadas parcialmente hacia el exterior. La

adsorción es debida justamente a la interacción de estas fuerzas con las interiores del soluto, provocando de

esta manera que las moléculas del soluto se distribuyan en capas sucesivas diferenciadas.

Las primeras capas de moléculas se adsorben 3 a 5 veces más fuertes que las capas siguientes. El calor de

adsorción para la primera capa adsorbida sobre un sólido está en el rango de 25-35 Kcal/mol, disminuye

rápidamente al rango de 5-10 Kcal/mol para capas sucesivas. Cuanto mayor sea la separación de cargas del

soluto (mayor momento dipolar), mayor será la adsorción.

Desde el punto de vista práctico la cromatografía de adsorción se aplica en la separación de sustancias de

media o baja polaridad. En resumen, podemos decir que las fuerzas que causan la adsorción de los solutos

neutros son:

3.2.1. Atracciones del tipo dipolo-dipolo entre adsorbentes polares y solutos polares.

3.2.2. Enlaces por puentes de hidrógeno entre los grupos hidróxilo dentro de la estructura química del

adsorbente que se usa, especialmente de la silica, y los átomos de oxígeno y nitrógeno en la estructura

química de los solutos.

3.2.3. Las fuerzas de polarizabilidad entre adsorbentes polares y solutos tales como materiales aromáticos

que pueden ser polarizados.

En todo caso, en cualquier fenómeno de adsorción influyen tres variables independientes. estas son el

adsorbente, el disolvente y las sustancias a cromatografiar. Las separaciones sobre adsorbentes dependen de

la existencia del equilibrio entre las moléculas adsorbidas en la fase estacionaria y las que están libres en el

disolvente (equilibrio adsorción - desorción). Si las moléculas de un componente particular tienen una elevada

afinidad por el adsorbente pasarán muy lentamente, mientras que otro componente con menos afinidad lo hará

más rápido.

3.3.- INFLUENCIA DEL DISOLVENTE.

El tipo de disolvente a usar es determinante para lograr una buena separación. La regla general es elegir la

polaridad del disolvente análoga a la de la muestra a emplear y en la mayoría de los casos adsorbentes

poderosos (activos) para sustancias no polares y adsorbentes con menos actividad para sustancias más

polares.


1919




La razón de la primera regla es obvia. Si, por ejemplo, elegimos un disolvente polar para una mezcla de

compuestos no polares, las moléculas del disolvente serán adsorbidas preferentemente, por lo que la mezcla

pasará rápidamente a través del sistema sin conseguir la separación. Contrariamente, si empleamos un

disolvente apolar para una mezcla polar, ésta permanecería en el origen sin lograrse tampoco la separación.

Existen dos fuerzas las cuales causan que los solutos se muevan con el solvente en un cromatograma.

La primera, es la tendencia para disolverse y moverse con el solvente, un fenómeno denominado

frecuentemente elución.

En este caso, los solventes ideales, deberán disolver los solutos y deberán ser lo suficientemente buenos como

solventes, como para competir con el poder de adsorción del adsorbente. Este tipo de situación probablemente

prevalece cuando se usan solventes apróticos para desarrollar los cromatogramas como por ejemplo:

hidrocarburos, éteres y compuestos con función carbonílica.

La segunda fuerza que tiende a mover los solutos en un sistema cromatográfico es un fenómeno de

desplazamiento.

Las moléculas del solvente tienden a competir con el soluto por los sitios de adsorción en el adsorbente y por

tanto tienden a mover las moléculas del soluto a lo largo del sistema. Este fenómeno se denomina

desplazamiento. En cierto sentido, la elución es una fuerza de tracción y el desplazamiento es una fuerza de

empuje. El fenómeno de elución prevalece con solventes apróticos y el de desplazamiento con solventes

próticos como los alcoholes.

Para facilitar la elección del disolvente, se les ha clasificado en una serie llamada elutrópica, es decir en orden de poder

eluyente creciente. El poder eluyente aumenta con la polaridad del disolvente. La serie elutrópica de Trappe modificada es:

DISOLVENTE CONSTANTE DIELECTRICA ()

Éter de petróleo 2,0

Ciclohexano 2,1

Tetracloruro de carbono 2,2

Benceno 2,3

Tolueno 2,4

Tricloroetileno 3,4

Éter dietílico 4,3

Cloroformo 5,0

Acetato de etilo 6,4

Cloruro de etileno 10,0

Piridina 12,0

Acetona 21,0

n - propanol 22,0


2020




Etanol 26,0

Metanol 34,0

Acetonitrilo 37,0

Agua 81,0

Es importante correlacionar el poder eluyente de un disolvente con su constante dieléctrica ya que la

cromatografía de adsorción está basada en atracciones electrostáticas, las cuales están gobernadas por la ley

de Coulomb.

Esta ecuación establece que la fuerza F, entre dos cargas depende de la magnitud de las cargas y es

inversamente proporcional a la constante dieléctrica del medio y al cuadrado de la distancia entre las cargas. Si

asumimos que los otros factores permanecen constantes, la fuerza de atracción varía inversamente con la

constante dieléctrica del medio. Es fácil demostrar (cómo ?) que el R f es inversamente proporcional a las

fuerzas de atracción entre el adsorbente y el material adsorbido, esto es: mientras menor es la

interacción soluto - adsorbente, mayor es su Rf; si es grande, F es pequeña, y el Rf es grande.

Cuando no es posible obtener una buena separación con disolventes puros se usan mezclas de disolventes,

hasta conseguir aquella combinación que permita obtener la separación deseada. Para que los resultados de la

cromatografía en capa fina sean reproducibles se usan disolventes de alto grado de pureza, ya que las

constantes dieléctricas dependen grandemente de la pureza.

3.4.- INFLUENCIA DE LA ESTRUCTURA QUÍMICA DE LAS SUSTANCIAS A

SEPARAR.

La polaridad de las moléculas es un factor muy importante en las separaciones cromatográficas por adsorción.

En general, cuanto más polar es una sustancia, más fuertemente es adsorbida. Las sustancias adsorbidas

fuertemente necesitan disolventes más polares para ser eluidos.

Si las sustancias a separar poseen en la adsorción con un disolvente no acuoso poca afinidad por los

adsorbentes hidrófilos usuales, entonces se trabajará con un absorbente activo y eluyentes poco polares. Por

el contrario, se emplearán adsorbentes poco activos y eluyentes polares cuando la afinidad de adsorción de las

combinaciones es grande. Por esto es muy importante conocer qué características de la estructura química de

las sustancias influyen en la fuerza de unión por adsorción. Los principios en los que esto se rige se indican a

continuación:

3.4.1.- Los hidrocarburos saturados son poco o nada adsorbidos. la introducción de enlaces dobles

aumenta la afinidad de adsorción, tanto más, cuanto mayor es su número y más todavía si están conjugados.


2121




Con la introducción de enlaces dobles, especialmente enlaces dobles conjugados, aumenta la facultad de

polarización de las moléculas y con esto la fuerza de la unión adsortiva a la superficie de los adsorbentes

hidrófilos.

3.4.2.-Si se introducen grupos funcionales en un hidrocarburo, aumenta generalmente la afinidad de

adsorción, pudiéndose observar la siguiente serie de adsorción descendente: -COOH, -CONH2, -OH, -

NHCOCH3, -NH2, -OCOCH3, -COCH3, -N(CH3)2, -NO2, -OCH3, -H, -Cl. Las combinaciones carbonílicas se

adsorben más débilmente que las hidroxílicas y amínicas. Los grupos C - metilo están sin una influencia

especial.

3.4.3.- Si en una molécula están presentes varios grupos funcionales de distinta naturaleza, sus

influencias separadas en la adsorción son aproximadamente aditivas. Los efectos estéricos son importantes y

pueden variar grandemente el grado de adsorción.

De aquí resulta que para la separación de sustancias poco polares (vértice del triángulo punteado señalando

hacia abajo a la izquierda en la dirección de mezcla a separar no polar), hay que emplear un adsorbente con

actividad alta (vértice del triángulo punteado señalando hacia arriba a la izquierda en la dirección de la fase

estacionaria con actividad I) y un eluyente con poco poder de elución (vértice del triángulo punteado señalando

hacia la derecha).

3.5.- NATURALEZA DEL ADSORBENTE.

La adsorción de sustancias en la superficie del sólido que actúa como adsorbente es mayor cuanto mayor es la

polaridad del absorbente. La presencia de agua disminuye la actividad del adsorbente. La actividad del

adsorbente (poder de adsorción), depende del tipo de material y del modo cómo se preparó.

Muchos de los sólidos empleados como adsorbentes en cromatografía de capa fina son óxidos metálicos,

óxidos hidratados y sales. Las sustancias adsorbidas, llamadas también adsorbatos, son combinaciones

polares o polarizables.

En general, están ligadas a la superficie del adsorbente por medio de fuerzas electrostáticas, las cuales

también son responsables de la cohesión de la red cristalina. Aquí, las tensiones reticulares actúan en parte

hacia afuera. Los centros activos de adsorción en el adsorbente son, por lo tanto, aristas, secciones de rotura,

ángulos y lugares defectuosos de la superficie, en los que los iones están mas o menos al descubierto. Con

esto se hace comprensible el paralelismo entre la actividad de adsorción y la escala de dureza, que representa

una medida de la magnitud de las fuerzas reticulares.

Por las tensiones eléctricas superficiales se inducen momentos dipolares en las combinaciones no polares, o

se intensifican los momentos dipolares ya existentes en combinaciones polares. Así pues, la unión del

adsorbato a la superficie del medio de adsorción está producida por fuerzas ion - dipolo o dipolo-dipolo

respectivamente. En caso extremo la polarización puede conducir a la ionización de las moléculas adsorbidas.


2222




Los puentes de hidrógeno participan a menudo de la unión entre el adsorbente y la sustancia adsorbida. Las

moléculas, que forman puentes de hidrógeno internos, se adsorben más débilmente en silicagel, óxido de

aluminio hidratado, que los compuestos isómeros que no poseen estas propiedades. Además, los puentes de

hidrógeno influyen en la movilidad entre la sustancia y el eluyente. La serie de poder adsortivo de los

adsorbentes más usados que se presenta en la tabla fue establecida por H. H. Strian. Para facilitar la elección

del sistema, se ha preparado una lista de adsorbentes y disolventes ordenados de menor a mayor polaridad

(actividad y poder eluyente respectivamente). Esta se ha elaborado a base de conocimientos prácticos y se

representa a continuación.

Adsorbentes por orden de menor

a mayor poder adsortivo

Disolventes por orden de menor

a mayor poder eluyente

Azúcar, almidón

Inulina

Nitrato magnésico

Talco

Sosa

Carbonato potasio

Carbonato cálcico

Fosfato cálcico

Carbonato magnésico

Magnesia

Ácido silicio activado

Silicato de magnesio activados

Óxido de aluminio activada

Carbón animal activado y magnesia activada

Hexano, éteres de petróleo

Heptano

Ciclohexano

Tetracloruro de carbono

Benceno

Tolueno

Cloroformo

Eter dietílico

Acetato de etilo

Piridina

Acetona

Propanol

Etanol

Metanol

Agua

Mezcla de ácidos, bases con agua, alcoholes o

piridina

Aunque esta relación es muy útil, hay que tener cuidado, especialmente con los disolventes, ya que con

frecuencia se encuentra inversión de los resultados, entre dos disolventes determinados, en las mismas

condiciones.

Virtualmente puede emplearse cualquier líquido como disolvente en la cromatografía de adsorción, pudiendo

combinarse mezclas de dos, tres e incluso cuatro líquidos de polaridad diferente. De esta manera, el número

de disolventes disponibles es mucho mayor que el de adsorbentes. Los adsorbentes más usados en TLC, en

orden de importancia son la silicagel, y la alúmina. En determinados casos también se emplean otros

adsorbentes especiales como kieselguhr, celulosa, carbón activado y el polvo de poliamida (nilón).


2323




En la práctica sólo se emplean con frecuencia solamente dos adsorbentes, la sílica gel y la alúmina,

desarrollando la separación empleando el disolvente apropiado o cambiando la polaridad del adsorbente por

adición de agua. Para conseguir la forma más activa del adsorbente, se calienta fuertemente, eliminando todo

el agua y cualquier impureza orgánica.

Los grados de menos actividad se consiguen por adición de cantidades conocidas de agua. A este proceso se

le denomina desactivado.

Algunos adsorbentes contienen un aglomerante el cual aumenta la adhesión del adsorbente a la placa de

vidrio. Los aglomerantes más comunes son el sulfato de calcio (yeso) y el almidón. Sin embargo, los productos

modernos tienen mejores propiedades adhesivas, siendo, en muchos casos, superfluo e incluso indeseable el

empleo de aglomerantes.

3.5.1.- SILICAGEL: (ÁCIDO SILICICO).

Es el adsorbente más extensamente usado en TLC y probablemente el mejor material para realizar las pruebas

iniciales de separación, ya que posee una capacidad de adsorción muy elevada.

Si los compuestos a separar son neutros y contienen uno o dos grupos funcionales, pueden ser resueltos sobre

capas de silicagel activada usando para el desarrollo de la cromatografía solventes orgánicos puros o mezclas

de solventes. Si los compuestos a ser separados son bases orgánicas, el solvente de desarrollo deberá

contener una pequeña cantidad de hidróxido de amonio o de dietilamina.

Del mismo modo, se deberá añadir una pequeña cantidad de ácido acético a los solventes usados para el

desarrollo del cromatograma cuando se desea separar mezclas de compuestos ácidos. La silicagel puede

usarse con todos los solventes, aún cuando exhibe capacidad de enlazamiento por puentes de hidrógeno con

algunos solutos y solventes cuando está presente el agua.

Esta capacidad de enlazamiento conjuntamente con el factor de inchamiento y por tanto la disminución de la

velocidad de flujo, en presencia de agua, metanol y etanol, causa algunas limitaciones a su uso general. Los

compuestos muy polares, tales como: alcoholes, aminas o ácidos carboxílicos, se adsorben fuertemente a la

superficie de la silica, formando puentes de hidrógeno con los residuos de ácido silicíco de la forma Si--O--H.

Por lo tanto, se requiere de un solvente muy polar para hacer que este tipo de compuestos se mueva a lo largo

de la superficie de la silicagel. Los compuestos apolares no serán muy atraídos por la silicagel y se moverán

rápidamente aún en la presencia de solventes apolares. La silicagel puede adquirirse en formas muy diversas.

Las más comunes son la silicagel G y la silicagel H. La forma G, (la G significa Gypsum o yeso de París, es

decir sulfato de calcio. Cuando este aglomerante se expone al contacto con el agua o la humedad, se convierte

en una masa rígida de CaSO4.2H2O, el cual se enlaza al adsorbente y a la placa de vidrio), contiene un 13% de

aglomerante: El tamaño medio de sus granos es de 5 a 25 micras. la silicagel H no contiene aglomerantes.

Igual que la forma G, posee un tamaño medio de granulación de 5 a 25 micras. Las capas de silicagel H

poseen una buena estabilidad. Los tiempos de recorrido, en comparación con los de la silicagel G son algo

superiores. También pueden obtenerse silicagel H y silicagel G, con indicadores de fluorescencia (silicagel


2424




GF254 y silicagel HF254). La materia fluorescente inorgánica (un silicato de zinc activado con manganeso), hace

innecesario en muchos casos, tener que colorear las sustancias. Se observa el cromatograma en la luz de una

lámpara UV de onda corta. Las sustancias que absorben la luz UV aparecen como manchas de absorción

oscuras sobre un fondo fluorescente.

3.5.2.- ALÚMINA:

Hasta ahora el óxido de aluminio (alúmina), se ha utilizado con menor frecuencia en la cromatografía de capa

fina que la silica gel. Las múltiples posibilidades de aplicación de la alúmina incluyen por ejemplo la separación

de terpenos, alcaloides, esteroides, combinaciones alicíclicas, alifáticas y aromáticas.

La alúmina tiene reacción alcalina, por lo tanto se usa frecuentemente para la separación de compuestos con

características básicas en preferencia a la silica gel. Debido a su naturaleza básica, no se requiere añadir

cantidad alguna de base al solvente de desarrollo.

La cromatografía de capa fina sobre alúmina también se usa como una herramienta complementaria para la

cromatografía de columna, técnica en la cual la alúmina se emplea más extensamente que la silica gel. La

alúmina presenta sitios de adsorción de estructura química variada del tipo: Al+, Al - OH, Al - O-, Al - OH+ y

dependiendo de su preparación iones sodio o hidronio.

La alúmina puede obtenerse en tres formas: ácida, básica y neutra. La alúmina ácida es una alúmina lavada

con ácido, la cual produce una suspensión en el agua con un pH de aproximadamente 4.

Esta alúmina es adecuada para la separación de compuestos con propiedades ácidas tales como aminoácidos

y ácidos carboxílicos. La alúmina neutra (pH aproximadamente 7) se puede usar para la separación de

cetoesteroides, glicósidos, cetales. lactonas, algunos ésteres y para la deshidratación de solventes. La alúmina

básica (pH aproximadamente 10) es adecuada para la separación de compuestos con características básicas

como las aminas.


2525




Este tipo de alúmina, posee el más amplio espectro de aplicación. Los compuestos altamente polares se

adsorben fuertemente sobre este material, mientras que los compuestos no-polares (excepción hecha con los

hidrocarburos insaturados) se enlazan débilmente. La acetona, no debe usarse como solvente de elución con

alúmina básica de alto grado de actividad, ya que puede condensar por una reacción de condensación aldólica.

Existen varios tipos de alúmina dependiendo de su grado de actividad, la cual se mide en la escala de Brockman, de

acuerdo al contenido de agua. Los grados de actividad son los siguientes:

grado de actividad I II III IV V

peso de agua (% en peso ) O 3 6 10 15

Para la alúmina, el grado de mayor actividad se define como actividad I de Brockman. El contenido de agua

posee un significado decisivo, ya que las moléculas de agua fácilmente adsorbibles bloquean los puntos

activos de la superficie.

La cromatografía de los ácidos y bases se desarrolla en forma diferente. De los adsorbentes que más se

emplean en cromatografía de capa fina, la silica gel es relativamente ácida y la alúmina es relativamente

básica. Si se intentara cromatografiar solutos con propiedades ácidas sobre alúmina, estos se unirán

fuertemente al adsorbente mediante fuerzas iónicas.

Debido a este hecho, se moverán con mucha dificultad a lo largo de la capa de adsorbente, por lo tanto, su

separación será muy difícil.

Igual situación ocurrirá con solutos básicos sobre silica gel. Es así como, las bases deberán ser

cromatografiadas sobre alúmina, donde podrán ser adsorbidas en casi la misma extensión que los alcoholes.

Los ácidos y fenoles, deberán ser separados sobre silica gel, donde podrán ser adsorbidos en una extensión

un poco mayor que los alcoholes.

3.5.3.- KIESELGUHR Y CELULOSA:

El kieselgur adsorbe más débilmente que la silica gel y la alúmina. Por eso es especialmente apropiado para

separaciones de combinaciones polares (en particular para cromatografía de reparto). Estos dos adsorbentes

se usan como soportes para películas líquidas en la cromatografía de partición.


2626




Este tipo de cromatografía se usa siempre para la separación de moléculas muy polares como los amino-

ácidos, los carbohidratos y algunos otros compuestos hidrofílicos naturales y frecuentemente para la

separación de isómeros estrechamente relacionados. Se debe tener cuidado de asegurar que las capas

contengan un líquido como fase estacionaria, generalmente agua. Esto es especialmente el caso, cuando las

capas se preparan por el método de inmersión. El sistema de solventes usado con estos adsorbentes contiene

generalmente varios constituyentes, uno de los cuales es la fase estacionaria líquida, por ejemplo, agua.

3.6. CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA A APLICAR.

La cantidad de muestra en la cromatografía de adsorción es muy importante, puesto que el poder adsorbente

de la superficie disminuye marcadamente con el incremento de la cantidad de muestras, ya que se ocupan

primero los centros más activos. El resultado es la aparición de ”colas” en dirección al origen.

Los mejores resultados se consiguen al aumentar tanto como se pueda la relación adsorbente/muestra. Lo

normal es que sea de 1000 a 1, para obtener resultados satisfactorios. En todo caso, las cantidades que se

pueden cromatografiar sin formación de cola, son distintas. Dependen del nivel de adsorción total, es decir de

la clase de adsorbente y de su capacidad, que en general va paralela con la actividad de adsorción.

Para un espesor de capa de 250 , las cantidades de sustancias que se pueden cromatografiar en cada capa

de silicagel ascienden a unos miligramos, sobre las capas de óxido de aluminio menos activadas, la décima

parte, mientras que sobre capas de Kieselgur inactivas, se pueden cromatografiar solamente 25 hasta 50 g de

mezclas de sustancias.

3.7.- ETAPAS PARA REALIZAR UNA CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

3.7.1.- PREPARACIÓN DE LA PAPILLA DE ADSORBENTE.

Sobre las placas se esparce en forma homogénea una papilla de adsorbente dispersado en un solvente

adecuado. Si el adsorbente no contiene aglomerante, las papillas de adsorbente pueden conservarse en

frascos cerrados, casi indefinidamente.

Normalmente, las papillas se hacen con agua que, si es necesario, puede contener ácidos, bases, tampones o

reactivos acomplejantes. El mayor problema en esta técnica es conseguir una consistencia correcta. Si la

papilla es demasiado diluida correrá rápidamente, dando lugar a capas excesivamente finas. Por el contrario, si

es muy espesa se extiende muy difícilmente, siendo fácil obtener líneas o grumos a lo largo de las placas. La

papilla con agua debe usarse inmediatamente después de su preparación, de lo contrario comenzará a formar

grumos. Esta no debe emplearse si la misma ha estado sin uso después de un periodo de tiempo. Las placas

preparadas con una papilla acuosa deben secarse en una estufa antes de su uso.

Aún cuando, se pueden usar un gran número de solventes, para preparar la papilla, el cloruro de metileno y el

cloroformo son probablemente los más convenientes. Poseen dos ventajas, ambos tienen bajos puntos de


2727




ebullición y la habilidad para evitar que el adsorbente forme grumos. Los bajos puntos de ebullición significa

que no es necesario secar las placas revestidas de adsorbente en una estufa.

Además, las placas preparadas con estos solventes son estables por varios días. Tienen la desventaja, que la

capa de adsorbente formada sobre el vidrio es frágil y por tanto se debe tratar cuidadosamente. Por esta razón,

algunas personas prefieren añadir una pequeña cantidad de metanol para hacer posible que el aglomerante se

fije más firmemente. El metanol solvata el sulfato de calcio tanto como el agua. La papilla se prepara

convenientemente en un recipiente de tamaño mediano con tapa hermética. Se requieren de 3 ml de

diclorometano por cada gramo de silica gel.

Para obtener una papilla sin grumos, se deberá añadir la silica gel al solvente, mientras la mezcla esta siendo

agitada. Añadir solvente al adsorbente usualmente causa la formación de grumos en la mezcla. Cuando la

adición del solvente es completa, se coloca la tapa del recipiente y se cierra herméticamente, se agita vigorosa

y para asegurar un mezclado completo.

3.7.2- PREPARACIÓN DE LAS PLACAS.

Las placas para la cromatografía de capa fina se pueden adquirir comercialmente revestidas de capas muy

uniformes de silica gel o alúmina sobre láminas de plástico. Estas placas pueden obtenerse con o sin un

colorante fluorescente impregnando la superficie del adsorbente. Sin embargo, generalmente se usan placas

de vidrio, de tamaño variable según las necesidades de la aplicación particular. Las dimensiones más comunes

son: 7,5 x 2,5 cm (portaobjeto), 20 x 5 cm, 20 x 10 cm, 20 x 20 cm (para cromatografía bidimensional), 100 x 20

cm (para cromatografía preparativa).

Las placas deben lavarse con jabón y agua, lavadas nuevamente con agua y luego con metanol acuoso al

50%. Seguidamente, se permite que las placas se sequen completamente sobre toallas de papel. La

manipulación de las placas debe hacerse por los extremos, debido a que las huellas digitales sobre la

superficie de las placas hacen dificultoso que el absorbente pueda adherirse al vidrio.

Para la preparación de placas de capa fina sobre láminas de vidrio en el laboratorio se usan frecuentemente

dos métodos:

(i) por revestimiento

(ii) por inmersión.

3.7.2.1.- REVESTIMIENTO.

En este método, placas de vidrio del mismo espesor se disponen en hilera sobre un soporte especial,

extendiendo la papilla de adsorbente con un extendedor de capa fina. Si las placas de vidrio poseen distinto

espesor se usa un aparato con un dispositivo que permite colocar las placas de tal manera que todas ellas

tengan la superficie superior en un mismo plano, para asegurar que cada placa recibe el mismo espesor de

adsorbente., al deslizar el extendedor con el adsorbente tal como se indica en las figuras:


2828




El nivelador automático de placas tiene una manivela frontal, la cual, con un giro, hace que suban las placas y

queden niveladas por la parte superior, ofreciendo una superficie total en un mismo plano, aunque el grosor de

las placas sea diferente.

Las placas se aplican por medio del extendedor, el cual cuenta con una serie de calibraciones para conseguir

capas de 0,25 ; 0,50 ; 0,75 ; y 1 mm de espesor.

Habiendo preparado las placas, el paso siguiente es el secado, lo que se consigue calentándolas en una estufa

a una temperatura de 100 - 125 ºC durante un par de horas. De esta forma se activan, lo que las hace

adecuadas para la cromatografía de adsorción.

3.7.2.2.- INMERSIÓN.

Este es el método más ampliamente usado para preparar placas revestidas de adsorbente, tipo portaobjetos,

con fines didácticos en el laboratorio.

Consiste en sumergir un par de portaobjetos de vidrio de similares dimensiones adheridos uno contra el otro y

sujetados por un extremo con los dedos índice y pulgar, dentro del recipiente que contiene la papilla a una

velocidad constante hasta que aproximadamente 0,25 cm desde el borde superior de las placas permanezca

sin revestimiento de adsorbente. A continuación, se extraen las placas, lentamente a una velocidad constante:

La operación puede visualizarse en la figura :


2929




La operación total del procedimiento oscila entre 3 y 5 segundos. Se requiere de cierta práctica para ajustar el

tiempo correcto. Después de extraídas. se permite escurrir la suspensión sobrante en el otro extremo de la

placa, apoyando el borde inferior de las placas en la parte superior del envase que contiene la papilla. Las

placas se separan, limpiando con un dedo el exceso de absorbente que haya quedado en los bordes y en la

superficie no cubierta de las placas, para finalmente colocarlas sobre una toalla de papel para completar el

proceso de secado.

3.7.3.- APLICACIÓN DE LAS MUESTRAS SOBRE LAS PLACAS.

Los métodos son prácticamente los mismos que para la cromatografía de papel, teniendo en cuenta que la

mayor delicadeza de las capas finas exige mayor cuidado al aplicar la muestra. Las muestras se aplican con un

capilar sobre la línea base, dejando evaporar el disolvente.(ver figura).

Los capilares que se usan son una extensión muy fina del tipo empleado en la determinación de puntos de

fusión.(ver figura) La evaporación del disolvente en la capa fina es tan rápida que no es necesario el empleo de

un secador de pelo u otro aparato similar. El diámetro de las manchas en el origen debe ser lo más pequeño

posible.

Las soluciones no muy concentradas se pueden aplicar varias veces dejando evaporar el disolvente entre cada

aplicación. El volumen de la muestra suele ser de 1 microlitro. No se debe olvidar marcar la placa de forma

adecuada, antes de comenzar la cromatografía. Lo más sencillo es enumerar los puntos de origen de izquierda

a derecha, anotando las sustancias que se aplican en el cuaderno de laboratorio.


3030




3.7.4.-ELECCIÓN DEL DISOLVENTE.

Para obtener resultados reproducibles, en la cromatografía se deben usar solamente disolventes muy puros.

En general, se procura emplear disolventes (eluyentes) sencillos, de uno o dos componentes. En caso de

disolventes de varios componentes, hay que evitar que los más volátiles se evaporen si se emplean recipientes

que no cierran herméticamente. Cuando se trata de mezclas de sustancias desconocidas, lo mejor es emplear

en primer lugar como disolvente benceno o cloroformo (con contenido de alcohol). Si las sustancias se quedan

durante la cromatografía cerca del origen, entonces o bien se elige un medio disolvente de mayor polaridad o

se agrega al disolvente empleado otro miscible con él de mayor polaridad.

Si las sustancias se desplazan demasiado aprisa (cerca del frente),se emplea entonces un disolvente, con

menor polaridad. En todo caso, la elección del disolvente dependerá de la naturaleza de los compuestos que

se van a separar y del material adsorbente sobre el cual se desarrollará la separación. Una regla general para

la elección del disolvente es establecer la comparación de polaridad del mismo con respecto a las polaridades

de las sustancias a separar.

Así, para sustancias solubles en agua se elegirán capas de celulosa o silicagel, empleándose un disolvente

polar. Para sustancias menos polares se elegirán capas de alúmina o silicagel activadas, empleándose un

disolvente no acuoso apropiado.

Una técnica sencilla para la elección del disolvente a emplear en una determinada separación consiste en

colocar una serie de manchas de la muestra a intervalos en un placa. Los disolventes se prueban aplicándolos

en los centros de las manchas mediante un capilar muy fino, lo que permite desarrollar las manchas

radialmente (ver figura).


3131




En el caso representado el disolvente 2 resulta ser el más apropiado, debido a que resulta en la separación del

mayor número de componentes de la mezcla en estudio.

3.7.5.- DESARROLLO DE LAS PLACAS.

El desarrollo se lleva a cabo por el método ascendente en cubetas especiales para cromatografía o en

recipientes adecuados tales como frascos pequeños con tapa de rosca, vasos de precipitados cubiertos con

vidrio de reloj, etc, del tipo que se muestran en las figuras anexas.

En el interior de la cámara de desarrollo debe colocarse un papel de filtro, empapado de disolvente, que cubra

las paredes interiores de la misma, para conseguir que la atmósfera esté saturada de vapor del disolvente.


3232




El fondo de la cubeta se cubre de disolvente hasta una altura de 0,5 a 1 cm y, después de un periodo de

tiempo apropiado, en el que se consigue el equilibrio, se introduce la placa. Durante el desarrollo no puede

moverse la cubeta. Por lo general, cuando se desarrolla una placa se deja que ascienda el disolvente unos 10

cm por encima del origen y se saca la placa. El frente del disolvente se marca cuidadosamente con un lápiz

puntiagudo y se deja evaporar el mismo, operación que dura unos pocos minutos. Si es necesario se calienta la

placa, estando lista para el revelado.

3.7.6.- REVELADO DE LAS PLACAS.

Los procedimientos empleados para revelar las placas son análogos a los que se usan en la cromatografía

sobre papel. Sin embargo, existen algunas diferencias interesantes. En principio, el método de bañado no es

recomendable, ya que las placas se estropean fácilmente con este método.

Una de las ventajas de la cromatografía en capa fina sobre la de papel es la posibilidad de revelado con

agentes corrosivos tal como los ácidos concentrados y compuestos fuertemente oxidantes, a alta temperatura,

debido a la naturaleza inorgánica de la capa. Otro reactivo muy empleado son los vapores de yodo.


3333




En un recipiente con tapa hermética que contiene en el fondo unos pocos cristalitos de yodo, se introduce el

cromatograma y se deja unos minutos.

El yodo tiende a concentrarse en los sitios donde están los compuestos, por lo que aparece una mancha

marrón oscuro, sobre un fondo amarillo pálido. En tanto que el yodo no reaccione con los compuestos

revelados, el método es extraordinariamente bueno como revelador no destructivo.

Otros métodos que no afectan a los productos en el revelado son la fluorescencia y la radiactividad: Muchas

placas llevan impregnadas sustancias fluorescentes como aditivos para el revelado de los compuestos,

localizándose los mismos por la aparición de manchas no fluorescentes. Además, muchas veces los

compuestos a separar absorben en el ultravioleta, siendo este el método más sencillo para localizarlos.

Cuando se emplea una lámpara UV, cualquier material orgánico que contenga un cromóforo, aparecerá sobre

la placa como una mancha oscura sobre un fondo luminoso. Teniendo en cuenta que el material orgánico se

deposita sobre la superficie del adsorbente, si se tiene un cromóforo, actuará como una sombra o cortina que

evitará que la radiación UV alcance la superficie del adsorbente. La posición de la mancha debe delinearse

como se mencionó antes.

Si se desea emplear el revelado UV, se coloca la placa seca bajo una lámpara UV, preferiblemente en un

recinto oscurecido. Existen diversas lámparas de luz UV, pero las dos más comunes son una que puede

manipularse con la mano y colocarse directamente sobre la placa y otra con un recinto cerrado por todos los

lados, provista de un trapo oscuro en la parte frontal y una mirilla en la parte superior. Si se emplea una

lámpara de mano, se mantiene sobre la placa a una altura de 10 cm aproximadamente, tal como se muestra en

la figura. Mírese sólo la placa, evite siempre mirar directamente a la lámpara.

3.7.7.- CONSERVACIÓN DEL CROMATOGRAMA.

La conservación de los cromatogramas en capa fina es difícil y generalmente indeseable, puesto que las placas

se utilizan muchas veces. Interesa, por tanto, encontrar un medio para conservar los cromatogramas obtenidos.


3434




El espesor del vidrio y la naturaleza tan delicada de la capa son obstáculo para guardar los cromatogramas. La

posición de las manchas después del revelado puede fotografiarse o dibujarse.

Un método que puede usarse convenientemente, consiste en adherir con sumo cuidado sobre la superficie del

adsorbente, una cinta plástica transparente de una anchura un poco mayor que el de la placa y, tratar que el

cromatograma se pegue en la cinta de manera que conservarlo por largo tiempo.

3.9.- APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA EN QUÍMICA

ORGÁNICA.

La técnica de cromatografía en capa fina tiene muchos usos importantes en química orgánica. Puede usarse

en las siguientes aplicaciones.

3.9.1.- Establecer si dos compuestos determinados son idénticos.

3.9.2.- Determinar el número de componentes en una mezcla.

3.9.3.- Determinar el solvente apropiado para una separación en columna cromatográfica.

3.9.4.- Monitorear la separación de una columna cromatográfica.

3.9.5.- Comprobar la efectividad de separaciones realizadas en columna, o mediante técnicas de

extracción o cristalización.

3.9.6.- Registrar el progreso de una reacción.

En todas estas aplicaciones, la cromatografía de capa fina tiene la ventaja sobre otras técnicas, que en esta, se

usan pequeñas cantidades de material para realizar los análisis. Con muchos de los métodos de visualización,

se pueden detectar cantidades tan pequeñas como 10-7 gramos. Por otra parte, pueden utilizarse cantidades

relativamente grandes como 1 miligramo.

El uso de la cromatografía de capa fina, puede servir para establecer la identidad química de dos compuestos

que se sospechan son idénticos. Simplemente se aplican ambos compuestos en una misma placa y se

desarrolla en un solvente adecuado. Si ambos compuestos recorren la misma distancia, es decir tienen el

mismo valor de Rf, estos serán probablemente idénticos.

Si en cambio, la posición de ambas manchas no es la misma, se puede asegurar en forma definitiva y

concluyente que los dos compuestos no son idénticos.

Es importante, aplicar ambos compuestos en la misma placa. Esta precaución es especialmente importante

cuando se usan placas preparadas por inmersión, puesto que estos varían de uno a otro. Dos placas

preparadas de esta forma no tendrán exactamente el mismo espesor de adsorbente.

La cromatografía en capa fina, también encuentra aplicación para establecer si un compuesto es una sustancia

pura o en su defecto se trata de una mezcla. Una sustancia pura produce una sola mancha sin importar el

solvente que se use para desarrollar la placa. Por otra parte, el número de componentes de una mezcla puede

establecerse probando varios solventes para desarrollar la mezcla.


3535




Sin embargo, los resultados deben tomarse con cuidado, ya que a menudo resulta difícil, conseguir un solvente

adecuado que pueda separar una mezcla de compuestos con propiedades muy similares tales como los

isómeros. La falta de separación no es prueba absoluta de que un aplicación particular de una muestra sea una

sustancia pura.

Podemos emplear la cromatografía de capa fina para determinar el mejor solvente que podrá ser usado en la

resolución de una mezcla que ha de ser separada utilizando la técnica de cromatografía en columna. El proceso

consiste en preparar varias placas, impregnadas con el mismo adsorbente que será usado en la separación por

cromatografía en columna, aplicar la solución de la mezcla en cada una de las placas y analizar los resultados

que se obtienen al desarrollar la cromatografía de capa fina en solventes de diferente polaridad.

El solvente que proporciona una mejor resolución en capa fina, muy probablemente funcionará mejor en

columna. Estos experimentos en pequeña escala tienen la virtud de ser rápidos, usar pequeñas cantidades de

material y ahorrar tiempo.

En forma similar, la técnica de TLC, puede usarse para monitorear el progreso de una separación por

cromatografía de columna. Una situación hipotética se analiza en los diagramas de la figura que se muestra a

continuación.

El análisis preliminar por cromatografía de capa fina revela que un solvente determinado, separa la

mezcla en cuatro componentes (A-D). Por lo tanto, se usa este solvente para eluir la columna. Este proceso

conduce a la obtención de 11 fracciones de 15 ml cada una.

El estudio detallado de las distintas fracciones por TLC muestra que las fracciones 1, 2, y 3, contienen el

componente A, las fracciones 4, 5, 6, y 7, el componente B, las fracciones 8 y 9, el componente C y las


3636




fracciones 10 y 11, el componente D. Se observa que las fracciones 3, 4, 7 y 9. se obtienen con una pequeña

contaminación de otro componente. La fracción 3 está contaminada con algo de B. la 4 con A, la 7 con C y la 9

con D.

Otro ejemplo de la aplicación de la técnica de TLC, se encuentra en el análisis de una mezcla producto de una

reacción. El análisis del producto de reacción por TLC, produjo dos manchas, A y B. Después de la

cristalización del producto, se procedió a analizar los cristales obtenidos por TLC, encontrándose que los

cristales eran puros e idénticos al componente A, mientras que las aguas madre contenían una mezcla de A y

B. Estos resultados conducen a pensar que el proceso de purificación resulta satisfactorio para el componente

A.

Finalmente, es posible usar la técnica de TLC para monitorear el progreso de una reacción. A intervalos de

tiempo específicos, durante el transcurso de la reacción, se toman muestras de la mezcla de reacción y se

someten a análisis por TLC. Un ejemplo se detalla en las figuras esquematizadas a continuación:

En este caso, se desea convertir el reactante A en el producto B. Al comienzo de la reacción (0 hr), se

preparo una placa en la cual se aplicaron los compuestos puros A y B, además de la mezcla de reacción.

Análisis similares se condujeron a 0,5; 1; 2; y 3 horas después del inicio de la reacción. Las placas muestran

que la reacción se completa en 2 horas: Cuando el tiempo de reacción se prolonga por más de 2 horas,

comienza a aparecer un producto colateral nuevo C. Por lo tanto, el tiempo óptimo de reacción es de 2 horas.


3737




BIBLIOGRAFIA

1. Introducción a la Cromatografía, David Abbott y R. S. Andrews, Tercera Edición., Alhambra

S.A.., Madrid., 1973.

2. Paper, Thin Layer Chromatography and Electrophoresis, A Teaching Level Manual., Smith

Ivor and Feinberg, J. G.., Shandon., London., 1965

3. Experimental Methods in Organic Chemistry., Moore, J. A.., and Dalrymple, D. L., Second

Edition., W. B. Saunders Co., Philadelphia., 1976.

4. Introduction to Organic Laboratory Techniques. A Contemporary Approach, Second

Edition., Pavia, Lampman y Kriz

5. Curso Práctico de Química Orgánica, Tercera Edición, Brewster, Vanderwerf, McEwen

6. Química Orgánica, Fundamentos teóricos – prácticos para el Laboratorio, Lydia Galagovsky

Kurman., Quinta Edición, Manuales Eudeba, Buenos Aires, 1995.

7. Química Orgánica Experimental. Primera Edición Española., H. D. Durst y G. W. Gokel, Editorial

Reverté S.A., Barcelona, 1985.

8. A Text Book of Practical Organic Chemistry, Third Edition., A. I. Vogel., Wiley., New York.,

1972.

9. Experimentos de Química Orgánica. L. F. Fieser., Editorial Reverté S.A., Madrid., 1967.

10. The Organic Chem Lab Survival Manual, A Student´s Guide to Techniques., James W.

Zubrick., Third Edition., John Wiley and Sons., New York., 1992.

CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL Y CAPA FINA.Laboratorio de Química Orgánica I-A. Cromatografía sobre papel y capa fina 38

3838




PARTE EXPERIMENTAL

NOTA: Para esta práctica el estudiante debe llevar al laboratorio el siguiente material: 1 lápiz

mongol Nº 2, 1 tijera; 2 escuadras grandes graduadas; y una regla. Marcador negro y de

colores .

1.- EXPERIMENTOS DE CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL.

1.1- CROMATOGRAFÍA ASCENDENTE, UNA TIRA DE PAPEL, DE TINTA DE MARCADOR:

a)El papel: manipule el papel con mucho cuidado. Determine la orientación de la fibra del papel (señalado en

la caja que lo contiene). Corte una tira de papel de 23 x 2,5 cm (el lado debe ser paralelo a la dirección de

orientación de la fibra) . Trace a 1 cm de uno de los extremos una raya paralela al borde, (USE LÁPIZ DE

GRAFITO).

b) La muestra a aplicar: es tinta de marcador negro. Se aplicará directamente con el marcador en forma de

raya. Con el marcador trace una línea de 1 cm de longitud sobre la raya de grafito, a igual distancia de los

lados. Deje secar la tinta.

c) La cámara de desarrollo: (cubeta cromatográfica): la constituye un cilindro graduado de 250 ml con un

tapón monohoradado que ajuste bien.

d) El disolvente: es la fase orgánica de una mezcla de n-butanol, ácido acético y agua, en la proporción 4:1:5

(en volumen) recién preparada.

e) Procedimiento: con dos clips, suspenda la tira de papel del tapón. Ajuste el tapón (con la tira de papel

suspendida) en la boca del cilindro graduado. Suba o baje uno de los clips hasta que el extremo de la tira de

papel quede lo más cerca posible del fondo del cilindro (1 cm). Retire el tapón con la tira de papel.

Coloque con una pipeta el disolvente en el cilindro procurando no mojar las paredes, y en cantidad suficiente de

manera que toque ligeramente la tira de papel (la cantidad no debe ser más de 15 ml y no debe tocar la

muestra).

Introduzca la tira de papel y ajuste bien el tapón. Asegúrese que el nivel del disolvente no esté por encima del

punto de, aplicación de la muestra.

La tira de papel debe quedar centrada; evite que se pegue a las paredes del cilindro, porque de lo contrario el

disolvente ascenderá en forma irregular. Al cabo de 2 y ½ horas saque el cromatograma. Marque

inmediatamente el frente del disolvente. Seque el cromatograma.

f) Análisis del cromatograma: marque con un lápiz el borde de cada mancha que observe a simple vista.

Ilumine el cromatograma con luz ultravioleta. En caso de que aparezcan nuevas manchas, delinée éstas

anotando el color que presentan.


3939




1.2.- Repita la cromatografía anterior, usando como disolvente una mezcla de n-butanol, etanol y amoníaco

2N, en la proporción 2:1:2 (en volumen). Analice el cromatograma y compare los resultados con los obtenidos

en el cromatograma 1 (decir cual ha sido el mejor disolvente, en base a las manchas y su separación).

1.3.- CROMATOGRAFÍA ASCENDENTE DE AMINOÁCIDOS

a.- El papel: manipule el papel con mucho cuidado. Evite todo contacto directo de los dedos con el papel.

Determine la orientación de la fibra y corte una pieza rectangular (22 x 12 cm) de papel. La dirección de la fibra

debe ser paralela al lado de 12 cm. Trace a 1 cm de cada borde del lado más grande una raya paralela. (USE

LÁPIZ DE GRAFITO). Sobre una de las rayas marque trece puntos, con 1,5 cm de separación entre cada uno

de ellos; el primero y el último deben quedar a 2 cm del borde:

b.- Las muestras a aplicar: son soluciones de 4 aminoácidos ( 3 mg/ml) en etanol-agua (1:1) y

extractos preparados de jugo de limón, naranja y tomate. Con capilares finos (o micropipetas) aplique las

siguientes muestras, usando un capilar para cada solución:

Punto Nº 1: dos gotas de solución de lisina (LYS).

Punto Nº 2: dos gotas de solución de ácido aspartico (ASP).

Punto Nº 3: dos gotas de solución de metionina (MET).

Punto Nº 4: dos gotas de solución de leucina (LEU).

Punto Nº 5: dos gotas de cada una de las soluciones de los cuatro aminoácidos.

Punto Nº 6: dos gotas de extracto de jugo de limón.

Punto Nº 7: cuatro gotas de extracto de jugo de limón.

Punto Nº 8: dos gotas de extracto de jugo de naranja.

Punto Nº 9: cuatro gotas de extracto de jugo de naranja.

Punto Nº 10: dos gotas de extracto de jugo de tomate.

Punto Nº 11: cuatro gotas de extracto de jugo de tomate.

Punto Nº 12: tres gotas de solución de cada uno de los cuatro aminoácidos.

Punto Nº 13: tres gotas de solución de ácido aspártico.

Las manchas aplicadas no deben tener un diámetro mayor de 2 cm. Deje secar cada gota antes de aplicar la

siguiente. Antes de introducir el papel en el disolvente las manchas deben estar secas.

a. La cámara de desarrollo: La constituye un vaso de precipitados de 800-1000 ml, el cual se cubre con

un trozo de papel aluminio.

b. El disolvente: es el n-BuOH, AcOH, H2O (4:1:5) usado en la primera cromatografía.


4040




c. Procedimiento: En el vaso de precipitados coloque 10 ml del disolvente y tápelo herméticamente. Doble

la pieza de papel hasta obtener un cilindro. Una los extremos, sin que estos se toquen, mediante tres

grapas (mejor es hacerlo con aguja e hilo blanco).

Introduzca el cilindro de papel en la cámara de desarrollo; al cabo de dos horas aproximadamente, el frente del

disolvente debe alcanzar 11 cm. Saque el cromatograma e inmediatamente marque con un lápiz el frente del

disolvente. Seque el cromatograma. Rocíelo con la solución reveladora (ninhidrina al 0,5% en n-butanol), y

llévelo a la estufa (120 ºC) durante 10 minutos. Marque con un lápiz el borde de cada mancha.

d. Análisis del cromatograma: Calcule el Rf de cada mancha. Tabule los resultados, indicando el color y

el Rf de cada mancha, asi como el disolvente usado y la temperatura. Por comparación indique cuantos

aminoácidos están presentes en los extractos de los jugos e identifique algunos de ellos.

1.4.- CROMATOGRAFÍA ASCENDENTE DE VARIAS TINTAS DE MARCADORES:

Repita la cromatografía 3. Use el mismo disolvente. Las muestras a aplicar son tintas de diferentes colores y

marcas. La aplicación se hace directamente con el marcador. Analice el cromatograma. Establezca si en tintas

diferentes de una misma marca hay colorantes iguales. Establezca si tintas de marcas diferentes tienen los

mismos colorantes.

5. EXPERIMENTOS DE C ROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

5.1.- PREPARACIÓN DE LAS PLACAS.

Lave bien con agua y jabón 12 placas de vidrio(portaobjetos), de manera de eliminar cualquier residuo de grasa

adherida en ellas, escúrralas y séquelas completamente sobre papel adsorbente. Evite que a las placas se le

pegue residuos del papel.

Adhiera dos placas y sujetándolas por uno de sus extremos introdúzcalas lentamente en una suspensión de 60

gramos de gel de sílice tipo G en 150 ml de una mezcla de cloroformo - metanol (2:1). Saque las placas

lentamente con velocidad contínua; escurra la suspensión sobrante en el extremo de la placa apoyando el

borde inferior de las placas en la pared del envase que contiene la suspensión. Con un movimiento de los

dedos, despegue las placas.

Permita que el solvente se evapore y proceda a limpiar con la punta del dedo el exceso de adsorbente que se

haya permanecido en los bordes y en la superficie no cubierta de la placa. Repita el proceso con las otras 10

placas restantes. Active 10 de las placas en una estufa a 120ºC durante 1 hora.

NOTA: LAS PLACAS SON MUY FRÁGILES. MANÉJELAS CON CUIDADO.


4141




5.2.- PREPARACIÓN DE LAS CÁMARAS DE DESARROLLO.

Lave bien y seque completamente los envase que servirán como cámaras de desarrollo. Coloque en su interior

una banda de papel de filtro que alcance para cubrir las 2/3 partes de las paredes internas de los envases.

En cada uno coloque un volumen de solvente a usar tal que alcance una altura de aproximadamente 3 mm

sobre el fondo del envase ( 5 ml). Tape el recipiente con un circulo de papel aluminio o con un vidrio de reloj y

deje en reposo para permitir que el papel de filtro interno se impregne completamente con el solvente. Agregue

más solvente hasta alcanzar el nivel inicial.

5.3.- PREPARACIÓN DE UNA CÁMARA DE REVELADO CON VAPORES DE YODO.

Use un recipiente que posea tapa enroscable. Lávelo bien y séquelo completamente. Coloque en su interior

unos cristales de yodo. Tape el envase y déjelo en reposo para que la atmósfera se sature con los vapores del

yodo que se sublima.

5.4.- APLICACIÓN DE LAS MUESTRAS.

Debe utilizar un capilar fino para cada una de las soluciones a ser utilizadas. Llene el capilar con la solución a

cromatografiar, aplique una pequeña cantidad de la solución, procurando que la mancha obtenida no tenga un

diámetro superior de 2mm.

Evite romper la capa de adsorbente con la punta del capilar. la aplicación debe hacerse a 6 mm

aproximadamente del extremo de la placa. cuando haya aplicado todas las muestras trace una raya con un lápiz

de grafito de punta fina en el extremo opuesto de la placa a 3 mm aproximadamente del borde del adsorbente.

Esto se consigue raspando el absorbente con la punta del lápiz.

5.5.- CROMATOGRAFÍA DE VARIOS ANALGÉSICOS.

Las muestras a analizar son soluciones de cuatro analgésicos en cloroformo. Para las primeras 6 experimentos

utilice placas activadas. Aplique las muestras a intervalos de 5 mm, use un capilar para cada solución. Evite en

todo momento confundirlos, de lo contrario contaminará las soluciones y los resultados serán impredecibles.

placa Nº 1:

primer punto: 2 gotas de solución de rilan

segundo punto: 2 gotas de solución de cafenol

tercer punto: 2 gotas de solución de coricidin

cuarto punto: 2 gotas de solución de rhinazol

Desarrolle el cromatograma usando acetato de etilo como solvente. Inmediatamente después de obtenido el

cromatograma, localice las manchas usando una lámpara Ultravioleta, márquelas con un lápiz y luego

introduzca la placa en la cámara de yodo y observe si aparecen nuevas manchas.

placa Nº 2.


4242




Aplique las mismas soluciones que usó para la placa Nº 1.

Use n-butanol como solvente

placa Nº 3


Use butanona como solvente

placa Nº 4.


Use éter de petróleo como solvente

placa Nº 5.


Use une mezcla de n-butanol, butanona y acetato de etilo en la proporción 2:9:9 como solvente

placa Nº 6.

Aplique las siguientes muestras patrones:

primer punto: 2 gotas de solución de ácido acetilsalicílico

segundo punto: 2 gotas de solución de cafeína

tercer punto 2 gotas de solución de fenacetina.

Use como solvente aquel que haya desarrollo el mejor cromatograma en las cinco primeras placas.

placa Nº 7.

Utilice para este experimento una placa sin activar.


Use como solvente aquel que haya desarrollo el mejor cromatograma en las cinco primeras placas.


4343




Análisis de los resultados:

Copie el resultado de cada una de las placas en su cuaderno. Especifique los datos

concernientes a saber: adsorbente, solvente y activación. por comparación de los resultados indique

el orden de polaridad de los solventes usados. En el mejor de los cromatogramas obtenido, calcule el

Rf de cada mancha y por comparación con los Rf obtenidos para las muestras patrón, identifique el

analgésico que está presente en las soluciones de rilan, rhinazol, cafenol y coricidin. Compare los

valores de Rf que se obtienen en la mejor placa activada con respecto a la placa sin activar.

BIBLIOGRAFIA

1) Introducción a la Cromatografía, David Abbott y R. S. Andrews, Tercera Edición., Alhambra

S.A.., Madrid., 1973.

2) Paper, Thin Layer Chromatography and Electrophoresis, A Teaching Level Manual., Smith

Ivor and Feinberg, J. G.., Shandon., London., 1965

3) Experimental Methods in Organic Chemistry., Moore, J. A.., and Dalrymple, D. L., Second

Edition., W. B. Saunders Co., Philadelphia., 1976.

4) Introduction to Organic Laboratory Techniques. A Contemporary Approach, Second

Edition., Pavia, Lampman y Kriz

5) Curso Práctico de Química Orgánica, Tercera Edición, Brewster, Vanderwerf, McEwen

6) Química Orgánica, Fundamentos teóricos – prácticos para el Laboratorio, Lydia Galagovsky

Kurman., Quinta Edición, Manuales Eudeba, Buenos Aires, 1995.

7) Química Orgánica Experimental. Primera Edición Española., H. D. Durst y G. W. Gokel, Editorial

Reverté S.A., Barcelona, 1985.

8) A Text Book of Practical Organic Chemistry, Third Edition., A. I. Vogel., Wiley., New York.,

1972.


4444




9) Experimentos de Química Orgánica. L. F. Fieser., Editorial Reverté S.A., Madrid., 1967.

10) The Organic Chem Lab Survival Manual, A Student´s Guide to Techniques., James W.

Zubrick., Third Edition., John Wiley and Sons., New York., 1992.

11) The Identification of Aspirin – Free Bayer Products. An Alternative to the Classical TLC of

Analgesics., John J. Cawley,, Journal of Chemical Education, Volume 72., Number 3., March

1995.

12) Thin – Layer Chromatography of Analgesics. An Update. John W. Elder., Journal of Chemical

Education., Volume 72., Number 11., November 1995.


4545

Cromatografia Papel- Capa Fina[1]

Documents

Transcript of Cromatografia Papel- Capa Fina[1]