03/07/2012

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CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

Curso: Química Analítica II

Loreto Ascar

2012

Esquema de las bases de la separación en cromatografía de:

(a)absorción, (b) partición, (c) Intercambio iónico y (d) Exclusión por

tamaño

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CROMATOGRAFÍA DE REPARTO

• Cromatografía líquido – líquido

(adsorción física de la fase estacionaria sobre el soporte)

Desventaja: Pérdida de fase estacionaria por disolución en la fase

móvil, no permite trabajar en gradiente

• Cromatografía de fase unida químicamente o enlazada

(unión química de la fase estacionaria sobre el soporte)

El líquido de la fase estacionaria está adsorbido sobre un

soporte sólido. Los líquidos que componen ambas fases

deben ser inmiscibles

Fase Estacionaria

R es un grupo alquilo o alquilo sustituido , le confiere carácter polar o apolar:

Polares: Fase Normal Apolares: Fase Reversaciano ((–C2H4CN) cadena hidrocarbonada

diol (–C3H6OCH2CHOHCH2OH) n-octyl (C8)

amino (–C3H6NH2) n-octyldecyl (C18)

Sílice hidrolizada

Fases estacionarias polares

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Fases estacionarias apolares

El enlace covalente, le confiere carácter térmico e hidrolítico

estable

Octadecil: Si-O-Si -------------CH3

Octil: Si-O-Si--------CH3

Dimetil: Si-O-Si - CH3

CH3

Partícula de relleno para (a) cromatografía en fase normal y

(b) cromatografía en fase reversa

• Fase Normal

�Fase estacionaria: polar

�Fase móvil: apolar

• Fase Inversa

�Fase estacionaria: apolar

�Fase móvil: polar

Rellenos de Fase Normal y Fase Inversa

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Fase Normal y Fase Inversa

Efecto largo de cadena en fase inversa

Partículas de 5 µm, fase móvil 50/50 : metanol/agua, caudal 1,0 mL/min

Elección del Método Cromatográfico

Debe existir un adecuado equilibrio entre lasfuerzas intermoleculares del soluto, fase móvil yfase estacionaria

� Soluto muy afín con fase móvil, tiempo de elución muy bajo,pobre separación

� Soluto muy afín con fase estacionaria, tiempo de eluciónexcesivamente largo

Polaridad grupos funcionales:

Hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas < aldehídos < amidas <aminas < alcoholes

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Acetaminofen, cafeína, ácido benzoico y ácido salicílico

Aplicaciones de la cromatografía de reparto

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Derivatización

• Reducir la polaridad de los analitos, poder usar cromatografía

de reparto

• Aumentar la respuesta del detector (sensibilidad)

• Aumentar la selectividad del detector

CROMATOGRAFÍA DE PARES IÓNICOS (ICP)

Permite la determinación de especies iónicas por cromatografía

de reparto en fase inversa, incorporando un contraión a la fase

móvil de carga opuesta al analito, generando una especie neutra.

La fase móvil está constituida por una disolución acuosa

reguladora que contiene un disolvente orgánico como metanol o

acetonitrilo y un compuesto iónico que aporta un contra ión de

carga opuesta al analito, generando una especie neutra que es

retenida por el relleno de fase inversa.

• Formación de pares iónicos del contraión con la

muestra ionizada, para formar la especie neutra que

luego va a interactuar con la fase estacionaria.

• La cadena alquílica del contraión se reparte en la fase

estacionaria dejándola cargada, esto convierte la

columna de fase inversa en una columna iónica.

Mecanismos para la separación por cromatografía de pares iónicos

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CROMATOGRAFÍA CON FASES ESTACIONARIAS QUIRALES

Es una metodología que permite la separación de isómeros

ópticamente activos (enantiómeros)

Se recubre el soporte con un polímero al cual se le enlaza un

isómero ópticamente activo

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

Cromatografía líquido- sólido

Fase estacionaria: altamente polar (Sílice o alúmina)

Fase móvil: relativamente no polar

Es adecuada para compuestos no polares de masas

moleculares inferiores a 5000

Hidrocarburos aromáticos, haluros, aldehídos, sulfuros, éteres,

ésteres, cetonas, alcoholes

SELECCIÓN DE LA FASE MÓVIL

Para optimizar las separaciones sólo se puede modificar la

composición de la fase móvil

En la cromatografía de adsorción hay dos procesos competitivos involucrados:

•Reacciones entre el grupo funcional del soluto y los sitios de

enlace de la fase estacionaria.

•Competencia entre la fase móvil y las moléculas del soluto

por los sitios de enlace de la fase estacionaria

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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO(cromatografía en geles o filtración en geles)

La cromatografía de exclusión por tamaño, consiste en una fase

estacionaria de geles con tamaño de poro controlado.

Los componentes de la muestra se separan de acuerdo al tamaño

de sus moléculas

Rellenos de columna

Pequeñas partículas poliméricas o de sílice (5 a 10 um de tamaño),

con una red de poros uniformes en los que pueden difundir las

moléculas de soluto y el disolvente

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Rellenos de columna

La curva de calibración se realiza con estándares.

Teoría de la cromatografía de exclusión por tamaño

Cromatograma de exclusión de una mezcla de seis ácidos débiles

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Proteínas

Cromatografía de intercambio iónica o cromatografía iónica (IC)

Separación y determinación de iones utilizando resinas de

intercambio iónico.

Utiliza como fase estacionaria una resina y como fase móvil un

disolvente

Los intercambiadores catiónicos contienen ácido sulfónico.

Los intercambiadores aniónicos contienen grupos amino

cuaternarios –N(CH 3)3+ OH- o grupos amina primaria -NH3+ OH-

los primeros son base fuerte y los segundos base débil.

Intercambiador aniónico:

RN(CH3)+ OH- + A X- <----> RH (CH3-) A x- + xOH-

solido disol sólido disol

Intercambiadores catiónicos:

xRSO3- H+ + M X+ <---> (RSO3

-)x MX+ + xH+

sólido disol. sólido disol.

RSO3- H+ :grupos de Ac. sulfónico unidos a una gran molécula polimérica.

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Rellenos de Intercambio Iónico

Partículas esféricas porosas producidas por la polimerización de

estireno con divinilbenceno, actualmente se utilizan partículas

esféricas no porosas

Resinas de intercambio catiónico:ácido sulfónico (-SO3

-H+, ácido fuerte)

ácido carboxílico (-COO-H+, ácido débil)

Resinas de intercambio aniónico: grupos amino cuaternarios (–N(CH3)3

+ OH- , base fuerte)

grupos amina primaria ( -NH3+ OH- ,base débil)

Rellenos de Intercambio Iónico

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Cationes y metales de transición

Aplicaciones

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